CN108918731A - 一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷rm的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，属于生物技术领域，从甜叶菊植株叶片中提取出甜菊糖苷粗提取液，用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物，利用甜叶菊的同科植物的生长优势扩大培养并大量获得该同科植物的成熟叶片，和/或利用该同科植物叶片生长富集甜菊糖苷RM的作用，从该同科植物的成熟健壮的叶片中提取出高含量的甜菊糖苷RM的过程。该方法利用甜叶菊的同科植物的生长优势扩大培养，可以大大增加甜菊糖苷RM的产量。

Description

一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法。

背景技术

甜叶菊为菊科(Compositae)甜叶菊属(Stevia)草本植物，原产南美巴拉圭地区，其叶片中含有甜菊糖苷(stevioside,ST)，其甜度为蔗糖的200-300倍，是天然的高甜度低能量型甜味物质。经现代科学证明，甜叶菊对高血压、糖尿病、动脉硬化、冠心病患者有较好的防治效果，喝甜菊茶，能帮助解除精神疲劳，促进新陈代谢，有益于人体健康。目前，已有研究表明甜菊糖苷类物质有，莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)、RB、RC、RD、RM等多种化合物。其中斯替维苷(ST)和瑞鲍迪苷A(RA)所占比例最大(一般在90％以上)，瑞鲍迪苷C(RC)、杜尔克苷A(DA)、甜菊双糖苷(RM)的含量较少。从不同甜菊糖苷成分的口感分析结果表明，糖基多的甜菊糖苷RA和RM比糖基少的甜菊糖苷ST味道更甜。近年来研究证明，甜叶菊中的甜菊双糖苷RM的甜度高于甜菊双糖苷RA，而苦味比甜菊双糖苷RA和ST弱，因而甜叶菊中的甜菊糖苷RM成分将具有更广的应用前景。但是，目前甜叶菊叶片中甜菊糖苷RM含量较少，如果甜菊糖苷RM成分能够在同科植物的菊花体内富集，而菊花植株比甜叶菊植株生物量大，则甜菊糖苷RM的产量将大大增加。

菊花(Chrysanthemum morifolium Rmat.)为菊科菊属多年生草本植物。菊花原产我国，具有1600多年的栽培历史。目前我国菊花品种超过3000多个，栽培面积达到8900公顷。菊花主要用于园林绿化、地被、室内装饰、茶用、药用以及酿酒等。目前菊花用于茶用的品种已筛选的‘皇冠’花朵呈鲜黄色、花朵大小约13cm，泡出的汤色金黄，非常适合做茶用菊花，因而其栽培面积不断扩大。但目前的茶用菊花‘皇冠’花朵泡出的茶味虽甘甜但略带苦味。如果利用甜叶菊中的甜菊糖苷提取液，能使茶用菊花的茶味更加甘甜，则其市场前景将会非常广阔。

发明内容

本发明提供了一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，该方法是从甜叶菊植株叶片中提取出甜菊糖苷粗提取液，用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物，利用甜叶菊的同科植物的生长优势扩大培养并大量获得该同科植物的成熟叶片，和/或利用该同科植物叶片生长富集甜菊糖苷RM的作用，从该同科植物的成熟健壮的叶片中提取出高含量的甜菊糖苷RM的过程。

优选的，所述的甜叶菊的同科植物采用菊花植株。

优选的，所述的用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物的介入培养的方式为：用甜菊糖苷粗提取液全株喷施甜叶菊的同科植物的植株。

优选的，所述的全株喷施方法是：先将甜菊糖苷粗提取液稀释3～40倍，利用喷雾器，在甜叶菊的同科植物植株上全株喷施，每星期喷施1～5次，每次间隔大于24h，连续喷施10-30次；末次喷施后间隔一星期收取该同科植物的成熟健壮的叶片用于提取出甜菊糖苷RM。

优选的，所述的从甜叶菊植株叶片中提取出甜菊糖苷粗提取液的工艺采用纤维素酶法提取方式：将甜叶菊植株叶片于40～85℃干燥至恒重、粉碎、过滤过筛后得到粉末，粉末中加入纯净水和纤维素酶，于40～85℃水浴15-85min酶解反应后，抽滤，离心后，取上清液；针对离心残渣，进一步加入纯净水和纤维素酶后，在40～85℃水浴中加热5～50min，抽滤，取滤液；上清液和滤液混合，在混合液中加入絮凝剂，在35～85℃水浴中水浴，除杂质后，搅拌过滤到容量瓶中定容，获得甜叶菊叶片中的甜菊糖苷粗提取液。

优选的，用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物通过上述的纤维素酶法提取该同科植物叶片中的甜菊糖苷，得该同科植物叶片甜菊糖苷粗提液，粗提液通过大孔型吸附树脂吸附，洗脱液洗脱，再通过微孔滤膜过滤，过滤的滤液蒸干后用流动相溶解，得甜菊糖苷富集溶液，测定其总甜菊糖苷含量和甜菊糖苷RM含量。

优选的，所述的絮凝剂采用氧化钙和硫酸铝钾的混合物。

优选的，所述的微孔滤膜孔径为0.45μm。

一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，是以甜叶菊叶片为原材料，其步骤是：

(1)甜菊糖苷粗提取液制备：采摘甜叶菊植株上的叶片，将叶片于40～85℃干燥至恒重、粉碎、过滤过筛后得到粉末，粉末中加入纯净水和纤维素酶，于40～85℃水浴15-85min酶解反应后，抽滤，离心后，取上清液；针对离心残渣，进一步加入纯净水和纤维素酶后，在40～85℃水浴中加热5～50min，抽滤，取滤液；上清液和滤液混合，在混合液中加入絮凝剂，在35～85℃水浴中水浴，除杂质后，搅拌过滤到容量瓶中定容，获得甜叶菊叶片中的甜菊糖苷粗提取液；

(2)甜菊糖苷粗提取液喷施菊花植株：先将甜菊糖苷粗提取液稀释3～40倍，利用喷雾器，在菊花上全株喷施，每星期喷施1～5次，每次间隔大于24h，连续喷施10-30次；末次喷施后间隔一星期收取菊花的成熟健壮的叶片用于提取出甜菊糖苷RM；

(3)纤维素酶法提取菊花叶片中甜菊糖苷：将步骤(2)中的菊花叶片干燥粉碎后，过滤，将过滤出的粉末称取置于烧杯中，加入纯净水和纤维素酶，于40-85℃水浴锅中水浴15-85min，用布氏漏斗抽滤，离心后，取上清液过滤。取出的残渣中，进一步加入纯净水和纤维素酶后，在水浴锅中加热5-50min，抽滤，取滤液。然后，在滤液中加入1-50g氧化钙和1-50g硫酸铝钾后，在35-85℃水浴中除杂质5-20min，搅拌过滤到容量瓶中定容，从而获得菊花叶片中的甜菊糖苷粗提取液；

(4)大孔树脂吸附法纯化甜菊糖苷粗提取液:将步骤(3)中得到的甜菊糖苷粗提液，通过装有大孔型吸附树脂的层析柱，此时，甜菊糖苷几乎全部被树脂吸附，弃去滤液；用65-99％的乙醇洗脱树脂所吸附的甜菊糖苷，直至树脂变白色，收集洗脱液。将洗脱液经微孔滤膜过滤；

(5)旋转蒸发仪法蒸干菊花中甜菊糖提取液：将步骤(4)中得到的滤液在35-55℃下的旋转蒸发仪上蒸干，菊花叶片甜菊糖苷成分被蒸干在圆底烧瓶中，用2-10ml的流动相65-99％乙醇溶解；

(6)高效液相色谱仪分析菊花叶片甜菊糖苷含量：通过高效液相色谱仪分析菊花叶片甜菊糖苷含量，发现总甜菊糖苷含量达0.81％，RM含量为0.50％。

本发明同时提供了一种利用菊花作为同科植物扩培或富集甜菊糖苷RM在大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法中的应用。

本发明的有益效果为：

通过将甜叶菊叶片提取液喷施到甜叶菊的同科植物中，将甜叶菊甜菊糖苷RM转化成甜叶菊的同科植物体内的甜菊糖苷RM，利用甜叶菊的同科植物的生长优势扩大培养，获得甜叶菊的同科植物体内的甜菊糖苷RM成分，可以大大增加甜菊糖苷RM的产量。

采用全株喷施的介入培养的方式具有吸收快、作用强、用量省、效率高的特点，甜叶菊叶片提取液能够很快地被植株的叶片或茎部吸收，直接进入植物体，参与作物的新陈代谢，作用效果比土壤灌溉等其他方式要显著。

通过控制喷施次数既可以使植株很好的吸收甜叶菊叶片提取液，又可以避免因喷施频率过高引起植株吸收不了，造成甜叶菊叶片提取液的浪费。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

本发明的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，是从甜叶菊植株叶片中提取出甜菊糖苷粗提取液，用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物，利用甜叶菊的同科植物的生长优势扩大培养并大量获得该同科植物的成熟叶片，和/或利用该同科植物叶片生长富集甜菊糖苷RM的作用，从该同科植物的成熟健壮的叶片中提取出高含量的甜菊糖苷RM的过程。其具体操作步骤是：

(1)获得甜菊糖苷粗提取液

采摘甜叶菊植株上的叶片，将叶片放入干燥箱内干燥，干燥箱温度在55℃条件下干燥48h后备用。将干燥的甜叶菊叶片500g粉碎后，倒入80目筛中过滤，将过滤出的粉末称取50g于烧杯中，加入230ml纯净水和5ml 2％纤维素酶，于60℃水浴锅中水浴50min，用布氏漏斗抽滤，离心后，取上清液过滤。取出的残渣中，进一步加入230ml纯净水和5ml 2％纤维素酶后，在水浴锅中加热20min，抽滤，取滤液。然后，在滤液中加入5g氧化钙和4g硫酸铝钾后，在60℃水浴中除杂质10min，搅拌过滤到1L容量瓶中定容，从而获得甜叶菊叶片中的甜菊糖苷粗提取液1L。

(2)甜菊糖苷粗提取液喷施菊花植株

将经过上述1过程获得的甜叶菊叶片中的甜菊糖苷粗提取液稀释10倍。当菊花株高达到30cm时，上午9：00将稀释液喷施菊花植株一次，每次喷施甜菊糖苷粗提取液的方法是全株喷施，而且以喷到菊花叶片上不滴水珠为度，每周喷一次，连续喷施4次。喷施4次后隔一周，在上午9：00时分，菊花植株上无露珠时，取菊花地上部所有健壮、无病斑的叶片，将菊花叶片放入干燥箱内干燥，干燥箱温度设为55℃，干燥时长为48h，干燥后备用。

(3)纤维素酶法提取菊花叶片中甜菊糖苷

采摘菊花品种“皇冠”植株上的叶片，将叶片放入干燥箱内干燥，干燥箱温度设为55℃，干燥48h后备用。将干燥的菊花叶片500g粉碎后，倒入80目筛中过滤，将过滤出的粉末称取50g于烧杯中，加入230ml纯净水和5ml 2％纤维素酶，于60℃水浴锅中水浴50min，用布氏漏斗抽滤，离心后，取上清液过滤。取出的残渣中，进一步加入230ml纯净水和5ml 2％纤维素酶后，在水浴锅中加热20min，抽滤，取滤液。然后，在滤液中加入5g氧化钙和4g硫酸铝钾后，在60℃水浴中除杂质10min，搅拌过滤到1L容量瓶中定容，从而获得菊花叶片中的甜菊糖苷粗提取液1L。

(4)大孔树脂吸附法纯化甜菊糖苷粗提取液

将经过上述3过程提取的菊花叶片甜菊糖苷粗提液，通过装有大孔型吸附树脂的层析柱，此时，甜菊糖苷几乎全部被树脂吸附，弃去滤液。用95％的乙醇洗脱树脂所吸附的甜菊糖苷，直至树脂变白色，收集洗脱液。将洗脱液经0.45μm微孔滤膜过滤。

(5)旋转蒸发仪法蒸干菊花中甜菊糖提取液

将经过上述4过程所得到的滤液在45℃下的旋转蒸发仪上蒸干，菊花叶片甜菊糖苷成分被蒸干在圆底烧瓶中，用3ml的流动相95％乙醇溶解，即可得到可得到甜菊糖苷RM。

(6)高效液相色谱仪分析菊花叶片甜菊糖苷含量

准确称取99％RA、85％RC、98.5％STV标准品5mg，置10mL容量瓶中，用流动相95％乙醇溶解，并定容到5ml，摇匀后备用。精密吸取对照溶液和处理的样品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，以外标法计算各个甜菊糖苷成分的含量。高效液相色谱仪检测条件设为：仪器型号，美国Waters 515型；检测器，Waters2487双波长紫外检测器；色谱柱，Kromasil 250×4.6氨基柱；流动相，乙腈：水＝80：20；波长，210nm；灵敏度，0.5AUFS；流速，0.9ml/min；进样量，10ul。

通过高效液相色谱仪分析菊花叶片甜菊糖苷含量，发现总甜菊糖苷含量达到0.88％。RM含量高达0.51％。

通过高效液相色谱法分析甜叶菊叶子、未喷施甜菊糖苷提取液的菊花叶子以及喷施甜菊糖苷提取液的菊花叶子中RM的含量，数据如下表所示：

表1菊花叶片中不同甜菊糖苷成分含量

注：Control：表明未喷施甜菊糖苷提取液的对照；Treatment1，2，3：表明喷施甜菊糖苷提取液的处理。

表2甜叶菊叶子检测数据如下：

上表中的数据表明喷施甜菊糖苷提取液的菊花叶片中RM的含量明显高于甜叶菊叶片及未喷施甜菊糖苷提取液的菊花叶片。

同时前期通过采用土壤灌溉的方式对菊花植株进行介入培养，对培养后的菊花叶片进行高效液相色谱分析发现叶片中的RM含量与未进行介入培养的菊花叶片比较无差异性变化。

以上结果表明通过菊花植株的富集作用将甜叶菊甜菊糖苷RM转化成甜叶菊的同科植物体内的甜菊糖苷RM，利用甜叶菊的同科植物的生长优势扩大培养，获得甜叶菊的同科植物体内的甜菊糖苷RM成分，可以大大增加甜菊糖苷RM的产量。

上面具体实施方式对本发明的一种利用甜叶菊提取液从菊花叶片中获得甜菊糖苷RM的方法做了详细的说明。但是，本发明并不限于上面所描述的内容，在本领域技术人员所具备的知识范围内，不脱离本发明构思做出的各种变化，仍落在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：该方法是从甜叶菊植株叶片中提取出甜菊糖苷粗提取液，用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物，利用甜叶菊的同科植物的生长优势扩大培养并大量获得该同科植物的成熟叶片，和/或利用该同科植物叶片生长富集甜菊糖苷RM的作用，从该同科植物的成熟健壮的叶片中提取出高含量的甜菊糖苷RM的过程。

2.根据权利要求1所述的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：甜叶菊的同科植物采用菊花植株。

3.根据权利要求1或2所述的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物的介入培养的方式为：用甜菊糖苷粗提取液全株喷施甜叶菊的同科植物的植株。

4.根据权利要求3所述的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：全株喷施方法是：先将甜菊糖苷粗提取液稀释3～40倍，利用喷雾器，在甜叶菊的同科植物植株上全株喷施，每星期喷施1～5次，每次间隔大于24h，连续喷施10-30次；末次喷施后间隔一星期收取该同科植物的成熟健壮的叶片用于提取出甜菊糖苷RM。

5.根据权利要求1所述的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：从甜叶菊植株叶片中提取出甜菊糖苷粗提取液的工艺采用纤维素酶法提取方式：

将甜叶菊植株叶片于40～85℃干燥至恒重、粉碎、过滤过筛后得到粉末，粉末中加入纯净水和纤维素酶，于40～85℃水浴15-85min酶解反应后，抽滤，离心后，取上清液；针对离心残渣，进一步加入纯净水和纤维素酶后，在40～85℃水浴中加热5～50min，抽滤，取滤液；上清液和滤液混合，在混合液中加入絮凝剂，在35～85℃水浴中水浴，除杂质后，搅拌过滤到容量瓶中定容，获得甜叶菊叶片中的甜菊糖苷粗提取液。

6.根据权利要求1或4所述的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：用甜菊糖苷粗提取液介入培养甜叶菊的同科植物通过权利要求5所述的纤维素酶法提取该同科植物叶片中的甜菊糖苷，得该同科植物叶片甜菊糖苷粗提液，粗提液通过大孔型吸附树脂吸附，洗脱液洗脱，再通过微孔滤膜过滤，过滤的滤液蒸干后用流动相溶解，得甜菊糖苷富集溶液，测定其总甜菊糖苷含量和甜菊糖苷RM含量。

7.根据权利要求5所述的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：所述絮凝剂采用氧化钙和硫酸铝钾的混合物。

8.根据权利要求6所述的一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：所述微孔滤膜孔径为0.45μm。

9.一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法，其特征在于：该方法是以甜叶菊品种叶片为原材料，其步骤是：

(1)甜菊糖苷粗提取液制备：采摘甜叶菊植株上的叶片，将叶片于40～85℃干燥至恒重、粉碎、过滤过筛后得到粉末，粉末中加入纯净水和纤维素酶，于40～85℃水浴15-85min酶解反应后，抽滤，离心后，取上清液；针对离心残渣，进一步加入纯净水和纤维素酶后，在40～85℃水浴中加热5～50min，抽滤，取滤液；上清液和滤液混合，在混合液中加入絮凝剂，在35～85℃水浴中水浴，除杂质后，搅拌过滤到容量瓶中定容，获得甜叶菊叶片中的甜菊糖苷粗提取液；

(2)甜菊糖苷粗提取液喷施菊花植株：先将甜菊糖苷粗提取液稀释3～40倍，利用喷雾器，在菊花上全株喷施，每星期喷施1～5次，每次间隔大于24h，连续喷施10-30次；末次喷施后间隔一星期收取菊花的成熟健壮的叶片用于提取出甜菊糖苷RM；

(3)纤维素酶法提取菊花叶片中甜菊糖苷：将步骤(2)中的菊花叶片干燥粉碎后，过滤，将过滤出的粉末称取置于烧杯中，加入纯净水和纤维素酶，于40-85℃水浴锅中水浴15-85min，用布氏漏斗抽滤，离心后，取上清液过滤；取出的残渣中，进一步加入纯净水和纤维素酶后，在水浴锅中加热5-50min，抽滤，取滤液；然后，在滤液中加入1-50g氧化钙和1-50g硫酸铝钾后，在35-85℃水浴中除杂质5-20min，搅拌过滤到容量瓶中定容，从而获得菊花叶片中的甜菊糖苷粗提取液；

(4)大孔树脂吸附法纯化甜菊糖苷粗提取液:将步骤(3)中得到的甜菊糖苷粗提液，通过装有大孔型吸附树脂的层析柱，此时，甜菊糖苷几乎全部被树脂吸附，弃去滤液；用65-99％的乙醇洗脱树脂所吸附的甜菊糖苷，直至树脂变白色，收集洗脱液，将洗脱液经微孔滤膜过滤；

(5)旋转蒸发仪法蒸干菊花中甜菊糖提取液：将步骤(4)中得到的滤液在35-55℃下的旋转蒸发仪上蒸干，菊花叶片甜菊糖苷成分被蒸干在圆底烧瓶中，用2-10ml的流动相65-99％乙醇溶解；

(6)高效液相色谱仪分析菊花叶片甜菊糖苷含量。

10.利用菊花作为同科植物扩培或富集甜菊糖苷RM在大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法中的应用。