CN108956572B - 一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法 - Google Patents

一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法，利用氯霉素对于锰掺杂的硫化锌量子点的內滤效应——加入不同浓度氯霉素后，该量子点一定波长的激发光被氯霉素不同程度的吸收，表现出磷光信号减弱，进而实现对蜂蜜中氯霉素的检测；具体包括在pH值8‑11的PBS溶液中配制浓度0.05‑0.5mg/ml的L‑半胱氨酸作为稳定剂的锰掺杂硫化锌量子溶液；采用荧光/磷光分光光度计的磷光模式对多种不同浓度的氯霉素的量子点溶液进行测定，生成氯霉素的标准曲线图；对蜂蜜样品进行简单前处理后进行检测，将检测结果代入标准曲线计算被测蜂蜜样品中氯霉素含量。该方法用于蜂蜜中氯霉素的检测方法，步骤简单，易操作，灵敏度高，成本低，利于推广。

Description

一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法。
背景技术
蜂蜜中的氯霉素是由于养蜂过程中为防治蜂病使用氯霉素而造成的残留。氯霉素是一种有效的广谱抗菌药物，对主要的病原菌如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，以及其他微生物都具有较好的抑制效果。氯霉素于1947年从Streptomyces venezuelae中分离出来，被广泛用于治疗人和动物的感染性疾病，其作用原理是通过与原核细胞中50S核糖体亚基结合而发挥作用，从而抑制了蛋白质的合成。氯霉素会导致人体再生障碍性贫血，并具有基因毒性，因此氯霉素的使用在许多国家受到限制，在日本、欧盟和美国被完全禁止用于生产食品的动物[Kikuchi H,Sakai T,Teshima R,Nemoto S,Akiyama H(2017).Totaldetermination of chloramphenicol residues in foods by liquid chromatography-tandem mass spectrometry Food]。我国的动物性食品中不得检出氯霉素(检出限为0.1ppb)[蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法,GB/T 18932.19-2003.]。
氯霉素是蜂蜜食品安全的高风险因素，我国每年均有蜂蜜中氯霉素指标不符合要求的报道，对我国蜂蜜产业的发展产生了较大的影响。但由于传统的检测方法仪器设备复杂，成本高，操作技术难度大，耗时等问题致使大多数蜂蜜企业无力承担，因此蜂蜜企业对于蜂蜜中氯霉素的监测普遍存在不到位的情况，为蜂蜜的安全问题埋下了隐患。氯霉素的快速检测技术开发是近年来研究的热点问题，与传统的液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法等方法相比，快速检测方法具有操作简便，灵敏度高，成本低廉等特点，纳米材料、电化学、生物传感器、酶联免疫吸附法等快速检测方法用于蜂蜜中氯霉素的检测。目前，酶联免疫吸附法(ELISA)已经商业化应用，其原理是利用抗原与抗体的特异性免疫反应，酶标记物与样品中的氯霉素竞争与抗体反应，样品中氯霉素越多，相对地就会竞争反应越多的酶标记物，使得能结合上抗体的酶标记物相对地减少，用底物显色，样品中的氯霉素含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出氯霉素含量。酶联免疫吸附法虽然简便，但成本依然较高，且酶标记物、抗体等试剂需特殊条件保存，因此其推广应用也受到一定的限制。生物传感器也被用于蜂蜜中氯霉素的检测，比如核酸适配体介导的比色法用于蜂蜜中氯霉素的快速、高灵敏检测[Yan C,Zhang J,Yao L,Xue F,Lu J,Li B,Chen W(2018).Aptamer-mediated colorimetric method for rapid and sensitive detection ofchloramphenicol in food Food chemistry 260,208-212.]，但类似快速检测方法所有试剂种类较多，操作过程繁琐，且大多处于研究试验阶段。纳米材料大多具有特殊的光学性质，广泛用于食品安全检测，锰掺杂硫化锌量子点属于半导体纳米材料，本发明利用锰掺杂硫化锌量子点的常温磷光性质发明了一种简便、灵敏、实用的蜂蜜中氯霉素的检测方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素检测方法，本方法检测操作简便、快速高效、灵敏度高、成本低廉。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法，包括L-半胱氨酸作为稳定剂的锰掺杂硫化锌量子点(L-Cys-Mn:ZnS QDs)的合成与纯化，检测体系溶液配制，磷光信号检测条件选择，标准曲线绘制，蜂蜜样品前处理，检测操作过程及计算。且
L-Cys-Mn:ZnS QDs的合成与纯化：在100ml圆底烧瓶内，加入50ml 0.03M L-半胱氨酸(L-cys)溶液和5ml 0.1M ZnSO4溶液，用2M NaOH调节溶液pH值至11，室温下氮气保护剧烈揽拌1h，以保证L-cys稳定剂与Zn2+充分络合。然后用注射器往入1.4ml 0.01M氮气饱和的MnCl2溶液，反应30min后再用注射器注入5.5ml 0.1M氮气饱和Na2S溶液，继续反应30min。将得到的量子点溶液在空气中50℃陈化2.5h以上，即可制得L-Cys-Mn:ZnS QDs水溶液。陈化得到溶液用等体积无水己醇沉降，离心后得到的沉淀用无水乙醇反复清洗3次，并置于真空干燥箱干燥，获得高度水溶性的L-Cys-Mn:ZnS QDs固体粉末，备用。
检测体系溶液配制：在pH值为8至11的磷酸缓冲溶液(PBS)中加入终浓度为0.05-0.5mg/ml的L-Cys-Mn:ZnS QDs，并使其均匀分散；
磷光信号检测条件：室温下，将荧光光谱仪调至磷光模式，激发波长设置为280-300nm，激发和发射狭缝宽度分别为5-10nm和10-20nm，扫描速度为1000nm/min；
标准曲线绘制：制备多种不同浓度的氯霉素标准溶液，生成氯霉素的标准曲线图，标准溶液浓度分别为25ng/ml、500ng/ml、2μg/ml、4μg/ml、15μg/ml、60μg/ml、120μg/ml。
蜂蜜样品前处理：取≥10g待测蜂蜜，用2倍以上蜂蜜体积的PBS稀释，充分混合后，加入与PBS等体积的乙酸乙酯，超声萃取后4000r/min离心10min，取部分上层有机相(≤90％)用高纯氮气吹干得固体残渣，备用；
检测操作过程及计算：用配置好的L-Cys-Mn:ZnS QDs检测体系将蜂蜜提取的固体残渣超声充分溶解，并在10min内进行L-Cys-Mn:ZnS QDs的磷光信号检测，检测结果与标准曲线进行对比,通过计算确定被测样品中的氯霉素含量。
在L-Cys-Mn:ZnS QDs的合成中，根据参考文献50℃陈化时间为2h，但本发明人在研发过程中发现，在陈化时间超过2.5h时所合成的材料才出现较明显磷光，在陈化时间达到4h时出现较强磷光，因此本发明将陈化时间确定为2.5h以上。
研发过程中发现，在L-Cys-Mn:ZnS QDs检测体系溶液配制过程中，所用PBS的pH对量子点的磷光强度有较大影响，经过实验，当PBS的pH在8-11范围内，L-Cys-Mn:ZnS QDs的磷光强度较大，有利于提高本检测体系的灵敏度。
由于氯霉素的紫外最大吸收波长为292nm，L-Cys-Mn:ZnS QDs的磷光最佳激发波长为289nm，研发过程中发现激发波长在280-300nm区间均能表现出较好內滤效应，因此将磷光信号检测条件中的激发波长范围确定为280-300nm。
在蜂蜜样品前处理过程中，由于蜂蜜成分的复杂性，萃取完成后在有机相与水相间存在一定量的絮状物质，为避免其对分离有机相时造成干扰，取≤90％的有机相用于后续处理和检测，可提高准确性。在计算检测结果时按所取有机相比例换算即可。
根据氯霉素的标准曲线图，确定线性方程及线性相关系数，以信噪比等于3时对应的浓度为检出限，经计算，本发明L-Cys-Mn:ZnS QDs检测体系的检出限为0.81ng/ml,未达到0.1μg/kg(《蜂蜜中氮霉素残留的测定方法液相色谱一串联质谱法》(GB/T 18932.19-2003))的检出限的要求，因此，在蜂蜜样品前处理过程中称取蜂蜜的质量确定为≥10g,以确保蜂蜜样品中低于0.1μg/kg时被检出。
根据荧光/磷光分光光度计的原理，相同浓度的L-Cys-Mn:ZnS QDs在检测磷光信号时，信号强度在一定程度上随着激发狭缝宽度的增大而降低，随着发射狭缝宽度的增大而增大，因此，为保证本发明方法的灵敏度和准确性，在实际检测时激发和发射狭缝宽度应在5-10nm和10-20nm的范围内选择适当组合，以实现较高的灵敏度。
本发明利用了锰掺杂硫化锌量子点的磷光性质，通过内滤效应实现了对蜂蜜中氯霉素精确定量，所用设备更简单，操作过程更简便，检测成本更低，试剂携带保存不需要特殊条件，与现有其他方法相比更具有推广性。
附图说明
以下附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。图1是L-Cys-Mn:ZnS QDs激发光谱图和氯霉素(CPA)紫外吸收光谱图，从图中可以看出氯霉素的最大紫外吸收波长与L-Cys-Mn:ZnS QDs的激发波长非常接近，这是本发明运用磷光信号变化进行检测的机理——內滤效应。
图2是L-Cys-Mn:ZnS QDs激发光谱图和发射光谱图，发射和激发波长分别为289nm和583nm。
图3是氯霉素的标准曲线图，其横坐标表示氯霉素的浓度，单位为纳克/毫升(ng/ml),纵坐标表示空白L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液的磷光信号强度(P0)与含一定浓度氯霉素的L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液的磷光信号强度(P)比值的自然对数(ln(P0/P))。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。下面将结合具体实例对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。
在本发明中，样品包括各花种蜂蜜样品或混合花种蜂蜜样品，以下实施例采用的是混合花种蜂蜜样品，但本领域技术人员可以理解，也可以在采用其他样品。
一、本发明一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法，各步骤的参数如表1所示：
表1本发明实施例和对比例参数
Figure BDA0001745906990000071
现以表1中的实施例一举例，具体说明本发明一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法，其操作步骤为：
1.L-半胱氨酸作为稳定剂的锰掺杂硫化锌量子点(L-Cys-Mn:ZnS QDs)的合成与纯化：在100ml圆底烧瓶内，加入50ml 0.03M L-半胱氨酸(L-cys)溶液和5ml 0.1M ZnSO4溶液，用2M NaOH调节溶液pH值至11，室温下氮气保护剧烈揽拌1h，以保证L-cys稳定剂和Zn2+充分络合。然后用注射器往入1.4ml 0.01M氮气饱和的MnCl2溶液，反应30min后再用注射器注入5.5ml 0.1M氮气饱和Na2S溶液，继续反应30min。将得到的量子点溶液在空气中50℃陈化4h，即可制得L-Cys-Mn:ZnS QDs水溶液。陈化得到溶液用等体积无水己醇沉降，离心后得到的沉淀用无水乙醇反复清洗3次，并置于真空干燥箱干燥，获得高度水溶性的L-Cys-Mn:ZnS QDs固体粉末，备用。
2、检测体系溶液配制：精密称取10mg L-Cys-Mn:ZnS QDs，用pH值为10的PBS定容与10ml容量瓶中，得到浓度为1mg/ml的L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液，超声使其均匀分散；
3、磷光信号检测条件：室温下，将荧光分光光度计调至磷光模式，激发波长设置为289nm，激发和发射狭缝宽度分别为10nm和20nm，在400-700nm波长范围内扫描，扫描速度为1000nm/min；
4、标准曲线绘制：精密称取氯霉素标准品10mg，用PBS定容于100ml容量瓶中，混匀，得到氯霉素浓度为0.1mg/ml的标准储备溶液，放置于4℃冰箱中保存，至少可以保存2个星期，使用时稀释。分别吸取1ml 1mg/ml的L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液于8支10ml比色管中，加入不同体积的氯霉素标准溶液后定容至10ml，使氯霉素的浓度分别为(0、0.025、0.5、2、4、15、60、120)μg/ml。将荧光分析仪按照3中条件设置后测定含不同浓度氯霉素的标准检测体系溶液，以横坐标表示氯霉素的浓度，单位为纳克/毫升(ng/ml)，纵坐标表示空白L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液的磷光信号强度(P0)与含一定浓度氯霉素的L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液的磷光信号强度(P)比值的自然对数(ln(P0/P))，绘制标准曲线，如附图3所示。
5、蜂蜜样品前处理：取10g蜂蜜，用20ml蜂蜜体积的PBS稀释，充分混合后，加入20ml乙酸乙酯，超声萃取后4000r/min离心10min，取50％上层有机相用高纯氮气吹干得固体残渣，备用；
6、检测操作过程及计算：用配置好的L-Cys-Mn:ZnS QDs检测体系将蜂蜜提取的固体残渣超声充分溶解，并在5min内进行L-Cys-Mn:ZnS QDs的磷光信号检测，检测结果与标准曲线进行对比，通过计算确定被测溶液中氯霉素含量，进而计算出被测蜂蜜样品中的氯霉素含量。
实施例二、三、四、五、六及对比例一按照相应参数操作过程与实施例一致。
对比例2：绘制标准曲线时，以横坐标表示氯霉素的浓度,，单位为纳克/毫升(ng/ml)，纵坐标表示空白L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液的磷光信号强度(P0)与含一定浓度氯霉素的L-Cys-Mn:ZnS QDs溶液的磷光信号强度(P)之差(P0-P)绘制标准曲线。
二、对本发明一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法(实施例一至实施例六、对比例一至对比例二)相关技术指标如表2所示：
由表2可见，采用本发明实施例一至实施例六建立的蜂蜜中氯霉素的检测方法与对比例一、对比例二相比，线性好，检出限低。
对本发明检测方法的重现性和样品加标回收率及与标准方法比对分析：选取本发明实施例一中参数，对某氯霉素阳性蜂蜜样品进行平行测定10次，得到本发明测定的重现性结果如表3所示。另外，分别在该蜂蜜样品中加入3个梯度的标准氯霉素溶液，得到种不同浓度的加标样，测定结果如表4所示。同时，相同加标样品用国家标准方法《蜂蜜中氮霉素残留的测定方法液相色谱一串联质谱法》(GB/T18932.19-2003)方法测定，结果如表4所示。
表2实施例与对比例的相关技术指标
Figure BDA0001745906990000101
表3重现性结果
Figure BDA0001745906990000111
表4加标回收率结果及与标准方法比对分析结果
Figure BDA0001745906990000112
由表3可以看出，本发明检测方法的相对标准偏差为5.14％，由表4看出加标回收率为94.0％—97.1％，平均加标回收率为95.3％，与国家标准液相色谱一串联质谱相比，相对误差在0.96％—2.53％，具有很好的符合性。说明本发明蜂蜜中氯霉素的检测方法精密度好、回收率高。
分别选取本发明实施例二、三的蜂蜜中氯霉素的检测方法方法的重现性和样品加标回收率及与标准方法比对分析，其步骤与实施例一完全相同，不再赘述。
因此，本发明一种基于锰掺杂硫化锌量子点的蜂蜜中氯霉素的检测方法成本非常低，按照本发明说明书中方法一次合成的L-Cys-Mn:ZnS QDs可用于检测数千个蜂蜜样品；操作简便，不需要很高的技术操作水平，一般检验人员均能胜任；检测过程快速高效，试剂便于储存携带；检测方法回收率高、重现性好，检测结果与国家标准高效液相色谱法相符性高，平均回收率达95.3％，相对标准偏差为5.14％，说明本发明测定回收率高、重现性好；另外，本发明对于蜂蜜中氯霉素具有较宽的线性范围，与其他方法相比，可以实现蜂蜜样品中更大浓度氯霉素残留的定量检测。
以上所述仅为本发明较佳实施例，并非是对本发明作任何形式上的限制，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构和技术思路的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (3)

1.一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：选择L-半胱氨酸作为稳定剂的锰掺杂硫化锌量子点L-Cys-Mn:ZnSQDs作为磷光信号检测介质，利用氯霉素对于L-Cys-Mn:ZnSQDs的内滤效应，实现对氯霉素的检测；
L-Cys-Mn:ZnSQDs的合成与纯化：在100mL圆底烧瓶内，加入50ml0.03mol/LL-半胱氨酸L-Cys溶液和5ml0.1mol/LZnSO4溶液，用2mol/LNaOH调节溶液pH值至11，室温下氮气保护剧烈揽拌1h，以保证L-Cys稳定剂与Zn2+充分络合，然后用注射器注入1.4mL0.01mol/L氮气饱和的MnCl2溶液，反应30min后再用注射器注入5.5mL0.1mol/L氮气饱和Na2S溶液，继续反应30min；将得到的量子点溶液在空气中50℃陈化4h，制得L-Cys-Mn:ZnSQDs水溶液，陈化得到溶液用等体积无水乙醇沉降，离心后得到的沉淀用无水乙醇反复清洗3次，并置于真空干燥箱干燥，获得高度水溶性的L-Cys-Mn:ZnS QDs固体粉末，备用；
检测体系溶液配制：在pH值为8～11的磷酸缓冲溶液PBS中加入终浓度为0.05～0.5mg/mL的L-Cys-Mn:ZnSQDs，并使其均匀分散；
磷光信号检测条件：室温下，将荧光光谱仪调至磷光模式，激发波长设置为280～300nm，激发和发射狭缝宽度分别为5～10nm和10～20nm，扫描速度为1000nm/min；
标准曲线绘制：制备多种不同浓度的氯霉素标准溶液，生成氯霉素的标准曲线图；
蜂蜜样品前处理：取≥10g待测蜂蜜，用2倍以上蜂蜜体积的PBS稀释，充分混合后，加入与PBS等体积的乙酸乙酯，超声萃取后4000r/min离心10min，取上层≤90％比例的有机相用高纯氮气吹干得固体残渣，备用；
检测操作过程及计算：用配制好的L-Cys-Mn:ZnSQDs检测体系将蜂蜜提取的固体残渣超声充分溶解，并在将固体残渣与L-Cys-Mn:ZnSQDs混合时起10min内进行L-Cys-Mn:ZnSQDs的磷光信号检测，检测结果与标准曲线进行对比，通过计算确定被测样品中的氯霉素含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法，其特征在于：绘制标准曲线时，横坐标为氯霉素的浓度，纵坐标为空白L-Cys-Mn:ZnSQDs溶液的磷光信号强度P0与含一定浓度氯霉素的L-Cys-Mn:ZnSQDs溶液的磷光信号强度P比值的自然对数ln(P0/P)。
3.根据权利要求1所述的一种基于锰掺杂硫化锌量子点磷光信号的蜂蜜中氯霉素的检测方法，其特征在于：所述不同浓度的氯霉素标准溶液分别为25ng/mL、500ng/mL、2μg/mL、4μg/mL、15μg/mL、60μg/mL、120μg/mL。
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