CN108885210A - 具有表面标记物的外来体的检测 - Google Patents

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Abstract

用于检测纳米颗粒外来体生物标记物靶的光谱反射成像装置包括照射源，所述照射源用多个独立波长的不相干光照射衬底。所述衬底包括氧化物层和结合剂，以选择性地将纳米颗粒外来体生物标记物靶与所述衬底结合。成像装置结合从所述衬底反射或透射穿过所述衬底的光，并且图像处理系统检测随所述衬底的反射性质变化而变的所述纳米颗粒外来体生物标记物靶。

Description

具有表面标记物的外来体的检测
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月6日提交的美国申请序列号第62/291,848号的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及包含生物分子(例如与癌症(例如胰腺癌)相关的生物分子)的颗粒(例如纳米颗粒，例如外来体，例如细胞外囊泡)的检测。
背景技术
检测生物靶分子以及纳米分子颗粒的能力是我们理解细胞生理学和疾病进展以及用于各种应用(例如早期和快速评估，例如疾病的诊断)的基础。需要用于检测纳米分子颗粒的系统和方法，其对于诊断、分期或确定受试者的疾病风险具有高灵敏度和特异性。
发明内容
外来体是在血液中循环的小的脂质双层封闭的细胞外囊泡，其大小约为30-200nm。外来体由多种细胞类型分泌，包括癌细胞。源自癌细胞的外来体特异性地富集细胞表面蛋白多糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)以及来自磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的其它蛋白质。本文描述了使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖阳性(例如，GPC1阳性)富集的外来体作为非侵入性评估、诊断和筛选工具的方法，以及实施这些方法的装置。例如，本文描述的方法和装置包括评估样品、评估受试者或诊断受试者的方法，包括：在适合于将样品中的循环细胞外囊泡(例如外来体)与结合剂结合的条件下，使来自受试者的样品与布置在衬底上的结合剂接触，其中，所述结合剂为例如对于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1具有特异性的结合剂，所述衬底为例如包含基本平坦表面的衬底；确定循环的细胞外囊泡，例如外来体，例如包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的外来体，是否与结合剂结合，从而评估样品，评估受试者或诊断受试者。
在某些实施方案中，本文描述的方法或装置可以使用诸如LED的非激光光源作为照射源在干涉测量检测原理下操作。LED成本极低，紧凑且坚固，是用于诊断和研究应用的大规模使用和分配的理想选择。本文描述的某些实施方案并入了通过衬底微阵列成像系统获得的定量分子结合测量，其具有使用低成本非相干照射源的能力，所述低成本非相干照射源使得能够以高放大率检测样品中发现的单个生物分子靶。
衬底增强的微阵列成像具有以无标记方式同时检测生物分子与数万个斑点的表面结合的能力。在某些实施方案中，本文描述的装置包括非相干光源，例如发光二极管(LED)，其可以用作用于检测和测量的干涉测量原理的照射源。LED成本极低，紧凑且坚固，因此是用于诊断和研究应用的大规模使用和分配的理想选择。这些装置和相关方法提供了低成本的非相干照射源，其使得检测和成像样品中的纳米颗粒，例如细胞外囊泡，例如包含生物标记物的外来体的高放大率实施方案能够实现。
在某些实施方案中，本文描述的装置有助于促进使用LED照射用于纳米颗粒细胞外囊泡(例如结合至表面的外来体生物标记物)的衬底增强检测的方法。在一个方面，本文描述了高通量光谱装置，其有助于同时记录整个衬底表面的反应的方法，包括使用至少一个非相干照射光源并通过成像装置对反射或透射光成像。在某些实施方案中，如本文所提供，至少一个非相干照射光源以420nm为中心。在某些实施方案中，如本文所提供，衬底包含60nm厚的透明层。
在一个方面，本发明涉及一种分离癌源性循环细胞外囊泡(例如，外来体)的方法，包括：使获自受试者的样品与衬底表面接触，其中衬底表面任选地包含对循环细胞外囊泡表面上表达的一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖具有特异性的一或多种结合剂，以使样品中存在的循环细胞外囊泡与衬底表面结合(例如通过吸附，例如通过一或多种结合剂)(例如非共价地，例如共价地)，从而分离出细胞外囊泡；并检测结合到衬底表面的细胞外囊泡。
另一方面，本发明涉及一种分离循环细胞外囊泡(例如，癌源性循环细胞外囊泡)(例如，外来体)的方法，包括：使获自受试者的样品与衬底表面接触，其中衬底表面任选地包含第一组对循环细胞外囊泡表面上表达的一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖具有特异性的一或多种结合剂，以使样品中存在的循环细胞外囊泡与衬底表面结合(例如通过吸附，例如通过一或多种结合剂)(例如非共价地，例如共价地)，从而分离出细胞外囊泡；使样品与第二组一或多种结合剂接触(例如，在将样品中存在的任何循环细胞外囊泡与衬底表面结合之前)(例如，在将样品中存在的任何循环细胞外囊泡与衬底表面结合之后)；检测结合到衬底表面的细胞外囊泡。
在某些实施方案中，一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含选自由以下组成的群组中的一项：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)。
在某些实施方案中，一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含或是磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。在某些实施方案中，一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含或是磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。
在某些实施方案中，癌症包括腺癌。在某些实施方案中，癌症包括肺癌。在某些实施方案中，肺癌包括非小细胞肺癌或小细胞肺癌。在某些实施方案中，癌症包括选自由以下组成的群组中的一项：食道癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、直肠癌、皮肤癌和前列腺癌。
在某些实施方案中，所述方法包括评估样品中循环细胞外囊泡的水平(例如量，例如数目，例如浓度)。在某些实施方案中，所述方法包括评估结合至衬底或衬底的预定部分或区域，存在于样品中或存在于获得样品的受试者中的循环细胞外囊泡的数目。
在某些实施方案中，所述方法包括提供与结合至衬底或衬底的预定部分或区域，存在于样品中或存在于获得样品的受试者中的循环细胞外囊泡的数目相关的参数值(例如，丰度参数)。
在某些实施方案中，所述方法包括确定结合至衬底或衬底的预定部分或区域，存在于样品中或存在于获得样品的受试者中的循环细胞外囊泡的大小(例如直径，例如体积)(例如，其中直径为约10nm至约3100nm，例如约50nm至约2000nm，例如约50nm至约1000nm，例如约20nm至约300nm，例如约30nm至约100nm，例如约50nm至约200nm，例如约200nm至约3000nm)。
在某些实施方案中，大小是指结合至衬底或衬底的预定部分或区域的细胞外囊泡的平均大小。
在某些实施方案中，所述方法包括提供与结合至衬底或衬底的预定部分或区域，存在于样品中或存在于获得样品的受试者中的循环细胞外囊泡的直径相关的参数值(例如，大小参数)。
在某些实施方案中，所述方法包括将丰度参数、大小参数(例如直径参数，例如体积参数)或与大小和丰度都相关的参数值与参考值进行比较(例如，从而评估样品，例如，从而表征样品，例如，从而诊断受试者)。
在某些实施方案中，如果丰度参数、大小参数或与大小和丰度都相关的参数中的一或多个的值满足与参考值的预定关系，则对样品或受试者进行分类。在某些实施方案中，如果丰度参数、大小参数或与大小和丰度都相关的参数中的一或多个的值大于参考值，则对样品或受试者进行分类，例如，将受试者分类为处于患有癌症的风险中或患有癌症。
在某些实施方案中，参考值是针对未患有预选病症(例如癌症)的受试者确定的值。在某些实施方案中，参考值随来自未患有预选病症(例如癌症)的受试者的丰度参数、直径参数或与直径和丰度都相关的参数中的一或多个而变。在某些实施方案中，丰度参数、直径参数或与直径和丰度都相关的参数中的一或多个的值大于参考值，并且受试者被分类为处于患有胰腺癌的风险中或患有胰腺癌，所述胰腺癌例如为胰腺腺癌。在某些实施方案中，如果丰度参数、直径参数或与直径和丰度都相关的参数中的一或多个的值大于参考值，则对样品或受试者进行分类，例如，将受试者分类为处于患有癌症的风险中或患有癌症。
在某些实施方案中，将样品分类为指示以下任何一种或其组合：a)不存在预选癌症(例如胰腺癌，例如胰腺腺癌，例如乳腺癌，例如肺癌，例如结肠癌，例如成胶质细胞瘤，例如卵巢癌)；b)存在预选癌症；c)存在预选组织的非癌性病症(例如胰腺，例如肺，例如结肠，例如乳房，例如脑，例如卵巢)；或d)存在预选组织的预选癌前病变。
在某些实施方案中，受试者被分类为具有以下任何一种或其组合的提升的可能：a)不具有预选癌症；b)具有预选癌症；c)具有预选组织的非癌性病症；或d)具有预选组织的预选癌前病变。
在某些实施方案中，所述方法包括监测或评估预选癌症的进展或状态。
在某些实施方案中，丰度参数、大小参数或与大小和丰度都相关的参数中的一或多个的值与预选癌症的进展或状态相关。
在某些实施方案中，所述方法包括响应于评估、分类或诊断，为受试者选择治疗方案。
在某些实施方案中，所述方法包括治疗受试者，例如治疗受试者的癌症(例如，其中癌症包括选自由以下组成的群组中的一项：食道癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、直肠癌、皮肤癌和前列腺癌)。
在某些实施方案中，一或多种结合剂包含选自由以下组成的群组中的一项：抗体分子、核酸、多肽和适体。
在某些实施方案中，抗体分子包含选自由以下组成的群组中的一项：单克隆抗体、多克隆抗体及其抗原结合片段(例如，其中一或多种结合剂包含啮齿动物、兔、小鼠或大鼠，抗人抗体或其结合片段)。
在某些实施方案中，抗体分子特异性结合在癌细胞表面上发现的抗原(例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如，其中磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含选自由以下组成的群组中的一项：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)(例如，其中抗体分子特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖的细胞外部分))。
在某些实施方案中，结合至衬底表面的第一结合剂(例如，结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的细胞外部分的第一结合剂，例如使磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的细胞外部分与衬底表面结合的结合剂)不同于第二结合剂，其与循环细胞外囊泡表面上的蛋白质结合(例如，结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的细胞外部分，例如结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的细胞外部分)(例如，其中蛋白质包含选自由以下组成的群组中的一项：CD63、CD81、CD9、阀蛋白-1(Flotillin-1)、甘露糖结合凝集素和凝集素)(例如，其中第二结合剂是癌症或疾病特异性的)(例如，其中第二结合剂在结合至衬底表面之前结合循环细胞外囊泡)(例如，其中第二结合剂附着于标记物(例如纳米颗粒，例如荧光团))。
在某些实施方案中，循环细胞外囊泡来自胰腺癌细胞。在某些实施方案中，循环细胞外囊泡来自乳腺癌细胞。
在某些实施方案中，体液包含血浆、血清、全血、唾液、脑脊髓液(CSF)或尿液。
在某些实施方案中，用反射成像系统评估样品，例如本文所述的成像系统。
在某些实施方案中，光谱反射成像系统包括：具有第一反射表面和提供第二反射表面的部分透明层的衬底；与第二反射表面结合的生物层，包括第一组一或多种结合剂；照射源，例如包括至少一个光源的照射源，其在窄频带中提供光并且将光的频带引导至衬底处(例如，其中窄频带中的一个包括以下波长范围：约300nm至约800nm，例如约400nm至约600nm，例如约405nm至约455nm，例如约420nm)；以及成像装置，其指向衬底的第二反射表面，并适于产生代表被第一反射表面、第二反射表面反射的来自照射源的光；以及来自第二表面上的颗粒的散射光的成像信号。
在某些实施方案中，第一反射表面是硅衬底，透明层是二氧化硅(SiO2)。
在某些实施方案中，光谱反射成像系统还包括图像采集和处理系统，其与成像装置连接并适于接收成像信号并在程序控制下在第二反射表面上产生生物层和/或颗粒的图像。
在某些实施方案中，透明层为约10nm厚至约100nm厚，例如，约40nm厚至约70nm厚，例如约60nm厚)。
在某些实施方案中，所述方法包括提供衬底的第一镜面反射界面，其具有用于将循环细胞外囊泡(例如，包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖的外来体)与衬底的第一镜面反射界面结合的结合剂；提供第二镜面反射界面，所述第二镜面反射界面基本上平行于第一镜面反射界面并位于其下面；用基本上以一或多个波长的光为中心的光照射表面；使用成像装置将从衬底反射或透射的光成像；产生衬底表面的光谱反射图像；以及将图像上的特征(例如，循环细胞外囊泡的直径)与表面上离散的循环细胞外囊泡相关联(例如，从而评估每个离散的循环细胞外囊泡的大小)。
在某些实施方案中，透明层为约60nm厚，其中窄频带中的一个为420nm(例如，其中成像发生在衬底浸入水溶液中时，例如，其中成像发生在干燥衬底之后)。
在某些实施方案中，成像装置包括具有高数值孔径的高放大率物镜的相机。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的窄带光源产生。
在某些实施方案中，成像装置是单色CCD或CMOS相机。
在某些实施方案中，由来自标准明视场显微镜光学装置的光源照射表面，并且其中反射光被透射到目镜。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的发光二极管(LED)产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长，并且其中成像装置是单色相机。
在某些实施方案中，成像装置是单色CCD或CMOS相机。
在某些实施方案中，分层衬底包括在Si晶片上层叠的任何约30-100nm(例如，约60nm)的SiO2。在某些实施方案中，用白光照射表面，并且成像装置包括彩色相机。在某些实施方案中，由RGB(红绿蓝)LED照射表面，并且成像装置包括彩色相机。在某些实施方案中，由宽带光源照射表面。
在某些实施方案中，相机还包括相机光轴上的空间滤波器。
在某些实施方案中，光是不相干的。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的窄带光源或宽带光源产生。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的发光二极管(LED)产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长。
在某些实施方案中，成像装置包括选自由以下组成的群组中的一项：单色CCD相机、CMOS传感器和彩色相机。在某些实施方案中，相机还包括相机光轴上的空间滤波器。
在某些实施方案中，检测颗粒包括检测颗粒在分层衬底表面上的结合。
在某些实施方案中，分层表面的表面包含用于结合预定义颗粒的结合剂，并且溶液包含至少一种预定义颗粒。
另一方面，本发明涉及一种衬底，例如本文所述的衬底，其上布置有本文所述的结合剂，例如对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂，例如抗体分子。在某些实施方案中，衬底包含与结合剂结合的循环细胞外囊泡(例如，外来体)。
另一方面，本发明涉及一种光谱反射成像系统，包括：具有第一反射表面和提供第二反射表面的薄半透明层的衬底；结合到第二反射表面的生物层，其包含一或多种对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂；包括至少一个光源的照射源，其在一个窄频带中提供光并且将光的频带引导至衬底处；以及成像装置，其指向衬底的第二反射表面，并适于产生代表来自照射源的光被第一反射表面和第二反射表面反射的成像信号。
在某些实施方案中，第一反射表面是硅衬底，半透明层是二氧化硅(SiO2)。
在某些实施方案中，所述系统包括图像采集和处理系统，其与成像装置连接并适于接收成像信号并且在程序控制下，在第二反射表面上产生生物层的图像。
在某些实施方案中，照射源产生白光，并且系统还包括具有至少一个滤波器的色轮，每个滤波器产生至少三个窄频带之一的光束，所述光束指向衬底。
另一方面，本发明涉及一种用于通过光谱反射成像系统进行分析的盒，所述盒包括衬底(例如，本文所述的衬底)，其上布置有对癌细胞(例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6))表面上发现的抗原具有特异性的结合剂(例如，抗体分子)。
另一方面，本发明涉及一种检测循环细胞外囊泡(例如外来体)与衬底表面的结合的方法，所述方法包括：提供衬底的第一镜面反射界面，其具有与衬底的第一镜面反射界面结合的一或多种结合剂(例如，对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂)；提供第二镜面反射界面，所述第二镜面反射界面基本上平行于第一镜面反射界面并位于其下面；用基本上以一或多个波长为中心的光照射表面；使用成像装置将从衬底反射或透射的光成像；产生衬底表面的图像；以及将图像上的特征与表面上的离散的循环细胞外囊泡生物标记物(磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6))相关联。
在某些实施方案中，成像装置包括具有高数值孔径的高放大率物镜的相机。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的窄带光源产生。
在某些实施方案中，成像装置是单色CCD或CMOS相机。
在某些实施方案中，由来自标准明视场显微镜光学装置的光源照射表面，并且其中反射光被透射到目镜。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的发光二极管(LED)产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长，并且其中成像装置是单色相机。
在某些实施方案中，成像装置是单色CCD或CMOS相机。
在某些实施方案中，分层衬底包括在Si晶片上层叠的任何30-100nm范围内(例如，60nm)的SiO2。
在某些实施方案中，用白光照射表面，并且成像装置包括彩色相机。
在某些实施方案中，由RGB(红绿蓝)LED照射表面，并且成像装置包括彩色相机。
在某些实施方案中，由宽带光源照射表面。
在某些实施方案中，相机还包括相机光轴上的空间滤波器。
另一方面，本发明涉及一种用于检测分层衬底表面上的颗粒的方法，包括：提供具有结合剂的分层衬底表面，例如对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂；使具有至少一个循环细胞外囊泡的溶液与所述衬底表面接触，所述细胞外囊泡包含外来体生物标记物(磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6))；用至少一个波长的光照射所述表面；使用成像装置将从衬底反射或透射的光成像；以及产生衬底表面的图像，以检测分层衬底表面上的细胞外循环囊泡(例如，外来体)。
在某些实施方案中，分层衬底包括在Si衬底上层叠的SiO2。
在某些实施方案中，光是不相干的。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的窄带光源产生。
在某些实施方案中，每个波长的光由不同的发光二极管(LED)产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长。在某些实施方案中，每个波长的光由白光源产生。在某些实施方案中，每个波长的光由标准明视场显微镜光学装置产生，并且其中反射光被透射到目镜。
在某些实施方案中，成像装置是单色CCD相机或彩色相机。在某些实施方案中，彩色相机是3-D CCD相机。在某些实施方案中，成像装置包括具有高数值孔径的高放大率物镜的相机。在某些实施方案中，相机还包括相机光轴上的空间滤波器。在某些实施方案中，检测颗粒包括检测外来体纳米颗粒在分层衬底表面上的结合。
在某些实施方案中，所述方法包括对于每个后续照射，用渐增波长的光顺序照射衬底(例如，其中多个波长的每个后续照射波长具有比先前照射的波长更长的波长)(例如，其中多个波长的每一个在约500nm至约750nm的范围内，例如，约525nm至约700nm)(例如，其中多个波长的第一波长为约420nm，例如，其中多个波长的第二波长为约535nm)。
涉及本发明的一个方面的实施方案的元件(例如，方法)可以应用于涉及本发明的其它方面的实施方案中，反之亦然。
附图说明
通过参考以下描述结合附图，本公开的前述和其它目的、方面、特征和优点将变得更加明显且更好理解，其中：
图1显示了根据本发明的说明性实施方案，用于进行干涉测量的光谱反射成像系统的示意图；
图2显示了根据本发明的说明性实施方案，用根据本公开的成像平台直接从血浆中检测GPC1外来体，并进行用扫描电子显微镜检测相同样品的并行比较；
图3说明了根据本发明的说明性实施方案，进行高放大率衬底增强微阵列成像所需的一些性质；
图4描绘了根据本发明的说明性实施方案，使用空间滤波器作为执行高放大率衬底增强微阵列成像的选项；
图5描绘了从癌症患者(胰腺癌、肺癌或乳腺癌患者)获得的血浆中外来体上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表面表达；
图6说明了用结合探针功能化的衬底的示意图，以及如何从衬底的两层光谱反射照射衬底的光，其干涉来自与一个衬底表面结合的颗粒的散射光；以及
图7A是根据本发明的说明性实施方案，用于衬底成像的仪器的图片；
图7B是根据本发明的说明性实施方案，光谱反射率芯片(衬底)的图像；
图7C是根据本发明的说明性实施方案，布置在微流控盒内的光谱反射率芯片的图像，其允许样品在衬底上流动；以及
图7D是根据本发明的说明性实施方案，衬底上的结合探针阵列的图示。
图8A-8C显示了根据本发明的说明性实施方案的示意图，其描绘了可以通过物理吸附或结合剂在传感器芯片上分离诸如外来体的细胞外囊泡。例如，结合剂可以靶向生物颗粒表面电荷、糖基化、脂质组成和/或表面蛋白。
图8A显示了根据本发明的说明性实施方案，用结合剂或多种结合剂的组合(例如蛋白质标记物，例如CD63抗体，CD9抗体，CD81抗体，Tim-4和阀蛋白-1抗体；例如，碳水化合物结合凝集素，例如雪花莲凝集素(GNA))功能化的衬底的示意图。
图8B显示了根据本发明的说明性实施方案的示意图，其中可以混合标记物的组合然后固定在衬底上。用两或多种混合在一起的结合剂将衬底功能化。
图8C显示了根据本发明的说明性实施方案的示意图，其中使样品与功能化的衬底接触以分离细胞外囊泡和外来体。可以使用干涉式生物传感器(例如，SP-IRIS)来量化捕获的囊泡的量。
图9显示了根据本发明的说明性实施方案，在衬底上分离细胞外囊泡(例如外来体)的方法的示意图。使样品与功能化的衬底接触以分离细胞外囊泡和/或外来体。可以在分离后或在分离期间使用SP-IRIS量化捕获的囊泡的量。固定并渗透含有捕获的细胞外囊泡和/或外来体的衬底。可以用二级标记物标记捕获的细胞外囊泡和/或外来体，以测量结合的颗粒与可能具有疾病特异性的二级标记物(例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1)的比例。
图10显示了根据本发明的说明性实施方案，在衬底上分离细胞外囊泡(例如外来体)的方法的示意图。
图11显示了吸附到SP-IRIS衬底的直径为100nm的聚苯乙烯珠的对比度百分比的信号，所述SP-IRIS衬底包含具有半透明二氧化硅上层的硅。将纳米颗粒吸附到二氧化硅上层。显示了不同氧化物厚度和照射波长的对比度百分比。
图12显示了对于直径范围为40至220纳米的纳米颗粒的对比度百分比的信号。针对不同的氧化物厚度和照射波长绘制颗粒对比度。
图13和14显示了根据本发明的说明性实施方案，分离癌源性循环细胞外囊泡(例如外来体)的方法。
图15显示了根据本发明的说明性实施方案，用于检测循环细胞外囊泡(例如外来体)与衬底表面的结合的方法。
具体实施方式
在整个说明书中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定组分，或者方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，预期另外存在基本上由所述组分组成或由所述组分组成的组合物，以及存在基本上由所述方法步骤组成或由所述方法步骤组成的根据本发明的方法。
应当理解，只要本发明仍然可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是不重要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
本文，例如在背景部分，中提及的任何出版物并不是承认所述出版物充当关于本文提出的任何权利要求的现有技术。背景部分是出于清楚的目的而给出的，并不意味着对任何权利要求的现有技术的描述。
在一或多个实施方案中，本发明涉及一种设备，其可以检测纳米颗粒细胞外囊泡(例如外来体)与衬底表面上的结合剂的结合。结合剂可以固定在分层衬底表面上，所述衬底表面具有光谱反射特征，所述特征在所述纳米颗粒固定在衬底表面上的结合层上时被改变。特别地，如本文将描述的，图像处理系统检测作为衬底反射性质变化函数的细胞外囊泡，并且图像处理系统包括正向模型以提供细胞外囊泡的精确和定量尺寸。特别地，所述装置的优选实施方案使用单一波长(带)的光来测量来自结合层的反射光与来自颗粒的散射光(光的散射)的干涉/混合。当细胞外囊泡与结合层结合时，来自这些物体的散射光干涉来自衬底表面的反射光，使得细胞外囊泡在成像装置上可观察为离散物体(点)。用一或多个波长的光照射衬底，并且如果样品中的一或多个细胞外囊泡物体与结合层结合，则纳米颗粒靶将作为单一离散物体出现在图像中，从而允许检测纳米颗粒靶的个体结合以及细胞外囊泡的定量尺寸。所述设备允许同时成像表面的整个视场以用于高通量应用。所述设备和方法具有几个优点，例如低成本、高通量、快速和便携的检测。
本文还描述了使用所述装置检测多种生物分子靶的方法。在一些方面，本文描述的装置和方法提供用于同时记录整个衬底表面的反应的高通量方法，包括使用提供非相干光的光源在至少一个波长进行采样，和使用成像装置对反射或透射光进行成像。所述装置可以包括发光二极管(LED)作为用于干涉测量检测原理的照射源。干涉测量可以使用光程长度差(OPD)提供所需的灵敏度和分辨率。
因此，本文描述了用于衬底增强检测分子或纳米颗粒或细胞外囊泡(例如外来体)与衬底表面结合的装置和方法。所述装置通过使用例如LED用至少一个波长的光照射衬底，并通过成像装置(例如2-D阵列像素相机)记录反射率来对反射光谱进行采样。以这种方式，同时记录整个视场的反射光谱。使用所述装置和方法，可以实现高通量微阵列成像。本发明还可以提供高放大率成像，用于检测30nm至几(2-3)微米范围内的生物分子纳米颗粒靶。这种高放大率检测可用于例如检测捕获表面上的单个颗粒。
所述仪器和工艺提供高通量光谱技术，其中通过使用诸如LED的窄带光源实现在至少一个波长采样，并且将反射或透射的光成像到成像装置，例如单色CCD相机，从而允许同时记录整个成像表面的反应。微阵列可以在分层衬底上制造(例如：在Si晶片上层叠的任何几nm的SiO2至100nm的SiO2)。优选实施方案包括绿色LED光源(535nm)和在Si晶片上层叠的100nm的SiO2氧化物。第二优选实施方案包括紫外LED光源(420nm)和在Si晶片上层叠的60nm的SiO2氧化物。用于在复杂介质中成像时使用的第三优选实施方案包括紫外LED光源(420nm)和在Si晶片上层叠的30至60nm的SiO2氧化物。
图1说明了根据本发明的实施方案，光谱反射成像系统100的示意图。系统100可包括：照射源101，其将光引导到衬底122上，衬底122具有氧化物层124和待检测的颗粒126；以及成像系统130，用于捕获由衬底122、氧化物层124以及颗粒126反射的光的图像。系统100还可以包括计算机系统140，用于控制照射源101并接收来自成像系统130的成像信号。在优选实施方案中，照射源101包括非相干光源(LED)102，其提供基本上为窄带波长的一个波长的非相干光。在一些实施方案中，照射源101可包括三或更多个非相干光源102、104、106，其产生三个不同波长的非相干光。发光二极管(LED)或等效光源各自在多个波长之一处提供非相干光。在一些实施方案中，照射源101可包括照射元件阵列，包括一或多个照射元件，其提供相同波长的光并以几何(例如，圆形或矩形)、随机或空间位移的阵列布置。可以通过聚焦透镜112和其它光学元件(例如，偏振透镜、滤波器和光调节部件，未示出)将来自照射源101的光引导到分束器114，分束器114将光引导到衬底122、氧化物层124和颗粒126上。可以提供光学部件用以调节光以基本上均匀地照射分层衬底122的整个表面。可以通过分束器114和成像透镜134将由衬底122、氧化物层124和颗粒126反射的光引导进入相机132以捕获衬底表面的图像。相机132可以是，例如，CCD相机(彩色或单色)并产生代表图像的图像信号。可以通过无线或有线连接将图像信号从相机132发送到计算机系统140。
计算机系统140可包括一或多个中央处理器(CPU)和相关存储器(包括易失性和非易失性存储器，例如RAM、ROM、闪速存储器、光存储器和磁存储器)以及用于向用户呈现信息的显示器146。存储器可以存储一或多个计算机程序，这些计算机程序可以由CPU执行以存储和处理图像数据并产生衬底表面的图像。可以提供额外的计算机程序用于分析图像数据和图像，以检测衬底122的氧化物层124的表面上的干涉图样和颗粒126。
计算机程序可以由计算机执行以实施根据本发明的一个或多个实施方案的方法，由此可以进行干涉测量。计算机程序可以控制包括一或多个LED的照射源101，所述LED可以用于照射分层衬底。底面和顶面之间的光程差(OPD)引起干涉图样。干涉图样可以通过CCD照相机132一次在整个衬底上成像为强度变化。
在一个替代实施方案中，每个非相干光源可以是光纤(未示出)，其将光引导到分层衬底122。可以提供光学部件用以调节光以基本上均匀地照射分层衬底122的整个表面。
图2A-2B显示了使用根据本公开的成像平台直接从血浆中检测GPC1外来体，并进行用扫描电子显微镜检测相同样品的并行比较。如图2A中可见，用本文公开的传感器平台将培养的PDAC患者样品成像，然后用四氧化锇(脂质特异性染色)将样品染色以用电子显微镜使样品可视化，如图2B所示。用传感器平台将培养的PDAC患者样品成像，如图2A所示进行裁剪，以实现与图2B中来自电子显微镜的图像相似区域的可视化。从并行比较可以看出，将样品的常见大特征以红色突出显示以便于在成像样品之间进行比较，且绿色圆圈显示一些成像的小纳米颗粒。
图3示出了进行高放大率衬底增强微阵列成像所需的性质。为了进行高放大率成像，应使用具有更高数值孔径(NA)的物镜。因为光是在高角度范围内收集的，所以大部分光均达到平均值(如图所示)。此外，薄氧化物的使用增加了空间分辨率的限制，因为当光通过时光的色散较小。
图4描绘了使用空间滤波器作为进行高放大率衬底增强微阵列成像的选项。为了维持单颗粒检测的横向分辨率和反射率曲线的对比度，可能希望在收集路径上放置空间滤波器，其将拒绝一定角度范围的反射光。可以在肥皂泡上的颜色上看到干涉的简单观察。使用光干涉进行高精度测量的最终实例之一是具有阿米(attometer)能力的LIGO。
图5描绘了从癌症患者(胰腺癌、肺癌或乳腺癌患者)获得的血浆中外来体上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表面表达。使用光谱反射成像技术进行测量，以用于计数来自人血浆的外来体的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3表达。数据显示癌症患者中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和/或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达更高。
图6描绘了在纳米颗粒细胞外囊泡(例如外来体)吸附到衬底表面上的结合剂时反射光的干涉散射。来自包括硅表面和二氧化硅表面的不同层的反射干涉从由结合剂捕获的纳米颗粒反射的光，引起反射光的变化，这可以由图像处理系统检测。特别地，衬底表面上的结合层上的所述纳米颗粒改变了入射光的反射特征，以干涉从硅表面和二氧化硅表面反射的光。与硅表面和二氧化硅的反射特性相比，图1的成像系统检测来自细胞外囊泡的反射中的干涉，并且图像处理系统包括正向模型以提供细胞外囊泡的精确和定量尺寸。成像装置的优选实施方案使用单一波长(带)的光来测量来自结合层的反射光与来自颗粒的散射光(光的散射)的干涉/混合。
图7A是如本文所述的用于衬底成像的仪器的图片。图7B是如本文所述的光谱反射率芯片(衬底)的图像。图7C是布置在微流控盒内的光谱反射率芯片的图像，其允许样品在衬底上流动。图7D是如本文所述的衬底上的结合探针阵列的图示。
图8A-8C显示了根据本发明的说明性实施方案的示意图，其描绘了可以通过物理吸附或结合剂在传感器芯片上分离诸如外来体的细胞外囊泡。例如，结合剂可以靶向生物颗粒表面电荷、糖基化、脂质组成和/或表面蛋白。
图8A显示了根据本发明的说明性实施方案，用结合剂或多种结合剂的组合(例如蛋白质标记物，例如CD63抗体，CD9抗体，CD81抗体，Tim-4和阀蛋白-1抗体；例如，碳水化合物结合凝集素，例如雪花莲凝集素(GNA))功能化的衬底的示意图。
图8B显示了图8A描绘的示意图的替代方案，可以混合标记物的组合然后固定在衬底上。用两或多种混合在一起的结合剂将衬底功能化。
图8C显示了根据本发明的说明性实施方案的示意图，其中使样品与功能化的衬底接触以分离细胞外囊泡和外来体。可以使用干涉式生物传感器(例如，SP-IRIS)来量化捕获的囊泡的量。
图9显示了根据本发明的说明性实施方案，在衬底上分离细胞外囊泡(例如外来体)的方法的示意图。使样品与功能化的衬底接触以分离细胞外囊泡和/或外来体。可以在分离后或在分离期间使用SP-IRIS量化捕获的囊泡的量。固定并渗透含有捕获的细胞外囊泡和/或外来体的衬底。可以用二级标记物标记捕获的细胞外囊泡和/或外来体，以测量结合的颗粒与可能具有疾病特异性的二级标记物(例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1)的比例。
图10显示了根据本发明的说明性实施方案，在衬底上分离细胞外囊泡(例如外来体)的方法的示意图。
图11显示了吸附到SP-IRIS衬底的直径为100nm的聚苯乙烯珠的对比度百分比的信号，所述SP-IRIS衬底包含具有半透明二氧化硅上层的硅。将纳米颗粒吸附到二氧化硅上层。显示了不同氧化物厚度和照射波长的对比度百分比。
图12显示了对于直径范围为40至220纳米的纳米颗粒的对比度百分比的信号。针对不同的氧化物厚度和照射波长绘制颗粒对比度。
在一些实施方案中，可以使用具有不同发射峰波长的三或更多个LED作为光源。在使用多于一个非相干光源的一些实施方案中，所使用的光源具有窄范围的波长，并且每个单独光源的波长之间的宽度小。在一些实施方案中，使用一或两个光源。
在本文所述的一些实施方案中，在层状衬底上制造微阵列或结合剂，所述衬底包括在Si晶片上层叠的任何几纳米至100nm的SiO2。在一些实施方案中，在层状衬底上制造微阵列或结合剂，所述衬底包括在Si晶片上层叠的95-100nm的SiO2。在一些实施方案中，在层状衬底上制造微阵列或结合剂，所述衬底包括在Si晶片上层叠的30-60nm的SiO2。优选实施方案包括绿色LED光源(接近535nm)和在Si晶片上层叠的100nm的SiO2氧化物。第二优选实施方案包括紫外LED光源(接近420nm)和在Si晶片上层叠的60nm的SiO2氧化物。用于在复杂介质中成像时使用的第三优选实施方案包括紫外LED光源(接近420nm)和在Si晶片上层叠的30至60nm的SiO2氧化物。本文描述的装置和方法可以部分地用于高放大率干涉测量，例如但不限于，在给定样品中检测细胞外囊泡，例如癌症的外来体生物标记物。
如本文所定义的“颗粒”是指通过本文所述的装置和方法检测的任何靶，其具有从几纳米高至几微米的半径。
高放大率干涉测量的使用是一种检测生物分子靶和颗粒的方法。本文描述的方法和设备提供通过具有高数值孔径的高放大率物镜成像并在相机的光轴上放置空间滤波器。高数值孔径物镜将允许在高放大率下成像，并且空间滤波器用于通过仅收集来自高角度或一定角度范围的入射光的光来保持分层衬底引起的干涉对比度。所描述的光学设置将允许检测亚波长结构而不会损失对比度或横向分辨率。
简化本文所述的成像装置的另一种方法可以是使用宽带光源和彩色CCD相机，其中光谱采样由相机完成。专用于检测不同颜色的相机的像素可用于提取包括在给定光谱带中的光的强度，从而实现光谱检测方案。
具有LED光源的实施方案的一个优点是基于LED的照射源使得成像装置更加坚固和便携，从而实现现场应用。另一个优点是本发明的高放大率能力。高放大率将允许检测结合剂表面上的单一生物分子靶(例如，长度或直径>几nm)。在一些实施方案中，白光源或具有3CCD或其它彩色相机的RGB LED可用于捕获三个不同波长的光谱信息以增加时间分辨率。例如，这有利于研究动态生物相互作用。
本文描述的装置促进了使用LED照射源用于衬底增强检测结合到表面的样品中的细胞外囊泡例如外来体生物标记物的方法。所述装置在一个方面提供了高通量光谱法，用于同时记录整个衬底表面的反应。所述装置和方法可用于任何高通量应用。因此，本发明的一个方面提供了一种用于固体衬底的高通量光学传感的平台或系统，包括照射源和成像装置。
在一些实施方案中，成像装置是相机。所述装置可用于细胞外囊泡，例如衬底上的外来体生物标记物，的多重和动态检测。
可以将装置的所有实施方案描述为功能模块，其包括记录在计算机可读介质上并且使计算机在其执行时实施方法步骤的计算机可执行指令。为清楚起见，可以通过功能来区分模块。然而，应该理解，模块不需要对应于离散的代码块，并且所描述的功能可以通过执行存储在各种介质上并在不同时间执行的各种代码部分来实施。
在一些实施方案中，所述装置提供一种用于获得关于固体衬底的光学传感的数据的系统，包括：a)确定模块，配置为确定光学信息，其中光学信息包括使用窄带光源在至少一个波长采样；b)存储装置，配置为存储从确定模块输出的数据；c)比较模块，适于将存储在存储装置上的数据与对照数据进行比较，所述比较是检索内容；以及d)显示模块，用于在客户端计算机上为用户显示检索内容的页面，其中检索内容是衬底的光吸收特性，其中某一光吸收特性表示外来体生物标记物的结合。
在一些实施方案中，本发明提供了一种计算机程序，包括计算机可读介质或存储器，其上记录有计算机可读指令以定义包括用于在计算机上实现方法的确定模块和比较模块的软件模块，所述方法包括a)用确定模块确定光学信息，其中光学信息包括使用窄带光源在至少一个波长采样；b)存储从确定模块输出的数据；c)用比较模块将存储装置上存储的数据与对照数据进行比较，所述比较是检索内容，以及d)在客户端计算机上为用户显示检索内容的页面，其中检索内容是固体衬底的光吸收特性，其中某一光吸收特性指示外来体生物标记物的结合。
“计算机可读介质”可以包括用于进行本发明方法步骤的数据和计算机可执行指令。合适的计算机可读介质包括软盘、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、硬盘驱动器、闪速存储器、ROM/RAM、磁带等。可以用合适的计算机语言或若干语言的组合来编写计算机可执行指令。基本的计算生物学方法在，例如，塞图巴尔(Setubal)和梅丹尼斯(Meidanis)等人中有描述。
计算生物学方法简介(Introduction to Computational Biology Methods)(PWS出版社(PWS Publishing Company)，波士顿(Boston)，1997)；扎尔茨贝格(Salzberg)，瑟尔斯(Searles)，卡西弗(Kasif)，(编辑)，分子生物学中的计算方法(Computational Methodsin Molecular Biology)，(爱思唯尔(Elsevier)，阿姆斯特丹(Amsterdam)，1998)；拉希迪(Rashidi)和比勒(Buehler)，生物信息学基础：生物科学和医学应用(BioinformaticsBasics:Application in Biological Science and Medicine)(CRC出版社(CRC Press)，伦敦(London)，2000)；以及韦莱(Ouelette)和别泽瓦尼斯(Bzevanis)，生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南(Bioinformatics:A Practical Guide for Analysis of Gene andProteins)(约翰威立出版有限公司(Wiley&Sons，Inc.)，第二版，2001)。
在一些方面，所述装置的实施方案的功能模块包括确定模块、存储装置、比较模块和显示模块。确定模块可包括使用光学仪器来确定和提供光学信息的计算机可执行指令。如本文所用的“光学仪器”是指处理光波以增强图像以供观察，或分析光波(或光子)以确定多种特征光学性质之一的任何仪器。
用于确定光学性质的已知的确定模块包括，例如但不限于显微镜、照相机、干涉仪(用于测量光波的干涉性质)、光度计(用于测量光强度)；旋光仪(用于测量偏振光的色散或旋转)、反射计(用于测量表面或物体的反射率)、折射计(用于测量各种材料的折射率)、光谱仪或单色仪(用于产生或测量光谱的一部分，以用于化学或材料分析的目的)、自动准直仪(用于测量角度偏转)和屈度计(用于确定镜片如眼镜、隐形眼镜和放大镜镜片的屈光力)。
如本文所定义的“摄谱仪”或“光谱仪”是用于测量电磁光谱的特定部分上的光的性质的光学仪器，通常用于光谱分析以识别材料。测量的变量最通常是光的强度，但也可以是例如偏振态。自变量通常是光的波长，一般表示为米的分数，但有时表示为与光子能量成正比的单位，例如波数或电子伏特，其与波长具有倒数关系。光谱仪用于光谱学，以产生光谱线并测量它们的波长和强度。光谱仪是一个适用于在很宽的波长范围内(从伽马射线和X射线到远红外线)工作的仪器的术语。如果目标区域被限制在可见光谱附近，则所述研究称为分光光度法。
分光光度法涉及使用分光光度计。如本文所定义的“分光光度计”是光度计(用于测量光强度的装置)，其可以测量作为颜色函数的强度，或者更具体地，光的波长。分光光度计有很多种。用于对它们进行分类的最重要的区别是它们的运行波长，它们使用的测量技术，它们如何获得光谱，以及它们被设计用于测量的强度变化的来源。分光光度计的其它重要特征包括光谱带宽和线性范围。有两大类分光光度计；单光束和双光束。双光束分光光度计测量两个不同光路上的光强度比，单光束分光光度计测量绝对光强度。虽然比例测量更容易，并且通常更稳定，但单光束仪器具有优势；例如，它们可以具有更大的动态范围，并且它们可以更紧凑。历史上，分光光度计使用单色仪来分析光谱，但也存在使用光电传感器阵列的分光光度计。尤其是对于红外分光光度计，存在使用傅里叶变换技术以在称为傅立叶变换红外技术的技术中更快地获取光谱信息的分光光度计。分光光度计量化物质。分光光度计最常见的应用是光吸收的测量，但它们也可以设计用于测量漫反射率或镜面反射率。严格地说，即使是发光仪器的发射部分也是一种分光光度计。
在确定模块中确定的光学信息可以保存到存储装置并由存储装置读取。如本文所用的“存储装置”旨在包括任何合适的计算或处理设备或配置或适于存储数据或信息的其它装置。适用于本发明的存储装置的实例包括独立计算设备；通信网络，包括局域网(LAN)、广域网(WAN)、互联网、内联网和外联网；以及包括“云”的本地和分布式处理系统。存储装置还包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，例如光盘等；电存储介质，例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；一般硬盘和这些类别的混合，例如磁/光存储介质。所述介质适合或配置用于在上面记录序列信息或表达水平信息。数据通常以数字形式提供，可以电子方式传输和读取，例如通过因特网，磁盘或任何其它电子或非电子通信模式。
如本文所用“存储”是指用于在存储装置上存储信息使得可以从所述装置读回信息的过程。本领域技术人员可以容易地采用任何目前已知的用于在已知介质上记录信息的方法来生成包括序列信息或表达水平信息的产品。
可以使用各种软件程序和格式将光学信息存储在存储装置上。可以采用任何数量的数据处理器结构格式(例如，文本文件或数据库)来获得或创建其上记录有信息的介质。
通过以计算机可读形式提供光学信息，可以使用可读形式的光学信息来比较特定光学性质与存储在比较模块的数据库内的光学信息。例如，可以将来自给定样本的所确定的光学信息与对照数据光学信息(例如，从对照样本获得的数据)进行直接比较。以计算机可读形式进行的比较是来自比较模块的检索内容，其可以通过各种手段处理。
然后可以通过“显示模块”显示检索内容。
如本文所用的盒被定义为配制为包含硅/二氧化硅芯片，其具有透明且高质量的成像窗口(COP或聚碳酸酯)，和薄的流体通道。
如本文所定义的“发光二极管(LED)”是基于半导体二极管的电子光源。当二极管正向偏置(打开)时，电子能够与空穴重新结合，能量以光的形式释放。这种效应称为电致发光，并且光的颜色由半导体的能隙决定。LED通常面积小(小于1毫米)，带有集成的光学部件，以形成其辐射方向图，并有助于测量通过给定溶液的光分数。在分光光度计中，将来自灯的光引导通过单色仪，单色仪从连续光谱中拾取一个特定波长的光。所述光通过正在测量的样品。在样品之后，用光电二极管或其它光传感器测量剩余光的强度，然后计算所述波长的透射比。简而言之，分光光度计中的事件顺序如下：光源透过样品，样品吸收光，检测器检测样品吸收的光量，然后检测器将样品吸收的光量转换为数字，将所述数字传送到比较模块以进一步操纵(例如曲线平滑，基线校正)。许多分光光度计必须通过称为“归零”的程序进行校准。将某些标准物质的吸光度设定为基线值，因此相对于初始“归零”物质记录所有其它物质的吸光度。然后分光光度计显示％吸光度(相对于初始反射吸收的光量)。与普通二极管一样，LED由浸渍或掺杂有杂质的半导体材料芯片组成，以形成p-n结。与在其它二极管中一样，电流很容易从p侧或阳极流向n侧或阴极，但不能反向流动。电荷载流子-电子和空穴-从不同电压的电极流入结。当电子遇到空穴时，它落入较低的能级，并以光子的形式释放能量。所述波长的光发射，因此它的颜色取决于形成p-n结的材料的带隙能量。在硅或锗二极管中，电子和空穴通过非辐射跃迁重新组合，不产生光发射，因为这些是间接带隙材料。用于LED的材料具有直接带隙，能量对应于近红外、可见或近紫外光。LED通常构建在n型衬底上，其中电极附着在其表面上沉积的p型层上。P型衬底虽然不太常见，但也会发生。许多商用LED，尤其是GaN/InGaN，也使用蓝宝石衬底。用于LED生产的大多数材料具有非常高的折射率。这意味着很多光将被反射回材料/空气表面界面处的材料。用于本发明的LED包括但不限于：
如本文所定义的衬底表面可包括“镜面反射界面”。这种镜面反射界面指的是入射光在其上经历“镜面反射”的那些表面，即来自表面的光(或有时是其它种类的波)的镜面类反射，其中来自单个入射方向的光(射线)被反射到单个出射方向。表面、衬底或界面的这种镜面反射行为由反射定律描述，其表明入射光(入射线)的方向和反射的出射光(反射线)的方向相对于表面法线形成相同的角度，因此入射角等于反射角；在数学上定义为θi＝θr。镜面反射的第二个定义特征是入射、法线和反射方向是共面的。可以使用例如光泽计准确地测量镜面反射。测量基于物体的折射率实现。在本文所述方面的一些实施方案中，镜面反射界面包括具有透明介电层的衬底，例如硅衬底上的二氧化硅(SiO2)层。在本文方面的一些实施方案中，二氧化硅(SiO2)层具有用于结合纳米颗粒例如其上的外来体生物标记物的结合剂层。在一些实施方案中，替代的透明介电层例如氮化硅以及其它涂层可用作薄透明或镜面反射界面层。
传感器和方法的应用
检测样品中生物细胞外囊泡(例如外来体，例如包含外来体生物标记物的外来体，例如细胞表面生物标记物)的能力是我们理解细胞生理学和疾病进展以及用于各种应用(例如早期和快速检测)的基础。本文描述的是快速、灵敏、易于使用和廉价的生物传感器，其可用于涉及检测纳米颗粒的各种应用，从研究和医学诊断到癌症的检测。
因此，在一个方面，本文所述的衬底用于检测样品中细胞外囊泡(例如外来体，例如包含外来体生物标记物的外来体，例如细胞表面生物标记物)与衬底层的结合，其中接触的样品中的外来体生物标记物与衬底层的结合相对于在不存在样品的情况下的光程长度改变了光程长度，导致通过本文所述的装置和方法检测和测量的干涉图样。在一些实施方案中，与衬底接触的样品可具有多个生物分子靶，使得多个细胞外囊泡结合到衬底层并通过本文所述的装置和方法检测。
装置和衬底可用于平行研究一或多种特异性结合相互作用，即多重应用。可以检测样品中的一或多个特定细胞外囊泡与各个靶表面的结合。用光照射衬底，并且如果样品中的一或多个纳米颗粒靶结合一或多个靶，则它们将作为单个离散物体显示在图像中，从而允许检测纳米颗粒靶的个体结合。在生物传感器衬底表面包括包含一或多个特定靶的一或多个不同靶位置的阵列的实施方案中，则从衬底的每个不同位置检测干涉图样。
因此，在一些实施方案中，多个特定靶分子可以以阵列形式固定在衬底表面上。然后使衬底与目标测试样品接触，所述测试样品包含潜在的纳米颗粒靶，例如外来体生物标记物。只有特异性结合靶表面的外来体才与衬底结合。对于高通量应用，生物传感器可以阵列的阵列排列，其中在衬底表面上包括特定结合分子靶阵列的若干衬底以阵列排列。
因此，装置和衬底用于检测样品中存在的多个纳米颗粒靶中的一或多个与生物传感器衬底层的结合，所述生物传感器衬底层包含附着于衬底层的多个固定的靶分子中的一或多个。例如，一或多个特定的固定分子可以衬底层表面上的一或多个不同位置的阵列排列。一或多个不同位置可以限定直径约50-500微米，或约150-200微米的微阵列点。
样品是指含有生物分子靶的任何样品，例如，如血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰液、囊液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液、前列腺液或细胞裂解液。样品也可以从环境来源获得，例如从污染的湖泊或其它水体获得的水样品，或从认为被污染的食品来源获得的液体样品。
如本文所用的术语“样品”或“生物样品”是指任何样品，包括但不限于细胞、生物体、裂解细胞、细胞提取物、核提取物、细胞或生物体的组分、细胞外液、培养细胞的介质、血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰液、囊液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液和前列腺液。此外，样品可以是病毒或细菌样品，从环境来源获得的样品，例如污染水体、空气样品或土壤样品，以及食品工业样品。
如本文所用的术语“标记”或“标签”是指能够产生指示测定样品中存在靶的可检测信号的组合物。合适的标记包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光部分等。因此，标记是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。
冠词“一(a)”和“一个(an)”在本文中用于指该冠词的一或一个以上(即，至少一个)语法对象。举例来说，“元素”表示一个元素或一个以上的元素。因此，除非上下文另有明确说明，否则在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。因此，例如，提及包含“药剂”的药物组合物包括涉及两或多种药剂。
如本文所用的术语“包含”是指除了所呈现的限定元素之外还可以存在其它元素。“包含”的使用表示包含而不是限制。术语“由…组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各个组分，其不包括在所述实施方案的描述中未记载的任何元素。如本文所用的术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些元素。所述术语允许存在不会实质上影响本发明所述实施方案的基本和新颖或功能特征的元素。除了在操作实施例中或另有说明之外，否则本文所用的表示成分量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以表示+/-百分比。
外来体
外来体是小的、膜结合的囊泡，尺寸为40-150nm(潘(Pan)等人，1985；特拉姆(Trams)等人，1981)。它们由多种不同的细胞类型分泌，例如癌细胞、间充质细胞、凝血细胞(卡勒特(Kahlert)和卡鲁里(Kalluri)，肿瘤微环境中的外来体影响癌症进展和转移(Exosomes in tumor microenvironment influence cancer progression andmetastasis)，分子医学杂志(J.Mol Med.)(柏林(Berl))，91:431-437,2013；海涅南(Heijnen)等人，活化血小板释放两种类型的膜囊泡：通过表面脱落的微泡和源自多泡体和α粒子的胞吐作用的外来体(Activated platelets release two types of membranevesicles:microvesicles by surface shedding and exosomes derived fromexocytosis of multivesicular bodies and alpha-granules)，血液(Blood)，94:3791-3799,1999；拉波索(Raposo)等人，B淋巴细胞分泌抗原呈递囊泡(B lymphocytes secreteantigen-presenting vesicles)，实验医学杂志(The Journal of ExperimentalMedicine)，183:1 161-1172,1996)、免疫细胞(泰里(Thery)等人，外来体：组成、生源论和功能(Exosomes:composition,biogenesis and function)，自然评论免疫学(Nat.Rev.Immunol)，2:569-579,2002)、血小板(贾诺夫斯卡·维切雷克(Janowska-Wieczorek)等人，来自活化血小板的微泡诱导肺癌的转移和血管生成(Microvesiclesderived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lungcancer)，癌症国际杂志(International Journal of Cancer)，1 13:752-760,2005；贾西(Jazieh)等人，生物标记物在胰腺腺癌管理中的临床应用(The clinical utility ofbiomarkers in the management of pancreatic adenocarcinoma)，放射肿瘤学研讨会(Seminars in Radiation Oncology)，24:67-76,2014)以及内皮细胞(赫根瑞德(Hergenreider)等人，内皮细胞和平滑肌细胞之间通过miRNA进行的抗动脉粥样硬化交流(Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth musclecells through miRNAs)，自然细胞生物学(Nature Cell Biology)，14:249-256,2012)。外来体生源论的第一步涉及来自晚期内体内界膜的向内出芽(特拉科维奇(Trajkovic)等人，神经酰胺触发外来体囊泡出芽到多泡内体中(Ceramide triggers budding of exosomevesicles into multivesicular endosomes)，科学(Science)，319:1244-1247,2008)。在此过程中，外来体充满来自亲代细胞的RNA分子和蛋白质(特拉姆(Trams)，微泡形式的膜胞外酶的剥离(Exfoliation of membrane ecto-enzymes in the form of micro-vesicles)，生物化学与生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)，645:63-70,1981；特拉科维奇(Trajkovic)，同上)。在释放到细胞外空间后，肿瘤来源的外来体可以将具有致癌活性的蛋白质和RNA转移到受体细胞(格兰赫(Grange)等人，从人肾癌干细胞释放的微泡刺激血管生成和肺转移前微环境的形成(Microvesicles released from humanrenal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lungpremetastatic niche)，癌症研究(Cancer Research)，71:5346-5356,2011；佩纳多(Peinado)等人，黑素瘤外来体通过MET向促转移表型培养骨髓祖细胞(Melanoma exosomeseducate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotypethrough MET)，神经医学(Neur Medicine)，18:883-891,2012)。因为外来体在不同条件下非常稳定，所以它们可以保护其生物货物免受细胞外环境中的降解和变性(泰勒(Taylor)和杰塞尔·泰勒(Gercel-Taylor)，外来体/微泡：癌症相关免疫抑制微环境的介质(Exosomes/microvesicles:mediators of cancer-associated immunosuppressivemicroenvironments)，免疫病理学研讨会(Seminars in Immunopathology)，33:441-454,2011)。循环中的基因组DNA主要包含在外来体中(卡勒特(Kahlert)等人，用胰腺癌患者的血清外来体中的突变KRAS和p53DNA跨越所有染色体鉴定双链基因组DNA(Identificationof double-stranded genomic DNA spanning all chromosomes with mutated KRAS andp53DNA in the serum exosomes of patients with pancreatic cancer)。生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)，289:3869-3875,2014)。来自星形胶质细胞和成胶质细胞瘤细胞的外来体携带线粒体DNA(古斯基尼(Guescini)等人，C2C12成肌细胞释放含有mtDNA的微泡和参与信号转导的蛋白质(C2C12myoblasts release micro-vesiclescontaining mtDNA and proteins involved in signal transduction)，实验细胞研究(Experimental Cell Research)，316:1977-1984,2010)。此外，已经显示来自成胶质细胞瘤细胞系的外来体含有少量的单链DNA以及高水平的转座因子(巴拉日(Balaj)等人，肿瘤微泡含有反转录转座子元素和扩增的致癌基因序列(Tumour microvesicles containretrotransposon elements and amplified oncogene sequences)，自然通讯(NatureCommunications)，2:180,2011)。
外来体存在于癌症患者的所有体液中，例如血清、唾液、脑脊髓液、骨髓穿刺液、眼分泌物/泪液以及腹水(佩纳多(Peinado)同上；刘(Lau)等人，胰腺癌衍生的外来体在唾液生物标记物发育中的作用(Role of Pancreatic Cancer-derived Exosomes in SalivaryBiomarker Development)，生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)，288:26888-26897,2013；崔(Choi)等人，源自人结直肠癌腹水的微泡的蛋白质组学分析(Proteomic analysis of microvesicles derived from human colorectal cancerascites)，蛋白质组学(Proteomics)，11:2745-2751,2011)。因此，外来体是在癌症中具有广阔前景的诊断和预测生物标记物。然而，关于来自癌症患者的循环DNA的基因图研究被分离的DNA代表身体的所有细胞的事实混淆，从而使突变和遗传缺陷具有挑战性(穆尔塔扎(Murtaza)等人，通过血浆DNA测序非侵入性分析对癌症治疗的获得性抗性(Non-invasiveanalysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasmaDNA)，自然(Nature)，497；108-1 12,2013；永(Yong)，癌症生物标记物：写在血液中(Cancerbiomarkers:Written in blood)，自然(Nature)，51 1:524-526,2014；基尔克(Kirk)，乳腺癌：循环肿瘤DNA，更好的血液生物标记物(Breast cancer:Circulating tumour DNA thebetter of the blood biomarkers)，自然综述，临床肿瘤学(Nature Reviews，ClinicalOncology)，10:247,2013；克罗利(Crowley)等人，液体活检：监测血液中的癌症遗传学(Liquid biopsy:monitoring cancer-genetics in the blood)，自然综述，临床肿瘤学(Nature Reviews，Clinical Oncology)，10:472-484,2013)。
已经提出了几种外来体标记物，包括四跨膜蛋白家族成员(CD9、CD63、CD81)，内体蛋白分选转运装置成员(ESCRT；TSG101，Alix)以及热休克蛋白(Hsp60、Hsp70、Hsp90)(泰勒(Taylor)和杰塞尔·泰勒(Gercel-Taylor)，同上)。上皮肿瘤细胞分泌携带上皮细胞粘附分子(EpCAM)的外来体(泰勒(Taylor)和杰塞尔·泰勒(Gercel-Taylor)，同上；席尔瓦(Silva)等人，人结直肠癌的外来体释放及其预后价值分析(Analysis of exosomerelease and its prognostic value in human colorectal cancer)，基因、染色体与癌症(Genes，Chromosomes&Cancer)，51:409-418,2012；林茨(Runz)等人，卵巢癌患者的恶性腹水来源的外来体含有CD24和EpCAM(Malignant ascites-derived exosomes of ovariancarcinoma patients contain CD24and EpCAM)，妇科肿瘤学(Gynecologic Oncology)，107:563-571,2007)。黑素瘤衍生的外来体含有肿瘤相关抗原Mart-1和酪氨酸酶相关蛋白-2(TYRP2)(佩纳多(Peinado)同上；米尔斯(Mears)等人，通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱法对黑素瘤衍生的外来体进行蛋白质组学分析(Proteomic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis andmass spectrometry)，蛋白质组学(Proteomics)，4:4019-4031,2004；安德烈(Andre)等人，恶性积水和免疫原性肿瘤来源的外来体(Malignant effusions and immunogenictumour-derived exosomes)，兰赛特(Lancet)，360:295-305,2002)。来自胃癌、乳腺癌和胰腺癌的外来体携带人表皮生长因子受体(HER)家族的成员(亚当奇克(Adamczyk)等人，从胰腺癌细胞释放的EGFR的可溶性和外来体形式的表征(Characterization of soluble andexosomal forms of the EGFR released from pancreatic cancer cells)。生命科学(Life Sciences)，89:304-312,2011；巴朗(Baran)等人，胃癌患者血浆中循环肿瘤来源的微泡(Circulating tumour-derived microvesicles in plasma of gastric cancerpatients)，癌症免疫学，免疫疗法：CII(Cancer Immunology,Immunotherapy:CII)，59:841-850,2010；奇拉沃洛(Ciravolo)等人，HER2过表达外来体在抗曲妥珠单抗-基疗法中的潜在作用(Potential role of HER2-overexpressing exosomes in counteringtrastuzumab-based therapy)，细胞生理学杂志(Journal of Cellular Physiology)，227:658-667,2012)。
如本文所用的术语“微泡”和“外来体”是指膜质颗粒，其中外来体的至少部分膜可直接从细胞获得。最常见的是，外来体的尺寸(平均直径)高达供体细胞尺寸的5％。因此，特别考虑的外来体包括从细胞中脱落的外来体。
可以在任何合适的样品类型(例如体液)中检测外来体或从其分离外来体。如本文所用的术语“样品”是指适用于本发明提供的方法的任何样品。样品可以是包括适于检测或分离的外来体的任何样品。样本来源包括血液、骨髓、胸膜液、腹膜液、脑脊髓液、尿液、唾液、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、母乳、汗液、泪液、关节液和支气管冲洗液。在一个方面，样品是血液样品，包括例如全血或其任何部分或组分。可以从已知的任何来源提取适用于本发明的血液样品，包括血细胞或其组分，例如静脉、动脉、外周、组织、脐带等。例如，可以使用公知的和常规的临床方法(例如，抽取和处理全血的程序)获得和处理样品。在一个方面，示例性样品可以是从患有癌症的受试者抽取的外周血。
也可以从组织样品中分离外来体，例如手术样品、活检样品、组织、粪便和培养细胞。当从组织来源分离外来体时，可能需要使组织均质化以获得单细胞悬浮液，然后裂解细胞以释放外来体。当从组织样品中分离外来体时，重要的是选择不会导致外来体破坏的均质化和裂解程序。优选在生理学上可接受的溶液中从体液中分离本文考虑的外来体，例如，缓冲盐水、生长培养基、各种水性介质等。
可以从新收集的样品中分离，或者从冷冻或冷藏储存的样品中分离外来体。尽管不是必需的，但如果在用体积排除聚合物沉淀之前澄清流体样品以从样品中除去任何碎片，则可以获得更高纯度的外来体。澄清方法包括离心、超速离心、过滤或超滤。最典型地，可通过本领域公知的多种方法分离外来体。一种优选的方法是从体液或细胞培养上清液中进行差速离心。用于分离外来体的示例性方法描述于(洛什(Losche)等人，血小板衍生的微泡将组织因子转移到单核细胞，但不转移到中性粒细胞(Platelet-derivedmicrovesicles transfer tissue factor to monocytes but not to neutrophils)，血小板(Platelets)，15:109-1 15,2004；迈斯里(Mesri)和阿尔铁里(Altieri)，白细胞微粒活化内皮细胞(Endothelial cell activation by leukocyte microparticles)，免疫学杂志(J.Immunol)，161:4382-4387,1998；莫雷尔(Morel)等人，细胞微粒：生物活性血管效应物的播散存储池(Cellular microparticles:a disseminated storage pool ofbioactive vascular effectors)，血液学研究现状(Curr.Opin.Hematol)，11:156-164,2004)。或者，也可以通过描述于以下的流式细胞术分离外来体(Combes等人，一种用于血浆中血小板衍生的微泡定量的新的流式细胞术方法(A new flow cytometry method ofplatelet-derived microvesicle quantitation in plasma)，血栓形成与止血(Thromb.Haemost.)，77:220,1997)。
一种用于分离外来体的可接受的方案包括超速离心，通常与蔗糖密度梯度或蔗糖垫组合以浮起相对低密度的外来体。通过顺序差速离心分离外来体由于具有与其它微泡或大分子复合物的尺寸分布重叠的可能性而变得复杂。此外，离心可能提供不足以基于其尺寸分离囊泡的手段。然而，当与蔗糖梯度超速离心组合时，顺序离心可以提供外来体的高度富集。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖
磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸肝素蛋白多糖的两个主要家族之一，另一主要家族是粘结蛋白聚糖。已经在哺乳动物中鉴定出六种磷脂酰肌醇蛋白聚糖，并且称为GPC1至GPC6。虽然已在哺乳动物中鉴定出六种磷脂酰肌醇蛋白聚糖，但这些不同蛋白质之间的几种特征保持一致。首先，所有磷脂酰肌醇蛋白聚糖的核心蛋白尺寸相似，大约在60-70kDa。另外，就氨基酸序列而言，十四个半胱氨酸残基的位置是保守的。对于磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的所有成员，蛋白质的C末端通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚共价地附着于细胞膜。为了允许添加GPI锚，磷脂酰肌醇蛋白聚糖在蛋白质的C末端具有疏水结构域。在所述GPI锚的50个氨基酸内，硫酸肝素链附着于蛋白质核心。磷脂酰肌醇蛋白聚糖在很大程度上涉及发育形态发生，并且已经被认为是几种细胞信号传导途径中的调节因子，包括Wnt和Hedgehog。在多种类型的癌症中(包括卵巢癌、间皮瘤、胰腺癌、神经胶质瘤和乳腺癌)已经注意到磷脂酰肌醇蛋白聚糖的异常表达。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(也称为GLPC1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1)是细胞表面硫酸肝素蛋白多糖，其由通过糖基磷脂酰肌醇连接锚向细胞质膜的核心蛋白组成。同种型1(规范序列)是558个氨基酸和61.680kDa(UniProtKB蛋白质符号：P35052-GPC1_HUMAN；蛋白质登录号：P35052)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1与癌细胞衍生的外来体相关(WO2015085096；梅洛(Melo)等人，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1鉴定癌症外来体并检测早期胰腺癌(Glypican-1identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer)(2015)自然(Nature)doi:10.1038/nature14581)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2或GPC2与包括黏多醣贮积症在内的疾病有关。蛋白质是579个氨基酸和62830Da(UniProtKB蛋白质符号：Q8N158-GPC2_HUMAN；蛋白质登录号：Q8N158)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(也称为GLPC3和磷脂酰肌醇蛋白多糖3)是细胞表面硫酸肝素蛋白多糖，其由通过糖基磷脂酰肌醇连接锚向细胞质膜的核心蛋白组成。同种型1(规范序列)是580个氨基酸和65563Da(UniProtKB蛋白质符号：P51654-GPC3_HUMAN；蛋白质登录号：P51654)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4是556个氨基酸和62412Da(蛋白质符号：O75487-GPC4_HUMAN；蛋白质登录号：O75487)。GPC4基因与GPC3的3'末端相邻，也可能在Simpson-Golabi-Behmel综合征中起作用。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5为572个氨基酸长和63707Da(蛋白质符号：P78333-GPC5_HUMAN；蛋白质登录号：P78333)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6为555个氨基酸长和62736Da(蛋白质符号：Q9Y625-GPC6_HUMAN；蛋白质登录号：Q9Y625)。与GPC6相关的疾病包括omodysplasia 1和omodysplasia。
抗体
抗体可用作结合剂，例如，表面上提供的GLPC1抗体可用于捕获包含GLPC1的外来体或表面上提供的GLPC3抗体可用于捕获包含GLPC3的外来体。如本文所用的术语“抗体”或“抗体分子”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(例如与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与…发生免疫反应”是指抗体与所需抗原的一或多个抗原决定簇反应，并且对其它多肽具有较低的亲和力，例如，不与其它多肽反应。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白(Ig)分子的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间插入在重链和轻链的可变区内的三个高度不同的区段(称为高变区)。术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，在三维空间中相对于彼此布置轻链的三个高变区和重链的三个高变区以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且每条重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
已经定义了框架区和CDR的范围(参见，E.A.卡巴特(Kabat,E.A.)等人(1991)免疫学所关注蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH公开号91-3242，和C.乔西亚(Chothia,C.)等人(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917)。本文使用卡巴特定义。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，以氨基酸顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在实施方案中，抗体或抗体分子包括全长抗体和抗体片段。例如，全长抗体是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(Ig)分子(例如，IgG抗体)。在实施方案中，抗体或抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性抗原结合部分，例如抗体片段。
抗体片段，例如功能片段，是抗体的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、域抗体(dAb)、可变片段(Fv)或单链可变片段(scFv)。功能性抗体片段与完整抗体识别的相同抗原结合。例如，抗胰岛素单克隆抗体片段与胰岛素结合。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段或其中轻和重可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。在一些实施方案中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如Fc片段或单个氨基酸残基。抗体片段包括功能片段，并且包括在术语“抗体”或“抗体分子”中。
示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如dAb(域抗体)、单链、Fab、Fab'和F(ab')2片段，以及单链可变片段(scFv)。
scFv多肽分子是共价连接的可变重链(VH)::可变轻链(VL)异二聚体，其可以从包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的基因融合表达。参见，例如，赫斯顿(Huston)等人，(1988)美国国家科学院学报(Proc Nat Acad Sci USA)85(16):5879-5883。VH和VL结构域的N-至C-末端方向可以是任一方向，例如VH-VL或VL-VH。已经创建了大的天然人scFv库，以提供针对多种靶分子的重排抗体基因的来源。为了分离疾病特异性抗体，可以从患有某些疾病的个体构建库。参见，例如，巴巴斯(Barbas)等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:9339-43(1992)；和西庇太(Zebedee)等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:3175-79(1992)。
术语“多克隆抗体”是指与多于一种抗原的免疫原性决定簇反应的不同抗体分子的混合物。在实施方案中，可以从哺乳动物的血液、分泌物或其它液体中或从卵中分离或纯化多克隆抗体。在其它实施方案中，多克隆抗体由不同单克隆抗体的混合物组成。在其它实施方案中，多克隆抗体可以作为重组多克隆抗体产生。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”是指抗体分子群，其仅含有一种分子种类的抗体分子，其由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点，其特征在于对其具有独特的结合亲和力。
本文还提供了抗体融合蛋白，例如重组产生的抗原结合分子，其中连接了具有相同或不同特异性的一或多种相同或不同的单链抗体或抗体片段区段。抗体(例如融合抗体蛋白)的效价表示抗体具有多少与单个抗原或表位的结合臂或位点；即，一价、二价、三价或多价。抗体的多价性意味着它可以利用与抗原结合的多种相互作用，从而增加与抗原结合的亲合力。特异性表示抗体能够结合多少抗原或表位，即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。例如，天然抗体，例如IgG，是二价的，因为它具有两个结合臂，但它同时是单特异性的，因为它结合一个表位。单特异性多价抗体，例如抗体融合蛋白，具有多于一个表位结合位点，但仅与一个表位结合。融合蛋白可包含单一抗体组分，不同抗体组分的多价或多特异性组合或相同抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可另外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。示例性毒素包括但不限于核糖核酸酶(RNase)，例如重组RNase、白喉毒素、假单胞菌外毒素、单耳他汀E或mertansine。本文描述了另外的示例性毒素。在实施方案中，抗体分子(例如，抗体或其功能片段)和治疗剂(例如，毒素)由单一核酸分子编码。在实施方案中，抗体分子(例如，抗体或其功能片段)和治疗剂(例如毒素)布置在相同多肽上。在其它实施方案中，抗体分子(例如，抗体或其功能片段)和治疗剂(例如毒素)由不同的核酸分子编码。在实施方案中，抗体分子(例如，抗体或其功能片段)和治疗剂(例如毒素)布置在不同的多肽上。可以将多种蛋白质或肽效应物掺入融合蛋白中。下文进一步讨论了毒素的缀合物/融合物。
多特异性抗体是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶的抗体，例如两个不同的抗原，同一抗原上的两个不同表位，或半抗原和/或抗原或表位。例如，一种特异性可以是对于B细胞，例如胰岛素特异性B细胞上的胰岛素特异性BCR，另一种特异性可以是针对B细胞上的不同抗原。在另一个实例中，另一种特异性可以是针对吞噬细胞上的受体，例如巨噬细胞。在另一个实例中，另一种特异性可以是针对树突细胞上的受体。多特异性多价抗体是具有多于一个结合位点的构建体，并且结合位点具有不同的特异性。
人源化、嵌合或全人源抗体分子
本文还提供了人源化、嵌合或全人源抗体分子，例如全长抗体、抗体片段、抗体或抗体片段融合物，或抗体或抗体片段缀合物。
人源化抗体是重组蛋白，其中将来自一个物种的抗体(例如，啮齿动物(例如大鼠或小鼠)抗体)的互补决定区(CDR)从啮齿动物抗体的重和轻可变链转移到人类重和轻可变结构域中。抗体分子的恒定结构域衍生自人源抗体的恒定结构域。
本领域已经描述了用于人源化非人源抗体的方法。在实施方案中，人源化抗体具有从非人源引入的一或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“进口”残基，其通常取自“进口”可变结构域。可以按照温特(Winter)及其同事的方法进行人源化(琼斯(Jones)等人，自然(Nature)，321:522-525(1986)；雷克曼(Reichmann)等人，自然(Nature)，332:323-327(1988)；韦霍伊恩(Verhoeyen)等人，科学(Science)，239:1534-1536(1988))，例如，通过用人源抗体的相应序列取代高变区序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实施方案中，人源化抗体是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的抗体。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻和重二者)的选择可在降低抗原性中起作用。在一些实施方案中，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(孙(Suns)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，151:2296(1993)；乔西亚(Chothia)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol)，196:901(1987))。在实施方案中，另一种方法使用衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(卡特(Carter)等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89:4285(1992)；普雷斯塔(Presta)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，151:2623(1993))。
在实施方案中，抗体是人源化的，保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了实现所述目标，在某些实施方案中，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型。可获得计算机程序，其说明并显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，例如保留或增加对靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最基本地参与影响抗原结合。
在实施方案中，人源化抗体分子，例如本文所述的人源化抗体分子，包含一或多个非人(例如小鼠)CDR，并且包含人框架和恒定区(例如，来自人免疫球蛋白的框架和恒定区，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
抗体结合和亲和力
如本文所用的术语“表位”包括任何蛋白质决定簇，其能够特异性结合免疫球蛋白，抗体片段，例如本文所述的抗体片段，或B细胞受体(BCR)(例如，包含免疫球蛋白的BCR)。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，可以针对多肽的N-末端或C-末端肽产生抗体。
如本文所用的术语“免疫结合”、“免疫结合特性”、“特异性结合”或“选择性结合”是指在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(Kd)表示，其中较小的Kd表示更大的亲和力。可以使用本领域公知的方法定量所选多肽的免疫结合性质。这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度，相互作用的亲和力，以及同样影响两个方向上的速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)都可以通过计算浓度和实际的缔合和解离速率来确定。参见，例如，自然(Nature)361:186-87(1993)。koff/kon的比例使得能够消除与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数Kd。(通常参见戴维斯(Davies)等人(1990)生物化学综合年刊(Annual Rev Biochem)59:439-473)。
在一些实施方案中，当平衡结合常数(Kd)小于或等于1μM，例如，小于或等于100nM，小于或等于10nM，小于或等于100pM，或小于或等于约1pM时，本文所述的抗体分子特异性结合抗原/表位(例如，自身抗原，例如胰岛自身抗原，例如胰岛素；或B细胞，例如自身抗原特异性B细胞、胰岛素特异性B细胞；或自身抗原::BCR复合物，例如胰岛素::BCR复合物)例如，如通过测定测量的，所述测定为例如放射性配体结合测定、ELISA、表面等离子体共振、平衡结合测定或本领域技术人员已知的类似测定。
抗体产生
本领域已知的各种程序可用于产生针对本发明蛋白质或肽，或针对其衍生物、片段、类似物同源物或直系同源物的抗体分子，例如抗体或其功能片段。(参见，例如，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，哈洛E(Harlow E)和莱恩D(Lane D)，1988，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约(N.Y.)，通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，自身抗原(例如，胰岛自身抗原，例如本文所述的胰岛自身抗原，例如胰岛素)、B细胞(例如，自身抗原特异性B细胞，例如胰岛素特异性B细胞)或自身抗原::B细胞受体(BCR)复合物(例如胰岛素::BCR复合物)可用作免疫原，产生免疫特异性结合这些蛋白质组分的抗体分子。
可以通过公知技术纯化抗体分子，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和色谱，例如，其提供免疫血清的IgG级分。随后或可替代地，可以将作为所寻求的免疫球蛋白靶的特异性抗原或其表位固定在柱上，以通过免疫亲和色谱纯化免疫特异性抗体。例如，D.威尔金森(D.Wilkinson)(科学家(The Scientist),由科学家公司(The Scientist,Inc.)出版,费城(Philadelphia Pa.)，Vol.14,No.8(2000年4月17日)，第25-28页)讨论了免疫球蛋白的纯化。
可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，自然(Nature)，256:495(1975)中描述的方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂使小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物免疫以引出产生或能够产生特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外使淋巴细胞免疫。
在实施方案中，免疫剂包括蛋白质抗原，其片段或其融合蛋白。根据本文所述的组合物和方法，免疫剂包含自身抗原，例如胰岛自身抗原，例如本文所述的胰岛自身抗原，例如胰岛素。通常，如果需要人源细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合，形成杂交瘤细胞(戈丁(Goding)，单克隆抗体：原理和实践(MonoclonalAntibodies:Principles and Practice)，学术出版社(Academic Press)，(1986)，第59-103页)。无限增殖化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。在实施方案中，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一或多种抑制未融合的无限增殖化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的无限增殖化细胞系是下述细胞系：其有效融合，通过选择的抗体生成细胞支持抗体的稳定高水平表达，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感。示例性无限增殖化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以例如从索尔克研究所细胞分布中心(Salk Institute CellDistribution Center)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(CA)和美国典型微生物保藏中心(American Type Culture Collection)，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(Va)获得。还描述了将人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体。(参见科兹布尔(Kozbor)，免疫学杂志(J.Immunol.)，133:3001(1984)；布罗德(Brodeur)等人，单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约(New York)，(1987)第51-63页)。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对抗原的单克隆抗体。例如，通过免疫沉淀或通过体外结合测定来确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，例如放射性免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，流式细胞术/FACS或表面等离子体共振。此类技术和测定在本领域中是已知的。可以，例如，通过芒森(Munson)和波拉德(Pollard)，分析生物化学(Anal.Biochem.),107:220(1980)的斯卡查德分析来确定单克隆抗体的结合亲和力。在实施方案中，在单克隆抗体的治疗应用中，鉴定对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体可能是重要的。
在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，可以将克隆通过有限稀释程序亚克隆并通过标准方法生长。(参见戈丁(Goding)，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，学术出版社(Academic Press)，(1986)，第59-103页)。用于此目的的合适的培养基包括，例如，杜尔贝科改良伊格尔培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中在体内作为腹水生长。
可以通过常规免疫球蛋白纯化程序从培养基或腹水中分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体，所述免疫球蛋白纯化程序包括，例如，蛋白A琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
也可以通过重组DNA方法生产单克隆抗体，例如美国专利第4,816,567号中所述的那些。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码本文所述单克隆抗体的DNA。在实施方案中，杂交瘤细胞用作此类DNA的来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染入宿主细胞，如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以得到单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。也可以修饰DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(参见美国专利第4,816,567号；莫里森(Morrison)，自然(Nature)368,812-13(1994))或通过使免疫球蛋白编码序列与全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列共价连接。这种非免疫球蛋白多肽可以被本发明抗体的恒定结构域取代，或者可以被本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域取代以产生嵌合二价抗体。
全人源抗体是抗体分子，其中轻链和重链的整个序列(包括CDR)来自人基因。此类抗体在本文中称为“人源”抗体或“全人源”抗体。可以通过使用三瘤体技术；人B细胞杂交瘤技术(参见科兹布尔(Kozbor)等人，1983今日免疫学(Immunol Today)4：72)；以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见科尔(Cole)等人，1985在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)中，阿兰·R·丽丝公司(Alan R.Liss，Inc.)，第77-96页)来生产人单克隆抗体。可以使用人单克隆抗体，并且可以通过使用人杂交瘤(参见科特(Cote)等人，1983，美国国家科学院学报(Proc Nat Acad Sci USA)80:2026-2030)或通过在体外用爱泼斯坦-巴尔二氏病毒转化人B细胞(参见科尔(Cole)等人，1985在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)中，阿兰·R·丽丝公司(Alan R.Liss，Inc.)，第77-96页)来生产人单克隆抗体。
此外，还可以使用其它技术生产人源抗体，包括噬菌体展示文库。(参见霍根布隆(Hoogenboom)和温特(Winter)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),227:381(1991)；马克斯(Marks)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),222:581(1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如小鼠)中来制备人源抗体，其中转基因动物的内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在攻击后，观察到人源抗体产生，其在所有方面与人类中观察到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。例如，在美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号，和马克斯(Marks)等人,生物技术(Bio/Technology)10,779-783(1992)；伦贝格(Lonberg)等人,自然(Nature)368 856-859(1994)；莫里森(Morrison),自然(Nature)368,812-13(1994)；菲什维尔德(Fishwild)等人,自然生物技术(Nature Biotechnology)14,845-51(1996)；纽伯格(Neuberger),自然生物技术(Nature Biotechnology)14,826(1996)；以及伦贝格(Lonberg)和胡萨尔(Huszar),内部免疫综述(Intern.Rev.Immunol.)13 65-93(1995)中描述了这种方法。
还可以使用转基因非人动物产生人源抗体，所述转基因非人动物经过修饰以产生全人源抗体而不是响应抗原攻击的动物内源抗体。(参见PCT公开WO94/02602)。编码非人宿主中的重和轻免疫球蛋白链的内源基因已经丧失能力，并且编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座被插入宿主的基因组中。例如，使用含有必需的人DNA片段的酵母人工染色体掺入人基因。然后通过杂交含有少于完整修饰的中间转基因动物，获得提供所有所需修饰的动物作为后代。这种非人动物的优选实施方案是小鼠，并且如PCT公开WO 96/33735和WO96/34096中所公开的称为转基因鼠(XenomouseTM)。该动物产生分泌全人源免疫球蛋白的B细胞。在用目标免疫原免疫后，可以直接从动物获得抗体，作为例如多克隆抗体的制备物，或者直接从来自动物的无限增殖化B细胞，例如产生单克隆抗体的杂交瘤，获得抗体。另外，可以回收和表达编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因以直接获得抗体，或者可以将其进一步修饰以获得抗体的类似物或片段，例如单链Fv(scFv)分子。
用于产生本文所述抗体例如人源抗体的示例性方法公开于美国专利第5,916,771号中。所述方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养的一个哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入另一哺乳动物宿主细胞，并融合这两个细胞以形成杂交细胞。杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。在一个实施方案中，在PCT公开WO 99/53049中公开了用于鉴定免疫原上临床相关表位的方法，以及用于选择以高亲和力免疫特异性结合相关表位的抗体的相关方法。
载体
可以通过含有编码抗体分子例如本文所述的抗体分子的DNA区段的载体表达抗体分子。
这些可以包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包括化学缀合物，例如WO 93/64701中所述的，其具有靶向部分(例如细胞表面受体的配体)，和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)，病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)，融合蛋白，例如PCT/US95/02140(WO 95/22618)中所述的，其是含有靶部分(例如，对靶细胞具有特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白，质粒，噬菌体等。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。
示例性载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。在实施方案中，病毒载体是DNA病毒载体。示例性DNA载体包括痘病毒载体，例如正痘病毒或禽痘病毒载体，疱疹病毒载体，例如单纯疱疹病毒I型(HSV)载体(参见A.I.盖勒(Geller,A.I.)等人，神经化学杂志(J.Neurochem),64:487(1995)；F.利姆(Lim,F.)等人,在DNA克隆：哺乳动物系统(DNA Cloning:Mammalian Systems)中,D.格洛弗(D.Glover)编辑(牛津大学出版社(Oxford Univ.Press),牛津(Oxford)英国(England))(1995)；A.I.盖勒(Geller,A.I.)等人,美国国家科学院学报(Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.)90:7603(1993)；A.I.盖勒(Geller,A.I.)等人,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:1149(1990))，腺病毒载体(参见里格·拉萨尔(LeGal LaSalle)等人,科学(Science),259:988(1993)；戴维森(Davidson)等人,自然遗传学(Nat.Genet)3:219(1993)；杨(Yang)等人,病毒学杂志(J.Virol.)69:2004(1995))以及腺相关病毒载体(参见M.G.卡普利特(Kaplitt,M.G.)等人,自然遗传学(Nat.Genet)8:148(1994))。
痘病毒载体将基因引入细胞质中。禽痘病毒载体仅导致核酸的短期表达。在实施方案中，腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体用于将核酸引入细胞。腺病毒载体导致比腺相关病毒(约4个月)更短期的表达(约2个月)，腺相关病毒又短于HSV载体。选择的特定载体将取决于靶细胞和所治疗的病况。引入可以通过标准技术，例如感染、转染、转导或转化进行。基因转移模式的实例包括，例如，裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染、细胞显微注射和病毒载体。
载体可用于基本上靶向任何所需的靶细胞。例如，立体定位注射可用于将载体(例如腺病毒，HSV)导向所需位置。另外，可以通过使用微泵输注系统(例如SynchroMed输注系统)进行脑室内(icv)输注来递送颗粒。基于总体流动的方法(称为对流)也被证明在将大分子递送到大脑的拓展区方面是有效的，并且可以用于将载体递送至靶细胞。(参见博博(Bobo)等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:2076-2080(1994)；莫里森(Morrison)等人，美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)266:292-305(1994))。可以使用的其它方法包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射，以及口服或其它已知的给药途径。
这些载体可用于表达抗体分子，例如本文所述的抗体分子。技术可以适用于产生对本发明的抗原蛋白具有特异性的单链抗体(参见，例如，美国专利第4,946,778号)。此外，方法可以适用于构建Fab表达库(参见，例如，休斯(Huse)等人，1989科学(Science)246:1275-1281)，以允许快速有效地鉴定具有蛋白质特异性的单克隆Fab片段或其衍生物、片段、类似物或同源物。可以通过本领域已知的技术产生含有蛋白质抗原独特型的抗体片段，所述技术包括但不限于：(i)通过胃蛋白酶消化抗体分子生产的F(ab′)2片段；(ii)通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生的Fab片段；(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段以及(iv)Fv片段。
癌症
如本文所用的术语“癌症”、“肿瘤”或“肿瘤组织”是指由过度细胞分裂导致的异常组织块，在某些情况下，组织包括表达、过表达或异常表达过度增殖细胞蛋白的细胞。癌症、肿瘤或肿瘤组织包括“肿瘤细胞”，其是具有异常生长特性且没有有用的身体功能的赘生性细胞。癌症、肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性或恶性的。癌症、肿瘤或肿瘤组织还可以包括“肿瘤相关的非肿瘤细胞”，例如形成血管以供应肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。可以通过肿瘤细胞诱导非肿瘤细胞复制和发育，例如，在肿瘤或肿瘤组织中诱导血管生成。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症的更具体的实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌以及肺鳞状癌，腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastriccancer或stomach cancer)，包括胃肠癌，胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer或renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未迁移到受试者身体中除原始恶性肿瘤或肿瘤部位以外的部位的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，由转移引起的那些，恶性细胞或肿瘤细胞迁移到与原始肿瘤部位不同的继发性部分)。
在一些实施方案中，癌症是腺癌。在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌和皮肤癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺、肺、头颈、前列腺、食道、气管、脑、肝、膀胱、胃、胰腺、卵巢、子宫、宫颈癌、睾丸、结肠、直肠或皮肤的腺癌。在一些实施方案中，癌症选自胰腺癌，肺癌(例如小细胞或非小细胞肺癌)和乳腺癌。
癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞白血病、成人急性髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓性白血病、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童期非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤文氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、戈谢病、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐匿性原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、妊娠期非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状细胞癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、过渡性肾盂和输尿管癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤和除了瘤形成外位于上面列出的器官系统中的任何其它过度增生性疾病。
结合试剂
在本领域已知和本文所述的用于测量和/或检测蛋白质水平的各种方法中，可以使用多种结合试剂中的任一种捕获磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如本文所述和本领域已知的结合试剂。考虑任何可以特异性结合或以其它方式检测如本文所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1糖蛋白的结合试剂作为合适的结合试剂。说明性结合试剂包括但不限于抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段，以及抗体片段，包括ScFv、F(ab)、F(ab')2、Fv)、同位素标记的肽、核酸探针、DNA或RNA适体(参见，例如，美国专利申请公开第20030219801号，以及点击化学用于靶向引导合成的用途(路易斯(Lewis)等人，应用化学-国际版(Angewandte Chemie-International Edition),41,1053-,2002；曼内奇(Manetsch)等人,美国化学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)126,12809-12818,2004；拉姆斯特伦(Ramstrom)等人,自然评论药物发现(Nature Rev.Drug Discov.)1,26-36,2002)、小分子化合物以及聚合物。
应理解，前述详细描述和以下实施例仅是说明性的，不应视为对本发明范围的限制。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的实施例进行各种改变和修改，这些改变和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。此外，所有提及的专利、专利申请和出版物都通过引用明确地并入本文中，用于描述和公开，例如，在这些出版物中描述的可能与本发明结合使用的方法的目的。提供的这些出版物仅仅是针对它们在本申请的提交日之前公开的公开内容。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权因先前发明或任何其它原因而先于这些公开内容。关于日期的所有陈述或关于这些文件内容的描绘均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
实施例
以下实施例旨在用于说明，并不意味着以任何方式对本发明进行限制。
实施例1.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3外来体表面表达
得到从非癌症健康受试者或患有胰腺癌、肺癌或乳腺癌的受试者获得的人血浆，并将其置于涂有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的传感器芯片上。将血浆直接置于芯片上或用缓冲液稀释后置于芯片上。如图5所示，与来自非癌症人类受试者的血浆样品相比，源自患有癌症的受试者的样品显示出表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和/或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的外来体的更高表达。
实施例2.与具有约60nm的氧化物厚度的衬底连接的420nm波长光的照射使得能够改进纳米颗粒检测。实施例证明不能连续缩短波长以改善对比度。
图11显示了吸附到SP-IRIS衬底的直径为100nm的聚苯乙烯珠的对比度百分比的信号，所述SP-IRIS衬底包含具有半透明二氧化硅上层的硅。纳米颗粒被吸附到二氧化硅上层。显示了不同氧化物厚度和照射波长的对比度百分比。
图12显示了对于直径范围为40至220纳米的纳米颗粒的对比度百分比的信号。针对不同的氧化物厚度和照射波长绘制颗粒对比度。
在某些实施方案中，用420nm光照射具有60nm氧化物厚度的衬底提供了在衬底表面上区分直径小于300nm的离散小纳米颗粒的能力。但是，大于300nm的纳米颗粒会使相机饱和。为了解决这个问题，在用波长为420nm的光照射衬底之后，可以用波长大于约535nm至约700nm的光顺序照射衬底，以使较大的颗粒可视化。顺序照射可以改善颗粒的附加信息的提取(例如，大小的范围，例如纳米颗粒的物理性质(例如折射率、大小参数))。
通过引用并入
本文提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入。
等同物
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由所附权利要求涵盖。

Claims (92)

1.一种分离癌源性循环细胞外囊泡(例如，外来体)的方法，其包含：
使获自受试者的样品与衬底表面接触，其中所述衬底表面任选地包含对所述循环细胞外囊泡表面上表达的一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖具有特异性的一或多种结合剂，以使所述样品中存在的循环细胞外囊泡与所述衬底表面结合(例如通过吸附，例如通过一或多种结合剂)(例如非共价地，例如共价地)，从而分离出所述细胞外囊泡；以及
检测结合到所述衬底表面的所述细胞外囊泡。
2.一种分离循环细胞外囊泡(例如，癌源性循环细胞外囊泡)(例如，外来体)的方法，其包含：
使获自受试者的样品与衬底表面接触，其中所述衬底表面任选地包含第一组对所述循环细胞外囊泡表面上表达的一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖具有特异性的一或多种结合剂，以使所述样品中存在的循环细胞外囊泡与所述衬底表面结合(例如通过吸附，例如通过一或多种结合剂)(例如非共价地，例如共价地)，从而分离出所述细胞外囊泡；
使所述样品与第二组的一或多种结合剂接触(例如，在将所述样品中存在的任何循环细胞外囊泡与所述衬底表面结合之前)(例如，在将所述样品中存在的任何循环细胞外囊泡与所述衬底表面结合之后)；以及
检测结合到所述衬底表面的所述细胞外囊泡。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含选自由以下组成的群组的成员：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含或为磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含或为磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。
6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症包含腺癌。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症包含肺癌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述肺癌包含非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症包含选自由以下组成的群组的成员：食道癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、直肠癌、皮肤癌和前列腺癌。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含评估所述样品中循环细胞外囊泡的水平(例如量，例如数目，例如浓度)。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含评估结合至所述衬底或所述衬底的预定部分或区域、存在于所述样品中或存在于获得所述样品的所述受试者中的循环细胞外囊泡的数目。
12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其包含提供与结合至所述衬底或所述衬底的预定部分或区域、存在于所述样品中或存在于获得所述样品的所述受试者中的循环细胞外囊泡的数目相关的参数值(例如，丰度参数)。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其进一步包含确定结合至所述衬底或所述衬底的预定部分或区域、存在于所述样品中或存在于获得所述样品的所述受试者中的所述循环细胞外囊泡的大小(例如直径，例如体积)(例如，其中所述直径为约10nm至约3100nm，例如约50nm至约2000nm，例如约50nm至约1000nm，例如约20nm至约300nm，例如约30nm至约100nm，例如约50nm至约200nm，例如约200nm至约3000nm)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述大小是结合至所述衬底或所述衬底的预定部分或区域的所述细胞外囊泡的平均大小。
15.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其包含提供与结合至所述衬底或所述衬底的预定部分或区域、存在于所述样品中或存在于获得所述样品的所述受试者中的循环细胞外囊泡的直径相关的参数(大小参数)值。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其包含将丰度参数、大小参数(例如直径参数，例如体积参数)或与大小和丰度都相关的参数值与参考值进行比较(例如，从而评估所述样品，例如，从而表征所述样品，例如，从而诊断所述受试者)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中如果丰度参数、大小参数或与大小和丰度都相关的参数中的一或多个的值满足与参考值的预定关系，则对所述样品或受试者进行分类。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中如果丰度参数、大小参数或与大小和丰度都相关的参数中的一或多个的值大于参考值，则对所述样品或受试者进行分类，例如将所述受试者分类为处于患有癌症的风险中或患有癌症。
19.根据权利要求16到18中任一权利要求所述的方法，其中所述参考值是针对未患有预选病症(例如癌症)的受试者确定的值。
20.根据权利要求16到19中任一权利要求所述的方法，其中所述参考值随来自未患有预选病症(例如癌症)的受试者的丰度参数、直径参数或与直径和丰度都相关的参数中的一或多个而变。
21.根据权利要求16到20中任一权利要求所述的方法，其中丰度参数、直径参数或与直径和丰度都相关的参数中的一或多个的值大于参考值，并且所述受试者被分类为处于患有胰腺癌的风险中或患有胰腺癌，所述胰腺癌例如为胰腺腺癌。
22.根据权利要求16到20中任一权利要求所述的方法，其中如果丰度参数、直径参数或与直径和丰度都相关的参数中的一或多个的值大于参考值，则对所述样品或受试者进行分类，例如，将所述受试者分类为处于患有癌症的风险中或患有癌症。
23.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的方法，其中将所述样品分类为指示以下中的任何一种或其组合：
a)不存在预选癌症(例如胰腺癌，例如胰腺腺癌，例如乳腺癌，例如肺癌，例如结肠癌，例如成胶质细胞瘤，例如卵巢癌)；
b)存在所述预选癌症；
c)存在预选组织(例如胰腺，例如肺，例如结肠，例如乳房，例如脑，例如卵巢)的非癌性病症；或
d)存在所述预选组织的预选癌前病变。
24.根据权利要求1到23中任一权利要求所述的方法，其中将所述受试者分类为具有以下中的任何一种或其组合的提升的可能：
a)不具有所述预选癌症；
b)具有所述预选癌症；
c)具有所述预选组织的所述非癌性病症；或
d)具有所述预选组织的所述预选癌前病变。
25.根据权利要求1到24中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包含监测或评估所述预选癌症的进展或状态。
26.根据权利要求1到25中任一权利要求所述的方法，其中丰度参数、大小参数或与大小和丰度都相关的参数中的一或多个的值与所述预选癌症的进展或状态相关。
27.根据权利要求1到26中任一权利要求所述的方法，其包含响应于所述评估、分类或诊断，为所述受试者选择治疗方案。
28.根据权利要求1到27中任一权利要求所述的方法，其包含治疗所述受试者的例如癌症(例如，其中所述癌症包括选自由以下组成的群组的成员：食道癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、直肠癌、皮肤癌和前列腺癌)。
29.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种结合剂包含选自由以下组成的群组的成员：抗体分子、核酸、多肽和适体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体分子包含选自由以下组成的群组的成员：单克隆抗体、多克隆抗体和其抗原结合片段(例如，其中所述一或多种结合剂包含啮齿动物、兔、小鼠或大鼠、抗人类抗体或其结合片段)。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗体分子特异性结合在癌细胞表面上发现的抗原(例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如，其中所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖包含选自由以下组成的群组的成员：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)(例如，其中所述抗体分子特异性结合所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖的细胞外部分))。
32.根据权利要求31所述的方法，其中结合至所述衬底表面的第一结合剂(例如，结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的细胞外部分的第一结合剂，例如使磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的细胞外部分与所述衬底表面结合的结合剂)不同于第二结合剂，所述第二结合剂与所述循环细胞外囊泡表面上的蛋白质结合(例如，结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的细胞外部分，例如结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的细胞外部分)(例如，其中所述蛋白质包含选自由以下组成的群组的成员：CD63、CD81、CD9、阀蛋白-1、甘露糖结合凝集素和凝集素)(例如，其中所述第二结合剂是癌症或疾病特异性的)(例如，其中所述第二结合剂在结合至所述衬底表面之前结合所述循环细胞外囊泡)(例如，其中所述第二结合剂附着于标记(例如纳米颗粒，例如荧光团))。
33.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述循环细胞外囊泡来自胰腺癌细胞。
34.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述循环细胞外囊泡来自乳腺癌细胞。
35.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中体液包含血浆、血清、全血、唾液、脑脊髓液CSF或尿液。
36.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述样品用反射成像系统，例如本文所述的成像系统评估。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述光谱反射成像系统包含：
具有第一反射表面和部分透明层的衬底，所述部分透明层提供第二反射表面；
与所述第二反射表面结合的生物层，其包含所述第一组的一或多种结合剂；
照射源，例如包含至少一个光源的照射源，其在窄频带中提供光并且将所述频带的光引导至衬底处(例如，其中所述窄频带中的一个包括以下波长范围：约300nm至约800nm，例如约400nm至约600nm，例如约405nm至约455nm，例如约420nm)；以及
成像装置，其指向所述衬底的所述第二反射表面，并适于产生代表来自所述照射源的被所述第一反射表面、所述第二反射表面反射的光；以及由所述第二表面上的颗粒散射的光的成像信号。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一反射表面是硅衬底，并且所述透明层是二氧化硅SiO2。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述光谱反射成像系统进一步包含图像采集和处理系统，所述系统与所述成像装置耦联并适于接收所述成像信号并在程序控制下在所述第二反射表面上产生生物层和/或颗粒的图像。
40.根据权利要求37到39中任一权利要求所述的方法，其中所述透明层为约10nm厚至约100nm厚，例如约40nm厚至约70nm厚，例如约60nm厚)。
41.根据权利要求37到40中任一权利要求所述的方法，其包含：
提供所述衬底的第一镜面反射界面，其具有用于将循环细胞外囊泡(例如，包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖的外来体)与所述衬底的所述第一镜面反射界面结合的结合剂；
提供第二镜面反射界面，所述第二镜面反射界面基本上平行于所述第一镜面反射界面并位于其下面；
用基本上以一或多个波长的光为中心的光照射所述表面；
使用成像装置将从所述衬底反射或透射的光成像；产生所述衬底表面的光谱反射图像；
以及将所述图像上的特征(例如，所述循环细胞外囊泡的直径)与所述表面上离散的循环细胞外囊泡相关联(例如，从而评估每个所述离散的循环细胞外囊泡的大小)。
42.根据权利要求37到41中任一权利要求所述的方法，其中所述透明层为约60nm厚，其中所述窄频带中的一个为420nm(例如，其中所述成像发生在所述衬底浸入水溶液中时，例如，其中所述成像发生在干燥所述衬底之后)。
43.根据权利要求37到42中任一权利要求所述的方法，其中所述成像装置包含具有高数值孔径的高放大率物镜的相机。
44.根据权利要求37到42中任一权利要求所述的方法，其中每个波长的光由独立的窄带光源产生。
45.根据权利要求37到44中任一权利要求所述的方法，其中所述成像装置是单色CCD或CMOS相机。
46.根据权利要求37到45中任一权利要求所述的方法，其中所述表面由来自标准明视场显微镜光学装置的光源照射，并且其中反射光被透射到目镜。
47.根据权利要求37到46中任一权利要求所述的方法，其中每个波长的光由独立的发光二极管LED产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长，并且其中所述成像装置是单色相机。
48.根据权利要求37到47中任一权利要求所述的方法，其中所述成像装置是单色CCD或CMOS相机。
49.根据权利要求37到48中任一权利要求所述的方法，其中分层衬底在任何地方包含在Si晶片上分层的约30-100nm(例如，约60nm)的SiO2。
50.根据权利要求37到49中任一权利要求所述的方法，其中所述表面用白光照射，并且所述成像装置包括彩色相机。
51.根据权利要求37到50中任一权利要求所述的方法，其中所述表面由RGB(红绿蓝)LED照射，并且所述成像装置包括彩色相机。
52.根据权利要求37到51中任一权利要求所述的方法，其中所述表面由宽带光源照射。
53.根据权利要求37到52中任一权利要求所述的方法，其中所述相机进一步包含所述相机的光轴上的空间滤波器。
54.根据权利要求37到53中任一权利要求所述的方法，其中所述光是不相干的。
55.根据权利要求37到54中任一权利要求所述的方法，其中每个波长的光由独立的窄带光源或宽带光源产生。
56.根据权利要求37到55中任一权利要求所述的方法，其中每个波长的光由独立的发光二极管LED产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长。
57.根据权利要求37到56中任一权利要求所述的方法，其中所述成像装置包括选自由以下组成的群组的成员：单色CCD相机、CMOS传感器和彩色相机。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述相机进一步包含所述相机的光轴上的空间滤波器。
59.根据权利要求58所述的方法，其中检测所述颗粒包含检测所述颗粒在所述分层衬底表面上的结合。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述分层表面的表面包含用于结合预定义颗粒的结合剂，并且溶液包含至少一种预定义颗粒。
61.一种衬底，例如本文所述的衬底，其上布置有本文所述的结合剂，例如对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂，例如抗体分子。
62.根据权利要求61所述的衬底，其进一步包含与所述结合剂结合的循环细胞外囊泡(例如，外来体)。
63.一种光谱反射成像系统，其包含：
具有第一反射表面和薄半透明层的衬底，所述薄半透明层提供第二反射表面；
结合到所述第二反射表面的生物层，其包含一或多种对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂；
包含至少一个光源的照射源，其在一个窄频带中提供光并且将所述频带的光引导至所述衬底处；以及
成像装置，其指向所述衬底的所述第二反射表面，并适于产生代表来自所述照射源的被所述第一反射表面和所述第二反射表面反射的光的成像信号。
64.根据权利要求63所述的光谱反射成像系统，其中所述第一反射表面是硅衬底，并且所述半透明层是二氧化硅SiO2。
65.根据权利要求63或64所述的光谱反射成像系统，其进一步包含图像采集和处理系统，所述系统与所述成像装置耦联并适于接收所述成像信号并且在程序控制下，在所述第二反射表面上产生所述生物层的图像。
66.根据权利要求63到65中任一权利要求所述的光谱反射成像系统，其中所述照射源产生白光，并且所述系统进一步包括具有至少一个滤波器的色轮，每个滤波器产生至少三个窄频带中的一个的光束，所述光束指向所述衬底。
67.一种用于通过根据权利要求63到66中任一权利要求所述的光谱反射成像系统进行分析的盒，所述盒包含衬底(例如，本文所述的衬底)，其上布置有对癌细胞表面上发现的抗原(例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6))具有特异性的结合剂(例如，抗体分子)。
68.一种检测循环细胞外囊泡(例如外来体)与衬底表面的结合的方法，所述方法包含：
提供所述衬底的第一镜面反射界面，其具有与所述衬底的所述第一镜面反射界面结合的一或多种结合剂(例如，对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂))；
提供第二镜面反射界面，所述第二镜面反射界面基本上平行于所述第一镜面反射界面并位于其下面；
用基本上以一或多个波长为中心的光照射所述表面；
使用成像装置将从所述衬底反射或透射的光成像；产生所述衬底表面的图像；以及
将所述图像上的特征与所述表面上的离散的循环细胞外囊泡生物标记物(磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6))相关联。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述成像装置包含具有高数值孔径的高放大率物镜的相机。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中每个波长的光由独立的窄带光源产生。
71.根据权利要求68到70中任一权利要求所述的方法，其中所述成像装置是单色CCD或CMOS相机。
72.根据权利要求68到71中任一权利要求所述的方法，其中所述表面由来自标准明视场显微镜光学装置的光源照射，并且其中所述反射光被透射到目镜。
73.根据权利要求68到72中任一权利要求所述的方法，其中每个波长的光由独立的发光二极管LED产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长，并且其中所述成像装置是单色相机。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述成像装置是单色CCD或CMOS相机。
75.根据权利要求68到74中任一权利要求所述的方法，其中分层衬底在任何地方包括在Si晶片上分层的30-100nm范围内(例如，60nm)的SiO2。
76.根据权利要求68到75中任一权利要求所述的方法，其中所述表面用白光照射，并且所述成像装置包括彩色相机。
77.根据权利要求68到76中任一权利要求所述的方法，其中所述表面由RGB(红绿蓝)LED照射，并且所述成像装置包括彩色相机。
78.根据权利要求68到77中任一权利要求所述的方法，其中所述表面由宽带光源照射。
79.根据权利要求68到78中任一权利要求所述的方法，其中所述相机进一步包含所述相机的光轴上的空间滤波器。
80.一种用于检测分层衬底表面上的颗粒的方法，其包含：
提供具有结合剂的所述分层衬底的表面，例如对磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6)具有特异性的结合剂；
使具有至少一个循环细胞外囊泡的溶液与所述衬底表面接触，所述细胞外囊泡包含外来体生物标记物(磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5，例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6))；
用至少一个波长的光照射所述表面；
使用成像装置将从所述衬底反射或透射的光成像；以及
产生所述衬底表面的图像，以检测所述分层衬底表面上的所述细胞外循环囊泡(例如，外来体)。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述分层衬底包含在Si衬底上分层的SiO2。
82.根据权利要求80或81所述的方法，其中所述光是不相干的。
83.根据权利要求81到82中任一权利要求所述的方法，其中每个波长的光由独立的窄带光源产生。
84.根据权利要求83所述的方法，其中每个波长的光由独立的发光二极管LED产生，每个发光二极管具有不同的发射峰波长。
85.根据权利要求83所述的方法，其中每个波长的光由白光源产生。
86.根据权利要求83所述的方法，其中每个波长的光由标准明视场显微镜光学装置产生，并且其中所述反射光被透射到目镜。
87.根据权利要求81到86中任一权利要求所述的方法，其中所述成像装置是单色CCD相机或彩色相机。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述彩色相机是3-D CCD相机。
89.根据权利要求81到86中任一权利要求所述的方法，其中所述成像装置包括具有高数值孔径的高放大率物镜的相机。
90.根据权利要求81到89中任一权利要求所述的方法，其中所述相机进一步包含所述相机的光轴上的空间滤波器。
91.根据权利要求81到90中任一权利要求所述的方法，其中检测所述颗粒包含检测外来体纳米颗粒在所述分层衬底表面上的结合。
92.根据权利要求68到91中任一权利要求所述的方法，其包含：
对于每个后续照射，用渐增波长的光按顺序照射所述衬底(例如，其中多个波长的每个后续照射波长具有比先前照射的波长更长的波长)(例如，其中多个波长中的每一个在约500nm至约750nm，例如约525nm至约700nm的范围内)(例如，其中多个波长中的第一波长为约420nm，例如，其中多个波长中的第二波长为约535nm)。
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