CN108913781B - 一种基于actn3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法。其具体技术方案为：提取伊犁马基因组DNA；伊犁马ACTN3基因的PCR扩增；利用测序技术对所述伊犁马ACTN3基因进行序列测定；根据基因序列测定结果进行DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能。有益效果是：将分子生物学应用到运动马的选择与培育，具有简单、快捷、准确的优势，可以有效排除早期运动选材及选育过程中可能出现的干扰，能够在一定程度上加快运动马的培育进程，节省了时间和费用。

Description

一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种测伊犁马比赛速度潜能的分子生物学方法。
背景技术
赛马是一项集旅游、文化、体育、休闲娱乐等于一体的新兴产业，目前国内赛马发展势头良好，国内缺乏专门化运动马品种，大部分优质速度赛马还需从国外进口。伊犁马产于新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州，是我国自主培育的优良品种。伊犁马是通过以阿哈尔捷金、顿河马、奥尔洛夫、布琼尼马等引进轻型品种与哈萨克马杂交培育，并于1985年代通过专家组技术鉴定，正式命名为“伊犁马”。自上世纪90年代以来，为了提高伊犁马的专项性能，引进纯血马等轻型品种进行改良，其运动性能得到了较大的提升，具有力速兼备的特性，在国产运动马中具有较大的市场份额，并在国产马比赛中取得了优异的成绩。
科学选材是竞技运动的重要组成部分，现代分子生物学的发展为运动选材提供了更多的科学依据。从分子水平上寻找决定运动性能的功能性基因，根据运动特性的不同而进行精准的选材，能够更好的发挥运动性能优势，从而在比赛中取得更好的成绩。将分子生物学应用到运动马的选择与培育，能够在一定程度上加快运动马的培育进程。
针对现有技术要求，本发明提供了一种用ACTN3基因型预示和鉴定伊犁马速度潜能的分子标记方法分子生物学技术，即采用基因测序法检测ACTN3基因型，从而预示和鉴定伊犁马速度潜能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、快捷、准确的预测伊犁马比赛速度潜能的方法，结合序列比对结果，从基因特征上预测伊犁马比赛速度潜能，进而应用于速度赛伊犁马育种与早期运动选材。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，包括以下步骤：
步骤1:提取待预测伊犁马的基因组DNA；
步骤2：将步骤1中提取的伊犁马的基因组DNA中的ACTN3基因进行PCR扩增；
步骤3:利用测序技术对步骤2扩增后的伊犁马ACTN3基因进行序列测定；
步骤4：根据步骤2中的基因序列测定结果与GenBank序列号:HQ005425(纯血马序列)进行DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能。
所述步骤4中，比对结果中，待测伊犁马的ACTN3基因G9764A、G9773A和G9783A突变位点可作为伊犁马1600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9764A突变位点GG基因型赛马速度极显著高于AA基因型；G9773A突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型；G9783A突变位点AA基因型赛马速度极显著高于GG基因型；比对结果中，待测伊犁马的G9789A和A9803G突变位点可作为伊犁马3600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9789A和A9803G突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型速度。
本发明的有益效果是：从分子水平上寻找决定运动性能的功能性基因，根据运动特性的不同而进行精准的选材，能够更好的发挥运动性能优势，从而在比赛中取得更好的成绩。将分子生物学应用到运动马的选择与培育，具有简单、快捷、准确的优势，可以有效排除早期运动选材及选育过程中可能出现的干扰，能够在一定程度上加快运动马的培育进程，节省了时间和费用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，待预测伊犁马的基因组DNA的提取：采集待测伊犁马颈静脉血液5mL，枸橼酸钠抗凝，-20℃保存；参照《分子克隆实验指南》，用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，-20℃保存。
采用上述进一步方案的有益效果是:保证待预测伊犁马的基因组DNA提取的准确性，避免外界因素的干扰。
进一步，所述步骤2中，PCR扩增步骤包括DNA变性、退火及延伸，参加所述PCR反应的物质主要有五种，即反应引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
采用上述进一步方案的有益效果是：使目的DNA得以迅速扩增,特异性强、灵敏度高、操作简便、省时。
进一步，所述PCR反应引物序列为：
上游引物F：5’-ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGA
下游引物R：5’-GTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC
引物扩增片段大小为701bp。
采用上述进一步方案的有益效果是：有效地扩增模板DNA序列，增强PCR的特异性，增大PCR的成功几率。
进一步，所述PCR扩增反应体系为25μL体系：上下游引物各0.5μL，dNTP(10mmol·L-1·M-1)0.5μL，Taq Buffer 2.5μL，Taq酶(5U·μL-1)0.2μL，ddH2O加至25μL。
采用上述进一步方案的有益效果是：为PCR提供必要的物质，保证PCR产物的数量和质量。
进一步，所述PCR扩增反应循环条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，45个循环，72℃修复延伸10min，4℃保存。
采用上述进一步方案的有益效果是：准确控制温度时间及保存温度，保证PCR过程有序进行，产物的特异性扩增。
进一步，所述步骤4中，样品测序后用DNA MAN软件进行比对DNA序列。
采用上述进一步方案的有益效果是：提高序列比对的准确性和可靠性。
附图说明
图1为本发明ACTN3基因G9764A PCR产物测序峰图；
图2为本发明ACTN3基因G9773A PCR产物测序峰图；
图3为本发明ACTN3基因G9783A PCR产物测序峰图；
图4为本发明ACTN3基因G9789A PCR产物测序峰图；
图5为本发明ACTN3基因A9803G PCR产物测序峰图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
如图1所示，ACTN3基因G9764A PCR产物测序峰图。
图2为ACTN3基因G9773A PCR产物测序峰图。
图3是ACTN3基因G9783A PCR产物测序峰图。
图4是ACTN3基因G9789A PCR产物测序峰图。
图5是ACTN3基因A9803G PCR产物测序峰图。
实施例1
下述实施例中若无特殊说明，所用的材料及试剂均可从商业途径购买。
1、提取伊犁马基因组DNA
实验马匹来自2016年及2017年新疆伊犁马常态化赛事的马匹，选用参加1600m赛事的31匹伊犁马和参加3600m赛事的30匹伊犁马。
采集待测伊犁马颈静脉血液5mL，枸橼酸钠抗凝，-20℃保存；
参照《分子克隆实验指南》，用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，-20℃保存。
2、伊犁马ACTN3基因的PCR扩增
根据NCBI公布的纯血马序列(GenBank序列号:HQ005425)，设计特异性引物，引物序列如下：
上游引物F：5’-ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGA
下游引物R：5’-GTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC
引物扩增片段大小为701bp。
PCR扩增反应体系为25μL体系：上下游引物各0.5μL，dNTP(10mmol·L-1·M-1)0.5μL，Taq Buffer 2.5μL，Taq酶(5U·μL-1)0.2μL，ddH2O加至25μL。
PCR扩增反应循环条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，45个循环，72℃修复延伸10min，4℃保存。
3、对伊犁马ACTN3基因进行序列测定
将扩增产物送往上海生物工程技术有限公司进行测序，采用第一代测序技术。
4、DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能
根据基因序列测定结果，利用DNA MAN软件进行比对DNA序列，检测出突变位点：G9764A、G9773A、G9783A、G9789A和A9803G的基因型。本发明通过选取伊犁马ACTN3基因G9764A、G9773A、G9783A、G9789A和A9803G突变位点的基因型来预示和鉴定短距离速度赛伊犁马速度性能。
利用SPSS 18.0软件对不同基因型伊犁马速度性能进行差异性分析，结果如下：
表1：不同基因型与1600m速度(m/s)的关系
Figure BDA0001711424590000051
Figure BDA0001711424590000061
注：同列肩标中不同大写字母表示差异性极显著(P<0.01)；不同小写字母表示差异性显著(P<0.05)
其中G9764A、G9773A和G9783A突变位点可作为伊犁马1600m比赛速度性能的分子标记，可用于1600m速度赛伊犁马早期运动选择和选育，ACTN3基因G9764A突变位点GG基因型赛马速度极显著高于AA基因型；G9773A突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型；G9783A突变位点AA基因型赛马速度极显著高于GG基因型。也就是说，在待测伊犁马中，ACTN3基因G9764A突变位点为GG基因型和/或者G9773A突变位点为GG基因型和/或者G9783A突变位点为AA时，待测伊犁马具有1600m比赛速度的潜能,换言之，G9764A、G9773A和G9783A三个突变位点中任一个均可预测伊犁马是否具有1600m比赛速度的潜能。
表2：不同基因型与3600m速度(m/s)的关系
Figure BDA0001711424590000062
注：同列肩标中不同小写字母表示差异性显著(P<0.05)
G9789A和A9803G突变位点可作为伊犁马3600m比赛速度性能的分子标记，可用于3600m速度赛伊犁马早期运动选择和选育，ACTN3基因G9789A和A9803G突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型速度。也就是说，在待测伊犁马中，ACTN3基因G9789A突变位点为GG基因型和/或者A9803G突变位点为GG基因型时，待测伊犁马具有3600m比赛速度的潜能，换言之，G9789A和A9803G两个突变位点中任一个均可预测伊犁马是否具有3600m比赛速度的潜能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1:提取待预测伊犁马的基因组DNA；
步骤2：将步骤1中提取的伊犁马的所述基因组DNA中的ACTN3基因进行PCR扩增；
步骤3:利用测序技术对步骤2扩增后的伊犁马ACTN3基因进行序列测定；
步骤4：根据步骤2中的基因序列测定结果与GenBank序列号:HQ005425进行DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能；所述步骤4中，当比对结果中，所述待测伊犁马的ACTN3基因G9764A、G9773A和G9783A突变位点可作为伊犁马1600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9764A突变位点GG基因型赛马速度极显著高于AA基因型；G9773A突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型；G9783A突变位点AA基因型赛马速度极显著高于GG基因型；所述步骤4中，当比对结果中，所述待测伊犁马的G9789A和A9803G突变位点可作为伊犁马3600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9789A和A9803G突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型速度。
2.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述步骤1中，基因组DNA的提取：采集待测伊犁马颈静脉血液5mL，枸橼酸钠抗凝，-20℃保存；用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，-20℃保存。
3.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法,其特征在于，所述步骤2中，PCR扩增步骤包括DNA变性、退火及延伸，参加所述PCR反应的物质主要有五种，即反应引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
4.根据权利要求3所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述PCR反应引物序列为：
上游引物F：5’-ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGA
下游引物R：5’-GTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC
引物扩增片段大小为701bp。
5.根据权利要求4所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为25μL体系：上下游引物各0.5μL，dNTP(10mmol·L-1·M-1)0.5μL，TaqBuffer 2.5μL，Taq酶(5U·μL-1)0.2μL，ddH2O加至25μL。
6.根据权利要求4所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，PCR扩增反应循环条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，45个循环，72℃修复延伸10min，4℃保存。
7.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述步骤4中，样品测序后用DNA MAN软件进行比对DNA序列。
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