CN108949592B - 一种酱油微生物固定化发酵组合物及制备工艺和使用方法 - Google Patents

一种酱油微生物固定化发酵组合物及制备工艺和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种酱油微生物固定化发酵组合物及制备工艺和使用方法，具体涉及调味品生产技术领域。本发明的发酵组合物包括：低脂果胶、水、鲁氏接合酵母、大豆接合酵母、埃契氏球拟酵母、嗜盐片球菌、酱油四联球菌、MgCl2溶液、鸡蛋清、圆褐固氮菌和海藻糖。本发明的发酵组合物用于酱油的发酵时，可将酱油酱醪与发酵组合物搅拌混合，充入氮气进行发酵，过滤后得到发酵液。本发明的发酵组合物无毒环保、抗压耐腐蚀、可循环使用，用于酱油的发酵能提高原料利用率、缩短发酵周期，得到的发酵液可溶性无盐固形物、全氮和氨基酸态氮含量高。

Description

一种酱油微生物固定化发酵组合物及制备工艺和使用方法
【技术领域】
本发明涉及调味品生产技术领域，具体涉及一种酱油微生物固定化发酵组合物及制备工艺和使用方法。
【背景技术】
酱油起源于我国，至今至少已有2000多年的历史，酱油的制造技术于唐朝时期，由鉴真和尚传入日本，后扩大到东南亚和世界各地。酱油作为一种调味品，在东方国家居于很高的地位，也越来越多地出现在西方的烹调中，酱油酿制工业是古老而又新兴的技术产业。
在酱油的酿造过程中，发酵工艺是使酱油呈现独特色、香、味、体风味的关键步骤，其中的酶和微生物可将原料中的糖类、蛋白质、脂类进一步分解转化形成易于人体吸收的低分子营养物质，并产生鲜香醇厚的口感，因此，酶和微生物的活性及生长态势是影响酱油品质的重要因素。酱油的制备方法依据发酵工艺不同，分为：高盐稀态发酵法、低盐固态发酵法、无盐固态发酵法，其中高盐稀态发酵法是传统工艺改进法，酱油成品氨基酸态氮生产率高，酱油风味好，但发酵周期为3-6个月，生产周期比较长；低盐固态发酵法是目前我国国内多数中小型酱油厂的主要生产工艺，发酵周期短，一般在25天左右，但酱油香气不如高盐稀态发酵法；无盐固态发酵法彻底摆脱食盐对酶的抑制作用，发酵周期最短，仅为48-72小时，但成品酱油氨基酸态氮含量低，风味不佳，缺少酱香，产品质量也不稳定。
目前，为在较短的发酵周期获得酱香味醇厚的酱油，中国专利授权公告号为CN101731568B，名为一种采用固定化细胞发酵制备高盐稀态酱油的方法的专利文献中，公开了一种酱油的制备方法，采用海藻酸钙凝胶固定球拟酵母、鲁氏酵母、生香赛特假丝酵母及酱油四联球菌发酵，来对高盐稀态发酵法制备成的酱油原液进行二次发酵，该方法的酱油发酵周期为60-90天，所得酱油风味独特、酱香醇厚，但海藻酸钙凝胶不耐磨、不耐盐，经不起长时间连续搅拌，导致产品质量不稳定，且海藻酸钙微有毒性，大量排放或处理不当会对水体造成污染。顾香玉在2002年总第75期的江苏调味副食品中发表的生物反应器系统连续化生产酱油一文中公开了将嗜盐片球菌、鲁氏接合酵母菌和易变假丝酵母菌固定于褐藻酸钠载体上的方法进行酱油发酵，发酵周期短，但由于菌种单一和菌种渗透压耐受力弱，导致菌种存活率低、发酵能力不强，所得酱油的香味和鲜味比高盐稀态发酵法弱，表明氨基酸态氮和酯香成分欠缺。由此可见，现有酱油发酵法存在工艺不稳定、风味不足的缺陷。
因此，为了能获得色、香、味、体醇厚鲜美的酱油，必需对发酵工艺进行改进，开发一种可缩短生产周期、提高原料利用率的微生物固定化发酵组合物。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对酱油现有技术中发酵法工艺不稳定、风味不足的问题，提供一种酱油微生物固定化发酵组合物，该发酵组合物运用于酱油的发酵工艺中，可提高原料利用率、缩短发酵周期，其中的酵母菌和乳酸菌在高渗透压环境下存活率高，并且无毒环保、抗压耐腐蚀、可循环使用，发酵液可溶性无盐固形物、全氮和氨基酸态氮含量高。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种酱油微生物固定化发酵组合物，包括以下重量份比的原料：低脂果胶1.5-3.5份、水23-39份、鲁氏接合酵母0.06-0.14份、大豆接合酵母0.04-0.08份、埃契氏球拟酵母0.03-0.06份、嗜盐片球菌0.07-0.14份、酱油四联球菌0.02-0.08份、MgCl2溶液5-9份、鸡蛋清0.2-0.3份、圆褐固氮菌0.02-0.04份和海藻糖2-4份。
优化的，包括以下重量份比的原料：低脂果胶2-3份、水26-36份、鲁氏接合酵母0.08-0.12份、大豆接合酵母0.05-0.07份、埃契氏球拟酵母0.04-0.05份、嗜盐片球菌0.09-0.13份、酱油四联球菌0.04-0.07份、MgCl2溶液6-8份、鸡蛋清0.14-0.28份、圆褐固氮菌0.03-0.04份和海藻糖2.5-3.5份。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
a.按重量份比，取2.5％-6.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理8-16分钟，得到酵母原液；
b.按重量份比，取鸡蛋清，分2-3次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理3-7分钟，得到酵母蛋清液；
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在6-10℃下静置28-34分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取低脂果胶，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得果胶混合液；
e.取果胶混合液滴入到MgCl2溶液中，搅拌均匀，静置15-25分钟，即得微生物固定化发酵组合物。
优化的，步骤a中所述超声处理的功率为70-80w、频率为15-25kHz、温度为20-26℃。
进一步优化的，步骤b中所述的超声处理的功率为90-100w、频率为32-38kHz、温度为40-46℃。
更进一步优化的，步骤b中所述鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.04-0.14份鸡蛋清，第2次加入0.1-0.2份鸡蛋清。
再更进一步优化的，步骤e中所述的MgCl2溶液的浓度为0.4％-0.8％。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，按重量份比，取酱油酱醪40-60份和发酵组合物4.5-6.5份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在28-38℃下发酵20-30小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明采用微生物固定化技术对酱油进行发酵，发酵周期仅需20-30个小时，发酵液可溶性无盐固形物、全氮和氨基酸态氮含量比高盐稀态发酵法分别高出约62％、37％和18％。选用鸡蛋清和海藻糖改进了鲁氏接合酵母、大豆接合酵、埃契氏球拟酵母、嗜盐片球菌、酱油四联球菌共5种微生物的渗透压耐受强度，降低它们的死亡率；加入了圆褐固氮菌，与发酵罐中的氮气反应，为发酵微生物提供必要的氮源，提高微生物的繁殖速率和发酵能力；选用低脂果胶凝胶作为固定化载体，实现无毒环保、抗压耐腐蚀、循环使用率高的效果。
2.本发明用于发酵的酱醪属于高渗溶液，微生物加入其中会迅速皱缩而失水死亡。在鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母中加入海藻糖和鸡蛋清，并进行超声处理，通过严格控制超声功率、频率、温度、时间参数，提升酵母对抗高渗透压的能力，使在高渗透压下繁殖速率比不加入海藻糖和鸡蛋清提高了60％。海藻糖能保护酵母的细胞膜，维持细胞结构的稳定性，增大高渗透压耐受力；同时通过增大酵母细胞内海藻糖含量，有效提升酵母的发酵能力，亦可进一步提升高渗透压耐受力。本发明将水、海藻糖、鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母一起溶解超声，以超声产生的空化力使酵母的细胞膜出现可逆性的穿透小孔，此时部分海藻糖得以进入酵母细胞体内，而在细胞外的海藻糖继续维持细胞膜的稳定，使超声处理不至于对细胞膜造成不可逆性损伤；接着加入鸡蛋清进行超声，使鸡蛋清中的蛋白质分子顺利嵌入到酵母细胞膜的穿透小孔上，与细胞膜实现紧密融合，使细胞膜结构得到进一步稳固，起到增大耐高渗透压的作用。通过多次实验论证，超声功率、频率、温度、时间过小过少，会使酵母细胞膜不能形成穿透孔或穿透孔过小，影响海藻糖的进入，使鸡蛋清的蛋白质分子不能获得足够的动能嵌入酵母细胞膜，影响酵母细胞结构的稳定；超声功率、频率、温度、时间过大过长，会对酵母细胞膜造成无法修复的穿孔损伤，增大细胞膜的通透性，影响酵母细胞的生理功能；同时，实验还证明，鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母的细胞膜与海藻糖和鸡蛋清具有良好的相容性，通过控制几种微生物的配比，能够发挥最佳的发酵能力，而假丝酵母属的易变假丝酵母和生香赛特假丝酵母、易变球拟酵母等相容性较差，达不到提高渗透压耐受力和活性的目的。
3.本发明的酱醪为高渗溶液，为提升嗜盐片球菌和酱油四联球菌的渗透压耐受力，加入了海藻糖和鸡蛋清，通过海藻糖的羟基与鸡蛋清中蛋白质的游离氨基形成氢键，在嗜盐片球菌和酱油四联球菌表面形成半透膜，与自身细胞膜组成双层生物防御屏障，起到抗高渗透压的效果，使在高渗透压下乳酸菌繁殖速率提高40％。通过反复论证，嗜盐片球菌和酱油四联球菌的高渗透压耐受性最强，植质乳杆菌较差，达不到提高渗透压耐受力和活性的目的。
4.本发明中加入圆褐固氮菌，并在发酵罐中充入氮气，使圆褐固氮菌通过吸收氮气转化为铵盐，为发酵微生物提供充足的氮源，也确保发酵过程的无氧环境，促进微生物生长，增强发酵能力，使发酵液中可溶性无盐固形物含量提高75％、全氮含量提高近45％、氨基酸态氮含量提高近35％。
5.本发明中将鸡蛋清分次加入到酵母蛋清液中，可使蛋清中的蛋白质分子均匀稳定地与所有酵母的细胞膜进行融合，使融合的成功率提升40％，大大提升酵母的存活率和发酵能力。
6.本发明中采用低脂果胶凝胶作为固定化载体，克服了海藻酸钙凝胶机械强度低、不耐盐的缺陷，使用上安全无毒环保、稳定性高、循环使用率高、具有抑菌功能，使鲁氏接合酵母、大豆接合酵母、埃契氏球拟酵母、嗜盐片球菌份、酱油四联球菌固定于凝胶中保持很高的活性，使发酵时间缩短至30个小时以内。
7.本发明加入海藻糖后有效促进了果胶凝胶的形成，降低了MgCl2溶液的浓度，减少了MgCl2的用量，使低脂果胶分子间的联结更紧密，提高凝胶的机械强度和抗腐蚀性能。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种酱油微生物固定化发酵组合物，包括以下重量份比的原料：低脂果胶1.5份、水23份、鲁氏接合酵母0.06份、大豆接合酵母0.04份、埃契氏球拟酵母0.03份、嗜盐片球菌0.07份、酱油四联球菌0.02份、MgCl2溶液5份、鸡蛋清0.2份、圆褐固氮菌0.02份和海藻糖2份。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
a.按重量份比，取2.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理8分钟，得到酵母原液；
其中，超声处理的功率为70w、频率为15kHz、温度为20℃。
b.按重量份比，取鸡蛋清，分2次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理3分钟，得到酵母蛋清液；
其中，超声处理的功率为90w、频率为32kHz、温度为40℃。
鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.04份鸡蛋清，第2次加入0.16份鸡蛋清。
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在6℃下静置28分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取低脂果胶，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得果胶混合液；
e.取果胶混合液滴入到MgCl2溶液中，搅拌均匀，静置15分钟，即得微生物固定化发酵组合物。
MgCl2溶液的浓度为0.4％％。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，按重量份比，取酱油酱醪40份和发酵组合物4.5份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在28℃下发酵20小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
实施例2
一种酱油微生物固定化发酵组合物，包括以下重量份比的原料：低脂果胶3.5份、水39份、鲁氏接合酵母0.14份、大豆接合酵母0.08份、埃契氏球拟酵母0.06份、嗜盐片球菌0.14份、酱油四联球菌0.08份、MgCl2溶液9份、鸡蛋清0.3份、圆褐固氮菌0.04份和海藻糖4份。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
a.按重量份比，取6.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理16分钟，得到酵母原液；
其中，超声处理的功率为80w、频率为25kHz、温度为26℃。
b.按重量份比，取鸡蛋清，分3次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理7分钟，得到酵母蛋清液；
其中，超声处理的功率为100w、频率为38kHz、温度为46℃。
鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.08份鸡蛋清，第2次加入0.2份鸡蛋清。
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在10℃下静置34分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取低脂果胶，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得果胶混合液；
e.取果胶混合液滴入到MgCl2溶液中，搅拌均匀，静置25分钟，即得微生物固定化发酵组合物。
MgCl2溶液的浓度为0.8％。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，按重量份比，取酱油酱醪60份和发酵组合物6.5份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在38℃下发酵30小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
实施例3
一种酱油微生物固定化发酵组合物，包括以下重量份比的原料：低脂果胶2份、水26份、鲁氏接合酵母0.08份、大豆接合酵母0.05份、埃契氏球拟酵母0.04份、嗜盐片球菌0.09份、酱油四联球菌0.04份、MgCl2溶液6份、鸡蛋清0.14份、圆褐固氮菌0.03份和海藻糖2.5份。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
a.按重量份比，取5.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理10分钟，得到酵母原液；
其中，超声处理的功率为72w、频率为18kHz、温度为21℃。
b.按重量份比，取鸡蛋清，分2次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理4分钟，得到酵母蛋清液；
其中，超声处理的功率为92w、频率为33kHz、温度为41℃。
鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.06份鸡蛋清，第2次加入0.18份鸡蛋清。
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在7℃下静置30分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取低脂果胶，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得果胶混合液；
e.取果胶混合液滴入到MgCl2溶液中，搅拌均匀，静置17分钟，即得微生物固定化发酵组合物。
MgCl2溶液的浓度为0.5％。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，按重量份比，取酱油酱醪45份和发酵组合物5份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在30℃下发酵23小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
实施例4
一种酱油微生物固定化发酵组合物，包括以下重量份比的原料：低脂果胶3份、水36份、鲁氏接合酵母0.12份、大豆接合酵母0.07份、埃契氏球拟酵母0.05份、嗜盐片球菌0.13份、酱油四联球菌0.07份、MgCl2溶液8份、鸡蛋清0.28份、圆褐固氮菌0.04份和海藻糖3.5份。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
a.按重量份比，取3.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理14分钟，得到酵母原液；
其中，超声处理的功率为78w、频率为23kHz、温度为25℃。
b.按重量份比，取鸡蛋清，分3次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理3-7分钟，得到酵母蛋清液；
其中，超声处理的功率为90-100w、频率为32-38kHz、温度为40-46℃。
鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.14份鸡蛋清，第2次加入0.1份鸡蛋清。
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在9℃下静置33分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取低脂果胶，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得果胶混合液；
e.取果胶混合液滴入到MgCl2溶液中，搅拌均匀，静置22分钟，即得微生物固定化发酵组合物。
MgCl2溶液的浓度为0.7％。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，按重量份比，取酱油酱醪55份和发酵组合物6份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在35℃下发酵27小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
实施例5
一种酱油微生物固定化发酵组合物，包括以下重量份比的原料：低脂果胶2.5份、水31份、鲁氏接合酵母0.1份、大豆接合酵母0.06份、埃契氏球拟酵母0.05份、嗜盐片球菌0.11份、酱油四联球菌0.05份、MgCl2溶液7份、鸡蛋清0.25份、圆褐固氮菌0.03份和海藻糖3份。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
a.按重量份比，取4.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理12分钟，得到酵母原液；
其中，超声处理的功率为75w、频率为20kHz、温度为23℃。
b.按重量份比，取鸡蛋清，分3次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理5分钟，得到酵母蛋清液；
其中，超声处理的功率为95w、频率为35kHz、温度为43℃。
鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.06份鸡蛋清，第2次加入0.12份鸡蛋清。
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在8℃下静置31分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取低脂果胶，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得果胶混合液；
e.取果胶混合液滴入到MgCl2溶液中，搅拌均匀，静置20分钟，即得微生物固定化发酵组合物。
MgCl2溶液的浓度为0.6％。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，按重量份比，取酱油酱醪50份和发酵组合物5.5份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在33℃下发酵25小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
实施例6
按实施例5处理方法，除步骤a中的超声处理时间为6分钟、功率为67w、频率为13kHz、温度为18℃，步骤b中超声处理时间为2分钟、功率为88w、频率为30kHz、温度为38℃外，其余方法同实施例5。
实施例7
按实施例5处理方法，除步骤a中的超声处理时间为18分钟、功率为82w、频率为27kHz、温度为28℃，步骤b中超声处理时间为9分钟、功率为102w、频率为40kHz、温度为48℃外，其余方法同实施例5。
实施例8
按实施例5处理方法，除发酵工艺中不加入海藻糖和鸡蛋清，也不进行超声处理外，其余方法同实施例5。
实施例9
按实施例5处理方法，除将原料中的大豆结合酵母、埃契氏球拟酵母修改为易变假丝酵母、易变球拟酵母外，其余方法同实施例5。
实施例10
按实施例5处理方法，除将原料中的酱油四联球菌修改为植质乳杆菌外，其余方法同实施例5。
实施例11
按实施例5处理方法，除步骤d中不加入圆褐固氮菌外，其余方法同实施例5。
实施例12
一种酱油的微生物固定化发酵组合物，包括以下重量份比的原料：海藻酸钠2.5份、水31份、鲁氏接合酵母0.1份、大豆接合酵母0.06份、埃契氏球拟酵母0.05份、嗜盐片球菌0.11份、酱油四联球菌0.05份、CaCl2溶液7份、鸡蛋清0.3份、圆褐固氮菌0.03份和海藻糖3份。
一种上诉酱油的微生物固定化发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：
a.按重量份比，取4.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理12分钟，得到酵母原液；
其中，超声处理的功率为75w、频率为20kHz、温度为23℃。
b.按重量份比，取鸡蛋清，分3次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理5分钟，得到酵母蛋清液；
其中，超声处理的功率为95w、频率为35kHz、温度为43℃；
鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.06份鸡蛋清，第2次加入0.12份鸡蛋清。
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在8℃下静置31分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取海藻酸钠，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得海藻酸钠混合液。
e.取海藻酸钠混合液滴入到CaCl2溶液中，搅拌均匀，静置20分钟，得到微生物固定化发酵组合物。
其中，CaCl2溶液的浓度为4.2％。
一种上述酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，按重量份比，取酱油酱醪50份和发酵组合物5.5份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在33℃下发酵25小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
实施例13
依照SB/T10312-1999高盐稀态发酵法制备酱油中的工艺流程对酱醪进行发酵。
实施例17实施效果对比
1.实验样品的制备：选用同一批相同制备工艺得到的酱醪，按照实施例1-13的方法制备得到发酵液，记为实验样品1-13。
2.评价方法
2.1发酵液品质评价：由中国调味品协会专家工作委员会组织20位感官评审专家，依次对实验样品1-12进行感官特性评定，依照表1评定标准对色泽体态、香味进行打分。同时，组织10名专业技术人员进行内含物指标测定。计算各指标平均值作为最终测定结果。
表1发酵液感官评定标准
Figure BDA0001704628640000121
2.2微生物渗透压耐受强度测试：分别吸取实施例1-10中的微生物混合液2ml，记为微生物混合液1-10(与实验样品1-10形成一一对应关系)，分别放入10份含盐量均为25％的琼脂培养基中，于37℃下培养48小时，分别计算酵母菌和乳酸菌的菌落总数。
3.评价结果
表2发酵液感官评定结果
Figure BDA0001704628640000122
Figure BDA0001704628640000131
表3发酵液内含物检测结果
Figure BDA0001704628640000132
Figure BDA0001704628640000141
表4渗透压耐受强度评定结果
样品 酵母菌数，cfu/mL 乳酸菌数，cfu/mL
微生物混合液1 3.7×10<sup>7</sup> 4.8×10<sup>8</sup>
微生物混合液2 4.3×10<sup>7</sup> 5.1×10<sup>8</sup>
微生物混合液3 5.7×10<sup>7</sup> 6.3×10<sup>8</sup>
微生物混合液4 4.9×10<sup>7</sup> 5.8×10<sup>8</sup>
微生物混合液5 6.5×10<sup>8</sup> 7.1×10<sup>9</sup>
微生物混合液6 2.1×10<sup>7</sup> 2.5×10<sup>8</sup>
微生物混合液7 1.1×10<sup>7</sup> 1.3×10<sup>8</sup>
微生物混合液8 2.3×10<sup>7</sup> 3.4×10<sup>8</sup>
微生物混合液9 2.5×10<sup>6</sup> 3.1×10<sup>7</sup>
微生物混合液10 2.7×10<sup>6</sup> 3.4×10<sup>7</sup>
4.实验结果
由表2、表3可以看出，实验样品1-5的品质优于实验样品6-13；由表4可以看出，实验样品1-5中的酵母菌和乳酸菌比实验样品6-10的渗透压耐受力强。
实验样品6和7与实验样品1-5的不同之处在于超声处理的时间、功率、频率和温度，表明超声时间过短或过长、超声功率和频率过小或过大、超声温度过低或过高，均不利于海藻糖和鸡蛋清参与到对微生物细胞膜的保护中，不能增大微生物混合液的渗透压耐受强度，影响了发酵液的色泽，降低了香气和内含物含量；实验样品8未加入海藻糖和鸡蛋清，也没有进行超声处理，导致微生物混合液繁殖速度较慢，对高渗透压的耐受强度较弱，影响发酵液品质；实验样品9和10采用了不同于实验样品1-5的酵母菌和乳酸菌，使海藻糖和鸡蛋清对它们的亲和力出现下降，相容性降低，得到的微生物混合液高渗透压耐受力低，发酵液品质下降较多；实验样品11中没有加入圆褐固氮菌，致使微生物的氮源供应不足，影响了发酵过程，降低了发酵液的品质；实验样品12采用海藻酸钙凝胶作为固定化载体，在搅拌过程中，凝胶出现破碎，影响到了酱醪的发酵，降低了发酵液的感官品质和内含物含量；实验样品13采用高盐稀态发酵法得到，发酵周期较长，但香气、色泽及内含物均未能超越实验样品1-5。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (8)

1.一种酱油微生物固定化发酵组合物，其特征在于，包括以下重量份比的原料：低脂果胶1.5-3.5份、水23-39份、鲁氏接合酵母0.06-0.14份、大豆接合酵母0.04-0.08份、埃契氏球拟酵母0.03-0.06份、嗜盐片球菌0.07-0.14份、酱油四联球菌0.02-0.08份、MgCl2溶液5-9份、鸡蛋清0.2-0.3份、圆褐固氮菌0.02-0.04份和海藻糖2-4份。
2.根据权利要求1所述的一种酱油微生物固定化发酵组合物，其特征在于，包括以下重量份比的原料：低脂果胶2-3份、水26-36份、鲁氏接合酵母0.08-0.12份、大豆接合酵母0.05-0.07份、埃契氏球拟酵母0.04-0.05份、嗜盐片球菌0.09-0.13份、酱油四联球菌0.04-0.07份、MgCl2溶液6-8份、鸡蛋清0.14-0.28份、圆褐固氮菌0.03-0.04份和海藻糖2.5-3.5份。
3.根据权利要求1或2所述的一种酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.按重量份比，取2.5％-6.5％总用水量的水，然后加入海藻糖，搅拌溶解，接着加入鲁氏接合酵母、大豆接合酵母和埃契氏球拟酵母，搅拌均匀，然后在超声波提取机中超声处理8-16分钟，得到酵母原液；
b.按重量份比，取鸡蛋清，分2-3次加入到酵母原液中，每次加入后超声处理3-7分钟，得到酵母蛋清液；
c.取酵母蛋清液，按重量份比，加入嗜盐片球菌和酱油四联球菌，搅拌均匀，在6-10℃下静置28-34分钟，得到微生物混合液；
d.按重量份比，取低脂果胶，加入到剩余用量的水中，搅拌均匀后，依次加入圆褐固氮菌和微生物混合液，搅拌均匀，即得果胶混合液；
e.取果胶混合液滴入到MgCl2溶液中，搅拌均匀，静置15-25分钟，即得微生物固定化发酵组合物。
4.根据权利要求3所述的一种酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤a中所述超声处理的功率为70-80w、频率为15-25kHz、温度为20-26℃。
5.根据权利要求3所述的一种酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤b中所述的超声处理的功率为90-100w、频率为32-38kHz、温度为40-46℃。
6.根据权利要求3所述的一种酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤b中所述鸡蛋清分次加入的方法为：第1次加入0.04-0.14份鸡蛋清，第2次加入0.1-0.2份鸡蛋清。
7.根据权利要求3所述的一种酱油微生物固定化发酵组合物的制备方法，其特征在于，步骤e中所述的MgCl2溶液的浓度为0.4％-0.8％。
8.根据权利要求1或2所述的一种酱油微生物固定化发酵组合物的使用方法，其特征在于，按重量份比，取酱油酱醪40-60份和发酵组合物4.5-6.5份，搅拌混合均匀，置于发酵罐中，然后充入氮气，在28-38℃下发酵20-30小时，发酵完成后，过滤，得酱油发酵液，之后按常规工艺进行后续处理。
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