CN104076015A - 基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法 - Google Patents
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Abstract
基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法，属于分析化学技术领域；其特征在于利用金纳米粒子对量子点的荧光猝灭作用检测啶虫脒的残留量，包括以下步骤：CdTe量子点的合成和纯化；金纳米粒子的制备；通过测定圆二色谱观察核酸适配体与啶虫脒的特异性结合作用；通过TEM和DLS测定观测核酸适配体对金纳米粒子的保护作用；运用金纳米粒子对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测啶虫脒并进行实际样品的检测，该方法可简单、快速、灵敏的检测啶虫脒，并且有很高的灵敏度，为以后的研究、生产、监管等提供了方便。
Description
技术领域
基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
啶虫脒又名莫比朗、吡虫清、NI-25,英文通用名为acetamiprid,1996年由日本曹达株式会社继1991年吡虫啉(imidacloprid,德国拜耳)、1995年烯啶虫胺(nitenpyram,日本武田)后开发并商品化的第3个氯化烟碱类杀虫剂。基本特点为:极性较大,水溶性好,在水溶液中稳定半衰期长,不易水解,有很强的内吸性,杀虫广谱且持效期长,能被微生物降解等。
国内关于啶虫脒的水生生态安全研究表明,它对部分鱼类高毒,对藻类低毒,因此该农药在使用时应预防其对水生生物造成危害。
国内外关于残留结果和对环境效应的报道也已很多。例如:以3％啶虫脒乳油1000倍在柑橘上喷施一次,残留主要在橘皮中,橘肉中也有少量残留,其在橘皮和土壤中半衰期分别为7.6～12.7d和1.8～9.2d；在柑橘生长初期和后期分别以3％啶虫脒乳油1000倍液各喷施一次,两次喷药间隔期为80～85d,橘皮中的最终残留量低于80.2μg/kg,橘肉中的残留量植物保护低于15.9μg/kg,全果中的最终残留低于27.2μg/kg；在土壤中的最终残留量则低于5.29μg/kg
目前，啶虫脒的检测手段主要包括液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、酶联免疫法(ELISA)等。尽管这些方法灵敏度高，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测啶虫脒。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法，以快速、简单、灵敏的检测啶虫脒的残留量。
技术问题：基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法基于以下原理：
核算适配体可以通过N和Au形成的配位键吸附在金纳米粒子表面，这种配位键的作用强于静电引力作用，所以核酸适配体对盐效应诱导金纳米粒子聚集起到保护作用。然而，当加入目标分子啶虫脒之后，核算适配体会与啶虫脒发生特异性结合形成超分子复合物，同时盐效应会引起金纳米粒子聚集。对于金属纳米粒子-量子点的复合荧光探针，金属纳米粒子的聚集改变荧光内滤效应中吸光体的吸光能力，从而能降低金属纳米粒子对量子点荧光的猝灭效率。核酸适配体与目标分子特异性结合后，盐效应引起失去保护的金属纳米粒子聚集，量子点的荧光恢复及机理。以量子点为荧光信号物质，构建基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒。
本发明的技术方案：
包括以下步骤：CdTe量子点的合成和纯化；金纳米粒子(AuNPs)的制备；通过测定圆二色谱观察核酸适配体与啶虫脒的特异性结合作用；通过TEM和DLS测定观测核酸适配体对金纳米粒子的保护作用；运用金纳米粒子对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测啶虫脒并进行实际样品的检测。
(1)CdTe量子点的制备：
首先称量0.0256g Te粉和0.0386g NaBH4加入到三口烧瓶中，用高纯水配制pH＝11的NaOH溶液100mL，向其中通入10min N2，装于一恒压滴定漏斗①中，用高纯水配制浓度为4×10-3mol/L的CdCl2溶液100mL，加入67μL TGA，用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝11，向其中通入10min N2，将得到的澄清透明溶液装于另一恒压滴定漏斗②中，将整个装置与真空、N2系统连接起来，经历几次抽真空和通N2的步骤除去体系中的O2；略微加热，打开漏斗①，加入3～5滴水，电磁搅拌，引发反应，待Te粉基本反应完全后(溶液为红色并且黑色粉末消失)，将①中的水全部加入，得到透明浅红色溶液，再将②中溶液全部加入，整个过程都进行N2保护；溶液全部加入后继续搅拌10min，撤去N2保护，将得到的混合溶液用50％的微波功率输出加热进行晶体生长反应；得到的产物加入等体积的异丙醇洗涤，并离心除去过量 前体，最后将其再分散在200mL的纯净水中。
(2)金纳米粒子(AuNPs)的制备：
所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0.45μm的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0.45μm的微孔膜过滤，4℃保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm。
(3)通过测定圆二色谱观察核算适配体与啶虫脒的特异性结合作用：
在两个装有10mM NaCl和5mM MgCl2的10mM Tris缓冲液的离心管(1.5mL)中加入0.25μM啶虫脒的核酸适配体，再在其中一个离心管中加入0.5μM的啶虫脒，另一个离心管不加，测圆二色谱图。
(4)通过TEM和DLS测定观测核酸适配体对金纳米粒子的保护作用：
①样品制备
取四个2.0mL的离心管，编号为a,b,c,d，分别依次加入，a管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子)，b管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl)，c管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体)，d管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体，0.5μM啶虫脒)。
②参数
将四种样品分别滴于四个铜网上，室温晾干，用JEM-2100F透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。
用Nano ZS纳米粒度仪测定样品①的粒径分布。
(5)核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的步骤：
56μL不同浓度的啶虫脒加入62μL1.6μM的核酸适配体，涡旋混合10min后加入266μL金纳米粒子(4.8×10-9mol·L-1)，继续涡旋混合8min后加入44μL500mM的NaCl，再次涡旋混合10min.最后加入100μL1.4×10-6mol·L-1的CdTe量子点，用荧光分光光度计进行检测。
(6)取白菜为例进行实际样品检测：
取10g白菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次，过滤液用10mL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL。在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的啶虫脒标准品。
本发明的有益效果：
本发明制备了金纳米粒子，并建立了一个简单、快速、灵敏的基于核酸适配体荧光传感器的方法，能够快速检测啶虫脒，为今后的监管提供了方便。
附图说明
图1圆二色谱图：核酸适配体(a)，核酸适配体和啶虫脒(b)；
图2金纳米粒子透射电镜图；
图3金纳米粒子-盐透射电镜图；
图4金纳米粒子-盐-核酸适配体透射电镜图；
图5金纳米粒子-盐-核酸适配体-啶虫脒透射电镜图；
图6不同体系的荧光光谱图：量子点(a)，金纳米粒子-量子点(b)，金纳米粒子-盐-量子点(c)，金纳米粒子-盐-核酸适配体-量子点(d)，金纳米粒子-盐-核酸适配体-啶虫脒-量子点(e)；
图7含有不同浓度啶虫脒(0,1.2,2.4,7.2,14.4,21.6μg/kg)的实际样品检测的荧光光谱图以及以工作曲线。
具体实施方式
CdTe量子点的合成和纯化
材料/试剂：Te粉，NaBH4和TGA购置于国药试剂
方法：首先称量0.0256g Te粉和0.0386g NaBH4加入到三口烧瓶中，用高纯水配制pH＝11的NaOH溶液100mL，向其中通入10min N2，装于一恒压滴定漏斗①中，用高纯水配制浓度为4×10-3mol/L的CdCl2溶液100mL，加入67μL TGA，用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝11，向其中通入10min N2，将得到的澄清透明溶液装于另一恒压滴定漏斗②中，将整个装置与真空、N2系统连接起来，经历几次抽真空和通N2的步骤除去体系中的O2；略微加热，打开漏斗①，加入3～5滴水，电磁搅拌，引发反应，待Te粉基本反应完全后(溶液为红色并且黑色粉末消失)，将①中的水全部加入，得到透明浅红色溶液，再将②中溶液全部加入，整个过程都进行N2保护；溶液全部加入后继续搅拌10min，撤去N2保护，将得到的混合溶液用50％的微波功率输出加热进行晶体生长反应；得到的产物加入等体积的异丙醇洗涤，并离心除去过量前体，最后将其再分散在200mL的纯净水中。
结果：CdTe量子点的荧光光谱在530nm处有最大峰，这与文献报道相一致。
金纳米粒子AuNPs的制备
材料/试剂：氯金酸和柠檬酸三钠购自北京化工厂。
方法：制备时，向洁净的装有回流装置的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸100mL，在磁力搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠10mL，边加热边搅拌，待溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，4℃保藏。
结果：经透射电镜表征，所制得的金纳米粒子粒径为13nm，且分散性良好，粒径均匀。
由于需要研究核酸适配体与啶虫脒的作用机理，所以需要进行圆二色谱测定。
材料/试剂：啶虫脒购自Sigma-Aldrich；核酸适配体购自生工生物(上海)公司，NaCl，MgCl2，Tris购自北京化工厂。
方法：在两个装有10mM NaCl和5mM MgCl2的10mM Tris缓冲液的离心管(1.5mL)中加入0.25μM啶虫脒的核酸适配体，再在其中一个离心管中加入0.5μM的啶虫脒，另一个离心管不加，测圆二色谱图。
结果：结果表明，啶虫脒和核酸适配体特异性结合，改变了空间结构。
由于需要研究核酸适配体对金纳米粒子的保护作用，所以需要进行TEM和DLS测定。
材料/试剂：金纳米粒子，啶虫脒购自Sigma-Aldrich；核酸适配体购自生工生物(上海)公司；NaCl购自北京化工厂。
方法：取四个2.0mL的离心管，编号为a,b,c,d，分别依次加入，a管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子)，b管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl)，c管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体)，d管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体，0.5μM啶虫脒)。
结果：结果表明，核酸适配体可以吸附在金纳米粒子表面，在NaCl存在时，保护金纳米粒子不团聚。
该方法用于啶虫脒检测
材料/试剂：量子点；金纳米粒子；啶虫脒购自Sigma-Aldrich；核酸适配体购自生工生物(上海)公司；NaCl购自北京化工厂；实际样品够于当地超市。
方法：
(1)56μL不同浓度的啶虫脒加入62μL1.6μM的核酸适配体，涡旋混合10min后加入266μL金纳米粒子(4.8×10-9mol·L-1)，继续涡旋混合8min后加入44μL500mM的NaCl，再次涡旋混合10min.最后加入100μL1.4×10-6mol·L-1的CdTe量子点，用荧光分光光度计进行检测。根据[(F-F0)/F0]与啶虫脒的浓度建立标准曲线，计算
(3)实际样品检测：取白菜进行实际样品检测。
取10g白菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次，过滤液用10mL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL。在样品提取液中，如权利 6所述，加入不同浓度的啶虫脒标准品。根据[(F-F0)/F0]与啶虫脒的浓度建立标准曲线，啶虫脒的检出限为0.192μg/kg，线性范围为1.2μg/kg-21.6μg/kg。
结果：根据[(F-F0)/F0]与啶虫脒的浓度建立标准曲线，啶虫脒的检出限为0.192μg/kg，线性范围为1.2μg/kg-21.6μg/kg。
表1实际样品的加标回收率
。
Claims (7)
1.基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法，其特征在于利用金纳米粒子对量子点的荧光猝灭作用检测啶虫脒的残留量，包括以下步骤：CdTe量子点的合成和纯化；金纳米粒子(AuNPs)的制备；通过测定圆二色谱观察核酸适配体与啶虫脒的特异性结合作用；通过TEM和DLS测定观测核酸适配体对金纳米粒子的保护作用；运用金纳米粒子对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测啶虫脒并进行实际样品的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CdTe量子点的制备步骤如下：
首先称量0.0256g Te粉和0.0386g NaBH4加入到三口烧瓶中，用高纯水配制pH＝11的NaOH溶液100mL，向其中通入10min N2，装于一恒压滴定漏斗①中，用高纯水配制浓度为4×10-3mol/L的CdCl2溶液100mL，加入67μL TGA，用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝11，向其中通入10min N2，将得到的澄清透明溶液装于另一恒压滴定漏斗②中，将整个装置与真空、N2系统连接起来，经历几次抽真空和通N2的步骤除去体系中的O2；略微加热，打开漏斗①，加入3～5滴水，电磁搅拌，引发反应，待Te粉基本反应完全后(溶液为红色并且黑色粉末消失)，将①中的水全部加入，得到透明浅红色溶液，再将②中溶液全部加入，整个过程都进行N2保护；溶液全部加入后继续搅拌10min，撤去N2保护，将得到的混合溶液用50％的微波功率输出加热进行晶体生长反应；得到的产物加入等体积的异丙醇洗涤，并离心除去过量前体，最后将其再分散在200mL的纯净水中。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述金纳米粒子(AuNPs)的制备步骤如下：所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0.45μm的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0.45μm的微孔膜过滤，4℃保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述通过测定圆二色谱观察核酸适配体与啶虫脒的特异性结合作用的步骤如下：
在两个装有10mM NaCl和5mM MgCl2的10mM Tris缓冲液的离心管(1.5mL)中加入0.25μM啶虫脒的核酸适配体，再在其中一个离心管中加入0.5μM的啶虫脒，另一个离心管不加，测圆二色谱图。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述通过TEM和DLS测定观测核酸适配体对金纳米粒子的保护作用的步骤如下：
①样品制备
取四个2.0mL的离心管，编号为a,b,c,d，分别依次加入，a管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子)，b管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl)，c管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体)，d管(3×10-9mol·L-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体，0.5μM啶虫脒)；
②参数
将四种样品分别滴于四个铜网上，室温晾干，用JEM-2100F透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜；
用Nano ZS纳米粒度仪测定样品①的粒径分布。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的步骤如下：
56μL不同浓度的啶虫脒加入62μL1.6μM的核酸适配体，涡旋混合10min后加入266μL金纳米粒子(4.8×10-9mol·L-1)，继续涡旋混合8min后加入44μL500mM的NaCl，再次涡旋混合10min.最后加入100μL1.4×10-6mol·L-1的CdTe QDs，用荧光分光光度计进行检测。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述实际样品的检测是取白菜进行的：
取10g白菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤，提取和过滤重复两次，过滤液用10mL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL，在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的啶虫脒标准品，根据[(F-F0)/F0]与啶虫脒的浓度建立标准曲线，啶虫脒的检出限为0.192μg/kg，线性范围为1.2μg/kg-21.6μg/kg。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141001 |