CN108931565A - 纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法 - Google Patents

Abstract

纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，涉及一种生物传感器的构建方法。是要解决现有纸基生物传感器存在的内部孔隙大、表面粗糙，导致的检测效率和准确度差的问题。方法：一、纳米纤维素的制备：将纤维素原料依次进行抽提处理和去木质素处理，得到综纤维素，然后进行机械预处理、化学机械混合预处理或生物机械混合预处理，得到含半纤维素的纳米纤维素水液；二、纳米纸的制备；三、纳米纸基生物传感器构建。经过检测，本发明制备的纳米纸无明显空隙，粗糙度在微米级以下，纳米纸孔隙率大于1％、粗糙度小于1um。本发明用于生物传感器领域。

Description

纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法

技术领域

本发明涉及一种生物传感器的构建方法。

背景技术

21世纪是信息科学的世纪，也是生命科学的世纪，生物传感器是生命科学和信息技术集成的、多学科相互渗透的高新技术产物。生物传感技术是一种专一性强、灵敏度高、可实现生物化学物质试剂检测、分析的生物分析技术。

生物传感器(Biosensor)的发展先后经历酶电极、介体酶电极、电化学生物传感器等三代，它在食品安全、环境监测和健康诊断等领域显示出独特优势。然而，传统的生物传感器都是以塑料、玻璃等为基底，存在不可再生、难降解、携带不便等弊端。

为此，以纸为基底的各种生物传感器被相继报道，如①一种纸基自供能生物传感器的制备方法，它提供了一种操作简单、低成本、自供能的三维中空通道微流控纸芯片适配体传感器并成功用于重金属离子检测；②一种纸基可视化分子印迹生物传感器检测农药残留的方法，它提供了一种操作简单、低成本、可视化、便携式的微流控纸芯片传感器，并成功通过颜色变化实现残留农药的可视化检测；③一种纸基高通量光致电化学生物传感器的构建方法，它提供了一种操作简单、高通量光致电化学生物传感器并成功用于同时检测三种癌细胞。

然而，这类生物传感器的基底—纸虽然绿色环保、可再生、易降解，可循环利用，却因纸内部孔隙大导致被检测液体易渗透，导路不连续致电信号采集准确性差，从而影响检测效率和准确度。

发明内容

本发明是要解决现有纸基生物传感器存在的内部孔隙大、表面粗糙，导致的检测效率和准确度差的问题，提供一种纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法。

本发明纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，包括以下步骤：

一、纳米纤维素的制备：

将纤维素原料依次进行抽提处理和去木质素处理，得到综纤维素，然后进行机械预处理、化学机械混合预处理或生物机械混合预处理，得到含半纤维素的纳米纤维素水液；

步骤一中所述抽提处理的具体步骤为：

将纤维素原料粉碎成90～120目粉末，然后进行苯醇抽提处理10～12h。所述苯醇为甲苯和无水乙醇按体积比2：1组成的混合物。

步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

①将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为1％～1.2％的亚氯酸钠溶液中，用冰醋酸调节溶液pH值到4～5，再在75～80℃恒温水浴锅中磁力加热搅拌1～1.5h；

②将步骤①得到的纤维素粉末浸入质量浓度为1％～1.2％的亚氯酸钠溶液中，用冰醋酸调节溶液pH值到4～5，再在75～80℃恒温水浴锅中磁力加热搅拌1～1.5h；

③重复步骤②5～6次，使木质素基本去除，然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素；

或步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为30％～35％的双氧水溶液中，加入硅酸镁(用硅酸镁作稳定剂)，在室温下磁力搅拌48～52h，使木质素基本去除；然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素；其中硅酸镁的质量为双氧水溶液质量的1％～1.5％。

步骤一中所述的机械预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素加入250mL的烧杯中，加入去离子水至综纤维素的质量分数为0.1％～0.3％

②然后用600bar的高压均质机械处理30～40min，即得含半纤维素的纳米纤维素水分散液，其中半纤维素占综纤维素质量的20％～30％；

步骤一中所述的化学机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素加入250mL的烧杯中，加入去离子水至综纤维素的质量分数为0.1％～0.3％，然后依次加入磷酸盐缓冲溶液、亚氯酸钠和TEMPO，然后磁力搅拌均匀，得到悬浊液；其中亚氯酸钠的质量为综纤维素质量的1～1.5倍，TEMPO的质量为综纤维素质量的15％～17％，综纤维素的质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1g:(80～100)mL；

②把次氯酸钠缓慢加入到正在搅拌的悬浊液中，然后用氢氧化钠调节pH值在6.8～7.0之间，再于60～65℃条件下水浴加热，并保持pH值为6.8～7.0，磁力搅拌3～4h，取出后进行抽滤、水洗，得到羧基化纤维素；其中次氯酸钠与综纤维素质量比为7.4:(90～110)；

③然后重新配成0.1％～0.3wt％的羧基化纤维素水液，再经14000～16000rpm的高速搅拌机机械分散20～30min，制得含半纤维素的纳米纤维素水液，其中半纤维素占综纤维素质量的10％～20％。

步骤一中所述的生物机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素放入锥形瓶中，加入pH＝5的乙酸/乙酸钠缓冲液，室温下磁力搅拌均匀；其中综纤维素的质量与缓冲液的体积比为1g:(24～26)mL；

②再加入质量浓度为1％～1.2％的纤维素酶水溶液，在30～50℃的条件下搅拌12～36h；其中综纤维素的质量与纤维素酶水溶液的体积比为1g：(20～40)mL；

③然后缓慢升温至90～95℃，搅拌0.5～1h，在高温下使酶失去活性；

④随后用布氏漏斗进行过滤、洗涤，去除水溶液中的酶及其他化学药品，得到酶预处理纤维素；

⑤将酶预处理纤维素配成0.1％～0.3wt％的悬浊液，500bar下高压均质2次，制备出纳米纤维素；其中半纤维素占综纤维素质量的20％～30％。

步骤一中所述的纤维素原料为粒度为100目以上的生物质原料粉末(如木材粉末、农作物秸秆粉末、废旧纸张或树叶、韧皮纤维原料等)；

二、纳米纸的制备：

将纳米纤维素水液经过真空抽滤、热压制得透明纳米纸，具体操作步骤如下：

①取一张孔径为0.22μm的亲水聚四氟乙烯滤纸平铺在砂芯漏斗上，并使滤纸与砂芯贴合紧密；

②将步骤一得到的纳米纤维素水液移入漏斗中，开启真空泵，抽滤至无水液流出，得到纳米纤维素自组装的湿膜；

③取出滤纸及湿膜，在湿膜上表面再覆盖一层亲水聚四氟乙烯滤纸，将夹有湿膜的滤纸置于两块玻璃平板之间，再在玻璃上表面压上200～500g的压力码，置于在50～70℃的烘箱中干燥48～60h，最终制得纳米纸；

三、纳米纸基生物传感器构建：

在纳米纸上构建反应区和三电极，从而形成纳米纸基生物传感器，具体操作步骤如下：

①取聚二甲基硅氧烷(PDMS)分散到丙酮溶剂中，然后通过注射器在纳米纸上打印反应区域边界，并于50～70℃下干燥，形成固化的反应区域；其中聚二甲基硅氧烷与丙酮的质量比为(5～10):1；

②然后在设计的反应区域内外喷墨打印三电极，分别是工作电极、辅助电极(对电极)和参比电极，室温下干燥，形成纳米纸基生物传感器。步骤三中工作电极和辅助电极由导电碳浆打印而成，参比电极由银-氯化银打印而成，导电垫也是由银-氯化银打印而成。

本发明的有益效果：

本发明提供一种利用纳米级纤维素为构筑单元，自组装形成的致密、透明、表面平整的纳米纸构建生物传感器的方法。其优点如下：

①半纤维素链段短，接枝在纳米纤维素长链段上，形成“刷子”状，比表面积大，且富含羟基官能团，能较好地固定生物小分子、大分子，利于传感器快速检测、识别；②半纤维素作为侧链，具有同纤维素主链相似的组成成分和结构单元，光折射率相当，利于获得高透光率的纳米纸；③纳米纤维素彼此通过丰富的官能团形成氢键，致使分子链相互自组装成致密的基体，进一步提高了纳米纸的透光率和力学强度；④纳米纤维素作为构筑单元，直径在纳米级，致使自组装成膜后表面粗糙度在微米以下尺度，粗糙度小，表面平整，利于构建稳定的反应区；⑤保留半纤维素，减少了纳米纤维素的提取步骤，使工艺流程简化；⑥半纤维素包覆在纳米纤维素周围，使机械分离提取纳米纤维素时，较容易分散开“半纤维素包覆的纳米纤维素”，能耗少，并避免了纳米纤维素分子链的“剪切致短”问题，利于得到长径比更高的纳米纤维素，潜在提高纳米纸的柔韧性，便于纳米纸基传感器的携带。经过检测，结果表明，普通纸的孔隙率高于20％、粗糙度大于50um，而本发明制备的纳米纸无明显空隙，粗糙度在微米级以下，纳米纸孔隙率大于1％、粗糙度小于1um，故本方法制备的生物传感器基底—纳米纸的结构，与普通的纸张(微米级孔隙和粗糙度)有本质区别。

该方法能制备表面平整、高透光率、稳定固载生物分子、灵敏准确检测的新型纳米纸基生物传感器，既丰富了生物传感器种类，又拓宽了纳米纤维素用途，提高了生物质材料的附加值。

本方法适用的纤维素原料：木材、竹材、农作物秸秆、韧皮纤维、草、叶、废旧纸张、海藻等。

附图说明

图1为实施例1步骤三得到的连续打印的纳米纸基生物传感器照片；

图2为纳米纸基生物传感器单个放大照片；其中1为纳米纸，2为PDMS，3为辅助电极，4为工作电极，5为参比电极，6为导电垫；

图3为纳米纸基生物传感器概念验证的循环伏安曲线对比图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，包括以下步骤：

一、纳米纤维素的制备：

将纤维素原料依次进行抽提处理和去木质素处理，得到综纤维素，然后进行机械预处理、化学机械混合预处理或生物机械混合预处理，得到含半纤维素的纳米纤维素水液；

所述的机械预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素中加入去离子水至综纤维素的质量分数为0.1％～0.3％；

②然后用600bar的高压均质机械处理30～40min，即得含半纤维素的纳米纤维素水分散液，其中半纤维素占综纤维素质量的20％～30％；

所述的化学机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素中加入去离子水至综纤维素的质量分数为0.1％～0.3％，然后依次加入磷酸盐缓冲溶液、亚氯酸钠和TEMPO，然后磁力搅拌均匀，得到悬浊液；其中亚氯酸钠的质量为综纤维素质量的1～1.5倍，TEMPO的质量为综纤维素质量的15％～17％，综纤维素的质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1g:(80～100)mL；

②把次氯酸钠缓慢加入到正在搅拌的悬浊液中，然后调节pH值在6.8～7.0之间，再于60～65℃条件下水浴加热，并保持pH值为6.8～7.0，磁力搅拌3～4h，取出后进行抽滤、水洗，得到羧基化纤维素；其中次氯酸钠与综纤维素质量比为7.4:(90～110)；

③然后重新配成0.1％～0.3wt％的羧基化纤维素水液，再经14000～16000rpm的高速搅拌机机械分散20～30min，制得含半纤维素的纳米纤维素水液，其中半纤维素占综纤维素质量的10％～20％；

所述的生物机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素放入锥形瓶中，加入pH＝5的乙酸/乙酸钠缓冲液，室温下磁力搅拌均匀；其中综纤维素的质量与缓冲液的体积比为1g:(24～26)mL；

②再加入质量浓度为1％～1.2％的纤维素酶水溶液，在30～50℃的条件下搅拌12～36h；其中综纤维素的质量与纤维素酶水溶液的体积比为1g：(20～40)mL；

③然后升温至90～95℃，搅拌0.5～1h，在高温下使酶失去活性；

④随后用布氏漏斗进行过滤、洗涤，得到酶预处理纤维素；

⑤将酶预处理纤维素配成0.1％～0.3wt％的悬浊液，500bar下高压均质2次，制备出纳米纤维素；其中半纤维素占综纤维素质量的20％～30％；

二、纳米纸的制备：

将纳米纤维素水液经过真空抽滤、热压制得透明纳米纸，具体操作步骤如下：

①取一张孔径为0.22μm的亲水聚四氟乙烯滤纸平铺在砂芯漏斗上，并使滤纸与砂芯贴合紧密；

②将步骤一得到的纳米纤维素水液移入漏斗中，开启真空泵，抽滤至无水液流出，得到纳米纤维素自组装的湿膜；

③取出滤纸及湿膜，在湿膜上表面再覆盖一层亲水聚四氟乙烯滤纸，将夹有湿膜的滤纸置于两块玻璃平板之间，再在玻璃上表面压上200～500g的压力码，置于在50～70℃的烘箱中干燥48～60h，最终制得纳米纸；

三、纳米纸基生物传感器构建：

在纳米纸上构建反应区和三电极，从而形成纳米纸基生物传感器，具体操作步骤如下：

①取聚二甲基硅氧烷分散到丙酮溶剂中，然后通过注射器在纳米纸上打印反应区域边界，并于50～70℃下干燥，形成固化的反应区域；

②然后在设计的反应区域内外喷墨打印三电极，分别是工作电极、辅助电极和参比电极，室温下干燥，形成纳米纸基生物传感器。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述抽提处理的具体步骤为：

将纤维素原料粉碎成90～120目粉末，然后进行苯醇抽提处理10～12h，所述苯醇为甲苯和无水乙醇按体积比2：1组成的混合物。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

①将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为1％～1.2％的亚氯酸钠溶液中，用冰醋酸调节溶液pH值到4～5，再在75～80℃恒温水浴锅中磁力加热搅拌1～1.5h；

②将步骤①得到的纤维素粉末浸入质量浓度为1％～1.2％的亚氯酸钠溶液中，用冰醋酸调节溶液pH值到4～5，再在75～80℃恒温水浴锅中磁力加热搅拌1～1.5h；

③重复步骤②5～6次，使木质素基本去除，然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为30％～35％的双氧水溶液中，加入硅酸镁，在室温下磁力搅拌48～52h，使木质素基本去除；然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素；其中硅酸镁的质量为双氧水溶液质量的1％～1.5％。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的纤维素原料为粒度为100目以上的生物质原料粉末。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：生物质原料粉末为木材粉末、农作物秸秆粉末、废旧纸张、树叶或韧皮纤维。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三①中聚二甲基硅氧烷与丙酮的质量比为(5～10):1。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中工作电极和辅助电极由导电碳浆打印而成，参比电极由银-氯化银打印而成，导电垫也是由银-氯化银打印而成。其它与具体实施方式一相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

本实施例纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，包括以下步骤：

一、纳米纤维素的制备：

将纤维素原料依次进行抽提处理、去木质素处理，得到综纤维素纤维，然后进行生物机械混合预处理，得到含半纤维素的纳米纤维素水液；

步骤一中所述抽提处理的具体步骤为：

将纤维素原料粉碎成100目粉末，然后进行苯醇抽提处理10h。所述苯醇是由甲苯和无水乙醇按体积比2：1组成的。

步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为30％的双氧水溶液中，加入硅酸镁(用硅酸镁作稳定剂)，在室温下磁力搅拌48h，使木质素基本去除；然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素；其中硅酸镁的质量为双氧水溶液质量的1％。

步骤一中所述的生物机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素放入锥形瓶中，加入pH＝5的乙酸/乙酸钠缓冲液，在磁力加热板上搅拌均匀；综纤维素与缓冲液的比例为1g:25mL；

②再加入质量浓度为1％纤维素酶水溶液，在40℃的条件下搅拌24h；其中综纤维素的质量与纤维素酶溶液的体积比为1g：30mL；

③然后缓慢升温至90℃，搅拌1h，在高温下使酶失去活性；

④随后用布氏漏斗进行过滤、洗涤，去除水溶液中的酶及其他化学药品，得到酶预处理纤维素；

⑤将酶预处理纤维素配成0.3wt％的悬浊液，500bar下高压均质2次，制备出纳米纤维素；其中半纤维素占综纤维素质量的25％。

步骤一中所述的纤维素原料为粒度为100目以上的木材粉末；

二、纳米纸的制备：

将纳米纤维素水液经过真空抽滤、热压制得透明纳米纸，具体操作步骤如下：

①取一张孔径为0.22μm的亲水聚四氟乙烯滤纸平铺在砂芯漏斗上，并使滤纸与砂芯贴合紧密；

②将步骤一得到的纳米纤维素水液移入漏斗中，开启真空泵，抽滤至无水液流出，得到纳米纤维素自组装的湿膜；

③取出滤纸及湿膜，在湿膜上表面再覆盖一层亲水聚四氟乙烯滤纸，将夹有湿膜的滤纸置于两块玻璃平板之间，再在玻璃上表面压上300g的压力码，置于在60℃的烘箱中干燥48h，最终制得纳米纸；

三、纳米纸基生物传感器构建：

在纳米纸上构建反应区和三电极，从而形成纳米纸基生物传感器，具体操作步骤如下：

①取聚二甲基硅氧烷(PDMS)分散到丙酮溶剂中，然后通过注射器在纳米纸上打印反应区域边界，并于60℃下干燥，形成固化的反应区域；其中聚二甲基硅氧烷与丙酮的质量比为10:1；

②然后在设计的反应区域内外喷墨打印三电极，分别是工作电极、辅助电极(对电极)和参比电极，室温下干燥，形成纳米纸基生物传感器。步骤三中工作电极和辅助电极由导电碳浆打印而成，参比电极由银-氯化银打印而成，导电垫也是由银-氯化银打印而成。

将实施例1得到的纳米纸基生物传感器进行概念验证：取两个反应区域，一个滴加的缓冲液中含有酶和铁氰化钾，另外一个缓冲液中只含有酶，分别对这两个生物传感器区域进行检测。当对相同浓度的葡萄糖溶液进行检测时，得到图3所示的曲线(图3中曲线a表示无介体纳米纸基生物传感器，曲线b表示存在介体的纳米纸基生物传感器)。从中可以发现不含有铁氰化钾的溶液的生物传感器，没有电信号产生；而含有酶的生物传感器能够产生明显的电信号，氧化峰电位为0.5V，还原峰电位为-0.3V，峰电位差ΔE＝0.8V，这说明在反应循环过程中，能够进行电子传递的物质是铁氰化钾，即铁氰化钾为扩散电子介体(电子探针)，能够在较低的电位下传输电子，而参与反应的酶和葡萄糖本身并不具有电活性，表明了纳米纸做基底构建生物传感器的可行性。

经检测，本实施例制备的传感器基底空隙率低于1％、表明粗糙度在1um以下，远远小于普通纸张孔隙率(大于20％)和表面粗糙度(大于50um)。

将实施例1得到的纳米纸基生物传感器用于葡萄糖含量测定：以pH＝7.4为酸碱环境，铁氰化钾为电子探针，葡萄糖氧化酶为催化剂，分别用二硝基水杨酸法和电化学生物传感器方法测定柚子水果中葡萄糖的含量，结果表明，二硝基水杨酸法和电化学生物传感器方法测得柚子中葡萄糖含量分别为51.6mg/mL和46mg/mL，表明设计构建的电化学生物传感器具有灵敏检测、快速可靠的优点。

实施例2：

本实施例纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，包括以下步骤：

一、纳米纤维素的制备：

将纤维素原料依次进行抽提处理、去木质素处理，得到综纤维素纤维，然后进行化学机械混合预处理，得到含半纤维素的纳米纤维素水液；

步骤一中所述抽提处理的具体步骤为：

将纤维素原料粉碎成100目粉末，然后进行苯醇抽提处理10h。所述苯醇是由甲苯和无水乙醇按体积比2：1组成的。

步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为30％的双氧水溶液中，加入硅酸镁(用硅酸镁作稳定剂)，在室温下磁力搅拌48h，使木质素基本去除；然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素；其中硅酸镁的质量为双氧水溶液质量的1％。

步骤一中所述的化学机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素加入250mL的烧杯中，加入去离子水至综纤维素的质量分数为0.3％，然后依次加入磷酸盐缓冲溶液、亚氯酸钠和TEMPO，然后磁力搅拌均匀，得到悬浊液；其中亚氯酸钠的质量为综纤维素质量的1倍，TEMPO的质量为综纤维素质量的16％，综纤维素的质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1g:90mL；

②把次氯酸钠缓慢加入到正在搅拌的悬浊液中，然后用氢氧化钠调节pH值在6.8之间，再于60℃条件下水浴加热，并保持pH值为6.8，磁力搅拌3h，取出后进行抽滤、水洗，得到羧基化纤维素；其中次氯酸钠与综纤维素质量比为7.4:100；

③然后重新配成0.3wt％的羧基化纤维素水液，再经15000rpm的高速搅拌机机械分散20min，制得含半纤维素的纳米纤维素水液，其中半纤维素占综纤维素质量的15％。

步骤一中所述的纤维素原料为粒度为100目以上的麦秸秆粉末；

二、纳米纸的制备：

将纳米纤维素水液经过真空抽滤、热压制得透明纳米纸，具体操作步骤如下：

①取一张孔径为0.22μm的亲水聚四氟乙烯滤纸平铺在砂芯漏斗上，并使滤纸与砂芯贴合紧密；

②将步骤一得到的纳米纤维素水液移入漏斗中，开启真空泵，抽滤至无水液流出，得到纳米纤维素自组装的湿膜；

③取出滤纸及湿膜，在湿膜上表面再覆盖一层亲水聚四氟乙烯滤纸，将夹有湿膜的滤纸置于两块玻璃平板之间，再在玻璃上表面压上300g的压力码，置于在60℃的烘箱中干燥48h，最终制得纳米纸；

三、纳米纸基生物传感器构建：

在纳米纸上构建反应区和三电极，从而形成纳米纸基生物传感器，具体操作步骤如下：

①取聚二甲基硅氧烷(PDMS)分散到丙酮溶剂中，然后通过注射器在纳米纸上打印反应区域边界，并于60℃下干燥，形成固化的反应区域；其中聚二甲基硅氧烷与丙酮的质量比为10:1；

②然后在设计的反应区域内外喷墨打印三电极，分别是工作电极、辅助电极(对电极)和参比电极，室温下干燥，形成纳米纸基生物传感器。步骤三中工作电极和辅助电极由导电碳浆打印而成，参比电极由银-氯化银打印而成，导电垫也是由银-氯化银打印而成。

经检测，本实施例制备的传感器基底空隙率低于1％、表明粗糙度在1um以下，远远小于普通纸张孔隙率(大于20％)和表面粗糙度(大于50um)。

将实施例2得到的纳米纸基生物传感器用于葡萄糖含量测定：以pH＝7.4为酸碱环境，铁氰化钾为电子探针，葡萄糖氧化酶为催化剂，分别用二硝基水杨酸法和电化学生物传感器方法测定梨子水果中葡萄糖的含量，结果表明，二硝基水杨酸法和电化学生物传感器方法测得梨子中葡萄糖含量分别为72mg/mL和67mg/mL，表明设计构建的电化学生物传感器具有灵敏检测、快速可靠的优点。

Claims (8)

1.纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

一、纳米纤维素的制备：

将纤维素原料依次进行抽提处理和去木质素处理，得到综纤维素，然后进行机械预处理、化学机械混合预处理或生物机械混合预处理，得到含半纤维素的纳米纤维素水液；

所述的机械预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素中加入去离子水至综纤维素的质量分数为0.1％～0.3％；

②然后用600bar的高压均质机械处理30～40min，即得含半纤维素的纳米纤维素水分散液，其中半纤维素占综纤维素质量的20％～30％；

所述的化学机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素中加入去离子水至综纤维素的质量分数为0.1％～0.3％，然后依次加入磷酸盐缓冲溶液、亚氯酸钠和TEMPO，然后磁力搅拌均匀，得到悬浊液；其中亚氯酸钠的质量为综纤维素质量的1～1.5倍，TEMPO的质量为综纤维素质量的15％～17％，综纤维素的质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1g:(80～100)mL；

②把次氯酸钠缓慢加入到正在搅拌的悬浊液中，然后调节pH值在6.8～7.0之间，再于60～65℃条件下水浴加热，并保持pH值为6.8～7.0，磁力搅拌3～4h，取出后进行抽滤、水洗，得到羧基化纤维素；其中次氯酸钠与综纤维素质量比为7.4:(90～110)；

③然后重新配成0.1％～0.3wt％的羧基化纤维素水液，再经14000～16000rpm的高速搅拌机机械分散20～30min，制得含半纤维素的纳米纤维素水液，其中半纤维素占综纤维素质量的10％～20％；

所述的生物机械混合预处理，具体操作步骤如下：

①将综纤维素放入锥形瓶中，加入pH＝5的乙酸/乙酸钠缓冲液，室温下磁力搅拌均匀；其中综纤维素的质量与缓冲液的体积比为1g:(24～26)mL；

②再加入质量浓度为1％～1.2％的纤维素酶水溶液，在30～50℃的条件下搅拌12～36h；其中综纤维素的质量与纤维素酶水溶液的体积比为1g：(20～40)mL；

③然后升温至90～95℃，搅拌0.5～1h，在高温下使酶失去活性；

④随后用布氏漏斗进行过滤、洗涤，得到酶预处理纤维素；

⑤将酶预处理纤维素配成0.1％～0.3wt％的悬浊液，500bar下高压均质2次，制备出纳米纤维素；其中半纤维素占综纤维素质量的20％～30％；

二、纳米纸的制备：

将纳米纤维素水液经过真空抽滤、热压制得透明纳米纸，具体操作步骤如下：

①取一张孔径为0.22μm的亲水聚四氟乙烯滤纸平铺在砂芯漏斗上，并使滤纸与砂芯贴合紧密；

②将步骤一得到的纳米纤维素水液移入漏斗中，开启真空泵，抽滤至无水液流出，得到纳米纤维素自组装的湿膜；

③取出滤纸及湿膜，在湿膜上表面再覆盖一层亲水聚四氟乙烯滤纸，将夹有湿膜的滤纸置于两块玻璃平板之间，再在玻璃上表面压上200～500g的压力码，置于在50～70℃的烘箱中干燥48～60h，最终制得纳米纸；

三、纳米纸基生物传感器构建：

在纳米纸上构建反应区和三电极，从而形成纳米纸基生物传感器，具体操作步骤如下：

①取聚二甲基硅氧烷分散到丙酮溶剂中，然后通过注射器在纳米纸上打印反应区域边界，并于50～70℃下干燥，形成固化的反应区域；

②然后在设计的反应区域内外喷墨打印三电极，分别是工作电极、辅助电极和参比电极，室温下干燥，形成纳米纸基生物传感器。

2.根据权利要求1所述的纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤一中所述抽提处理的具体步骤为：

将纤维素原料粉碎成90～120目粉末，然后进行苯醇抽提处理10～12h，所述苯醇为甲苯和无水乙醇按体积比2：1组成的混合物。

3.根据权利要求1所述的纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

①将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为1％～1.2％的亚氯酸钠溶液中，用冰醋酸调节溶液pH值到4～5，再在75～80℃恒温水浴锅中磁力加热搅拌1～1.5h；

②将步骤①得到的纤维素粉末浸入质量浓度为1％～1.2％的亚氯酸钠溶液中，用冰醋酸调节溶液pH值到4～5，再在75～80℃恒温水浴锅中磁力加热搅拌1～1.5h；

③重复步骤②5～6次，使木质素基本去除，然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素。

4.根据权利要求1所述的纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤一中所述去木质素处理的具体步骤为：

将抽提处理后的纤维素粉末浸入质量浓度为30％～35％的双氧水溶液中，加入硅酸镁，在室温下磁力搅拌48～52h，使木质素基本去除；然后将得到的液体用布氏漏斗进行过滤、洗涤，直至过滤液呈中性，最后得到综纤维素；其中硅酸镁的质量为双氧水溶液质量的1％～1.5％。

5.根据权利要求1所述的纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤一中所述的纤维素原料为粒度为100目以上的生物质原料粉末。

6.根据权利要求5所述的纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于：生物质原料粉末为木材粉末、农作物秸秆粉末、废旧纸张、树叶或韧皮纤维。

7.根据权利要求1所述的纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤三①中聚二甲基硅氧烷与丙酮的质量比为(5～10):1。

8.根据权利要求1所述的纳米纤维素纸基生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤三中工作电极和辅助电极由导电碳浆打印而成，参比电极由银-氯化银打印而成。