CN113970536A - 一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法，包括设置待检测基质的氨基甲酸酯类标准添加浓度；涡旋静置后加超声辅助提取0.5‑1h；在所述待检测基质溶液按质量比1:3:1加入无水硫酸镁和氯化钠，涡旋1min后离心5min取离心后的上清液按照质量比10：1：0.2加入无水硫酸镁和PSA，将离心后溶液和20％甲醇溶液按照体积比1：1混合得到复溶液；取所述复溶液按照体积比10：1加入固定化酶溶液按照10:1混合后涡旋振荡，静置反应后按照混合液11：10IDA溶液反应3min，磁场分离后取上清液检测荧光。本发明利用磁性介孔二氧化硅纳米粒子作为载体共价偶联固定乙酰胆碱酯酶，改善了蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测的准确度。

Description

一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法
技术领域
本发明属于农药检测技术领域，具体的，涉及一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法。
背景技术
农药在保护农作物免受病、虫、害伤害的同时，也会在食物链中残留和富集，对生态环境、食品安全和人类健康造成危害。克百威、灭多威、异丙威等氨基甲酸酯类农药，常被用于杀灭蔬菜中的害虫，这类农药的作用机理是通过抑制害虫体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)，阻碍了乙酰胆碱的水解，导致乙酰胆碱积累并不断刺激神经突触，引发昆虫的神经毒性症状，造成昆虫的死亡。但是人体内也同样具有乙酰胆碱酯酶这一氨基甲酸酯类农药的靶点，因此，其超量和超范围使用，会对消费者的身体健康造成很大的风险。
我国现有的高毒农药快速检测主流方法国家标准是《GB/T 5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》，方法原理为乙酰胆碱酯酶抑制法，即利用农药对乙酰胆碱酯酶催化显色反应的抑制作用，快速定性和定量分析蔬菜样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药。但该标准方法中存在一些问题，特别是在样品前处理时，只能使用水相缓冲液，以避免有机溶剂对后续试验中用到的胆碱酯酶造成不可逆的伤害。但是，氨基甲酸酯类农药多为脂溶性较强，水溶性较差。采用上述提取溶剂，很难保证蔬菜中氨基甲酸酯类农药的提取效率，进而造成农药残留检测结果误差较大。
因此，迫切需要对蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测的前处理方法进行创新，以克服样本前处理中引起的提取效率问题，改善检测方法的准确性。
发明内容
本发明提供一种操作简单、改善检测方法的准确性的用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法。
本发明包括以下步骤：
A设置待检测基质的氨基甲酸酯类标准添加浓度；
B将待检测基质溶液添加后涡旋静置2小时，之后加入5mL甲醇涡旋1min，超声辅助提取0.5-1h；
C在所述待检测基质溶液按质量比1:3:1加入无水硫酸镁和氯化钠，涡旋1min后离心5min取离心后的上清液按照质量比10：1：0.2加入无水硫酸镁和PSA，涡旋振荡1min后离心，将离心后溶液和20％甲醇溶液按照体积比1：1混合得到复溶液；
D取所述复溶液按照体积比10：1加入固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE溶液按照10:1混合后涡旋振荡，静置反应20-49min后按照混合液11：10IDA溶液反应3min，磁场分离后取上清液检测荧光。
进一步地，所述氨基甲酸酯类标准添加浓度包括克百威：10、20、50ppb；灭多威：100、200、500ppb；异丙威：200、500、800ppb；甲萘威：500、1000、2000ppb。
进一步地，，在步骤C中所述离心速度为9000rpm。
进一步地，所述固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE的制备方法包括
磁性纳米颗粒(Fe3O4)采用化学共沉淀法制备：FeSO4·7H2O(3.02g)和FeCl3(3.10g)溶于100ml双蒸馏水(ddH2O)，摩尔浓度之和为0.3mol·L-1.然后加入10mL(28wt％)氨水，45℃剧烈搅拌30min,80℃加热1h。磁性Fe3O4用磁体收集纳米颗粒，用ddH2O和乙醇洗涤3-4次，真空(60℃)干燥10h。
制备Fe3O4@SiO2@mSiO2：
Fe3O4@SiO2通过溶胶-凝胶法制备微球:在三颈圆底烧瓶中，加入1.0g上述制备的磁性Fe3O4纳米颗粒，加入200mL乙醇和25mL ddH2O。将混合物置于水浴中超声处理，使磁芯均匀分散。然后在温和机械搅拌(30℃)下加入4mL(25％～28％)氨水30min，再加入3.0mL正硅酸乙酯(TEOS)，机械连续搅拌20h。在那之后，Fe3O4@SiO2收集微球，用乙醇和去离子水反复洗涤。
其次,Fe3O4@SiO2@mSiO2微球的制备方法如下。在Fe3O4@SiO2上生长MSN外壳：Fe3O4@SiO2微球(0.20g)作为种子，再分散在含CTAB(0.30g)、ddH2O的混合溶液中(70mL)，乙醇(30mL)，氨水(1.0mL,28wt％)。所得混合物超声搅拌10min，然后机械搅拌15min，形成均匀的分散体。随后，在连续搅拌下，在2分钟内滴加2.2mL TEOS到分散体中。45℃搅拌10h后用磁体收集，用乙醇和去离子水反复洗涤。最后，提纯Fe3O4@SiO2@mSiO2，将微球分散在100ml丙酮中，搅拌，60℃回流24h，去除CTAB模板。
制备Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2
使Fe3O4@SiO2@mSiO2微球氨基化：0.10gFe3O4@SiO2@mSiO2将微球溶解在100mL有机溶剂(乙醇、甲苯或异丙醇)中，超声处理10min。随后，将0.40mL APTES加入混合物中，在70℃下机械搅拌6h，以提高氨基化微球的稳定性。用磁铁收集氨基化微球(Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2)，用乙醇和去离子水反复洗涤。最后，提纯Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2将微球储存在乙醇溶液中，以避免APTES的解离。
乙酰胆碱酯酶(AChE)固定
将不同浓度(3％、4％、5％(v/v))的戊二醛(20mL)与载体(100mg)磁力搅拌30、60、90、120、150、180min。反应结束后用乙醇和ddH2O洗涤载体表面的GA数次。然后，将活化的微球重悬于4mL 40mM磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.5)中。加入1mL乙酰胆碱酯酶(500μg·mL)-1)，在4℃振荡过夜。最终，固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE经磁选回收，用PBS(40mM,pH 7.5)洗涤两次，去除未结合的乙酰胆碱酯酶，得到所述固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE。
本发明的有益效果为：
本发明利用磁性介孔二氧化硅纳米粒子作为载体共价偶联固定乙酰胆碱酯酶，并包覆在酶表面，形成保护层，从而提高了酯酶有机溶剂的耐受性，使前处理过程中的氨基甲酸酯类农药的回收率大大提升，改善了蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测的准确度。
附图说明
图1为本发明实施例的氨基甲酸酯类农药检测效果图；
其中克百威检测校正曲线；b.灭多威检测校正曲线；c.异丙威检测校正曲线；d.甲萘威检测校正曲线
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
在本实施例子中包括以下步骤：
1.磁性纳米颗粒(Fe3O4)采用化学共沉淀法制备：FeSO4·7H2O(3.02g)和FeCl3(3.10g)溶于100ml双蒸馏水(ddH2O)，摩尔浓度之和为0.3mol·L-1.然后加入10mL(28wt％)氨水，45℃剧烈搅拌30min,80℃加热1h。磁性Fe3O4用磁体收集纳米颗粒，用ddH2O和乙醇洗涤3-4次，真空(60℃)干燥10h。
2.制备Fe3O4@SiO2@mSiO2：首先是磁性Fe3O4纳米粒子被包覆上一层致密的二氧化硅层，以防止磁芯在酸性环境下浸出。Fe3O4@SiO2通过溶胶-凝胶法制备微球:在三颈圆底烧瓶中，加入1.0g上述制备的磁性Fe3O4纳米颗粒，加入200mL乙醇和25mL ddH2O。将混合物置于水浴中超声处理，使磁芯均匀分散。然后在温和机械搅拌(30℃)下加入4mL(25％～28％)氨水30min，再加入3.0mL正硅酸乙酯(TEOS)，机械连续搅拌20h。在那之后，Fe3O4@SiO2收集微球，用乙醇和去离子水反复洗涤。
其次,Fe3O4@SiO2@mSiO2微球的制备方法如下。在Fe3O4@SiO2上生长MSN外壳：Fe3O4@SiO2微球(0.20g)作为种子，再分散在含CTAB(0.30g)、ddH2O的混合溶液中(70mL)，乙醇(30mL)，氨水(1.0mL,28wt％)。所得混合物超声搅拌10min，然后机械搅拌15min，形成均匀的分散体。随后，在连续搅拌下，在2分钟内滴加2.2mL TEOS到分散体中。45℃搅拌10h后用磁体收集，用乙醇和去离子水反复洗涤。最后，提纯Fe3O4@SiO2@mSiO2，将微球分散在100ml丙酮中，搅拌，60℃回流24h，去除CTAB模板。
制备Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2
使Fe3O4@SiO2@mSiO2微球氨基化：0.10gFe3O4@SiO2@mSiO2将微球溶解在100mL有机溶剂(乙醇、甲苯或异丙醇)中，超声处理10min。随后，将0.40mL APTES加入混合物中，在70℃下机械搅拌6h，以提高氨基化微球的稳定性。用磁铁收集氨基化微球(Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2)，用乙醇和去离子水反复洗涤。最后，提纯Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2将微球储存在乙醇溶液中，以避免APTES的解离。
乙酰胆碱酯酶(AChE)固定
乙酰胆碱酯酶(AChE)可固定在活化的Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2微球上：首先，采用双功能交联剂戊二醛(GA)对载体进行活化。将不同浓度(3％、4％、5％(v/v))的戊二醛(20mL)与载体(100mg)磁力搅拌30、60、90、120、150、180min。反应结束后用乙醇和ddH2O洗涤载体表面的GA数次。然后，将活化的微球重悬于4mL 40mM磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.5)中。加入1mL乙酰胆碱酯酶(500μg·mL)-1)，在4℃振荡过夜。最终，固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE经磁选回收，用PBS(40mM,pH 7.5)洗涤两次，去除未结合的乙酰胆碱酯酶。最后,Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE用5mL PBS(40mM,pH 7.5)重新溶解，4℃保存备用。
检测流程
实施例：1
在待检测基质分别设置不同的添加标准浓度，
所述标准浓度为克百威：10、20、50ppb；灭多威：100、200、500ppb；
异丙威：200、500、800ppb；甲萘威：500、1000、2000ppb。
克百威：10、20、50ppb；灭多威：100、200、500ppb；异丙威：200、500、800ppb；甲萘威：500、1000、2000ppb。
1.基质中氨基甲酸酯类农药提取步骤：
5g(±0.01g)黄瓜和5g(±0.01g)上海青基质分别设置不同的添加浓度，具体如下：
克百威：10、20、50ppb；灭多威：100、200、500ppb；异丙威：200、500、800ppb；甲萘威：500、1000、2000ppb。
完成基质添加后涡旋静置2小时，之后加入5mL甲醇涡旋1min，超声辅助提取半小时。加入3g无水硫酸镁和1g氯化钠，涡旋1min后离心(9000rpm，5min)。
取离心后的上清液3mL加入无水硫酸镁0.3g，PSA 0.06g，涡旋振荡1min后离心(9000rpm，5min)。最后取2.5mL离心后溶液氮吹近干，加入2.5mL 20％甲醇溶液复溶。
2.农药检测步骤：
取100μL复溶液加入10μL固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE溶液涡旋振荡，静置反应20min后加入100μL IDA溶液(0.3mM)反应3min，磁铁吸附96孔板后取上清液150μL检测荧光。
在常规方法是加入pH7.5的PBS缓冲液作为提取液，加入游离AChE，以及硫代乙酰胆碱作为底物，DTNB作为显色剂，进行检测，这样就是一边进行着催化显色反应一边检测，导致反应系统稳定性较差。而本专利通过磁吸附，使酶和显色液脱离，取出后的显色液荧光强度不再变化，稳定性更强
表1游离乙酰胆碱酯酶和固定乙酰胆碱酯酶(本方法)检测氨基甲酸酯类农药效果
Figure BDA0003344973570000081
Figure BDA0003344973570000091
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法，其特征在于:
包括以下步骤：
A设置待检测基质的氨基甲酸酯类标准添加浓度；
B将待检测基质溶液添加后涡旋静置2小时，之后加入5mL甲醇涡旋1min，超声辅助提取0.5-1h；
C在所述待检测基质溶液按质量比1:3:1加入无水硫酸镁和氯化钠，涡旋1min后离心5min取离心后的上清液按照质量比10：1：0.2加入无水硫酸镁和PSA，涡旋振荡1min后离心，将离心后溶液和20％甲醇溶液按照体积比1：1混合得到复溶液；
D取所述复溶液按照体积比10：1加入固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE溶液按照10:1混合后涡旋振荡，静置反应20-49min后按照混合液11：10IDA溶液反应3min，磁场分离后取上清液检测荧光。
2.根据权利要求1所述一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法，其特征在于，所述氨基甲酸酯类标准添加浓度包括克百威：10、20、50ppb；灭多威：100、200、500ppb；异丙威：200、500、800ppb；甲萘威：500、1000、2000ppb。
3.根据权利要求1所述一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法，其特征在于，在步骤C中所述离心速度为9000rpm。
4.根据权利要求1所述一种用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药快速检测方法，其特征在于，所述固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE的制备方法包括
磁性纳米颗粒(Fe3O4)采用化学共沉淀法制备：FeSO4·7H2O(3.02g)和FeCl3(3.10g)溶于100ml双蒸馏水(ddH2O)，摩尔浓度之和为0.3mol·L-1.然后加入10mL(28wt％)氨水，45℃剧烈搅拌30min,80℃加热1h。磁性Fe3O4用磁体收集纳米颗粒，用ddH2O和乙醇洗涤3-4次，真空(60℃)干燥10h。
制备Fe3O4@SiO2@mSiO2：
Fe3O4@SiO2通过溶胶-凝胶法制备微球:在三颈圆底烧瓶中，加入1.0g上述制备的磁性Fe3O4纳米颗粒，加入200mL乙醇和25mL ddH2O。将混合物置于水浴中超声处理，使磁芯均匀分散。然后在温和机械搅拌(30℃)下加入4mL(25％～28％)氨水30min，再加入3.0mL正硅酸乙酯(TEOS)，机械连续搅拌20h。在那之后，Fe3O4@SiO2收集微球，用乙醇和去离子水反复洗涤。
其次,Fe3O4@SiO2@mSiO2微球的制备方法如下。在Fe3O4@SiO2上生长MSN外壳：Fe3O4@SiO2微球(0.20g)作为种子，再分散在含CTAB(0.30g)、ddH2O的混合溶液中(70mL)，乙醇(30mL)，氨水(1.0mL,28wt％)。所得混合物超声搅拌10min，然后机械搅拌15min，形成均匀的分散体。随后，在连续搅拌下，在2分钟内滴加2.2mL TEOS到分散体中。45℃搅拌10h后用磁体收集，用乙醇和去离子水反复洗涤。最后，提纯Fe3O4@SiO2@mSiO2，将微球分散在100ml丙酮中，搅拌，60℃回流24h，去除CTAB模板。
制备Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2
使Fe3O4@SiO2@mSiO2微球氨基化：0.10gFe3O4@SiO2@mSiO2将微球溶解在100mL有机溶剂(乙醇、甲苯或异丙醇)中，超声处理10min。随后，将0.40mL APTES加入混合物中，在70℃下机械搅拌6h，以提高氨基化微球的稳定性。用磁铁收集氨基化微球(Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2)，用乙醇和去离子水反复洗涤。最后，提纯Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2将微球储存在乙醇溶液中，以避免APTES的解离。
乙酰胆碱酯酶(AChE)固定
将不同浓度(3％、4％、5％(v/v))的戊二醛(20mL)与载体(100mg)磁力搅拌30、60、90、120、150、180min。反应结束后用乙醇和ddH2O洗涤载体表面的GA数次。然后，将活化的微球重悬于4mL 40mM磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.5)中。加入1mL乙酰胆碱酯酶(500μg·mL)-1)，在4℃振荡过夜。最终，固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE经磁选回收，用PBS(40mM,pH7.5)洗涤两次，去除未结合的乙酰胆碱酯酶，得到所述固定化酶Fe3O4@SiO2@mSiO2-AChE。
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