CN104568868A - 一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒及测试方法,本发明提供的用于检测阿霉素的室温磷光检测试剂盒,包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和室温磷光量子点。本发明方法能实现对血清和尿液中阿霉素的定量检测,并且检测限低、检测灵敏度高、不受血清和尿液自体荧光的干扰,也可用于药品中阿霉素含量的检测。因此,本发明在阿霉素检测领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域,具体是一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒及检测方法。
背景技术
阿霉素(Doxorubicin:DXR)是一种抗肿瘤抗生素,抗瘤谱较广,对多种肿瘤均有作用,属周期非特异性药物,对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但阿霉素有一定的毒性作用,主要的毒性反应有,引起迟发性严重心力衰竭,白细胞和血小板减少;100%的病人有不同程度的毛发脱落,恶心、食欲减退;药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死等,另外,用药后尿液可出现红色,为及时掌握和控制阿霉素用药所引起的副作用,开发经济快速的人体血清和尿液中阿霉素含量的测定方法就显得非常重要。目前,对于阿霉素的检测方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳-紫外法、荧光法、化学发光法等,但这些方法比较耗时、或价格昂贵、或需要复杂的前处理过程、或抗干扰能力差。因此,急需检测结果稳定、快速、经济的标准方法。而室温磷光量子点生物传感器能克服以往方法的缺点,其检测速度快,不受生物体液自体荧光和散射光的干扰,不需要复杂的前处理,检测快速、准确度高。
荧光量子点作为一种常用的纳米材料,具有制备方法简单,尺寸可控,表面易于修饰和表征简便等优点,在分析化学领域得到了广泛的应用。而室温磷光量子点(Room-temperature phosphorescence Quantum Dots)与荧光量子点相比,拥有很多优点,主要有检测灵敏度高,无需低温冷却装置,免除了溶剂或溶液的除氧过程,大大降低了成本和简化了操作步骤,并可以避免激发光和生物体液背景荧光的干扰,使得检出限更低,并易于实现连续操作和自动化。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术中存在的问题,而提供一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒及检测方法。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒,包括CTAB溶液和室温磷光量子点溶液。
所述的CTAB(即:十六烷基三甲基溴化铵)溶液的浓度为10-3-10-2M;所述的室温磷光量子点溶液为表面含羧基的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点溶液,量子点直径为3-4nm,其直径偏差在5-15%之间,室温磷光量子点溶液的浓度为2g/L-6g/L,所述室温磷光量子点激发波长为295nm,发射波长为590nm。
试剂盒中还包括标准液和缓冲液,所述的标准液为盐酸阿霉素标准液,化学名称为10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮的盐酸盐,标准液的浓度为1-10μΜ;所述的缓冲液为PBS缓冲液,缓冲液的浓度为0.2M、pH为7.4。
一种通过上述试剂盒来检测阿霉素含量的方法,包括如下步骤:1)取100μL室温磷光量子点溶液和140μL CTAB溶液,并先后加入到500μLPBS缓冲液中,室温静置5min后得到混液A;2)准备9份溶液A,分别向9份溶液A中加入不同体积的标准液,分别为0μL、2.5μL、5.0μL、10.0μL、20.0μL、40.0μL、60.0μL、80.0μL、100.0μL;最后将每份添加了标准液的溶液A用二次水定容至5ml,室温静置10min后,得到9份溶液B;3)在荧光分光光度计磷光模式下分别对步骤2)中得到的9份溶液B进行磷光强度测定,设定激发波长为295nm、发射波长为590 nm;4)根据步骤3)测定得到磷光强度值和空白值的磷光强度差值△RTP,然后根据△RTP与设定标准溶液浓度建立“△RTP-阿霉素浓度”的线性方程,即标准曲线,如图2所示(横坐标表示:阿霉素的浓度,纵坐标表示:磷光强度测定值和空白值的差值△RTP),检测范围为0.005μM~0.2μM;5)取100μL室温磷光量子点溶液和140μL CTAB溶液,并先后加入到500μLPBS缓冲液中,室温静置5min后得到混液A,向溶液A中加入50μL待测样品,最后将添加了待测样品的溶液A用二次水定容至5ml,室温静置10min后,得到溶液C,其中,所述的待测样品包括人体血清、人体尿液和药品;6)在荧光分光光度计磷光模式下对步骤5)中得到的溶液C进行磷光强度测定,设定激发波长为295nm、发射波长为590 nm;7)根据步骤6)的磷光强度测定值,带入到步骤4)中得到的标准曲线中,计算出待测样品中的阿霉素浓度值。
本发明试剂盒检测方法的原理:采用室温磷光量子点作为磷光信号标记分子,将室温磷光量子点上的羧基与CTAB上的亲水基团通过静电作用链接,形成纳米复合物,使室温磷光信号增强,当不同浓度的阿霉素加入后,形成CTAB-阿霉素复合物,磷光强度逐渐恢复,通过与测定形式的标准曲线对比获得待测阿霉素的浓度。
阿霉素加入后,阿霉素竞争性地结合CTAB,CTAB以CTAB-阿霉素复合物的形成从室温磷光量子点上脱离。
本发明的阿霉素检测技术与量子点在生物医药领域的检测技术相关,是通过形成室温磷光纳米复合材料改善量子点的性能的途径实现对阿霉素的检测,该技术整合了室温磷光量子点纳米复合材料的合成,竞争式检测技术等相关领域的研究。
本发明之所以能检测血清和尿液中阿霉素,在于采用了一种基于室温磷光定量检测方法,由于磷光不受血清或尿液中背景荧光的的影响,大大提高了血清或尿液中阿霉素的检测能力。在室温磷光量子点与CTAB形成纳米复合材料后,改善了量子点的发光性能,使得量子点的磷光强度增强,当阿霉素加入后,阿霉素竞争性结合CTAB,CTAB从量子点上脱离,量子点的磷光强度降低,在一定范围内磷光强度变化值与阿霉素浓度成反比。通过添加不同浓度的阿霉素标准品可制成标准曲线,根据标准曲线和各检测样品的磷光强度计算出样品中阿霉素的浓度值。
其具体的技术步骤包括:
(一)室温磷光量子点纳米复合材料探针的制备:采用水溶性室温磷光量子点,利用静电吸引结合的方式将CTAB连接到室温磷光量子点表面,形成室温磷光量子点纳米复合材料探针;
(二)CTAB-阿霉素复合物的形成:在上述室温磷光量子点纳米复合材料探针中加入标准品或待测样品,标准品或待测样品中的阿霉素竞争性地结合CTAB,形成CTAB-阿霉素复合物;
(三)定量磷光检测:采用荧光分光光度计磷光模式测定量子点磷光强度,激发波长为295nm,发射波长为590nm;通过测定对应标准样品的磷光强度形成标准曲线,通过与测定形成的标准曲线对比获得待测样品阿霉素的浓度。
室温磷光量子点表面需带有易于与CTAB连接的基团,优化的基团是带羧基的表面官能团,采用静电吸引方法连接。
由于实际待测样品中阿霉素含量远高于本试剂盒的检测限和检测范围,所以待测样品需用二次水稀释到合适浓度,同时可以通过稀释降低其它物质的干扰。
本发明通过对室温磷光量子点、CTAB和阿霉素分子特性的研究,选择合适的室温磷光水溶性量子点与CTAB链接,获得功能性室温磷光量子点探针,并通过竞争性反应,达到阿霉素快速和高灵敏定量检测。实验证明,本发明试剂盒用于血清和尿液阿霉素的检测检出限低、灵敏度高、干扰小、速度快,准确度高。由于不受血清和尿液背景荧光干扰,本发明方法非常适用于对血清和尿液阿霉素的定量检测,也适用于对药品中阿霉素含量的测定。因此,本发明在阿霉素检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为巯基丙酸包被的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点电镜(TEM)图片。
图2为室温磷光量子点纳米复合材料检测阿霉素的标准曲线。
具体实施方式
一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒,包括CTAB溶液和室温磷光量子点溶液。
所述的CTAB即为十六烷基三甲基溴化铵,其溶液的浓度为10-3-10-2M;所述的室温磷光量子点溶液为表面含羧基的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点溶液,量子点直径为3-4nm,其直径偏差在5-15%之间,室温磷光量子点溶液的浓度为2g/L-6g/L,所述室温磷光量子点激发波长为295nm,发射波长为590nm,图1为巯基丙酸包被的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点电镜(TEM)图片。
试剂盒中还包括标准液和缓冲液,所述的标准液为盐酸阿霉素标准液,化学名称为10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮的盐酸盐,标准液的浓度为1-10μΜ;所述的缓冲液为PBS缓冲液,缓冲液的浓度为0.2M、pH为7.4。
一种通过上述试剂盒来检测阿霉素含量的方法,包括如下步骤:1)取100μL室温磷光量子点溶液和140μL CTAB溶液,并先后加入到500μLPBS缓冲液中,室温静置5min后得到混液A;2)准备9份溶液A,分别向9份溶液A中加入不同体积的标准液,分别为0μL、2.5μL、5.0μL、10.0μL、20.0μL、40.0μL、60.0μL、80.0μL、100.0μL;最后将每份添加了标准液的溶液A用二次水定容至5ml,室温静置10min后,得到9份溶液B;3)在荧光分光光度计磷光模式下分别对步骤2)中得到的9份溶液B进行磷光强度测定,设定激发波长为295nm、发射波长为590 nm;4)根据步骤3)测定得到磷光强度值和空白值的磷光强度差值△RTP,然后根据△RTP与设定标准溶液浓度建立“△RTP-阿霉素浓度”的线性方程,即标准曲线,如图2所示,检测范围为0.005μM~0.2μM;5)取100μL室温磷光量子点溶液和140μL CTAB溶液,并先后加入到500μLPBS缓冲液中,室温静置5min后得到混液A,向溶液A中加入50μL待测样品,最后将添加了待测样品的溶液A用二次水定容至5ml,室温静置10min后,得到溶液C,其中,所述的待测样品包括人体血清、人体尿液和药品;6)在荧光分光光度计磷光模式下对步骤5)中得到的溶液C进行磷光强度测定,设定激发波长为295nm、发射波长为590 nm;7)根据步骤6)的磷光强度测定值,带入到步骤4)中得到的标准曲线中,计算出待测样品中的阿霉素浓度值。
以下列举一个具体的实施例,对本发明技术方案作进一步的描述说明:
实施例1
一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒,在盒子中包括装有4管不同材料的试剂管,具体为:
(1)5ml的巯基丙酸包裹的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点溶液,浓度为2g/L-6g/L;
(2)7ml的CTAB 溶液,浓度为10-3-10-2M;
(3)5ml的 10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮的盐酸盐标准液,浓度为1-10μΜ;
(4)25ml PBS缓冲液,浓度为0.2M、pH值为7.4。
应用例1:利用本发明的试剂盒检测阿霉素在人血清中的加标回收率
(1)针对实施例中的试剂盒,量取室温磷光量子点溶液100μL加入到500μL的PBS溶液中;
(2)向上面溶液中加入140μL CTAB溶液,室温静置5分钟;
(3)取9份相同的上面溶液,并分别加入不同体积的(0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0μL)10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮的盐酸盐标准液,再用二次水定容至5ml,室温静置10分钟;
(4)将上述室温静置10分钟后的液体在荧光分光光度计磷光模式下进行磷光强度测定,激发波长为295nm,发射波长为590;
(5)以上实验平行样3个,既实验重复3次;
(6)根据以上测定得到磷光强度值和空白值的磷光强度差值△RTP,然后根据△RTP与设定标准溶液浓度建立“△RTP-阿霉素浓度”的线性方程,既标准曲线,检测范围为0.005μM~0.2μM,见图2;
(7)人血清加标:取3支10ml比色管,将浓度含量为1000μM的10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮的盐酸盐标准液25μL、50μL和100μL分别加入到各个比色管中,用阿霉素阴性的人血清定容至10ml,得到3种浓度的人血清加标液,分别为2.5μM、 5μM和10μM;
(8)检测阿霉素在人血清中的加标回收率,重复步骤(1)和(2),然后分别取(7)中加标后的人血清50μL加入比色管中,用二次水定容至5ml,相当于人血清稀释了100倍,定容后阿霉素的浓度分别为:0.025μM 、0.05μM和0.1μM,同时做空白样,室温静置10分钟,人血清样品不需要其它前处理;
(9)重复步骤(4);
(10)以上实验平行样3个,既实验重复3次;
(11)根据以上磷光强度测定值,带入步骤(6)标准曲线方程,计算出阿霉素浓度值;
(12)计算阿霉素在人血清中的加标回收率,见表1,阿霉素在人血清中的加标回收率为94%~102%。
表 1 人血清中阿霉素加标回收率 (平均值 ± 标准偏差; 重复次数 = 3)
应用例2:利用本发明的试剂盒检测阿霉素在人尿液中的加标回收率
(1)重复应用例1中的步骤(7)-(11),将其中的样品类型更换为人尿液即可;
(2)计算阿霉素在人尿液中的加标回收率,见表2,阿霉素在人尿液中的加标回收率为96%~102%。
表 2 人尿液中阿霉素加标回收率 (平均值 ± 标准偏差; 重复次数 = 3)
Claims (4)
1.一种用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒,其特征在于:包括CTAB溶液和室温磷光量子点溶液。
2.根据权利要求1所述的用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒,其特征在于:所述的CTAB溶液的浓度为10-3-10-2M;所述的室温磷光量子点溶液为表面含羧基的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点溶液,量子点直径为3-4nm,室温磷光量子点溶液的浓度为2g/L-6g/L。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒,其特征在于:试剂盒中还包括标准液和缓冲液,所述的标准液为盐酸阿霉素标准液,化学名称为10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮的盐酸盐,标准液的浓度为1-10μΜ;所述的缓冲液为PBS缓冲液,缓冲液的浓度为0.2M、pH为7.4。
4.一种如权利要求3所述的用于检测阿霉素含量的室温磷光检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:1)取100μL室温磷光量子点溶液和140μL CTAB溶液,并先后加入到500μLPBS缓冲液中,室温静置5min后得到混液A;2)准备9份溶液A,分别向9份溶液A中加入不同体积的标准液,分别为0μL、2.5μL、5.0μL、10.0μL、20.0μL、40.0μL、60.0μL、80.0μL、100.0μL;最后将每份添加了标准液的溶液A用二次水定容至5ml,室温静置10min后,得到9份溶液B;3)在荧光分光光度计磷光模式下分别对步骤2)中得到的9份溶液B进行磷光强度测定,设定激发波长为295nm、发射波长为590 nm;4)根据步骤3)测定得到磷光强度值和空白值的磷光强度差值△RTP,然后根据△RTP与设定标准溶液浓度建立“△RTP-阿霉素浓度”的线性方程,即标准曲线,检测范围为0.005μM~0.2μM;5)取100μL室温磷光量子点溶液和140μL CTAB溶液,并先后加入到500μLPBS缓冲液中,室温静置5min后得到混液A,向溶液A中加入50μL待测样品,最后将添加了待测样品的溶液A用二次水定容至5ml,室温静置10min后,得到溶液C,其中,所述的待测样品包括人体血清、人体尿液和药品;6)在荧光分光光度计磷光模式下对步骤5)中得到的溶液C进行磷光强度测定,设定激发波长为295nm、发射波长为590 nm;7)根据步骤6)的磷光强度测定值,带入到步骤4)中得到的标准曲线中,计算出待测样品中的阿霉素浓度值。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |