CN103364379A - 一种利用金纳米粒子和碲化镉量子点的荧光内滤效应检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用金纳米粒子(AuNPs)和碲化镉(CdTe)量子点的荧光内滤效应检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的方法，其特征在于利用AuNPs对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药的残留量，包括以下步骤：CdTe量子点的合成和纯化；AuNPs的制备；通过测定荧光光谱图观察CdTe量子点与AuNPs的荧光内滤作用；通过测定荧光光谱图观察CdTe量子点、金纳米粒子、底物(ATI)和酶(AChE)体系的反应；运用AuNPs对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测氨基甲酸酯类农药。该方法可简单、快速、灵敏的检测有机磷农药中的甲胺磷，并且有很高的灵敏度，为以后的研究、生产、监管等提供了方便。

Description

一种利用金纳米粒子和碲化镉量子点的荧光内滤效应检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药的方法

技术领域

利用金纳米粒子和碲化镉量子点的荧光内滤效应检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的方法，属于分析化学技术领域。 

背景技术

氨基甲酸酯类农药主要用作农业杀虫剂。本类农药杀虫效果好，残效期较短，但对温血动物具有一定毒性，毒性与化学结构有关。多数属于中等毒和低毒，少数属于高毒类。氨基甲酸酯农药通式如下： 

氨基甲酸酯农药可以和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)活性中心丝氨酸上的羟基结合，抑制AChE的活性，使AChE失去对乙酰胆碱的水解能力，造成组织中乙酰胆碱的积聚，引起胆碱能受体活性紊乱，这会引起呼吸麻痹甚至死亡。 

氨基甲酸酯农药在工农业生产中广泛应用，但农药的长期大量使用所带来的农药残留问题却成为影响人类健康与环境安全的重大隐患。 

2002年5月20日，福建省宁德市蕉城区金涵乡发生一起27人食物中毒事件。经流行病学、临床调查及实验室检验结果，确认是空心菜上残留的氨基甲酸酯类农药“灭多威”所引起，2004年9月25日盘锦市某乡中学发生了一起集体食物中毒事件，疑似病人14人，该学校已将病人送往市级医院抢救，经流行病调查和理化检验，确认为氨基甲酸酯类农药中毒，2012年，长春市发生了两起果汁饮料食物中毒事件，经公安部门检验认定，这两起事件剩余饮料中均含有高毒性的氨基甲酸脂类杀虫剂。 

目前，氨基甲酸酯农药的检测手段主要包括液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等。尽管这些方法灵敏度高，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测食品中的氨基甲酸酯农药。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用CdTe量子点和AuNPs的双信号法快速检测氨基甲酸酯农药的方法，以快速、简单、灵敏的检测食品中氨基甲酸酯农药的残留量。 

技术问题：利用CdTe量子点和AuNPs的双信号法快速检测氨基甲酸酯农药的方法基于以下原理： 

荧光团在含有分散的AuNPs的存在下发射弱，这是由于AuNPs同时对激发光和发射光的强吸收。(2) 

正价的碘化乙酰硫代胆碱(ATI)被用作AChE的底物并且会通过静电作用吸附在负电价的AuNPs表面。(3) 

AChE催化乙酰硫代胆碱的水解产生硫代胆碱，它是正电价并且含有一个额外的巯基(-SH)。由于这一特性，硫代胆碱将替换柠檬酸更容易的连接在AuNPs的表面。结果由于静电引力和强Au-SH键使得金纳米粒子交联和聚集，导致AuNPs吸收率的降低。最后，IFE降低的荧光团的发射将会恢复。(4) 

氨基甲酸酯农药的存在能不可逆地抑制AChE的催化活性和AuNPs的团聚，同时发射光谱又会在一定程度上减低。(5) 

本发明的技术方案： 

包括以下步骤：CdTe量子点水溶液的合成和纯化；AuNPs的制备；分别对CdTe量子点，AuNPs、底物和酶体系进行透射电镜表征；CdTe量子点和AuNPs间相互作用的荧光光谱和吸收光谱研究；利用CdTe量子点和AuNPs的双信号法快速检测氨基甲酸酯农药。 

(1)CdTe量子点水溶液的合成和纯化 

首先称量0.0256g Te粉和0.0386g NaBH4加入到三口烧瓶中，用高纯水配制pH＝11的NaOH溶液100mL，向其中通入10min N₂，装于一恒压滴定漏斗①中，用高纯水配制浓度为4×10^-3mol/L的CdCl₂溶液100mL，加入67μL TGA，用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝11，向其中通入10min N₂，将得到的澄清透明溶液装于另一恒压滴定漏斗②中，将整个装置与真空、N₂系统连接起来，经历几次抽真空和通N₂的步骤除去体系中的O₂；略微加热，打开漏斗①，加入3～5滴水，电磁搅拌，引发反应，待Te粉基本反应完全后(溶液为红色并且黑色粉末消失)，将①中的水全部加入，得到透明浅红色溶液，再将②中溶液全部加入，整个过程都进行N₂保护；溶液全部加入后继续搅拌10min，撤去N₂保护，将得到的混合溶液用50％的微波功率输出加热进行晶体生长反应；得到的产物加入等体积的异丙醇洗涤，并离心除去过量前体，最后将其再分散在200mL的纯净水中。 

(2)金纳米粒子(AuNPs)的制备 

所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0.45μm的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0.45μm的微孔膜过滤，4℃保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm。 

(3)CdTe量子点和AuNPs间相互作用的荧光光谱和吸收光谱研究 

在六个离心管(2.0mL)中分别依次加入CdTe量子点1mL，13nmAuNPs(1，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0mL)，娃哈哈纯净水(0.72，0.82，0.92，1.02，1.12，1.22，1.32，1.42，1.52，1.62，1.72mL)，测荧光光谱图。 

(4)检测灭多威所用体系的制备： 

向若干试管中(5mL)同时加入1mL AuNPs(制备后稀释一倍)，0.2mL ATI(10μM)，再依次加入不同浓度的灭多威溶液标准品，随即加入20μLAChE(1000mU/mL)，最后依次加入1mL CdTe量子点(制备后稀释10倍)。分别记录体系的紫外可见吸收光谱与荧光光谱，并且根据CdTe量子点的(F₀-F)/F₀建立灭多威的校准曲线，其中F₀等于F_{(CdTe-AuNPs-ATI-AChE)555}。 

所用灭多威标准品浓度依次为：0，0.017，0.083，0.17，0.33，0.5μg/mL。本发明中，灭多威的检出限为0.011μg/mL，线性范围为0.016～0.5μg/mL。 

(5)实际样品检测：取卷心菜进行实际样品检测。 

取10g卷心菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次，过滤液用10mL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL。在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的灭多威标准品。 

本发明的有益效果：本发明制备了CdTe量子点和AuNPs，并建立了一个可简单、快速、灵敏的的双信号法，能够快速检测食品中氨基甲酸酯农药，为今后的监管提供了方便。 

附图说明

图1透射电镜图：(A)金纳米粒子；(B)含有碘化乙酰硫代胆碱(10μM，pH8.0PBS)和乙酰胆碱酯酶(500mU/mL)的金纳米粒子；A中插图为标尺为20nm时金纳米粒子的透射电镜图。 

图2不同体系的荧光光谱图：(a)CdTe QDs，(b)CdTe-AuNPs，(c)CdTe-AuNPs-ATI-AChE，(d)CdTe-AuNPs-ATI-AChE-methomyl.AuNPs，3.4×10^-9mol/L；CdTe QDs，8.09×10^-7mol/L；ATI，10μM；AChE，1000mU/mL；methomyl，1.8μg/mL.λex＝400nm 

图3(A)含有不同浓度的灭多威(0，0.017，0.083，0.17，0.33，0.5μg/mL)的CdTe-AuNPs-ATI-AChE体系的荧光光谱图.(B)灭多威的标准曲线图.以CdTe-AuNPs-ATI-AChE体系为参照. 

图4样品的加标回收率。 

具体实施方式

CdTe量子点的合成和纯化 

材料/试剂：Te粉，NaBH4和TGA购置于国药试剂 

方法：首先称量0.0256gTe粉和0.0386gNaBH4加入到三口烧瓶中，用高纯水配制pH＝11的NaOH溶液100mL，向其中通入10min N2，装于一恒压滴定漏斗①中，用高纯水配制浓度为4×10-3mol/L的CdCl2溶液100mL，加入67μL TGA，用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝11，向其中通入10min N2，将得到的澄清透明溶液装于另一恒压滴定漏斗②中，将整个装置与真空、N2系统连接起来，经历几次抽真空和通N2的步骤除去体系中的O2；略微加热，打开漏斗①，加入3～5滴水，电磁搅拌，引发反应，待Te粉基本反应完全后(溶液为红色并且黑色粉末消失)，将①中的水全部加入，得到透明浅红色溶液，再将②中溶液全部加入，整个过程都进行N2保护；溶液全部加入后继续搅拌10min，撤去N2保护，将得到的混合溶液用50％的微波功率输出加热进行晶体生长反应；得到的产物加入等体积的异丙醇洗涤，并离心除去过量前体，最后将其再分散在200mL的纯净水中。 

结果：CdTe量子点的荧光光谱在530nm处有最大峰，这与文献报道相一致。 

金纳米粒子AuNPs的制备 

材料/试剂：氯金酸和柠檬酸三钠购自北京化工厂。 

方法：所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0.45μm的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0.45μm的微孔膜过滤，4℃保藏。 

结果：经透射电镜表征，所制得的金纳米粒子粒径为13nm，且分散性良好，粒径均匀。 

由于CdTe量子点与金纳米粒子的浓度比会影响金纳米粒子对CdTe量子点的荧光猝灭，所以需要研究反应体系中CdTe量子点与金纳米粒子的浓度比。 

材料/试剂：CdTe量子点；13nm的金纳米粒子 

方法：在六个离心管(2.0mL)中分别依次加入CdTe量子点1mL，13nmAuNPs(1，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0mL)，娃哈哈纯净水(0.72，0.82，0.92，1.02，1.12，1.22，1.32，1.42，1.52，1.62，1.72mL)，测荧光光谱图。 

结果：金纳米粒子对CdTe量子点荧光强度的抑制作用随量的增大而增强，所以实验选取金纳米粒子的加入量为1mL。 

由于实验所用的体系受到酶浓度和反应时间的影响，所以需要研究反应体系酶浓度和反应时间变化的影响。 

材料/试剂：CdTe量子点；13nm的金纳米粒子；碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶(500U/mg)购自Sigma-Aldrich。 

方法：在四个试管(2.0mL)中分别依次加入CdTe量子点1mL，13nm的金纳米粒子1mL，娃哈哈纯净水0.5mL，含有20μM碘化乙酰硫代胆碱的磷酸盐缓冲液(PBS，10mM，pH＝8.0)200μL，再依次加入不同浓度的AChE(200，400，600，800，1000，1200，1500mU/mL)20μL，然后将混合物在25℃下培养5min，测荧光吸收光谱。 

结果：结果表明，最适酶浓为1000mU。 

该方法用于灭多威检测 

材料/试剂：CdTe量子点；13nm的金纳米粒子；碘化乙酰硫代胆碱，乙酰胆碱酯酶(500U/mg)和灭多威标准品购自Sigma-Aldrich；有机蔬菜购自于当地超市。 

方法： 

(1)金纳米粒子对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测氨基甲酸酯农药：向制备好的检测灭多威的体系中分别加入不同浓度的灭多威溶液标准品，再迅速加1000mU的AChE20μL，由于灭多威抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得金纳米粒子团聚的程度不同，即由红色变为灰色的程度不同。 

(2)所用灭多威标准品浓度依次为：0，0.017，0.083，0.17，0.33，0.5μg/mL，添加到金纳米粒子体系中，并对金纳米粒子的特征等离子共振峰进行测定。 

(3)实际样品检测：取卷心菜进行实际样品检测。 

取10g卷心菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次，过滤液用10mL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL。在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的灭多威标准品。 

结果：根据(F₀-F)/F₀与灭多威的浓度建立标准曲线，其中F₀等于F_{(CdTe-AuNPs-ATI-AChE)555}，灭多威的检出限为0.011μg/mL，线性范围为0.016～0.5μg/mL。 

Claims (7)

1.一种利用金纳米粒子(AuNPs)和碲化镉(CdTe)量子点的荧光内滤效应检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的方法，其特征在于利用AuNPs对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药的残留量，包括以下步骤：CdTe量子点的合成和纯化；AuNPs的制备；通过测定荧光光谱图观察CdTe量子点与AuNPs的荧光内滤作用；通过测定荧光光谱图观察CdTe量子点、金纳米粒子、底物(ATI)和酶(AChE)体系的反应；运用AuNPs对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测氨基甲酸酯类农药并进行实际样品的检测。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述CdTe量子点的制备步骤如下：

首先称量0.0256g Te粉和0.0386g NaBH4加入到三口烧瓶中，用高纯水配制pH＝11的NaOH溶液100mL，向其中通入10min N₂，装于一恒压滴定漏斗①中，用高纯水配制浓度为4×10^-3mol/L的CdCl₂溶液100mL，加入67μL TGA，用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝11，向其中通入10min N₂，将得到的澄清透明溶液装于另一恒压滴定漏斗②中，将整个装置与真空、N₂系统连接起来，经历几次抽真空和通N₂的步骤除去体系中的O₂；略微加热，打开漏斗①，加入3～5滴水，电磁搅拌，引发反应，待Te粉基本反应完全后(溶液为红色并且黑色粉末消失)，将①中的水全部加入，得到透明浅红色溶液，再将②中溶液全部加入，整个过程都进行N₂保护；溶液全部加入后继续搅拌10min，撤去N₂保护，将得到的混合溶液用50％的微波功率输出加热进行晶体生长反应；得到的产物加入等体积的异丙醇洗涤，并离心除去过量前体，最后将其再分散在200mL的纯净水中。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述AuNPs的制备和透射电镜表征步骤如下：

所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0.45μm的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0.45μm的微孔膜过滤，4℃保藏，所制得的AuNPs粒径为13nm。

①样品制备

吸取13nm AuNPs180μL，娃哈哈纯净水720μL，含有15μM碘化乙酰硫代胆碱(ATI)的PBS(10mM，pH＝8.0)100μL，500mU/mL的乙酰胆碱酯酶10μL于2mL离心管中，作为对照，另一离心管中不加底物和乙酰胆碱酯酶，在25℃下同时培养10min；将两种样品分别滴于两个铜网上，室温晾干备用。

②参数

用TECNAI F20透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述通过测定荧光吸收光谱观察CdTe量子点与AuNPs的荧光内滤作用的步骤如下：

在六个离心管(2.0mL)中分别依次加入CdTe量子点1mL，13nm AuNPs(1，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0mL)，娃哈哈纯净水(0.72，0.82，0.92，1.02，1.12，1.22，1.32，1.42，1.52，1.62，1.72mL)，测荧光光谱图。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述通过测定荧光光谱图观察CdTe量子点、金纳米粒子、底物和酶体系的反应的步骤如下：

在四个试管(2.0mL)中分别依次加入CdTe量子点1mL，13nm的AuNPs1mL，娃哈哈纯净水0.5mL，含有20μM碘化乙酰硫代胆碱的磷酸盐缓冲液(PBS，10mM，pH＝8.0)200μL，再依次加入不同浓度的AChE(200，400，600，800，1000，1200，1500mU/mL)20μL，然后将混合物在25℃下培养5min，测荧光吸收光谱。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述AuNPs对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测氨基甲酸酯类农药的步骤如下：

以灭多威为氨基甲酸酯类农药的代表用该方法检测：

向含有1mL 13nmAuNPs，200μL 20μM碘化乙酰硫代胆碱的PBS(10mM，pH＝8.0)的体系中，分别加入不同浓度的灭多威溶液标准品和0.5mL 1000mU/mL的乙酰胆碱酯酶，最后加1mL CdTe量子点，CdTe量子点荧光强度抑制程度将随着农药浓度的不同而不同；

根据(F₀-F)/F₀与灭多威的浓度建立标准曲线，其中F₀等于F_{(CdTe-AuNPs-ATI-AChE)555}，灭多威的检出限为0.011μg/mL，线性范围为0.016～0.5μg/mL。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述实际样品的检测是取卷心菜为蔬菜的代表进行的。

取10g卷心菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤。提取和过滤重复两次，过滤液用10mL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL。在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的灭多威标准品。

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