CN103901008A - 利用荧光内滤效应检测鸡蛋中的三聚氰胺 - Google Patents
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Abstract
利用荧光内滤效应检测鸡蛋中的三聚氰胺，属于分析化学技术领域；其特征在于利用量子点（ZnSe QDs）与银纳米粒子（AgNPs）之间的荧光内滤效应快速检测三聚氰胺，包括以下步骤：柠檬酸盐稳定的AgNPs的合成；谷胱甘肽修饰的ZnSe QDs的合成与纯化；利用荧光法观察含有不同浓度三聚氰胺的量子点-胶体银体系，运用量子点的荧光恢复检测三聚氰胺；该方法可简单、快速、灵敏的检测鸡蛋中三聚氰胺，并且有很高的灵敏度，为以后的研究、生产、监管等提供了方便。
Description
技术领域
利用荧光内滤效应检测鸡蛋中的三聚氰胺，属于分析化学技术领域。
背景技术
环丙氨嗪可以抑制双翅目昆虫幼虫和蛹的生长，因而常被用于农药、兽药和饲料添加剂。三聚氰胺是生产环丙氨嗪的副产物，也是其代谢产物之一。喷洒过环丙氨嗪的水果和蔬菜，以及摄入含环丙氨嗪饲料的牲畜尿液中，经常能检测到三聚氰胺残留。
为了减少鸡粪便招致的苍蝇，经常会在母鸡的饲料中添加环丙氨嗪。环丙氨嗪在母鸡体内会代谢三聚氰胺，并且鸡蛋中也会有三聚氰胺的存在。
三聚氰胺C3H6N6，分子结构下所示：
三聚氰胺是氨基腈的三聚体，其分子中含有1个1,3,5-三氮杂苯环和3个氨基，含氮量高达66%。三聚氰胺可由尿素、双氰胺或氰化氢等不同的原料制取。工业上，高纯三聚氰胺（99%）通常由尿素通过气相催化法或高压液相催化法生产，低纯三聚氰胺可从结晶母液或煤中回收。
三聚氰胺的急性口服毒性较低，然而，长期或反复地大量摄入三聚氰胺，患肾结石甚至急性肾衰竭和膀胱癌的几率会大大增加。这是因为三聚氰胺在体内会部分转化为三聚氰酸，而三聚氰胺与三聚氰酸会结合形成无法溶解的氰尿酸三聚氰胺，进而引起一系列生殖和泌尿系统疾病。
目前，三聚氰胺的检测手段主要包括液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）等。尽管这些方法灵敏度高，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测牛奶及乳制品中三聚氰胺的含量。
国标中采用高效液相色谱法检测原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的的定量限为2mg/kg。还没有国标方法检测鸡蛋中的三聚氰胺。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用量子点（ZnSe QDs）与银纳米粒子（AgNPs）之间的荧光内滤效应快速检测三聚氰胺的方法，以快速、简单、灵敏的检测鸡蛋中三聚氰胺。
技术问题：利用量子点与银纳米粒子之间的荧光内滤效应快速检测三聚氰胺的方法基于以下原理：
在量子点中加入银纳米粒子后，由于荧光内滤效应作用，量子点的荧光强度会降低。
加入三聚氰胺(Melamine)后，三聚氰胺会强烈的结合到AgNPs表面，迅速地引起AgNPs的团聚，从而减少了量子点发射光谱与AgNPs吸收光谱的光谱重叠。因此，荧光内滤效应减少的量子点的荧光发射会显著恢复。
本发明的技术方案：
包括以下步骤：柠檬酸盐稳定的AgNPs的合成；谷胱甘肽修饰的ZnSe QDs的合成与纯化；利用荧光法观察含有不同浓度三聚氰胺的量子点-胶体银体系，运用量子点的荧光恢复检测三聚氰胺。
（1）柠檬酸盐稳定的AgNPs的合成：
所有的玻璃器皿都用新制备的王水浸泡24小时，再用蒸馏水漂洗干净，80℃烘干备用。在0.25mM硝酸银和0.25mM的柠檬酸钠的20ml的混合溶液中加入600uL的10mM NaBH4溶液，同时大力搅拌。溶液逐渐从无色变为深灰色，待反应完全后得到亮黄色溶液（大约20分钟）。将溶液静止放置八小时，并用0.4μm微孔膜过滤，4℃冷藏备用。
（2）谷胱甘肽修饰的ZnSe QDs的合成与纯化：0.014g硼氢化钠与0.0078g Se粉溶于300μL水，冰浴40min，得到NaHSe溶液。0.088g乙酸锌与0.12g谷胱甘肽溶于100mL水中，用NaOH调节pH至11，然后加入之前制备的300μL NaHSe溶液，同时搅拌。混合溶液在95℃加热90min，自然冷却至室温。ZnSe QDs溶液加入同体积的异丙醇，离心纯化，真空干燥后复溶于水。
（3）利用荧光法观察含有不同浓度三聚氰胺的量子点-胶体银体系，运用量子点的荧光恢复检测三聚氰胺。分析步骤如下：
1mL3.9nM AgNPs与0.3mL2mM硼酸盐缓冲液(pH=8)混合，然后加入1.2mL不同浓度的三聚氰胺，反应16min。然后向上述溶液中分别加入0.5mL1mM ZnSe QDs。以300nm激发，记录混合液在370nm处的荧光强度，存在三聚氰胺时F，不存在三聚氰胺时F0，以(F-F0)/F0比三聚氰胺浓度绘制标准曲线。
所用三聚氰胺标准品浓度依次为：1μg·L-1,3μg·L-1,5μg·L-1,9μg·L-1,12μg·L-1,18μg·L-1,24μg·L-1,30μg·L-1,36μg·L-1。
本发明的有益效果：本发明利用量子点与银纳米粒子之间的荧光内滤效应作用，建立了一个简单、快速、灵敏的信号法，能够快速检测有三聚氰胺，为今后的监管提供了方便。
附图说明
图1不同浓度的AgNPs(0,0.13,0.26,0.39,0.52,0.65,0.78,0.91,1.04,1.17,1.3nM)对量子点荧光强度的影响，虚线为量子点的荧光强度，实线为加入AgNPs后的荧光强度。
图2不同体系的荧光光谱图：a,ZnSe QDs;b;ZnSe QDs和melamine;c,ZnSe QDs和AgNPs;d,ZnSeQDs-AgNPs和melamine.ZnSe QDs:0.17mM;AgNPs:1.3nM;melamine:18μg·L-1。
图3三聚氰胺的标准曲线图，以(F-F0)/F0与三聚氰胺的浓度建立标准曲线。
具体实施方式
柠檬酸盐稳定的AgNPs的合成：
材料/试剂：硝酸银、柠檬酸钠、硼氢化钠购自北京化学试剂公司。
合成方法：所有的玻璃器皿都用新制备的王水浸泡24小时，再用蒸馏水漂洗干净，80℃烘干备用。在0.25mM硝酸银和0.25mM的柠檬酸钠的20ml的混合溶液中加入600uL的10mM NaBH4溶液，同时大力搅拌。溶液逐渐从无色变为深灰色，待反应完全后得到亮黄色溶液（大约20分钟）。将溶液静止放置八小时，并用0.4μm微孔膜过滤，4℃冷藏备用。
结果：获得的AgNPs的吸收光谱在395nm处有最大峰，这与文献报道相一致。
谷胱甘肽包覆的ZnSe QDs的合成：
材料/试剂：乙酸锌、硒粉、谷胱甘肽、硼氢化钠购自北京化学试剂公司。
合成方法：0.014g硼氢化钠与0.0078g Se粉溶于300μL水，冰浴40min，得到NaHSe溶液。0.088g乙酸锌与0.12g谷胱甘肽溶于100mL水中，用NaOH调节pH至11，然后加入之前制备的300μL NaHSe溶液，同时搅拌。混合溶液在95℃加热90min，自然冷却至室温。ZnSe QDs溶液加入同体积的异丙醇，离心纯化，真空干燥后复溶于水。
由于AgNPs的浓度对ZnSe QDs的荧光强度有影响，所以需要研究反应体系中AgNPs浓度变化的影响。
材料/试剂：柠檬酸盐稳定的AgNPs；谷胱甘肽包覆的ZnSe QDs。
方法：在十一个离心管（3.0mL）先分别依次加入0.17mM ZnSe QDs溶液，再加入不同浓度的AgNPs(终浓度为0,0.13,0.26,0.39,0.52,0.65,0.78,0.91,1.04,1.17,1.3nM)，激发波长300nm，激发和发射狭缝宽均为5nm，分别测定荧光光谱。
结果：在一定浓度范围内，随着AgNPs浓度的增加，ZnSe QDs的荧光强度逐渐降低。当AgNPs的浓度为1.3nM时，荧光背景较弱，荧光猝灭效率较高，因此AgNPs的最优浓度选择1.3nM。
该方法用于三聚氰胺的检测。
材料/试剂：柠檬酸盐稳定的AgNPs；谷胱甘肽包覆的ZnSe QDs；三聚氰胺购自阿拉丁试剂公司。
方法：（1）1mL3.9nM AgNPs与0.3mL2mM硼酸盐缓冲液(pH=8)混合，然后加入1.2mL不同浓度的三聚氰胺(1μg·L-1,3μg·L-1,5μg·L-1,9μg·L-1,12μg·L-1,18μg·L-1,24μg·L-1,30μg·L-1,36μg·L-1)，反应16min。
（2）向上述溶液中分别加入0.5mL1mM ZnSe QDs。以300nm激发，记录混合液在370nm处的荧光强度，存在三聚氰胺时F，不存在三聚氰胺时F0，以(F-F0)/F0比三聚氰胺浓度绘制标准曲线。
结果：以(F-F0)/F0比三聚氰胺浓度绘制标准曲线。F为存在三聚氰胺时体系荧光强度，F0为不存在三聚氰胺时荧光强度，方法的线性范围1μg·L-1-36μg·L-1。
Claims (4)
1.利用荧光内滤效应检测鸡蛋中的三聚氰胺，其特征在于利用量子点（ZnSeQDs）与银纳米粒子（AgNPs）之间的荧光内滤效应快速检测三聚氰胺，包括以下步骤：柠檬酸盐稳定的AgNPs的合成；谷胱甘肽修饰的ZnSe QDs的合成与纯化；利用荧光法观察含有不同浓度三聚氰胺的量子点-胶体银体系，运用量子点的荧光恢复检测三聚氰胺。
2.如权利要求1所述的方法，柠檬酸盐稳定的AgNPs的合成：
所有的玻璃器皿都用新制备的王水浸泡24小时，再用蒸馏水漂洗干净，80℃烘干备用；在0.25mM硝酸银和0.25mM的柠檬酸钠的20ml的混合溶液中加入600uL的10mM NaBH4溶液，同时大力搅拌；待反应完全后得到亮黄色溶液，将溶液静止放置八小时，并用0.4μm微孔膜过滤，4℃冷藏备用。
3.如权利要求1所述的方法，谷胱甘肽修饰的ZnSe QDs的合成与纯化：0.014g硼氢化钠与0.0078g Se粉溶于300μL水，冰浴40min，得到NaHSe溶液；0.088g乙酸锌与0.12g谷胱甘肽溶于100mL水中，用NaOH调节pH至11，然后加入之前制备的300μL NaHSe溶液，同时搅拌；混合溶液在95℃加热90min，自然冷却至室温；ZnSe QDs溶液加入同体积的异丙醇，离心纯化，真空干燥后复溶于水。
4.如权利要求1所述的方法，利用荧光法观察含有不同浓度三聚氰胺的量子点-胶体银体系，运用量子点的荧光恢复检测三聚氰胺；分析步骤如下：
1mL3.9nM AgNPs与0.3mL2mM硼酸盐缓冲液(pH=8)混合，然后加入1.2mL不同浓度的三聚氰胺，反应16min；然后向上述溶液中分别加入0.5mL1mMZnSe QDs；以300nm激发，记录混合液在370nm处的荧光强度，存在三聚氰胺时F，不存在三聚氰胺时F0，以(F-F0)/F0比三聚氰胺浓度绘制标准曲线。
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