CN113366317A - 用于囊泡货物标记和检测的系统和方法 - Google Patents

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CN113366317A CN202080012089.7A CN202080012089A CN113366317A CN 113366317 A CN113366317 A CN 113366317A CN 202080012089 A CN202080012089 A CN 202080012089A CN 113366317 A CN113366317 A CN 113366317A
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Abstract

本文提供用于检测复杂生物样品(例如细胞，例如组织，例如人血液、血浆和/或血清)中所含的粒子(例如胞外体，例如病毒，例如细胞外囊泡)内部的生物分子货物[例如蛋白质，例如DNA，例如RNA(例如微小RNA，例如非编码RNA)，例如染料，例如适体]的系统和方法。

Description

用于囊泡货物标记和检测的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月1日提交的美国申请第62/800,110号的优先权和权益，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入。
技术领域
本发明大体上涉及粒子(例如纳米粒子，例如胞外体，例如囊泡，如病毒或细胞外囊泡)内部的分子货物(例如生物分子，例如与癌症(例如胰腺癌)相关的生物分子，例如，如蛋白质和DNA的生物分子)的检测。
背景技术
检测生物目标分子的能力是我们理解细胞生理和疾病进展以及在如早期和快速评估(例如诊断)疾病的各种应用中使用的基础。荧光显微法在生物化学和其它生命科学领域中用于分析生物分子(例如DNA、RNA、蛋白质)。当前方法使用固定和透化技术用特异性抗体定位细胞和组织内的生物分子。此类程序不仅允许检测良好表征的细胞结构，而且提供关于细胞和组织内任何可检测分子的信息。
然而，这些基于细胞的技术受如细胞膜复杂性、细胞膜内蛋白质的复合物和细胞器等因素的限制。特定来说，这些常规技术需要高浓度和/或暴露于细胞固定和/或透化试剂，所述试剂可影响并且甚至破坏生物分子结构和/或功能(例如用于检测/监测疾病进展的细胞上抗原呈递和/或功能)。细胞和组织样品的异质性通常限制准确疾病诊断、分期和/或监测所需的检测灵敏度和准确性。
因此，需要以高灵敏度和特异性检测生物样品内部的纳米分子货物的系统和方法，以便对受试者的疾病进行诊断、分期或风险确定。
发明内容
本文提供用于检测复杂生物样品(例如细胞，例如组织，例如人血液、血浆和/或血清)中所含的粒子(例如胞外体，例如病毒，例如病毒样粒子，例如囊泡，例如细胞外囊泡(EV))内部的生物分子货物[例如蛋白质，例如DNA，例如RNA(例如微小RNA，例如非编码RNA)，例如染料，例如适体]的系统和方法。
本文所描述的技术允许使用者分析衍生自复杂生物样品(如人细胞和组织)的囊泡的异质群，其可帮助表征、诊断和/或分期疾病(例如癌症，例如神经疾病，如阿尔茨海默症(Alzheimer's))。举例来说，所描述的系统和方法可在含有疾病状态和/或进展所特有的生物分子货物的囊泡(如EV)之间进行区分，进一步提高疾病检测、分期和/或监测的灵敏度和准确性。另外，所描述的技术可用于监测治疗性治疗方案。举例来说，所述技术可用于评定递送到患病组织的治疗性工程化囊泡(例如经工程化以递送治疗剂的干细胞衍生的EV)是否改善疾病预后和/或分期(例如用于再生医学)。
过度暴露于固定和透化试剂会破坏用于检测和/或监测疾病的抗原。与常规基于细胞的分析相比，所描述的技术使用独特固定和透化方案的组合，其需要可不利影响生物结构和功能的潜在毒性化学试剂的较少暴露时间和/或较低浓度。此外，所描述的系统和方法检测含有与EV的亲本细胞相似(或相同)生物信息的EV内和/或外部的分子货物。
举例来说，常规基于细胞的技术使用需要4％PFA和1小时到过夜的培育时间(例如在4℃下16小时)的固定方案。超过1小时的培育时间会破坏抗原。与常规基于细胞的技术相比，所描述的技术可使用2％PFA在不到1小时的培育时间下有效地检测货物。另外，细胞和组织透化方案需要0.05％到1％浓度的TritonTM-X或
Figure BDA0003190486050000021
培育时间为约30分钟到5小时。相比之下，所描述的技术可使用小于0.5％TritonTM-X和1小时培育时间有效地检测货物。
对于货物成像和/或检测，固定囊泡，接着进行囊泡膜的透化允许接近内腔和内部分子货物。固定使囊泡的组分交联，使得囊泡更坚硬并且在透化时不会损失其结构。优化囊泡的固定和透化参数很困难。将囊泡固定(immobilizing)到固相表面(例如本文所描述的衬底)上，接着进行固定(fixing)提高透化时结构的稳定性。在不将囊泡固定在衬底上而是在液相中进行检测的检测方法(例如流式细胞术)中，固定且透化的囊泡不维持其结构。结果，囊泡将溶解。溶解将导致检测作为个体实体，而非作为可鉴别为属于个体囊泡和/或与个体囊泡相关的分子集合的分子组分。因此，在某些实施例中，通过提供囊泡和其生物分子货物(当固定在固体衬底上时)的灵敏检测，本文所描述的技术允许将特定生物分子货物鉴别为属于特定囊泡。
囊泡内分子货物的灵敏检测允许治疗开发。举例来说，所描述的技术可用于分析干细胞衍生的囊泡内的分子货物以帮助开发再生医学中的天然治疗剂。此外，一旦可确定活性货物，则可将囊泡工程化以包装某些治疗性货物(例如RNA，例如微小RNA)用于治疗性治疗。
另外，所描述的技术充当诊断和治疗监测平台。如EV的囊泡携带来自亲本细胞的信息，其对疾病检测和/或分期来说具有高信息量。囊泡的表面标记物可揭示细胞和/或肿瘤部位内正在发生的情况。举例来说，衍生自肿瘤部位的EV可包括来自肿瘤部位的蛋白质群。在此情境下，EV将携带指示肿瘤的标记物并且允许使用者在不必进行复杂活检的情况下测试疾病。
与常规基于细胞的荧光分析相比，所描述的技术还提供灵敏度提高的优点。在某些实施例中，所描述的技术使用光学衬底来增强分子货物的检测。所描述的光学衬底产生增强的荧光信号的能力提供提高的灵敏度和EV检测，其可促进疾病检测和/或监测，以及其它临床应用。在某些实施例中，所描述的系统同时共定位增强的对比度信号和荧光信号两者的能力提供粒子外部和内部两者的成像。
在一个方面，本发明涉及一种对囊泡[例如纳米囊泡；例如细胞外囊泡(例如胞外体)；例如病毒；例如病毒样粒子，例如脂质体]和其生物分子货物[例如潜在地存在于囊泡的至少一部分内的一或多种相关生物分子]进行分离、标记和成像的方法，所述方法包含：(a)使衬底(例如基本上平面反射衬底)的顶部表面与包含囊泡的样品[例如获自受试者的样品；例如复杂生物样品，如血液、血浆、唾液等；例如经过加工的样品(例如包含缓冲液中的囊泡)]接触，由此捕获存在于样品中的一或多种囊泡[例如其中衬底的表面包含一或多种捕获剂(例如抗体)，每种捕获剂对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)具有特异性；(b)[例如在步骤(a)之后(例如以便在捕获之后透化囊泡)；例如在步骤(a)之前(例如以便在捕获之前，例如在溶液中透化囊泡)]使囊泡与包含透化剂[例如有机溶剂(例如甲醇、丙酮等)；例如清洁剂(例如TritonTM-X、
Figure BDA0003190486050000031
NP-40等)；例如选择性清洁剂(例如与胆固醇特异性相互作用的清洁剂，如皂苷、毛地黄皂苷、leucopem等)]透化溶液接触，由此透化囊泡；(c)在步骤(b)之后，使囊泡与一或多种荧光货物标记{例如蛋白质(例如抗体)、核酸[例如DNA寡核苷酸(例如DNA适体)、RNA寡核苷酸(例如RNA适体)]、肽、染料等}接触，其中每种荧光货物标记：(i)对一或多种相关(例如并且潜在地存在于囊泡的至少一部分中)的生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种，由此标记囊泡内的生物分子货物(例如一或多种相关生物分子)；(d)将激发光导向衬底的顶部表面，由此激发标记囊泡的一或多种荧光货物标记；(e)用一或多个检测器检测由于激发光的激发而从一或多种荧光货物标记发射的荧光[在一或多个荧光波长下对衬底的顶部表面进行成像，每个波长对应于荧光货物标记(的荧光物种)的发射波长，由此获得一或多个荧光图像，每个图像与特定荧光货物标记和特定荧光货物标记所特异于的相关生物分子相关]；以及(g)使用检测到的荧光来检测和/或定量存在于囊泡内的一或多种相关生物分子的至少一部分。
在某些实施例中，所述方法包含在步骤(a)之后进行步骤(b)和(c)，以便在将囊泡捕获到衬底的顶部表面上之后对其进行透化和标记。
在某些实施例中，包含在步骤(a)之前进行步骤(b)和步骤(c)，以便在将囊泡捕获到衬底的顶部表面上之前对其进行透化和标记。
在某些实施例中，囊泡的直径小于或大致等于1微米(例如直径为约500nm或更小，或更小；直径为约200nm或更小；直径为约150nm或更小)(例如直径在约10nm到约150nm范围内；例如直径在约30nm到约100nm范围内)。
在某些实施例中，囊泡为细胞外囊泡。在某些实施例中，细胞外囊泡为胞外体。
在某些实施例中，所述方法包含[例如在步骤(a)之后和/或在步骤(b)之前(例如以便在捕获之后固定(交联)囊泡)；例如在步骤(a)之后和/或在步骤(b)之前(例如以便在捕获之前(例如在溶液中)固定(交联)囊泡)]使囊泡与交联剂[例如多聚甲醛(PFA)、戊二醛、DENT氏固定剂(例如含BSA的甲醇)等]接触[例如其中交联剂的浓度为约4％或更小(例如约2％或更小)]，由此固定(交联)囊泡(例如其中交联剂不需要脱水步骤)[例如其它固定剂包括例如醇(例如甲醇、乙醇)、丙酮、甲醛、福尔马林]。
在某些实施例中，所述方法包含将囊泡与交联剂一起培育经选择以避免过度固定囊泡的持续时间{例如以避免破坏囊泡表面上存在的一或多种目标因子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)和/或以避免破坏一或多种相关生物分子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)；例如其中持续时间基于囊泡的大小而选择；例如其中持续时间小于或大致等于1小时(例如约30分钟或更短；约10分钟或更短)；例如并且随后洗涤衬底表面[例如用缓冲液(例如HEPES缓冲液、水、PBS)]，例如以去除过量交联剂并且保留囊泡表面上存在的一或多种目标因子，和/或一或多种相关生物分子}。
在某些实施例中，交联剂的浓度经选择以避免过度固定囊泡[例如以避免破坏囊泡表面上存在的一或多种目标因子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)和/或以避免破坏一或多种相关生物分子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)；例如其中浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中浓度小于或大致等于2％(例如约1％或更小；约0.5％或更小)]。
在某些实施例中，根据前述技术方案中任一技术方案所述的方法，其中步骤(b)包含将囊泡与透化剂一起培育经选择以维持囊泡膜的完整性的持续时间(例如以避免破坏膜和/或使膜破裂；例如其中持续时间基于囊泡的大小而选择；例如其中持续时间小于或大致等于1小时，例如约30分钟，例如约10分钟或更短)。
在某些实施例中，透化溶液中透化剂的浓度经选择以维持囊泡膜的完整性(例如其中透化剂的浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中透化溶液内清洁剂的总浓度小于或大致等于0.5％，例如约0.2％或更小、约0.1％或更小、约0.05％或更小)。
在某些实施例中，衬底的顶部表面包含一或多种捕获剂(例如抗体)，每种捕获剂对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的一或多种目标因子的特定目标因子(例如抗原)具有特异性。
在某些实施例中，一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特异于的特定目标因子为与特定疾病和/或病状(例如癌症)相关的表面标记物(例如表面受体、整合素等)。
在某些实施例中，(i)一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体(例如抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗CD9抗体、抗CD171抗体)和/或(ii)一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白(例如CD63蛋白、CD81蛋白、CD9蛋白、CD171蛋白)。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质{例如一或多种p-Tau蛋白物种(例如两种或更多种不同p-Tau蛋白)；凋亡相关基因产物2(ALG-2)相互作用蛋白X(ALIX)；同线蛋白(syntenin)；多配体蛋白聚糖；肿瘤易感性基因101(TSG101)；一或多种荧光蛋白[例如荧光表达报告子，如绿色荧光蛋白(GFP)]；例如来自以下各项一或多类蛋白质的一或多种蛋白质：酶；结构蛋白；信号传导蛋白；调节蛋白；转运蛋白；感觉蛋白；马达蛋白；差异蛋白；贮藏蛋白；例如一或多种外周蛋白(例如在细胞膜外)；例如一或多种整合蛋白}。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种核酸[例如核酸片段；例如DNA寡核苷酸；例如RNA寡核苷酸(例如非编码RNA)；例如核酸(例如DNA和/或RNA)与蛋白质的组合；例如DNA和RNA组合寡核苷酸；例如锁核酸(LNA)和/或其它修饰碱基]。
在某些实施例中，步骤(c)包含使囊泡与一或多种货物标记溶液接触，每种溶液包含一或多种荧光货物标记中的至少一者和封闭剂(例如牛血清白蛋白(BSA))(例如其中货物标记溶液包含稀释于封闭缓冲液中的一或多种荧光货物标记)。
在某些实施例中，荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度(例如在荧光货物标记溶液内)为约1微克/毫升或更小。
在某些实施例中，所述方法包含：[例如在步骤(a)之后(例如以便在捕获之后用囊泡检测剂标记囊泡)；例如在步骤(a)之前(例如以便在捕获之前，例如在溶液中用囊泡检测剂标记囊泡)]，使囊泡与对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)(例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子不同的目标因子；例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子之一相同的目标因子)具有特异性的荧光囊泡检测剂(例如抗体)接触，由此用荧光囊泡检测剂标记囊泡(例如无关于其货物)；在步骤(d)处，激发荧光囊泡检测剂(例如除荧光货物标记之外)；以及在步骤(e)处，用一或多个检测器检测由于激发光的激发而从荧光囊泡检测剂发射的荧光(例如由此获得可用于检测囊泡存在的荧光图像，例如且随后与货物标记的荧光图像进行比较，以确定哪些/多少/多少百分比的囊泡包含特定相关生物分子)。
在某些实施例中，步骤(e)包含在一或多个荧光波长下对衬底的顶部表面进行成像，每个波长对应于荧光货物标记(的荧光物种)的发射波长，由此获得一或多个荧光图像，每个图像与特定荧光货物标记和特定荧光货物标记所特异于的特定相关生物分子相关。
在某些实施例中，步骤(g)包含：由计算装置的处理器接收和/或访问一或多个荧光图像；由处理器在一或多个荧光图像的至少一部分中的每一者内鉴别多个荧光发射的离散点，每个点确定为源自囊泡内[例如相对于背景自发荧光和/或来自非特异性结合荧光货物标记(例如在反射衬底的顶部表面上而非囊泡内)的信号，例如通过鉴别荧光图像内的高强度局部化区，例如通过用点扩散函数进行空间互相关]；以及由处理器使用荧光发射的离散点来检测和/或定量一或多种特定相关生物分子的部分[例如在荧光图像的部分中的每一者内对荧光图像的离散点求和；例如通过在两个或更多个荧光图像内鉴别源自相同囊泡的荧光发射的离散点，例如以鉴别两种或更多种相关生物分子的共表达(例如存在、流行率、比率)]。
在某些实施例中，所述方法包含：(h)将照明光导向衬底的顶部表面，由此照射捕获的囊泡以及衬底；和(i)用一或多个检测器检测对应于照明光(A)由囊泡散射和/或(B)由衬底反射的部分的无标记信号。
在某些实施例中，使用具有足够高放大率和分辨率的高放大率物镜进行成像，以检测从位于衬底顶部表面上的荧光标记的囊泡发射的荧光。在某些实施例中，其中高放大率物镜的放大率在约4×到约100×范围内(例如4×、10×、20×、40×、60×、100×)。在某些实施例中，高放大率物镜的数值孔径在约0.1与约1.3范围内(例如0.13、0.3、0.5、0.75、0.85、1.25、1.3)。
在某些实施例中，步骤(g)包含使用检测到的无标记信号以及检测到的荧光来检测和/或定量一或多种相关生物分子的部分。
在某些实施例中，步骤(i)包含在照明光的一或多个波长下对衬底顶部表面进行成像，由此获得一或多个无标记图像，每个图像与特定照射波长相关。在某些实施例中，步骤(g)包含：由计算装置的处理器接收和/或访问一或多个无标记图像；由处理器使用一或多个无标记图像鉴别衬底顶部表面上的多个囊泡位置[例如通过鉴别无标记图像内高散射强度的局部化区，例如通过用点扩散函数进行空间互相关]；和使用所鉴别的囊泡位置(例如与检测到的荧光组合)来检测和/或定量一或多种特定相关生物分子的部分[例如通过鉴别检测到荧光发射的囊泡位置，例如由此确定一或多种特定相关生物分子的表达的分率、流行率等]。
在某些实施例中，衬底为包含光学干涉涂层的反射衬底，光学干涉涂层包含一或多层(例如薄半透明层)之堆叠[例如使得反射衬底的顶部表面对应于光学干涉涂层的顶部表面(例如顶层的顶部表面)]，其中堆叠中一或多层中的每一者的厚度和/或材料使得：(A)来自荧光货物标记中的一或多者的荧光的激发和/或发射得到增强[例如相对于将观察到的为沉积于不具有光学干涉涂层的裸衬底(例如硅衬底；例如载玻片)]上的囊泡，和/或(B)通过检测囊泡响应于照明光的照射而散射的光而获得的无标记信号得到增强[例如相对于将观察到的为沉积于不具有光学干涉涂层的裸衬底(例如硅衬底；例如载玻片)]上的囊泡。在某些实施例中，反射衬底在一或多个特定波长(例如照明光的波长；例如一或多种荧光货物标记的至少一部分的激发和/或发射波长)下的反射率大于25％(例如大于30％，例如大于40％，例如大于50％，例如大于60％、大于70％、大于80％或更高)。
在另一方面，本发明涉及一种对囊泡[例如纳米囊泡；例如细胞外囊泡(例如胞外体)；例如病毒；例如病毒样粒子，例如脂质体]和其生物分子货物(例如潜在地存在于囊泡的至少一部分内的一或多种蛋白质物种)进行分离、透化和标记的方法，所述方法包含：(a)使衬底的表面[例如基本上平面衬底(例如反射衬底)的顶部表面；例如珠粒(例如磁珠)]与包含囊泡的样品[例如获自受试者的样品；例如复杂生物样品，如血液、血浆、唾液等；例如经过加工的样品(例如包含缓冲液中的囊泡)]接触，由此捕获存在于样品中的一或多种囊泡[例如其中衬底的表面包含一或多种捕获剂(例如抗体)，每种捕获剂对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)具有特异性]囊泡；(b)[例如在步骤(a)之后(例如以便在捕获之后透化囊泡)；例如在步骤(a)之前(例如以便在捕获之前，例如在溶液中透化囊泡)]，使囊泡与包含透化剂[例如清洁剂(例如TritonTM)]的透化溶液接触，由此透化捕获的囊泡，其中囊泡与透化溶液一起培育的持续时间和/或透化溶液中透化剂的浓度经选择以维持囊泡膜的完整性；以及(c)在步骤(b)之后，使囊泡与一或多种荧光货物标记{例如蛋白质(例如抗体)、核酸[例如DNA寡核苷酸(例如DNA适体)、RNA寡核苷酸(例如RNA适体)]、肽、染料等}接触，其中每种荧光货物标记：(i)对一或多种相关(例如并且潜在地存在于囊泡的至少一部分中)的生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种，由此标记囊泡内的生物分子货物(例如一或多种相关生物分子)。
在某些实施例中，所述方法包含在步骤(a)之后进行步骤(b)和(c)，以便在捕获囊泡之后对其进行透化和标记。
在某些实施例中，所述方法包含在步骤(a)之前进行步骤(b)和步骤(c)，以便在捕获囊泡之前对其进行透化和标记。
在某些实施例中，囊泡的直径小于或大致等于1微米(例如直径为约500nm或更小，或更小；直径为约200nm或更小；直径为约150nm或更小)(例如直径在约10nm到约150nm范围内；例如直径在约30nm到约100nm范围内)。
在某些实施例中，囊泡为细胞外囊泡。在某些实施例中，细胞外囊泡为胞外体。
在某些实施例中，所述方法包含[例如在步骤(a)之后和/或在步骤(b)之前(例如以便在捕获之后固定(交联)囊泡)；例如在步骤(a)之后和/或在步骤(b)之前(例如以便在捕获之前(例如在溶液中)固定(交联)囊泡)]使囊泡与交联剂[例如多聚甲醛(PFA)、戊二醛、DENT氏固定剂(例如含BSA的甲醇)等接触]，由此固定(交联)囊泡(例如其中交联剂不需要脱水步骤)[例如其它固定剂包括例如醇(例如甲醇、乙醇)、丙酮、甲醛、福尔马林]。
在某些实施例中，所述方法包含将囊泡与交联剂一起培育经选择以避免过度固定囊泡的持续时间{例如以避免破坏囊泡表面上存在的一或多种目标因子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)和/或以避免破坏一或多种相关生物分子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)；例如其中持续时间基于囊泡的大小而选择；例如其中持续时间小于或大致等于1小时(例如约30分钟或更短；约10分钟或更短)；例如并且随后进行洗涤步骤[例如用缓冲液(例如HEPES缓冲液、水、PBS)]，例如以去除过量交联剂并且保留囊泡表面上存在的一或多种目标因子，和/或一或多种相关生物分子}。
在某些实施例中，交联剂的浓度经选择以避免过度固定囊泡[例如以避免破坏囊泡表面上存在的一或多种目标因子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)和/或以避免破坏一或多种相关生物分子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)；例如其中浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中浓度小于或大致等于2％(例如约1％或更小；约0.5％或更小)]。
在某些实施例中，步骤(b)包含将囊泡与透化剂一起培育经选择以维持囊泡膜的完整性的持续时间(例如以避免破坏膜和/或使膜破裂；例如其中持续时间基于囊泡的大小而选择；例如其中持续时间小于或大致等于1小时，例如约30分钟，例如约10分钟或更短)。
在某些实施例中，透化溶液中透化剂的浓度经选择以维持囊泡膜的完整性(例如其中透化剂的浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中透化溶液内清洁剂的总浓度小于或大致等于0.5％，例如约0.2％或更小、约0.1％或更小、约0.05％或更小)。
在某些实施例中，衬底的表面包含一或多种捕获剂(例如抗体)，每种捕获剂对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的一或多种目标因子的特定目标因子(例如抗原)具有特异性。在某些实施例中，一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特异于的特定目标因子为与特定疾病和/或病状(例如癌症)相关的表面标记物(例如表面受体、整合素等)。在某些实施例中，(i)一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体(例如抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗CD9抗体、抗CD171抗体)和/或(ii)一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白(例如CD63蛋白、CD81蛋白、CD9蛋白、CD171蛋白)。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质{例如一或多种p-Tau蛋白物种(例如两种或更多种不同p-Tau蛋白)；凋亡相关基因产物2(ALG-2)相互作用蛋白X(ALIX)；同线蛋白；多配体蛋白聚糖；肿瘤易感性基因101(TSG101)；一或多种荧光蛋白[例如荧光表达报告子，如绿色荧光蛋白(GFP)]；例如来自以下各项一或多类蛋白质的一或多种蛋白质：酶；结构蛋白；信号传导蛋白；调节蛋白；转运蛋白；感觉蛋白；马达蛋白；差异蛋白；贮藏蛋白；例如一或多种外周蛋白(例如在细胞膜外)；例如一或多种整合蛋白}。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种相关生物分子包含一或多种核酸[例如核酸片段；例如DNA寡核苷酸；例如RNA寡核苷酸(例如非编码RNA)；例如核酸(例如DNA和/或RNA)与蛋白质的组合；例如DNA和RNA组合寡核苷酸；例如锁核酸(LNA)和/或其它修饰碱基]。
在某些实施例中，步骤(c)包含使囊泡与一或多种货物标记溶液接触，每种溶液包含一或多种荧光货物标记中的至少一者和封闭剂(例如牛血清白蛋白(BSA))(例如其中货物标记溶液包含稀释于封闭缓冲液中的一或多种荧光货物标记)。
在某些实施例中，荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度(例如在荧光货物标记溶液内)为约1微克/毫升或更小。
在某些实施例中，所述方法包含：[例如在步骤(a)之后(例如以便在捕获之后用囊泡检测剂标记囊泡)；例如在步骤(a)之前(例如以便在捕获之前，例如在溶液中用囊泡检测剂标记囊泡)]使囊泡与对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)(例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子不同的目标因子；例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子之一相同的目标因子)具有特异性的荧光囊泡检测剂(例如抗体)接触，由此用荧光囊泡检测剂标记囊泡(例如无关于其货物)。
在另一方面，本发明涉及一种用于对囊泡[例如纳米囊泡；例如细胞外囊泡(例如胞外体)；例如病毒；例如病毒样粒子；例如脂质体]和其生物分子货物(例如潜在地存在于纳米粒子的至少一部分内的一或多种蛋白质物种)进行分离、透化和标记的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)包含透化剂的预混合透化溶液；和(b)一或多种预混合货物标记溶液，每种溶液包含一或多种荧光货物标记[例如和封闭剂(例如牛血清白蛋白(BSA))(例如其中货物标记溶液包含稀释于封闭缓冲液中的一或多种荧光货物标记)]，其中每种荧光货物标记(i)对一或多种相关(例如并且潜在地存在于囊泡的至少一部分中)的生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种。
在某些实施例中，试剂盒进一步包含一或多种预混合捕获剂溶液，每种溶液包含一或多种捕获剂(例如抗体)，其中每种捕获剂对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)具有特异性。在某些实施例中，试剂盒进一步包含预点样衬底，其中预点样衬底包含一或多个捕获剂点，一或多个捕获剂点中的每一者包含对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)具有特异性的特定捕获剂(例如抗体)。
在某些实施例中，一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特异于的特定目标因子为与特定疾病和/或病状(例如癌症)相关的表面标记物(例如表面受体、整合素等)。
在某些实施例中，(i)一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体(例如抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗CD9抗体、抗CD171抗体)和/或(ii)一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白(例如CD63蛋白、CD81蛋白、CD9蛋白、CD171蛋白)。
在某些实施例中，试剂盒包含固定溶液，其包含用于固定(交联)囊泡的交联剂[例如多聚甲醛(PFA)、戊二醛、DENT氏固定剂(例如含BSA的甲醇)等](例如其中交联剂不需要脱水步骤)[例如其它固定剂包括例如醇(例如甲醇、乙醇)、丙酮、甲醛、福尔马林]。在某些实施例中，固定溶液中交联剂的浓度经选择以避免过度固定囊泡[例如以避免破坏囊泡表面上存在的一或多种目标因子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)和/或以避免破坏一或多种相关生物分子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)；例如其中浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中浓度小于或大致等于2％(例如约1％或更小；约0.5％或更小)]。
在某些实施例中，透化溶液中透化剂的浓度经选择以维持囊泡膜的完整性(例如其中透化剂的浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中透化溶液内清洁剂的总浓度小于或大致等于0.5％，例如约0.2％或更小、约0.1％或更小、约0.05％或更小)。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质{例如一或多种p-Tau蛋白物种(例如两种或更多种不同p-Tau蛋白)；凋亡相关基因产物2(ALG-2)相互作用蛋白X(ALIX)；同线蛋白；多配体蛋白聚糖；肿瘤易感性基因101(TSG101)；一或多种荧光蛋白[例如荧光表达报告子，如绿色荧光蛋白(GFP)]}。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种相关生物分子包含一或多种核酸[例如核酸片段；例如DNA寡核苷酸；例如RNA寡核苷酸(例如非编码RNA)；例如核酸(例如DNA和/或RNA)与蛋白质的组合；例如DNA和RNA组合寡核苷酸；例如锁核酸(LNA)和/或其它修饰碱基]。
在某些实施例中，荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度(例如在荧光货物标记溶液内)为约1微克/毫升或更小。
在某些实施例中，试剂盒包含囊泡检测溶液，其包含对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)(例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子不同的目标因子；例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子之一相同的目标因子)具有特异性的荧光囊泡检测剂(例如抗体)(例如用荧光囊泡检测剂标记囊泡(例如无关于其货物))。
在某些实施例中，试剂盒包含包括光学干涉涂层的反射衬底，光学干涉涂层包含一或多层(例如薄半透明层)之堆叠[例如使得反射衬底的顶部表面对应于光学干涉涂层的顶部表面(例如顶层的顶部表面)]，其中堆叠中一或多层中的每一者的厚度和/或材料使得：(A)来自荧光货物标记中的一或多者的荧光的激发和/或发射得到增强[例如相对于将观察到的为沉积于不具有光学干涉涂层的裸衬底(例如硅衬底；例如载玻片)]上的囊泡，和/或(B)通过检测囊泡响应于照明光的照射而散射的光而获得的无标记信号得到增强[例如相对于将观察到的为沉积于不具有光学干涉涂层的裸衬底(例如硅衬底；例如载玻片)]上的囊泡。在某些实施例中，反射衬底在一或多个特定波长(例如照明光的波长；例如一或多种荧光货物标记的至少一部分的激发和/或发射波长)下的反射率大于25％，(例如大于30％，例如大于40％，例如大于50％，例如大于60％、大于70％、大于80％或更高)。
在另一方面，本发明涉及一种用于对囊泡[例如纳米囊泡；例如细胞外囊泡(例如胞外体)；例如病毒；例如病毒样粒子；例如脂质体]和其生物分子货物(例如潜在地存在于纳米粒子的至少一部分内的一或多种蛋白质物种)进行分离、标记和成像的系统，所述系统包含：(a)试剂盒，其用于对囊泡[例如纳米囊泡；例如细胞外囊泡(例如胞外体)；例如病毒；例如病毒样粒子；例如脂质体]和其生物分子货物(例如潜在地存在于纳米粒子的至少一部分内的一或多种蛋白质物种)进行分离、透化和标记；(b)用于固持衬底的安装架(例如其中安装架为标准显微镜安装架)；(c)一或多个激发光源，其相对于安装架对准以便且将激发光导向衬底(例如当由安装架固持时)的顶部表面，以便提供位于衬底顶部表面上的一或多种荧光标记的(例如荧光货物标记)囊泡的激发；(d)一或多个检测器，其相对于安装架对准且可操作以检测从位于衬底顶部表面上的荧光标记的囊泡发射的荧光；(e)计算装置的处理器；以及(f)上面存储指令的存储器，其中指令在由处理器执行时使处理器：接收和/或访问对应于检测到的荧光的数据；和使用对应于检测到的荧光的数据来检测和/或定量囊泡的生物分子货物。
在某些实施例中，试剂盒包含：(A)包含透化剂的预混合透化溶液；和(B)一或多种预混合货物标记溶液，每种溶液包含一或多种荧光货物标记[例如和封闭剂(例如牛血清白蛋白(BSA))(例如其中货物标记溶液包含稀释于封闭缓冲液中的一或多种荧光货物标记)]，其中每种荧光货物标记(i)对一或多种相关(例如并且潜在地存在于囊泡的至少一部分中)的生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种。
在某些实施例中，一或多个检测器各自相对于具有足够高放大率和分辨率的高放大率物镜对准，以检测从位于衬底顶部表面上的荧光标记的囊泡发射的荧光。在某些实施例中，高放大率物镜的放大率在约4×到约100×范围内(例如4×、10×、20×、40×、60×、100×)。在某些实施例中，高放大率物镜的数值孔径在约0.1与约1.3范围内(例如0.13、0.3、0.5、0.75、0.85、1.25、1.3)。
在某些实施例中，试剂盒进一步包含一或多种预混合捕获剂溶液，每种溶液包含一或多种捕获剂(例如抗体)，其中每种捕获剂对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)具有特异性。
在某些实施例中，试剂盒进一步包含预点样衬底，其中预点样衬底包含一或多个捕获剂点，一或多个捕获剂点中的每一者包含对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)具有特异性的特定捕获剂(例如抗体)。
在某些实施例中，一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特异于的特定目标因子为与特定疾病和/或病状(例如癌症)相关的表面标记物(例如表面受体、整合素等)。
在某些实施例中，(i)一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体(例如抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗CD9抗体、抗CD171抗体)和/或(ii)一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白(例如CD63蛋白、CD81蛋白、CD9蛋白、CD171蛋白)。
在某些实施例中，试剂盒包含固定溶液，其包含用于固定(交联)囊泡的交联剂[例如多聚甲醛(PFA)、戊二醛、DENT氏固定剂(例如含BSA的甲醇)等](例如其中交联剂不需要脱水步骤)[例如其它固定剂包括例如醇(例如甲醇、乙醇)、丙酮、甲醛、福尔马林]。
在某些实施例中，固定溶液中交联剂的浓度经选择以避免过度固定囊泡[例如以避免破坏囊泡表面上存在的一或多种目标因子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)和/或以避免破坏一或多种相关生物分子(例如使其失活和/或损害其结构；例如变性)；例如其中浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中浓度小于或大致等于2％(例如约1％或更小；约0.5％或更小)]。
在某些实施例中，透化溶液中透化剂的浓度经选择以维持囊泡膜的完整性(例如其中透化剂的浓度基于囊泡的大小而选择；例如其中透化溶液内清洁剂的总浓度小于或大致等于0.5％，例如约0.2％或更小、约0.1％或更小、约0.05％或更小)。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质{例如一或多种p-Tau蛋白物种(例如两种或更多种不同p-Tau蛋白)；凋亡相关基因产物2(ALG-2)相互作用蛋白X(ALIX)；同线蛋白；多配体蛋白聚糖；肿瘤易感性基因101(TSG101)；一或多种荧光蛋白[例如荧光表达报告子，如绿色荧光蛋白(GFP)]}。
在某些实施例中，一或多种相关生物分子包含一或多种相关生物分子包含一或多种核酸[例如核酸片段；例如DNA寡核苷酸；例如RNA寡核苷酸(例如非编码RNA)；例如核酸(例如DNA和/或RNA)与蛋白质的组合；例如DNA和RNA组合寡核苷酸；例如锁核酸(LNA)和/或其它修饰碱基]。
在某些实施例中，荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度(例如在荧光货物标记溶液内)为约1微克/毫升或更小。
在某些实施例中，试剂盒包含囊泡检测溶液，其包含对与囊泡的至少一部分相关(例如在其表面上表达)的特定目标因子(例如抗原)(例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子不同的目标因子；例如与一或多种捕获剂所特异于的一或多种目标因子之一相同的目标因子)具有特异性的荧光囊泡检测剂(例如抗体)(例如用荧光囊泡检测剂标记囊泡(例如无关于其货物))。
在某些实施例中，系统包含包括光学干涉涂层的反射衬底，光学干涉涂层包含一或多层(例如薄半透明层)之堆叠[例如使得反射衬底的顶部表面对应于光学干涉涂层的顶部表面(例如顶层的顶部表面)]，其中堆叠中一或多层中的每一者的厚度和/或材料使得：(A)来自荧光货物标记中的一或多者的荧光的激发和/或发射得到增强[例如相对于将观察到的为沉积于不具有光学干涉涂层的裸衬底(例如硅衬底；例如载玻片)]上的囊泡，和/或(B)通过检测囊泡响应于照明光的照射而散射的光而获得的无标记信号得到增强[例如相对于将观察到的为沉积于不具有光学干涉涂层的裸衬底(例如硅衬底；例如载玻片)]上的囊泡。在某些实施例中，反射衬底在一或多个特定波长(例如照明光的波长；例如一或多种荧光货物标记的至少一部分的激发和/或发射波长)下的反射率大于25％，(例如大于30％，例如大于40％，例如大于50％，例如大于60％、大于70％、大于80％或更高)。
涉及本发明的一个方面(例如方法)的实施例的要素可应用于涉及本发明的其它方面的实施例中，且反之亦然。
附图说明
通过参考结合附图的以下描述，本公开的前述和其它目的、方面、特征和优点将变得更明显且更好理解，附图中：
图1A为展示根据本公开的说明性实施例的用于对细胞外囊泡和其生物分子货物进行分离、标记和成像的过程的框流程图。
图1B为展示根据本公开的说明性实施例的用于对细胞外囊泡和其生物分子货物进行分离、透化和标记的过程的框流程图。
图2为根据本公开的说明性实施例的用于检测结合到衬底的粒子的示范性系统的图。
图3为根据本公开的说明性实施例的从衬底反射且由结合到衬底的粒子散射的光的图。
图4A为展示根据说明性实施例的如本文所描述的用于对光学衬底成像，例如以检测粒子(例如胞外体)，例如共定位胞外体与相关生物分子货物的仪器的说明。
图4B为根据说明性实施例的如本文中所描述的反射芯片(衬底)的说明。
图4C为根据说明性实施例的安置于微流体盒内的反射芯片的说明，所述微流体盒允许样品在衬底上方流动。
图4D为根据说明性实施例的如本文所述的衬底上的捕获剂(例如抗体)阵列的说明。
图5为根据说明性实施例的用于通过荧光和单粒子散射的同时检测来定位和/或分类粒子的过程的框流程图。
图6为用于通过检测来自粒子内和/或表面上的多个不同荧光物种的增强荧光来定位和/或分类粒子的过程的框流程图。
图7为展示在存在(右)或不存在(左)PFA下培育的样品上的荧光标记的影响的一组荧光图像。
图8为展示结合到如通过本文所描述的示范性方法制备的透化囊泡的荧光标记物的一组图像。
图9为展示结合到如通过本文所描述的示范性方法制备的透化囊泡的荧光标记物的一组图像。
图10A为如本文所描述的使用抗CD63抗体结合到光学衬底(或芯片)且用荧光标记物标记的非透化细胞外囊泡(EV)的一组荧光图像。
图10B为展示用于鉴别CD63捕获的荧光通道中的每一个和阴性对照组中鉴别的荧光粒子的数目的图。
图11A为在15分钟透化之后的使用抗CD63抗体结合到光学衬底(或芯片)的细胞外囊泡(EV)的一组荧光图像。
图11B为描绘用于鉴别CD63捕获的荧光通道中的每一个和阴性对照组中鉴别的荧光粒子的数目的图。
图12为展示根据本公开的实施例通过无标记的SP-IRIS成像方法获得的来自人血浆的捕获细胞外囊泡(EV)的测量值的图。
图13为描绘抗体培育时间对荧光的影响的一组荧光图像。
图14为展示TritonTM-X浓度对透化的影响的一组图像。
图15为展示透化时间对标记的影响的一组图像。
图16为在某些实施例中使用的示范性云计算环境的框图。
图17为在某些实施例中使用的示例计算装置和示例移动计算装置的框图。
图18为展示原始和经纯化人血浆中荧光标记的同线蛋白的检测的图。
图19为如本文所描述的使用抗CD9抗体(顶部)或阴性对照物(底部)结合到光学衬底(或芯片)且用荧光标记物标记的细胞外囊泡(EV)的一组荧光图像。
图20A为展示从小鼠脑脊髓液(CSF)获得的细胞外囊泡(EV)中荧光标记的同线蛋白和CD9的检测的图。
图20B为展示从小鼠脑内皮细胞(bEnd3)获得的细胞系来源细胞外囊泡(EV)中荧光标记的同线蛋白和CD9的检测的图。
图20C为展示从小鼠成纤维细胞(NIH/3T3)获得的细胞系来源细胞外囊泡(EV)中荧光标记的同线蛋白和CD9的检测的图。
图21A为获自脑脊髓液(CSF)且用抗mCD9和抗小鼠同线蛋白(mSyntenin)免疫标记的细胞外囊泡(EV)的荧光图像。
图21B为获自小鼠脑内皮细胞(bEnd3)且用抗mCD9和抗小鼠同线蛋白免疫标记的细胞外囊泡(EV)的荧光图像。
图21C为获自小鼠成纤维细胞(NIH3T3)且用抗mCD9和抗小鼠同线蛋白免疫标记的细胞外囊泡(EV)的荧光图像。
图22为描绘在衬底上捕获的EV直径相比于其各自免疫标记的荧光强度的一组图。
本公开的特征和优点将从以下在结合图式时所阐述的详细描述而变得更显而易见，其中相似参考标号始终标识对应要素。在图式中，相似参考标号通常指示相同、功能上类似和/或结构上类似的要素。
定义
约：术语“约”当在本文中提及值使用时，是指在上下文中与所提及的值类似的值。一般来说，熟悉上下文的所属领域的技术人员应了解在所述上下文中由“约”所涵盖的相关偏差度。举例来说，在一些实施例中，术语“约”可涵盖在所指值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值的范围。
一(a/an)：冠词“一(a/an)”在本文中用来指所述冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法宾语。举例来说，“(一)元件”意味着一个元件或多于一个元件。因此，在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，举例来说，提及包含“(一)药剂”的药物组合物包括提及两种或更多种药剂。
抗体：如本文所用，术语“抗体”或“抗体分子”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原，例如与抗原免疫反应的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“免疫反应”意指抗体与所需抗原的一或多种抗原决定子反应并且对其它多肽具有较低亲和力，例如不与其它多肽反应。
在实施例中，抗体或抗体分子涵盖全长抗体和抗体片段。举例来说，全长抗体为天然存在或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(Ig)分子(例如IgG抗体)。在实施例中，抗体或抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性抗原结合部分，如抗体片段。
“抗原结合位点”、“结合部分”：术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白(Ig)分子的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。称为高变区的重链和轻链可变区内的三个高度趋异性片段插入于称为“框架区”或“FR”的较保守的侧接片段之间。术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并且与所述高变区相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区相对于彼此在三维空间中安置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一个的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
已定义构架区和CDR的范围(参见E.A.卡巴特(Kabat,E.A.)等人(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第五版，美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，第91-3242号NIH公开，和C.科西亚(Chothia,C.)等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917)。本文中使用卡巴特定义。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个FR构成，以氨基酸顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
结合剂、结合试剂、捕获剂：如本文所描述，术语“结合试剂”、“捕获剂”和“结合剂”在本文中可互换地用以指代结合到如本文所描述的相关目标的任何实体。在许多实施例中，相关捕获剂是与其目标特异性结合的捕获剂，因为其在特定相互作用接触中区分其目标与其它潜在结合搭配物。一般来说，捕获剂可以是或包含任何化学类别(例如聚合物、非聚合物、小分子、多肽、碳水化合物、脂质、核酸等)的实体。在一些实施例中，捕获剂为单一化学实体。在一些实施例中，捕获剂为在相关条件下通过非共价相互作用彼此结合的两个或更多个离散化学实体的复合物。举例来说，所属领域的技术人员将了解，在一些实施例中，捕获剂可包含“通用”结合部分(例如生物素/抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素和/或类别特异性抗体中的一种)和连接到通用结合部分的搭配物的“特异性”结合部分(例如具有特定分子目标的抗体或适体)。在一些实施例中，所述方法可允许通过不同特异性结合部分与相同通用结合部分搭配物的键联来模块化组装多种捕获剂。在一些实施例中，捕获剂为或包含肽和/或多肽(包括例如抗体或抗体片段)。在某些实施例中，肽和/或多肽可以进一步用同位素标记。在一些实施例中，捕获剂为或包含抗体(例如包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段，和包括ScFv、F(ab)、F(ab')2、Fv的抗体片段)。在一些实施例中，捕获剂为或包含小分子。在一些实施例中，捕获剂为或包含核酸。在一些实施例中，捕获剂为适体。在一些实施例中，捕获剂为聚合物。在一些实施例中，捕获剂是非聚合的，因为其不具有聚合部分。在一些实施例中，结合剂为或包含碳水化合物。在某些实施例中，捕获剂为或包含核酸，如DNA或RNA。在如本文所描述的某些实施例中，捕获剂可存在于如本文所描述的衬底(例如光学衬底，例如反射衬底)的顶部表面上。在某些优选实施例中，捕获剂可以是对癌症相关蛋白质具有特异性的抗体(例如对四次穿膜蛋白(tetraspanin)家族成员具有特异性，例如抗CD 63抗体、抗CD 81抗体、抗CD 9抗体、抗CD171抗体)。
生物标记物：术语“生物标记物”与其在所属领域中的使用一致，在本文中用于指代其存在、水平、程度和/或类型与特定相关生物事件或状态相关，以使得其被视为所述事件或状态的“标记物”的实体、事件或特征。仅举几例，在一些实施例中，生物标记物可为或包含特定疾病状态，或特定疾病、病症或病状可能产生、发生或复发的可能性的标记物。在一些实施例中，生物标记物可以是或包含特定疾病或治疗结果，或其可能性的标记物。因此，在一些实施例中，生物标记物是所关注的相关生物事件或状态的预测，在一些实施例中，生物标记物是所关注的相关生物事件或状态的预后，在一些实施例中，生物标记物是所关注的相关生物事件或状态的诊断。生物标记物可以是或包含任何化学类别的实体，并且可以是或包含实体的组合。举例来说，在一些实施例中，生物标记物可以是或包含核酸(例如DNA、RNA)、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、无机试剂(例如金属或离子)或其组合。在一些实施例中，生物标记物在细胞的表面上(例如表面细胞标记物)。在一些实施例中，生物标记物在囊泡(例如胞外体)的表面上。在一些实施例中，生物标记物在囊泡内部。在一些实施例中，生物标记物是四次穿膜蛋白家族的成员(例如CD9、CD63、CD81)。在一些实施例中，生物标记物是转运所需的内体分选复合物的成员(例如ESCRT；TSG101，Alix)。在一些实施例中，生物标记物为热休克蛋白(例如Hsp60、Hsp70、Hsp90)。在一些实施例中，生物标记物为细胞外囊泡(例如具有一或多种相关表面标记物的细胞外囊泡)。
癌症、肿瘤、肿瘤组织：如本文所用，术语“癌症”、“肿瘤”或“肿瘤组织”是指由过度细胞分裂产生的异常的组织块，在某些情况下，组织包含表达、过度表达或异常表达过度增殖细胞蛋白质的细胞。癌症、肿瘤或肿瘤组织包含“肿瘤细胞”，其为具有异常生长特性且无有用的身体功能的赘生性细胞。癌症、肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性或恶性的。癌症、肿瘤或肿瘤组织还可以包含“肿瘤相关非肿瘤细胞”，例如形成血管以供应肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。非肿瘤细胞可以通过肿瘤细胞诱导而复制和产生，例如肿瘤或肿瘤组织中的血管生成诱导。
癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴性恶性疾病。所述癌症的更具体实例在下文指出并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric/stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移到受试者体内除原始恶性疾病或肿瘤部位外的部位的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移，即恶性细胞或肿瘤细胞迁移到不同于原始肿瘤部位的继发性部位引起的那些)。
在一些实施例中，癌症为腺癌。在一些实施例中，癌症选自乳癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌和皮肤癌。在一些实施例中，癌症是乳、肺、头颈、前列腺、食道、气管、脑、肝、膀胱、胃、胰、卵巢、子宫、宫颈、睾丸、结肠、直肠或皮肤的腺癌。在一些实施例中，癌症选自胰腺癌、肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)和乳癌。
癌症或恶性疾病的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、AIDS相关恶性疾病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳癌、肾盂和输尿管的癌症、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's Sarcoma)和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、高雪氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃癌(GastricCancer)、胃肠类癌肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠期滋养细胞肿瘤、毛状细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症(Hypergammaglobulinemia)、下咽癌、肠癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、转移性隐匿原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合征、骨髓性白血病、骨髓白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、妊娠期间的非霍奇金氏淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症(Paraproteinemia)、紫癜、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节肉瘤、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌(Stomach Cancer)、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia)、维尔姆斯瘤(Wilms'Tumor)和位于上文所列器官系统中的除瘤形成以外的任何其它过度增生性疾病。
在某些实施例中，癌症使用表面标记物、表面受体和/或整合素检测。
包含：如本文所用，术语“包含”意味着除了所呈现的经定义要素之外，还可存在其它要素。“包含”的使用指示包括而非限制。术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其各自组分，其不包括在所述实施例的描述中未叙述的任何要素。如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施例所需要的那些要素。术语准许不实质上影响本公开的所述实施例的一或多种基本和新颖或功能特征的要素的存在。除在操作实例中或以其它方式指示的情况下，表达本文中所使用的成分的数量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。
表位：如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合到免疫球蛋白、抗体片段(例如本文所描述的抗体片段)或B细胞受体(BCR)(例如包含免疫球蛋白的BCR)的任何蛋白质决定子。表位决定子通常由根据表面化学活性分类的分子(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。举例来说，抗体可以针对多肽的N端或C端肽而产生。
免疫结合、免疫结合特性、特异性结合、选择性结合：如本文所用，术语“免疫结合”、“免疫结合特性”、“特异性结合”或“选择性结合”是指免疫球蛋白分子与免疫球蛋白具有特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的解离常数(Kd)表达，其中较小Kd表示较大亲和力。选定多肽的免疫结合特性可以使用所属领域中众所周知的方法定量。一种所述方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合搭配物的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可以通过计算浓度以及实际缔合和解离速率来确定“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)。参见例如《自然(Nature)》361:186-87(1993)。koff/kon的比率有助于消除与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数Kd。(一般来说，参见戴维斯(Davies)等人(1990)《生物化学年鉴(Annual Rev Biochem)》59:439-473)。
在一些实施例中，例如，如通过分析，如放射性配体结合分析、ELISA、表面等离激元共振、平衡结合分析或所属领域的技术人员已知的类似分析所测量，平衡结合常数(Kd)小于或等于1μM，例如小于或等于100nM、小于或等于10nM、小于或等于100pM或小于或等于约1pM时，本文所述的抗体分子特异性结合抗原/表位(例如自身抗原，例如胰岛自身抗原，例如胰岛素；或B细胞，例如自身抗原特异性B细胞、胰岛素特异性B细胞；或自身抗原::BCR复合物，例如胰岛素::BCR复合物)。
发光二极管(LED)：如本文所用，“发光二极管(LED)”为基于半导体二极管的电子光源。当二极管正偏(接通)时，电子能够与空穴重组，且能量以光的形式释放。此效应被称作电致发光，且光的颜色由半导体的能隙确定。LED的面积通常较小(小于1mm)，其具有集成光学组件以塑造其辐射方向图且辅助测量穿过给定溶液的光的分数。在分光光度计中，来自灯的光被引导穿过单色器，所述单色器从连续光谱中拾取一个特定波长的光。此光穿过被测量的样品。在样品之后，用光电二极管或其它光传感器测量剩余光的强度，且随后计算此波长的透射率。简单地说，在分光光度计中事件的顺序如下：光源照射穿过样品，样品吸收光，检测器检测样品已经吸收多少光，检测器随后将样品吸收了多少光转换成数字，将数字传输到比较模块以进一步操纵(例如曲线平滑、基线校正)。许多分光光度计必须通过称为“归零”的程序来校准。一些标准物质的吸收率被设置为基线值，因此所有其它物质的吸收率为相对于初始“归零”物质来记录。分光光度计随后显示吸收％(相对于初始反射吸收的光的量)。类似于普通二极管，LED由浸渍或掺杂有杂质以产生p-n结的半导体材料的芯片组成。如在其它二极管中，电流易于从p侧或阳极流动到n侧或阴极，但相反方向上并非如此。载流子电子和空穴从具有不同电压的电极流入到结中。当电子遇到空穴时，其下降到较低能级，且以光子的形式释放能量。所发射的光的波长，且因此其颜色取决于形成p-n结的材料的带隙能量。在硅或锗二极管中，电子和空穴通过不产生光学发射的非辐射跃迁重组，因为其是间接带隙材料。用于LED的材料具有带有对应于近红外光、可见光或近紫外光的能量的直接带隙。LED通常构建在n型衬底上，其中电极附接到沉积在其表面上的p型层。p型衬底虽然较不常见，但也有出现。许多市售LED，尤其GaN/InGaN，还使用蓝宝石衬底。用于LED生产的大多数材料具有极高折射率。这意味着许多光将在材料/空气表面界面处反射回到材料中。用于所描述技术的LED包括但不限于：
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粒子：如本文所定义的“粒子”是指待通过本文所描述的装置和方法检测的半径为几纳米到至多几微米的任何目标。在某些实施例中，粒子可为囊泡(例如纳米囊泡，例如细胞外囊泡，例如脂质体，例如胞外体)。在某些实施例中，粒子可以是细胞外囊泡(例如肿瘤来源的循环细胞外囊泡)。在某些特定实施例中，粒子可为胞外体。
单克隆抗体，mAb：如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指抗体分子群体，其仅含有由独特轻链基因产物和独特重链基因产物组成的抗体分子的一个分子物种。确切地说，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中是相同的。mAb含有能够与抗原的特征在于对其具有独特结合亲和力的特定表位免疫反应的抗原结合位点。
多特异性抗体：“多特异性抗体”为可与具有不同结构的至少两种目标，例如两种不同抗原、相同抗原上的两种不同表位，或半抗原和/或抗原或表位同时结合的抗体。举例来说，一种特异性可针对B细胞，例如胰岛素特异性B细胞上的胰岛素特异性BCR，且另一特异性可针对B细胞上的不同抗原。在另一实例中，另一特异性可针对吞噬细胞，例如巨噬细胞上的受体。在另一实例中，另一特异性可针对树突状细胞上的受体。多特异性多价抗体为具有超过一个结合位点，并且所述结合位点具有不同特异性的构筑体。
多克隆抗体：术语“多克隆抗体”是指与抗原的超过一个免疫原性决定子反应的不同抗体分子的混合物。在实施例中，多克隆抗体可以从哺乳动物血液、分泌物或其它流体或从卵中分离或纯化。在其它实施例中，多克隆抗体由不同单克隆抗体的混合物构成。在其它实施例中，多克隆抗体可作为重组多克隆抗体产生。
反射衬底：如本文所用，反射衬底用于指用于将光反射回到检测器的衬底。如本文所用，术语“反射衬底”打算涵盖具有各种反射率的多种衬底和/或衬底材料。在某些实施例中，反射衬底包含单层。在某些实施例中，反射衬底包含硅基底上的氧化物层。在某些实施例中，反射衬底包含多层(例如，如本文中进一步详细描述)。
在某些实施例中，反射衬底在一或多个相关波长和/或光谱范围下具有大于特定最小值的反射率。示范性光谱范围包括但不限于介于约400nm到450nm范围内的UV光谱范围、介于约460nm到约500nm范围内的蓝色光谱范围、介于约520nm到约560nm范围内的绿色光谱范围、介于约640nm到约680nm范围内的红色光谱范围，以及介于约710nm到约750nm范围内的深红色光谱范围。举例来说，反射衬底可具有在一或多个相关波长和/或光谱带中大于或大约等于25％(例如大于30％，例如大于40％，例如大于50％，例如大于60％，大于70％)的“反射率”或“反射性”。在某些实施例中，反射衬底具有在一或多个相关波长和/或光谱带中大于80％或更大的反射率。
反射衬底可具有根据特定功能形式而变化的反射率，如正弦形，其例如由光学干涉效应产生，使得其在一或多个相关波长和/或光谱范围下具有特定反射率，但在其它波长下具有相对较低的反射率。
样品，生物样品：如本文所用，术语“样品”和“生物样品”意指任何样品，包括但不限于细胞、生物体、溶解细胞、细胞提取物、细胞核提取物、细胞或生物体的组分、细胞外液、培养细胞的培养基、血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆、滑液、粪便、唾液、痰液、囊液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液和前列腺液。另外，样品可以是病毒或细菌样品、获自环境来源例如污染水体(例如湖泊)的样品、空气样品或土壤样品以及食品工业样品(例如被认为被污染的食品来源)。
摄谱仪，分光光度计：如本文所定义的“摄谱仪”或“光谱仪”为用于测量电磁波谱的特定部分的光的特性的光学仪器，其典型地用于光谱分析以鉴别材料。所测量的变量最通常为光的强度，但还可例如为光的偏振状态。自变量通常为光的波长，通常表示为米的分数，但有时表示为与光子能量成正比的单位，例如波数或电子伏，其与波长具有倒数关系。光谱仪在光谱法中用于产生光谱线并且测量其波长和强度。光谱仪为应用于在从γ射线和X射线到远红外线的极宽波长范围内操作的仪器的术语。如果相关区域限于可见光谱附近，那么研究被称为分光光度法。
分光光度法涉及使用分光光度计。如本文所定义，“分光光度计”为可测量随光的颜色，或更确切地说波长而变的强度的光度计(用于测量光强度的装置)。存在许多种类的分光光度计。用于对其进行分类的最重要区别尤其是其工作的波长、其使用的测量技术、其获取光谱的方式和其经设计测量的强度变化的来源。分光光度计的其它重要特征包括光谱带宽和线性范围。存在两种主要类别的分光光度计；单束和双束。双束分光光度计测量两个不同光路上的光强度的比率，且单束分光光度计测量绝对光强度。虽然比率测量更容易，且通常更稳定，但单束仪器也具有优点；举例来说，其可具有较大的动态范围，且其可更小。历史上，分光光度计使用单色器来分析光谱，但也存在使用光传感器阵列的分光光度计。尤其对于红外分光光度计，存在在称为傅里叶变换红外(FTIR)光谱法的技术中使用傅里叶变换技术以更快速地获取光谱信息的分光光度计。分光光度计定量物质)。分光光度计的最常见应用为光吸收的测量，但其可经设计以测量漫射或镜面反射。严格地说，甚至发光仪器的发射半部分也为一种分光光度计。
“标签”，“标记”：如本文所用，术语“标记”或“标签”是指能够产生指示分析样品中目标的存在的可检测信号的组合物。适合的标记包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁性粒子、生物发光部分等。因此，标记为可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的任何组合物。
“囊泡”，“微囊泡”，“胞外体”：如本文所用，术语“微囊泡”、“囊泡”和“胞外体”是指膜粒子，其中胞外体的膜的至少一部分直接获自细胞。最通常，胞外体将具有至多供体细胞大小的5％的大小(平均直径)。因此，尤其考虑的胞外体包括从细胞脱落的那些胞外体。如本文所用，术语“纳米囊泡”是指亚细胞的大体上球形体或膜体，如脂质体、微胞、细胞外囊泡、胞外体、病毒、病毒样粒子、微泡或单层囊泡。
具体实施方式
经考虑，本公开的系统、架构、装置、方法和过程涵盖使用本文所描述的实施例的信息开发的变化和修改。如本说明书所考虑，可以执行本文所描述的系统、架构、装置、方法和过程的适配和/或修改。
在整个说明书中，在将物品、装置、系统和架构描述为具有、包括或包含特定组件，或在将过程和方法描述为具有、包括或包含特定的步骤时，经考虑，另外，存在本公开的物品、装置、系统和架构，其基本上由所叙述的组件组成，或由所叙述的组件组成，并且存在根据本公开的过程和方法，其基本上由所叙述的处理步骤组成，或由所叙述的处理步骤组成。
应理解，步骤次序或用于执行某些动作的次序是不重要的，只要本发明保持可操作即可。此外，两个或更多个步骤或动作可以同时进行。
关于本文中所呈现的权利要求中任一权利要求，本文中对任何出版物的提及(例如在背景部分中)不是承认所述出版物充当现有技术。背景技术部分是出于清楚的目的而呈现，并且不意味是关于任何权利要求的现有技术的描述。
在特定术语的含义存在任何矛盾的情况下，以上面“定义”部分中提供的含义为准。
提供标题是为了方便读者，标题的存在和/或排列并非意图限制本文所描述的主题的范围。
应理解，详细描述和以下实例仅为说明性的，并且不应被视为对所描述技术的范围的限制。可在不脱离所描述技术的精神和范围的情况下进行所属领域的技术人员将显而易见的所公开实施例的各种改变和修改。此外，所鉴别的所有专利、专利申请和公开都是出于描述和公开的目的明确地以引用的方式并入本文中，例如描述于此类公开中的方法可与所描述的技术结合使用。这些公开仅仅是出于其在本申请的提交日之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其它原因而提前此类公开。所有关于这些文件的日期的声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本文提供用于检测复杂生物样品(例如人血液、血浆和/或血清)中所含的粒子(例如胞外体，例如脂质体，例如病毒，例如细胞外囊泡)内部的分子货物[例如蛋白质，例如DNA，例如RNA(例如微小RNA，例如非编码RNA)，例如染料，例如适体]的系统和方法。所述技术允许使用者分析衍生自复杂生物样品的纳米粒子的异质群，其可帮助表征、诊断和/或分期疾病(例如癌症，例如神经疾病，如阿尔茨海默症)。
与常规基于细胞的分析相比，所描述的技术使用特殊固定和透化方案，其需要可损害生物结构和/或功能的潜在毒性化学试剂的较少暴露时间和/或较低浓度。举例来说，常规基于细胞的技术使用需要4％PFA和1小时到过夜的培育时间(例如在4℃下16小时)的固定方案。超过1小时的时间会破坏抗原。相比之下，在某些实施例中，所描述的技术可使用2％PFA在不到1小时的培育时间下有效地检测货物。另外，细胞和组织透化方案需要0.05％到1％浓度的TritonTM-X或
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培育时间为约30分钟到5小时。相比之下，在某些实施例中，所描述的技术可使用小于0.5％TritonTM-X和1小时培育时间有效地检测货物。
此外，所描述的系统和方法检测如细胞外囊泡(EV)的粒子内的分子货物，所述粒子含有来自亲代亲本细胞的类似生物信息但结构较不复杂。所述技术还可包括独特的封闭步骤以进一步提高检测EV内所含的分子信息的能力。
在本文所描述的系统和方法的某些实施例中，用于检测细胞外囊泡和荧光分子货物的成像系统是如2017年2月3日提交的标题为“检测具有表面标记物的胞外体(Detectionof Exosomes Having Surface Markers)”的国际公开第WO2017/136676号系统和方法中所描述的SP-IRIS系统(单粒子干涉反射成像传感器)，所述公开的内容以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，SP-IRIS系统中使用的衬底经修饰以增强结合到衬底的荧光标记细胞外囊泡的无标记和荧光成像。可用于增强荧光和无标记成像的衬底的实例呈现于2019年5月31日提交的标题为“用于增强的基于无标记和荧光的纳米粒子检测的组合物、系统和方法(Compositions,Systems,and Methods for Enhanced Label-Free andFluorescence-Based Detection of Nanoparticles)”的国际PCT申请第WO/2019/232321号中，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
EV内分子货物的灵敏检测允许治疗开发。举例来说，所描述的技术可用于分析干细胞衍生的EV内的分子货物以帮助开发再生医学中的天然治疗剂。此外，一旦可确定活性货物，则可将EV工程化以包装某些治疗性货物(例如RNA，例如微小RNA)用于治疗性治疗。
另外，所描述的技术充当诊断和治疗监测工具。EV携带来自亲本细胞的信息，其对疾病检测和/或分期来说具有高信息量。EV的表面标记物揭示细胞和/或肿瘤部位内正在发生的情况。举例来说，衍生自肿瘤部位的EV可包括来自肿瘤部位的蛋白质群。在此情境下，EV将携带指示肿瘤的标记物并且允许使用者在不必进行复杂活检的情况下测试疾病。
在某些实施例中，所描述的技术使用光学衬底来增强分子货物的检测。所描述的光学衬底产生增强的荧光信号的能力提供提高的灵敏度和EV检测，其可促进疾病检测和监测，以及其它临床应用。在某些实施例中，所描述的系统同时共定位增强的对比度信号和荧光信号两者的能力提供粒子外部和内部两者的成像。
在某些实施例中，试剂盒含有预混合溶液试剂盒，其包含透化溶液、固定溶液、封闭溶液和/或含标记的溶液。
A.对囊泡，如细胞外囊泡和其货物进行分离、标记和成像
在某些实施例中，本文所述的系统和方法可用于分离任何类型的囊泡，如细胞外囊泡、胞外体、脂质体、病毒和/或病毒样粒子。此外，所描述的系统和方法可使用反射衬底或其它固相衬底，如，珠粒(例如磁珠)进行。还应注意，可以在固定/结合到所选择的衬底的表面之前或之后进行固定、透化和标记。
图1A展示对相关细胞外囊泡和其经标记分子(例如生物分子货物)进行分离、标记和成像的方法的实施例。在某些实施例中，细胞外囊泡为胞外体。在某些实施例中，相关的生物分子货物是潜在地存在于纳米粒子的至少一部分内的一或多种蛋白质物种。
首先，使反射衬底的顶部表面与包含细胞外囊泡的样品接触101，由此捕获存在于样品中的一或多种细胞外囊泡。在某些实施例中，包含细胞外囊泡的样品为获自患者的样品。在某些实施例中，反射衬底的顶部表面包含一或多种捕获剂，其中每一捕获剂对与细胞外囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性。在某些实施例中，捕获剂为抗体。在某些实施例中，目标因子为抗原。在某些实施例中，目标因子表达于细胞外囊泡的至少一部分的表面上。随后，使反射衬底的顶部表面与包含透化剂的透化溶液接触102，由此透化捕获的细胞外囊泡。在某些实施例中，透化剂为清洁剂。在某些实施例中，清洁剂为TritonTM。随后，使反射衬底的顶部表面与一或多种荧光货物标记接触103，其中每一荧光货物标记对一或多种相关生物分子具有特异性并且包含特定荧光物种，由此标记细胞外囊泡。在某些实施例中，一或多种相关生物分子潜在地存在于细胞外囊泡的至少一部分中。光被引导向反射衬底的顶部表面104，由此激发标记细胞外囊泡的荧光货物标记。在某些实施例中，在一或多个荧光波长下对反射衬底的顶部表面成像，所述荧光波长各自对应于荧光货物标记(的荧光物种)的发射波长，由此获得一或多个荧光图像，每一图像与特定荧光货物标记和特定荧光货物标记具有特异性的相关生物分子相关联。一或多个检测器检测由于激发光的激发而从一或多种荧光货物标记发射的荧光105。所检测到的荧光随后用于检测和/或定量存在于细胞外囊泡内的相关生物分子106。
图1B展示分离、透化和标记细胞外囊泡和其生物分子货物的方法的实施例。在某些实施例中，细胞外囊泡为纳米囊泡。在某些实施例中，细胞外囊泡为胞外体。在某些实施例中，生物分子货物是潜在地存在于纳米粒子的至少一部分内的一或多种蛋白质物种。使衬底的顶部表面与包含细胞外囊泡的样品接触151，由此捕获存在于样品中的一或多种细胞外囊泡。在某些实施例中，包含细胞外囊泡的样品从受试者获得。在某些实施例中，衬底的顶部表面包含一或多种捕获剂，每一捕获剂对与细胞外囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性。在某些实施例中，捕获剂为抗体。在某些实施例中，目标因子为抗原。在某些实施例中，特定目标因子在细胞外囊泡的至少一部分的表面上表达。随后，使衬底的顶部表面与包含透化剂的透化溶液接触152，由此透化捕获的细胞外囊泡。在某些实施例中，透化剂为清洁剂。在某些实施例中，清洁剂为TritonTM。TritonTM已知为：4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇。TritonTM具有化学式：C14H22O(C2H4O)n，其中n为9到10。TritonTM的化学结构为：
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随后，使衬底的顶部表面与包含一或多种荧光货物标记和封闭剂的货物标记溶液接触152。在某些实施例中，封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)。在某些实施例中，货物标记溶液包含稀释于封闭缓冲液中的一或多种荧光货物标记。每一荧光货物标记对一或多种相关生物分子中的特定相关生物分子具有特异性，且包含特定荧光物种，由此标记细胞外囊泡内的生物分子货物。在某些实施例中，一或多种相关生物分子潜在地存在于细胞外囊泡的至少一部分中。在某些实施例中，生物分子货物为一或多种相关生物分子。
B.光学传感器和检测方法
在一或多个实施例中，本文所描述的技术包括可以检测囊泡(如，结合到衬底表面上的捕获剂(例如抗体)的胞外体)内和/或表面上的生物标记物和/或生物分子货物(例如蛋白质，例如核酸，例如DNA，例如RNA)的设备和系统。在某些实施例中，囊泡可使用本文所描述的方案和方法固定和标记。图2说明其中可使用本文中所描述的衬底的用于对囊泡进行成像的示例成像系统200的简图。系统200可包括照明源201，其将照明光引导并提供到衬底222上。在如图2中所描绘的某些实施例中，衬底为反射衬底222，其具有单一氧化物层223和待检测的粒子(例如细胞外囊泡)226，以及用于捕获由衬底222、氧化物层224和粒子226反射的光的图像的成像系统230。在另一实施例中，光学衬底222可为大体上如本文所描述的多层反射衬底(未图示)。多层反射衬底可包含例如针对第一目标波长下的特定散射增强和第二目标波长下的荧光增强而设计的薄透明电介质层的堆叠。在某些实施例中，使用适合于衬底的尺寸的安装架(例如显微镜载片安装架、孔板安装架)将衬底安装并固持在适当位置。
系统200还可包括用于控制照明源201且从成像系统230接收成像信号的计算机系统240。在一实施例中，照明源201包括提供一个波长的非相干光的非相干光源(LED)202，其具有大体上窄带波长。在实施例中，照明源201包括相干光源(激光)。照明源还可充当激发源，以用于荧光标记的粒子检测/分类应用(例如用于检测荧光标记，例如荧光货物标记)。在某些实施例中，可利用多个照明源。在一些实施例中，照明源201可包括三个或更多个相干或非相干光源202、204、206，其产生三个不同波长的非相干光。发光二极管(LED)或等效光源各自在多个波长中的一个下提供非相干光。在一些实施例中，照明源201可包括照明元件阵列，其包括提供相同波长的光且布置成几何(例如圆形或矩形)、随机或空间位移的阵列的一或多个照明元件。来自照明源201的光可被引导穿过聚焦透镜212和其它光学元件(例如偏光透镜、滤光器和调光组件，未图示)到分束器214，所述分束器将光引导到衬底222、氧化物层224和粒子226上。可提供光学组件以调节光以大体上均匀地照明分层衬底222的整个表面。由衬底222、氧化物层224和粒子226反射的光可被引导穿过分束器214和成像透镜234到检测器(例如相机)232中以捕获衬底表面的图像。在某些实施例中，可存在超过一个检测器。在某些实施例中，成像透镜为高倍放大和高分辨率物镜。在某些实施例中，物镜为放大倍数在约4×到100×范围内(例如4×、10×、20×、40×、60×、100×)的高倍放大物镜。在某些实施例中，物镜的数值孔径在约0.1与约1.3范围内(例如0.13、0.3、0.5、0.75、0.85、1.25、1.3)。在某些实施例中，光由大体上附接到囊泡或与囊泡共定位的荧光标记(例如囊泡内的分子货物、囊泡表面上的分子生物标记物)发射。相机232可为例如CCD相机(彩色或单色)，且基于对应于由粒子散射和/或由衬底反射的照明光的数据产生表示图像的图像信号。在另一实施例中，相机232可基于对应于所检测到的由附接到粒子的荧光标签发射的荧光的数据而产生表示图像的图像信号。可通过无线或有线连接将图像信号从相机232发送到计算机系统210。
计算机系统240可包括一或多个中央处理单元(CPU)和相关联的存储器(包括易失性和非易失性存储器，例如RAM、ROM、闪存、光学和磁性存储器)和用于将信息呈现给用户的显示器246。存储器可存储可由CPU执行以存储并处理图像数据且产生衬底表面的图像的一或多个计算机程序。可提供额外计算机程序以用于分析图像数据和图像以检测衬底222的氧化物层224的表面上的干涉图案和粒子226。还可提供额外计算机程序以用于分析结合粒子的图像的荧光的图像，以增强粒子的成像。在其它实施例中，结合粒子的图像的荧光允许检测囊泡的生物分子货物。在某些实施例中，使用对应于检测到的荧光的数据对生物分子货物进行定量(例如每囊泡的量、每囊泡的数目、每囊泡的水平)(例如关于货物的数目和/或量的统计数量)。
计算机程序可由计算机执行以实施根据本发明的一或多个实施例的方法，借此可进行干涉式测量。计算机程序可控制照明源201，所述照明源包含可用于照明分层衬底的一个(或多个)LED。底部表面与顶部表面之间的光程差(OPD)产生干涉图案。干涉图案可以通过CCD相机232一次性在整个衬底上作为强度变化成像。
多种软件程序和格式可用于存储和/或处理通过本文中所描述的系统和方法获得的光学信息。可利用任何数目的数据处理器构造格式(例如文本文件、数据库)。通过以计算机可读形式提供光学信息，可使用呈可读形式的光学信息来比较特定光学概况与存储于比较模块的数据库内的光学信息。举例来说，来自给定样品的所测定的光学信息的直接比较可与对照数据光学信息(例如从对照样品获得的数据)进行比较。以计算机可读形式进行的比较是从比较模块检出的内容，其可以通过多种方式处理。
在另一实施例中，每一非相干光源可为在分层衬底222引导光的光纤(未图示)。可提供光学组件以调节光以大体上均匀地照明分层衬底222的整个表面。
图3描绘在由囊泡(例如胞外体)吸收时反射光的干涉式散射，其中所述囊泡结合于衬底的表面上的捕获剂以供本文所描述的方法和系统的某些实施例中使用。在此实施例中，从包括硅表面(Si)和二氧化硅表面(SiO2)的不同层的反射干涉从捕获剂(例如抗体)捕获的纳米粒子反射的光。所述干涉引起反射光的改变，所述改变可由如本文中所描述的成像系统检测。确切地说，入射光的反射特征由衬底表面上的结合层上的所述纳米粒子改变，干涉从硅表面和二氧化硅表面反射的光。图2的成像系统检测与硅表面和二氧化硅的反射特性相比从细胞外囊泡的反射的干涉，且图像处理系统包含提供细胞外囊泡的精确和定量性大小的前向模型。成像装置的优选实施例使用单一波长(带)的光以测量来自结合层的反射光与来自粒子的散射光的干涉/混合(光的散射)。
图4A为如本文所描述的用于对光学衬底成像，例如以检测粒子(例如胞外体)，例如共定位胞外体与相关生物分子货物的仪器的说明性实施例。图4B为如本文中所描述的反射芯片(衬底)的图像。图4C为安置于微流体盒内的反射芯片的图像，所述微流体盒允许样品在衬底上方流动。图4D为如本文所描述的衬底上的捕获剂(例如抗体)阵列的说明。
在用于对粒子成像的示范性仪器的一些实施例中，具有不同发射峰值波长的三个或更多个LED可用作光源或激发源。在使用超过一个非相干光源的一些实施例中，所使用的光源具有较窄范围的波长，且每一个别光源的波长之间的宽度较小。在一些实施例中，光源还可充当激发附接到粒子的荧光探针的激发源。在一些实施例中，可使用多个光源。在一些实施例中，光源中的一或多个为激光源。
使用高倍放大干涉式测量是一种检测生物分子目标和粒子的方法。本文中所描述的方法和装置通过使用具有高数值孔径的高倍放大物镜且将空间滤光器放置在相机的光轴上而对所述粒子成像。高数值孔径物镜将允许在高放大倍数下成像，且空间滤光器用于通过仅从入射光的高角度或角度范围收集光来维持分层衬底造成的干涉的对比度。所描述的光学设置允许检测(例如粒子或生物分子目标的)子波长结构而不损失对比度或横向分辨率。
简化本文中所描述的成像装置的另一方法可为使用宽带源和彩色CCD相机，其中通过相机完成取样。专用于检测个别颜色的相机的像素可用于提取包括于给定光谱带中的光的强度，因此实现各种波长的光谱检测方案。
具有LED光源的实施例的一个优点是基于LED的照明源允许成像装置更稳固且便携，因此允许现场应用。另一优点为光源可充当可在特定波长(带)的光下激发的荧光团物种的激发源。此外，使用多个LED将允许荧光团的同时或依序激发。另一优点为装置的高倍放大能力。高倍放大将允许在表面上和/或纳米粒子内检测单一纳米粒子或生物分子目标(例如长度或直径>几纳米)。在一些实施例中，白色光源或RGB LED与3CCD或其它彩色相机可用于捕获三个不同波长下的光谱信息以增加时间分辨率。这在研究例如动态生物相互作用方面是有益的。
如本文中所描述的装置有助于使用LED照明源以在结合到表面的样品中衬底增强检测粒子，如细胞外囊泡(例如胞外体生物标记物)的方法。LED照明源还可充当用于检测荧光标记的粒子的激发源。所述装置提供用于同时记录整个衬底表面的响应的高通量光谱方法。所述装置和方法可用于任何高通量应用中。所述装置和方法因此提供用于高通量光学感测结合到如本文所描述的反射衬底的表面或大体上接近所述表面定位的粒子的平台或系统。所述系统包含照明源、反射衬底和成像装置。
在一些实施例中，成像装置包含相机。装置可用于粒子(例如纳米粒子，[例如衬底上的细胞外囊泡，例如胞外体生物标记物])的多重和动态检测。此外，在一些实施例中，纳米粒子可以用荧光探针(标签)标记或含有所述探针以增强检测。
装置的某些实施例可描述为功能模块，所述功能模块包括记录在计算机可读媒体上且在执行时使得计算机执行方法步骤的计算机可执行指令。为了清楚起见，所述模块可由功能分开。然而，应理解，所述模块不需要对应于离散代码块，且所描述的功能可通过执行存储在各种媒体上且在各种时间执行的各种代码部分而进行。
在一些实施例中，装置提供用于检测和/或分类反射衬底上的粒子的系统，其包含a)确定模块，其经配置以确定光学信息，其中所述光学信息包含使用窄带光源对至少一个波长进行取样；b)存储装置，其经配置以存储从所述确定模块输出的数据；c)比较模块，其被适配成比较存储在所述存储装置上的数据与对照数据，所述比较是检出内容；以及d)显示模块，其用于在客户端计算机上将检出内容页呈现给用户，其中检出内容为衬底的光吸收概况，其中特定光吸收概况指示粒子的结合。
在一些实施例中，如本文所描述的成像装置提供包含计算机可读媒体或存储器的计算机程序，所述媒体或存储器具有记录于其上的计算机可读指令以定义包括确定模块和比较模块的软件模块以在计算机上实施方法，所述方法包含a)利用确定模块确定光学信息，其中所述光学信息包含使用窄带光源对至少一个波长进行取样；b)存储从所述确定模块输出的数据；c)利用比较模块比较存储在存储装置上的数据与对照数据，所述比较是检出内容，以及d)在客户端计算机上将检出内容页呈现给用户，其中检出内容为固体衬底的光吸收概况，其中特定光吸收概况指示粒子的结合。
用于确定光学特性的各种模块包括例如但不限于显微镜、相机、干涉计(用于测量光波的干涉特性)、光度计(用于测量光强度)；旋光计(用于测量偏振光的分散或旋转)、反射计(用于测量表面或物件的反射率)、折射计(用于测量各种材料的折射率)、光谱仪或单色仪(用于出于化学或材料分析的目的产生或测量光谱的一部分)、自准直仪(用于测量角度偏转)和焦度计(用于测定透镜，如眼镜、隐形眼镜和放大透镜的屈光力)。
如本文所用，盒被定义为被配置成含有如本文所描述的反射衬底与透明和高质量成像窗口(COP或聚碳酸酯)以及细流体通道。
如本文中所定义，衬底表面可包括“镜面反射界面”。所述镜面反射界面是指入射光在上面经历“镜面反射”，即从表面光(或有时其它种类的波)的镜样反射的那些表面，其中来自单一入射方向的光(射线)反射到单一出射方向。表面、衬底或界面的所述镜面反射行为通过反射定律描述，其陈述入射光(入射光线)的方向和所反射的出射光(反射光线)的方向相对于表面法线成相同角度，因此入射角等于反射角；数学上定义θi＝θr。镜面反射的第二定义特征为入射、法线和反射方向共平面。可使用例如光泽计精确地测量镜面反射。所述测量是基于物件的折射率。在本文中所描述的方面的一些实施例中，镜面反射界面包含具有透明电介质层(例如硅衬底上的氧化硅(SiO2)层)的衬底。在本文中的方面的一些实施例中，氧化硅(SiO2)层具有用于在其上结合纳米粒子，如胞外体生物标记物的结合剂的层。在一些实施例中，替代透明电介质层，如氮化硅，以及其它涂层可用作薄透明或镜面反射界面层。
C.传感器和方法的应用
检测样品中生物细胞外囊泡，例如胞外体，例如包含胞外体生物标记物，例如细胞表面生物标记物，例如胞外体的生物分子货物的胞外体的能力对于理解细胞生理和疾病进展以及在各种应用，例如早期和快速检测中的使用是基础。本文描述了快速、灵敏、使用简单并且便宜的生物传感器，其可用于涉及在研究和医疗诊断范围内的纳米粒子检测以检测癌症的多种应用。
因此，在某些实施例中，本文所描述的衬底用于检测样品中细胞外囊泡，例如胞外体，例如包含胞外体生物标记物，例如细胞表面生物标记物的胞外体与衬底层的结合，其中存在于与衬底层接触的样品中的胞外体生物标记物的结合相对于在不存在样品的情况下的光程长度改变光程长度，产生由本文所述的装置和方法检测到和测量的干涉图案。在一些实施例中，接触衬底的样品可具有多种生物分子目标，使得多种细胞外囊泡结合到衬底层并且由本文所描述的装置和方法检测到。
装置和衬底可以用于研究一个或同时研究多个特异性结合相互作用，即多重应用。可检测样品中的一或多种特定细胞外囊泡与各自目标表面的结合。衬底用光照明，并且如果样品中的一或多种纳米粒子目标结合一或多种捕获剂，那么其将在图像中呈现为单一离散对象，允许检测纳米粒子与捕获剂的个别结合。在衬底表面包含包括一或多个特定目标的一或多个不同目标位置的阵列的实施例中，则干涉图案从衬底的每一不同位置检测。因此，在某些实施例中，囊泡使用本文所描述的程序固定。固定囊泡随后使用荧光标记(例如荧光货物标记)标记以鉴别存在和/或不存在相关生物分子货物。
在一些实施例中，多种特定目标分子可以阵列形式固定到衬底表面上。随后使衬底与包含潜在纳米粒子目标，例如胞外体的相关测试样品接触。仅特异性结合于捕获剂的胞外体结合于衬底的表面。对于高通量应用，生物传感器可以一组阵列形式布置，其中衬底表面上包含特异性结合分子目标的阵列的若干衬底以阵列形式布置。
因此，装置和衬底可用于检测样品中存在的多种纳米粒子目标中的一或多种与具有附接到衬底层的多种捕获剂中的一或多种的生物传感器衬底层的结合。举例来说，一或多种特定固定化分子可布置于衬底层的表面上的一或多个不同位置的阵列中。一或多个不同位置可界定直径为约50到500微米或约150到200微米的微阵列点。
举例来说，结合剂可以固定在分层衬底表面上，所述表面的光谱反射特征在将所述纳米粒子固定在衬底表面上的结合层上之后改变。确切地说，如本文中将描述，图像处理系统随衬底的反射特性的变化检测细胞外囊泡，且图像处理系统包含提供细胞外囊泡的精确和定量性大小的前向模型。确切地说，装置的优选实施例使用单一波长(带)的光以测量来自结合层的反射光与来自粒子的散射光的干涉/混合(光的散射)。随着细胞外囊泡结合到结合层，来自这些对象的散射光干涉来自衬底表面的反射光，使得细胞外囊泡可在成像装置上作为离散对象(点)被观察到。衬底用一个(或多个)波长的光照明，并且如果样品中的一或多种细胞外囊泡对象与结合层结合，那么纳米粒子目标将在图像中呈现为单一离散对象，从而允许检测纳米粒子目标的个别结合以及确定细胞外囊泡的定量性大小。对于高通量应用设备允许对表面的整个视场进行同时成像。设备和方法具有若干优点，例如低成本、高通量、快速和便携式检测。
本文还描述了用于检测多种生物分子目标的装置的使用方法。在一些方面，本文中所描述的装置和方法提供一种用于同时记录整个衬底表面的响应的高通量方法，其包含使用提供非相干光的光源对至少一个波长进行取样，且使用成像装置对所反射或透射的光进行成像。所述装置可包括发光二极管(LED)作为用于干涉式原理的检测的照明源。干涉式测量可使用光程长度差(OPD)提供所需灵敏度和分辨率。
因此，本文所描述的是用于分子或纳米粒子或细胞外囊泡(如胞外体)与衬底表面的结合的衬底增强检测的装置和方法。装置通过使用例如LED用至少一个波长的光照明衬底且通过如2-D阵列像素相机的成像装置记录反射率来对反射光谱进行取样。以此方式，同时记录整个视场的反射光谱。使用此装置和方法，可实现高通量微阵列成像。本发明技术还可提供用于检测30nm到几(2-3)微米范围内的生物分子纳米粒子目标的高倍放大成像。所述高倍放大检测可例如用于检测捕获表面上的单一粒子。
仪器和过程提供高通量光谱法技术，其中通过使用窄带光源(例如LED)实现对至少一个波长的取样，且所反射或透射的光于成像装置(例如单色CCD相机)成像，因此允许同时记录整个成像表面的响应。微阵列可制造于分层衬底上(例如：在Si晶片上成层的从几纳米SiO2到至多100纳米SiO2的任何厚度)。优选实施例包括绿色LED光源(535nm)和在Si晶片上成层的100nm SiO2氧化物。第二优选实施例包括紫外LED光源(420nm)和在Si晶片上成层的60nm SiO2氧化物。在复杂介质中成像时使用的第三优选实施例包括紫外LED光源(420nm)和在Si晶片上成层的30到60nm SiO2氧化物。
在一些实施例中，具有不同发射峰值波长的三个或更多个LED可用作光源。在使用超过一个非相干光源的一些实施例中，所使用的光源具有较窄范围的波长，且每一个别光源的波长之间的宽度较小。在一些实施例中，使用一或两个光源。
在本文所述的一些实施例中，微阵列或结合剂制造于分层衬底上，包含在Si晶片上成层的几纳米到100纳米的任何厚度的SiO2。在一些实施例中，微阵列或结合剂制造于分层衬底上，包含在Si晶片上成层的95到100nm SiO2。在一些实施例中，微阵列或结合剂制造于分层衬底上，包含在Si晶片上成层的30到60nm SiO2。优选实施例包括绿色LED光源(接近535nm)和在Si晶片上成层的100nm SiO2氧化物。第二优选实施例包括紫外LED光源(接近420nm)和在Si晶片上成层的60nm SiO2氧化物。在复杂介质中成像时使用的第三优选实施例包括紫外LED光源(接近420nm)和在Si晶片上成层的30到60nm SiO2氧化物。本文中所描述的装置和方法可部分地用于高倍放大干涉式测量，例如但不限于检测给定样品中的细胞外囊泡，例如癌症的胞外体生物标记物。
可与所描述的光学衬底一起使用的传感器和方法的实例包括但不限于由达布勒(Daaboul)等人在2017年2月3日提交的标题为《具有表面标记物的胞外体的检测(Detection of Exosomes Having Surface Markers)》的第WO2017/136676号国际公开中所描述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
转向图5，在某些实施例中，本文中所描述的反射衬底可以用于通过荧光和单粒子无标记散射的同时检测，检测和/或分类大体上位于在反射衬底的顶部表面上方和附近的目标平面中的粒子(例如纳米粒子，例如纳米囊泡，例如胞外体，例如生物分子货物)的方法中。同时检测一或多个通道中的荧光和无标记散射信号允许囊泡(例如胞外体)连同内部和/或外部标记物的共定位。确切地说，本文中关于囊泡内和/或囊泡上的生物分子货物和/或标记物的透化和标记所描述的方法对于鉴别和/或分类相关粒子是尤其有利的。举例来说，在一个实施例中，囊泡的多种类型的生物分子货物可各自使用本文所描述的方法荧光标记。在一个实例中，每一货物类型可以用独特抗体标记，每一独特抗体连接有不同荧光团。不同通道中的荧光团随后可与无散射信号共定位以对囊泡的特征进行分类和/或定量。举例来说，荧光团的共定位可帮助确定囊泡的来源/类型(例如来源癌症类型、来源细胞类型)、囊泡的大小、囊泡的形状因素、货物类型。在某些实施例中，囊泡的分类可进一步包括确定杂散无标记或荧光信号(例如错误鉴别的囊泡，例如标签与表面的非特异性结合)。在某些实施例中，与荧光团共定位的所鉴别囊泡位置可用于检测和/或定量一或多种特定相关生物分子的一部分[例如通过鉴别检测到荧光发射的囊泡位置，例如由此确定一或多种特定相关生物分子的表达的分数、发生率等]。
图5展示所述方法的示例过程500。在一个步骤502中，将照明光引导到反射衬底的顶部表面。检测由粒子散射和/或由反射衬底反射的照明光(例如以获得散射图像)504。在另一步骤506中，激发光被引导向反射衬底的顶部表面，以在囊泡的表面上和/或囊泡内激发荧光货物标记。在某些实施例中，可随后使用一或多个检测器检测由荧光物种发射的荧光(例如以获得荧光图像)508。对应于(i)由粒子散射和/或由反射衬底反射的照明光的所检测部分(例如散射图像)和(ii)所检测荧光(例如荧光图像)的数据可用于定位和/或分类粒子的至少一部分，随后可经处理以检测和/或分类粒子510。在某些实施例中，对相关生物分子(例如生物分子货物)进行定量。在某些情况下，荧光和散射光图像(例如“无标记”图像)的共定位允许表征囊泡的大小、囊泡的类型、鉴别囊泡内的货物和/或去除“杂散”非特定信号。
本文所描述的反射衬底还可用于增强来自位于粒子内和/或粒子表面的多个不同荧光物种(例如靶向到抗原的荧光抗体)的荧光。所述衬底可用于通过检测来自粒子内和/或表面上的多个不同荧光物种的增强荧光来检测和/或分类粒子(例如纳米粒子；例如纳米囊泡；例如胞外体)的方法中。图6展示用于通过以此方式检测经增强荧光来检测和/或分类粒子的示例过程600。在一个步骤602中，将包含多个波长的激发光引导到反射衬底的顶部表面。激发光激发具有多种不同激发带的各种不同荧光物种，用所述物种标记粒子内/表面上所含有的生物分子货物。随后可检测由多个荧光物种响应于激发光激发而发射的荧光604(例如以获得多个荧光图像，每一图像对应于不同荧光物种)。随后可处理对应于所检测荧光的数据(例如多个荧光图像)以定位和/或分类粒子606。
在某些实施例中，本文所描述的方法包括用荧光物种标记粒子(例如纳米囊泡、胞外体等)的内部和/或表面生物标记物和/或生物分子货物，并且使粒子与反射衬底(传感器芯片)接触的方法。在一个方法中，例如可将粒子(例如纳米囊泡)与包含荧光物种的荧光团-探针复合物一起培育，随后与传感器芯片接触。在另一方法中，例如可将粒子(例如纳米囊泡)在捕获于芯片上之后用荧光团-探针复合物标记。
i.数据处理
本文所描述的系统和方法还包括独特的数据处理方法，其通过测量荧光和/或散射图像(例如使用本文所描述的反射衬底获得)内对应粒子图像特征的强度分布来提供个别粒子(例如囊泡、分子货物)的计数和表征。举例来说，如本文中所呈现，荧光和无标记信号的共定位在分类和/或鉴别囊泡(例如胞外体)和其生物分子货物方面提供特定的独特优点。在无标记图像中，粒子可呈现为与其周围相比相对明亮或黑暗的图像特征(例如光斑；例如衍射极限光斑；例如具有艾里斑(airy disc)形状)。无标记图像中此类粒子图像特征的强度测量可包括确定峰值粒子特征强度、测量粒子图像特征的整个“艾里斑”包络和定量粒子图像特征的强度的其它方法。
可处理拍摄的具有连接的粒子的光学衬底的图像以检测个别粒子(例如囊泡，例如胞外体)且提供关于其的强度信息。粒子检测可通过模板匹配阶段实现，在所述阶段中，基于低于显微镜的衍射极限的粒子将形成由显微镜的点扩散函数给出的“艾里斑”的知识来鉴别粒子图像特征。此对粒子将在图像中采用的形式的先验知识允许检测且随后定量粒子的数目以及其强度，这可用于提供大小确定信息。
当在多个图像(如荧光和散射图像)内检测到粒子强度特征时，可将不同图像中对应于相同粒子的粒子强度特征彼此匹配，由此提供粒子在各种图像中的共定位。举例来说，可表现散射信号和荧光信号中在一个波长下的粒子强度特征。在另一实施例中，其中获得多个荧光图像，多个荧光图像中粒子强度特征的共定位允许用于获得不同荧光图像的多个荧光标记物的共定位。
在一个实例中，进行无标记(散射)图像和通过检测目标(例如生物分子货物)上标签的Cy3发射获得的荧光图像中的粒子图像特征的共定位。在一个实例中，进行两个荧光图像中粒子图像特征的共定位，其中第一荧光图像通过检测连接到第一目标的标签的Cy3发射获得，并且第二荧光图像通过检测连接到第二(或相同)目标的标签的Cy5发射获得。在一个实例中，进行无标记(散射)图像和通过检测Cy3和Cy5发射获得的两个荧光图像中粒子图像特征的共定位。
在某些实施例中，获自粒子的荧光和无标记信号的共定位可分类为指示以下中的任一者或组合：(i)不存在预选癌症，(ii)存在预选癌症，(iii)存在预选组织的非癌性病症，或(iv)存在预选组织的预选癌前病变。在某些实施例中，受试者被分类为具有以下的升高风险：(i)未患有预选癌症，(ii)患有预选癌症，(iii)患有预选组织的非癌性病症，或(iv)患有预选组织的预选癌前病变。在某些实施例中，所述方法包含监测和/或评估预选癌症的进展或状态。
ii.荧光标记方法
可将荧光团连接到探针以指示粒子(例如纳米囊泡，例如胞外体)上和/或内分子目标的存在。荧光团可以是有机染料、荧光蛋白、酶的底物。荧光团可具有可见光谱中的激发和发射带。
在某些实施例中，荧光物种包含可用于染色粒子(例如胞外体)中和/或上的RNA和DNA的核酸染料。在某些实施例中，分子信标可用于检测核酸上的特定序列。
脂质染料可用于探测囊泡的脂质膜的组成。这些脂质染料可用于检测囊泡的组成并且理解囊泡的生体合成。此外，通过染色囊泡的脂质膜，信号与囊泡的表面积相关。因此，用脂质染料进行脂质染色可以是确认囊泡大小的正交测量和/或其可允许在光散射过低而无法检测时确定囊泡的大小。其它染料包括5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯和羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。
iii.分类和/或检测囊泡
在某些实施例中，本文所描述的反射衬底可用于通过荧光和单粒子散射的共定位检测和/或分类基本上位于反射衬底的顶部表面上方且接近所述顶部表面的目标平面中的粒子(例如纳米粒子，例如纳米囊泡，例如胞外体，例如生物分子货物)的方法中。在一个步骤中，将照明光引导到反射衬底的顶部表面。检测由粒子(例如胞外体)散射和/或由反射衬底反射的照明光(例如以获得散射图像)。在另一步骤中，将激发光导向反射衬底的顶部表面，以激发粒子(例如生物分子货物，例如生物标记物)的表面处和/或内部的荧光物种。随后可检测由荧光物种发射的荧光(例如以获得荧光图像)。随后可处理对应于(i)由粒子散射和/或由反射衬底反射的照明光的检测到的部分(例如散射图像)和(ii)检测到的荧光(例如荧光图像)并且用以定位和/或分类粒子的至少一部分的数据，以定位和/或分类粒子。
本文所描述的反射衬底还可用于增强来自位于粒子内和/或表面处的多个不同荧光物种的荧光。此类衬底可用于通过检测来自粒子内和/或表面上的多个不同荧光物种的增强荧光来检测和/或分类粒子(例如纳米粒子；例如纳米囊泡；例如胞外体)的方法中。在一个步骤中，将包含多个波长的激发光引导到反射衬底的顶部表面。激发光激发具有多个不同激发带的各种不同荧光物种，粒子(例如纳米粒子；例如纳米囊泡；例如胞外体)借此被标记。在某些实施例中，荧光物种结合到粒子内和/或表面上的生物标记物和/或生物分子货物。随后可检测由多个荧光物种响应于激发光的激发而发射的荧光(例如以获得多个荧光图像，每个图像对应于不同荧光物种)。随后可处理对应于检测到的荧光的数据(例如多个荧光图像)以定位和/或分类粒子。
在某些实施例中，本文所描述的方法包括用荧光物种标记粒子(如纳米囊泡、胞外体等)和使粒子与反射衬底(例如传感器芯片)接触的方法。在一个方法中，例如，可将粒子(例如纳米囊泡)与包含荧光物种的荧光团-探针复合物一起培育，随后与传感器芯片接触。在另一方法中，例如，可将粒子(例如纳米囊泡)在捕获于芯片上之后用荧光团-探针复合物标记。
在某些实施例中，所描述的光学衬底与达布勒等人在2017年2月3日提交的国际PCT申请第PCT/US2017/016434号中所描述的系统和方法组合使用，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，所述方法包括使用如本文所描述的衬底通过使衬底表面与样品接触并且检测结合到衬底表面的细胞外囊泡，从获自受试者的样品分离循环细胞外囊泡(例如癌症衍生的细胞外囊泡)(例如胞外体)。在某些实施例中，使用一或多种结合剂(例如，如本文所描述)(例如抗体、核酸、多肽和/或适体)，将循环细胞外囊泡结合到衬底表面。在某些实施例中，所述方法包含评估样品中细胞外囊泡的水平(例如数量，例如数目，例如浓度)。在某些实施例中，所述方法包含评估结合到衬底或其预定部分的细胞外囊泡的数目。在某些实施例中，所述方法包含确定结合到衬底的一或多个细胞外囊泡的大小(例如直径、体积)。
D.用于基于无标记和/或荧光的纳米粒子检测的增强衬底
在某些实施例中，所描述的系统和方法与达布勒等人在2018年8月3日提交的临时申请第62/714204号和2019年5月31日提交的国际PCT申请第PCT/US2019/034831号中所描述的用于增强的基于无标记和荧光的纳米粒子(如胞外体)检测的组合物、系统和方法组合使用，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，用于增强的基于无标记和荧光的纳米粒子检测的上述组合物、系统和方法涉及光学衬底，所述衬底(1)增强由荧光团发射的荧光信号和/或(2)增强包含非荧光波长下相比于衬底反射率的散射信号强度的“对比度”信号(“无标记”信号)。在某些实施例中，光学衬底包含薄透明层(例如电介质层，例如氧化物层)。在替代实施例中，光学衬底包含薄透明层电介质层的堆叠，所述堆叠针对第一目标波长下的特定散射增强和第二目标波长下的荧光增强两者而设计。所描述的光学衬底同时共定位增强的对比度信号和荧光信号的能力提供提高的灵敏度和纳米粒子(如细胞外囊泡(例如胞外体))的检测，其可促进疾病检测和监测，以及其它临床应用。
在某些实施例中，提供增加的样品激发和/或荧光发射的光学衬底还用于提高单独波长下的散射对比度。散射对比度通过在-荧光波长下激发偶极子并且测量粒子强度与背景强度的比率来测量(参见等式1)：
Eref＝Einc+rEinc；
Figure BDA0003190486050000391
增强散射对比度需要与荧光增强不同的优化，其包括设计表面，使得驻波干涉图案的强度最大值与荧光团在同一平面内。然而，对比度受来自纳米粒子的散射电场影响，所述散射电场干扰入射电场和离开衬底的反射场，以产生由如CCD阵列的检测器获取的强度。散射的特定辐射方向图可通过进行球形近似，并且例如视所讨论的粒子半径而定使用米氏理论(Mie theory)或瑞利散射理论(Rayleigh scattering theory)计算。
在荧光中，激发波长不同于发射波长，意味着来自荧光团的发射电磁(EM)辐射不干扰激发光。这是与在试图使用对比度测量来对粒子和其它生物物质进行大小确定和表征时在根本上不同的相互作用。荧光增强可通过最大化荧光团平面中跨越其激发带宽的局部电场并且同时提高跨越其发射带宽的反射率来收集更多的前向散射光来近似。假定后向散射光和前向散射光的振幅相等，这简化为：
Figure BDA0003190486050000401
对于标准载玻片和Cy3荧光团，荧光因子F为大致.34，载玻片上的Cy3荧光团的电磁场增强因子E增强为.66。
在某些实施例中，荧光强度的最大增强为8倍。可从电场强度强度增强获得4倍增强，并且可从衬底反射出来的所有前向散射光的集合获得2倍增强。此数字视为F，其中载玻片的F为.66。如以下等式展开所示，单一(60nm厚氧化物层)产生相对于载玻片增强的荧光图像信号：
F＝E(1+R)
F玻璃＝.65(1+.0351)＝Cy3的.66
F层(60nm)＝1.49(1+.19)＝1.78。
i.多层膜堆叠
在某些实施例中，衬底包含对应于多层堆叠的光学干涉涂层。在某些实施例中，多层堆叠包含三层。在某些实施例中，多层堆叠包含交替的低和高折射率层。以下展示包含交替的高和低折射率层的各种多层堆叠的实例(还展示对应于Si衬底的基础层和环境空气层)：
Si-SiO2-金属-SiO2-空气
Si-SiO2-Ni-SiO2-空气
Si-SiO2-Si-SiO2-空气
Si-SiO2-TiO2-SiO2-空气
在某些实施例中，顶层为生物接受材料(例如SiO2、Si3N4)。在某些实施例中，中间层是或包含金属或高折射率材料(例如金属；例如Ni；例如Si；例如TiO2)的薄层。在某些实施例中，光学干涉膜包含一或多层电介质材料，如但不限于SiO2、TiO2、Si、Ta2O5、HfO2、ZrO2、MgO、Si3N4、MgF2和YF3。在某些实施例中，每一层小于130nm(例如对于SiO2，750nm的四分之一波长)。高折射率层可具有在2.3与4之间的折射率。低折射率层可具有在1.1与1.7之间的折射率。
ii.荧光和散射增强的波长范围
如本文所描述的荧光和散射增强可使用本文所描述的方法在多个波长下实现。在某些实施例中，在可见光区中的波长(例如在400nm到750nm范围内的波长)下获得增强。以下列出可见光区中的各种“散射”或无标记目标中心波长：
1.约400到约450nm(UV)
2.约460到约500nm(蓝色)
3.约520到约560nm(绿色)
4.约640到约680nm(红色)
5.约710到约750nm(深红色)
在某些实施例中，散射信号的测量使用具有较短波长的照明光用于检测较小粒子。然而，本文所用的方法可用于工程化与较长波长一起使用的衬底，以防止例如生物粒子的漂白和破坏或其它效应。
另一实例涉及检测来自标记粒子的荧光物种的荧光，其中荧光物种可在传统无标记波长(例如420nm)下激发。在某些实施例中，并非检测散射传统无标记(例如散射)波长，而是优选使用较长波长检测散射信号，例如以便防止光致漂白且随后传统地检测荧光。因此，可使用经设计以增强激发范围外的长波长(例如红光)下的散射信号并且增强粒子可激发/发射之处(例如蓝光)的荧光的衬底。
E.实例
实例1：检测胞外体内部的生物分子货物的方法
本实例描述使用经标记抗体检测囊泡内部和/或表面上的生物标记物(例如蛋白质，例如核酸，例如DNA，例如RNA)的示范性方法。
此实例中所描述的生物标记物的实例包括ALG-2-相互作用蛋白X(ALIX)、同线蛋白和肿瘤易感性基因101蛋白质(TSG 101)和GFP(荧光蛋白)。
胞外体在衬底上的固定化
首先，在如本文所描述的衬底(例如反射衬底，例如光学衬底，例如ExoViewTM芯片)，或如在2018年8月3日提交的标题为《用于纳米粒子的增强的无标记且基于荧光的检测的组合物、系统和方法(COMPOSITIONS,SYSTEMS,AND METHODS FOR ENHANCED LABEL-FREEAND FLUORESCENCE-BASED DETECTION OF NANOPARTICLES)》的第62/714204号美国临时申请中描述的一种衬底上培育包含如胞外体的粒子的样品，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。在此实例中，使用抗体官能化光学衬底以从样品捕获和分离粒子，如胞外体。官能化光学衬底的实例描述于2017年2月3日提交的标题为《具有表面标记物的胞外体检测(DETECTION OF EXOSOMES HAVING SURFACE MARKERS)》的第PCT/US17/16434号国际申请中，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。另外，图3为在示范性官能化表面上捕获的胞外体的说明性实例。
将囊泡固定到固体表面(例如本文所述的衬底，珠粒)上随后固定提高了透化时结构的稳定性。在不需要粒子的固定化(例如流式细胞测量术)而是在液相中进行检测的检测方法中，固定和透化的囊泡(例如胞外体)不维持其结构。因此，囊泡将溶解。溶解将使得分子组分(例如生物分子货物)作为个别实体，而非作为属于个别囊泡和/或与个别囊泡相关的分子的集合被检测。
在将囊泡固定到衬底上之后，随后洗涤芯片以去除任何未结合的胞外体。结合的胞外体随后经历如以下的标记方案。
货物标记方案的概述
首先，用含2％多聚甲醛(PFA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定结合的胞外体约10分钟。图7展示固定对荧光标记的影响。此步骤的固定显著改进了所述过程中货物的荧光标记，从而优于没有固定的标记。固定使胞外体的组分交联，使得其更坚固且对在透化时其结构的损失具抗性。
囊泡的固定和透化的优化是一个困难的过程。如本文所论述，不正确的实验参数将引起抗原和/或囊泡的损坏。显著较长的固定时间(例如1小时或更久)可损坏胞外体内和/或表面上的抗原(例如生物分子货物)。另外，已发现，例如基于EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)的交联剂不适用于所述交联，因为其将损坏胞外体。
醛固定(例如使用甲醛、戊二醛等)为将细胞骨架中发现的蛋白质与细胞骨架的元件彼此交联的技术。使用醛的蛋白质化学修饰可以破坏抗原。当固定细胞时，此问题并不明显。然而，当使用醛固定组织时，所述方法需要极长时间的处理来实现样品穿透。长时间处理改变蛋白质结构。当使用醛时，有可能的情况下，建议避免细胞和组织中固定时间太长。在某些实施例中，在用醛固定之后，采用称作“淬灭”步骤的步骤。淬灭减少自身荧光，因为醛固定剂与胺和蛋白质反应以产生荧光产物。在某些实施例中，淬灭可以用包含淬灭剂(例如甘氨酸)的溶液进行。
在固定之后囊泡膜的透化允许接达囊泡的内腔和内部分子货物。因此，在一个实施例中，胞外体随后用于PBS中的0.05％TritonTM(PBST)透化约2分钟到10分钟。较高浓度的TritonTM(例如大于1％)和显著较长的培育时间(例如大于1小时)造成对相关胞外体和/或抗原的损伤。
芯片随后与约0.05μg/mL浓度的荧光探针在PBST中的10％牛血清白蛋白(BSA)中一起培育(例如在室温下约1小时，例如在4℃下过夜)。然而，荧光探针的浓度可以在至多10μg/mL范围内。芯片(例如，如图4B中所描绘)随后用缓冲液洗涤，干燥，且在检测系统(例如ExoViewTM读取器，例如，如图4A中所描绘)上读取，所述系统如在2018年8月3日提交的标题为“用于纳米粒子的增强的无标记且基于荧光的检测的组合物、系统和方法”的第62/714204号美国临时申请中描述的一种系统，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
在固定和透化过程期间，避免芯片的干燥以便防止蛋白质的脱水和/或干燥。蛋白质的脱水引起如使用傅里叶变换红外光谱法(Fourier-transform infraredspectroscopy)和分辨率增强技术所观察到的显著可测量的构象变化。因此，这些构象变化至少部分地不可逆。在某些情况下，观察到蛋白质变性和凝集。用于描述抗原-捕获剂结合强度的pK值(即解离常数)可因各种因素(例如蛋白质折叠、脱水、电荷-电荷相互作用、电荷-偶极相互作用)而扰乱。
在某些实施例中，有机溶剂可用于固定囊泡。有机溶剂(例如甲醇、丙酮、乙醇)不共价改变目标蛋白质。有机溶剂使蛋白质从溶液沉淀出。有机溶剂使细胞变得扁平或萎陷，产生蛋白质壳。壳使得某些细胞结构(例如细胞核、线粒体)的穿透更困难。另外，有机溶剂还去除脂质连接的蛋白质。然而，使用有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮)的固定细胞提供与某些抗体一起使用的优点。举例来说，当使用仅结合到天然埋入蛋白质结构内部的一种目标抗原的单克隆抗体时，有机溶剂是有用的。
货物标记分析方案的示范性步骤
将包含细胞外囊泡(EV)或胞外体的样品在光学衬底(例如NanoViewTM芯片，例如图4A和4D)(下文中称为“芯片”)上培育，所述光学衬底具有点样于芯片表面上的充当捕获剂的抗体。注意：抗体类型基于细胞外囊泡(EV)或胞外体表达的抗原而选择。
步骤1-洗涤未结合的粒子
使用振荡器以500rpm用包含以下的“HEPES缓冲液”洗涤芯片三次：50mM HEPES、150mM氯化钠、5mM EDTA、5mM EGTA和0.05％
Figure BDA0003190486050000431
20，每次5分钟。添加
Figure BDA0003190486050000432
20允许更容易地从抗体去除未结合/非特异性结合的粒子。
Figure BDA0003190486050000433
20也称为聚山梨醇酯20。
Figure BDA0003190486050000434
20的化学式为C58H114O26。
Figure BDA0003190486050000435
20具有以下化学结构：
Figure BDA0003190486050000436
程序
1)在将样品在芯片上培育过夜之后：将1mL HEPES缓冲液添加到孔中，并且振荡5分钟。
2)去除750μL缓冲液，并且随后添加750μL HEPES缓冲液(此过程重复总共3次)。
3)在最后一次HEPES缓冲液洗涤之后，去除750μL溶液体积，使得留下250μL溶液(孔中留下的体积)(例如以保持EV的完整性)。
步骤2-固定具有连接的EV的芯片(固定EV)
在去除未结合的粒子之后，使用稀释于PBS(pH 7到pH 7.4)中的多聚甲醛(无PFA-甲醇)固定(或交联)包含固定的EV的芯片。在某些实施例中，过度固定可导致对EV表达的抗原的破坏。
程序
4)将250μL 4％PFA添加到具有250μL HEPES缓冲液的孔中，使PFA的最终浓度达到2％。
5)将芯片与固定溶液在室温下一起培育10分钟。
步骤3-从芯片洗涤掉PFA
此步骤的目的是去除过量PFA并且尽可能地保留抗原。
程序
6)添加500μL HEPES缓冲液，使孔上的总体积为1mL。随后，去除750μL溶液，并且添加另外750μL HEPES缓冲液。进行这些步骤来进行缓冲液交换，并且稀释PFA以避免抗原破坏。
7)振荡芯片5分钟。其后，接着去除750μL溶液，并且添加750μL HEPES缓冲液。此过程重复三次。
8)在最后一次HEPES缓冲液洗涤之后，去除750μL溶液，使得250μL溶液留在孔中(例如以避免芯片干燥)。
步骤4-EV的透化
此步骤的目的是允许抗体在后续步骤中内化。清洁剂TritonTM-X用作主要透化剂(例如其中TritonTM-X的浓度在约0.05％到约1％范围内)。必须考虑时间选择，因为来自EV的膜可能损坏或破裂，并且无意中释放生物分子货物(例如蛋白质、DNA、RNA)。此示范性方案描述的时间选择优化为适合于使用0.05％浓度的TritonTM(或TritonTM-X)的PBS溶液的时间。应注意，培育时间可基于所使用的TritonTM浓度而改变。选择TritonTM-X浓度以维持EV的膜的完整性。
程序
9)将250μL 0.1％TritonTM-X溶液添加到已含有250μL HEPES缓冲液的孔中，使得孔中TritonTM的总浓度为0.05％。将芯片在室温下(无振荡)培育10分钟。
10)将500μL HEPES缓冲液添加到孔中，使总体积为1mL。随后，去除750μL溶液，并且添加另外750μL HEPES缓冲液。进行此步骤来尽可能快地进行缓冲液交换并且避免膜破坏。
11)将芯片洗涤5分钟。随后去除750μL溶液，并且添加另外750μL HEPES缓冲液。此步骤重复三次。
步骤5-免疫标记
程序
12)在洗涤芯片时，将抗体在含10％BSA的HEPES缓冲液中稀释。起始稀释度为约1:5000(例如假定抗体的初始浓度为0.5mg/mL)。在某些实施例中，初始抗体浓度的范围为约0.05mg/mL-5mg/mL。随后相应地改变起始稀释度。可在混合液中使用至多三种标记有不同荧光团的抗体。
13)一旦完成洗涤芯片，则将孔中的所有体积去除并且添加250μL抗体(或抗体混合液)的10％BSA溶液。
14)随后在无振荡的情况下，在室温下培育芯片1小时。
步骤6-洗涤未结合的抗体并且使芯片准备好进行扫描
在此阶段添加洗涤步骤去除未结合/非特异性结合的针对EV的标记抗体。
程序
15)在培育之后，添加750μL HEPES缓冲液，使孔中的总体积为1mL。随后，去除750μL溶液，并且添加另外750μL。此步骤稀释抗体，以避免由在室温下培育时间过长导致的任何非特异性结合。
16)随后将芯片在室温下以500rpm振荡5分钟。
17)随后去除750μL溶液，并且添加另外750μL HEPES缓冲液。这些步骤重复三次。
18)在最终洗涤时，去除750μL溶液，并且添加750μL不含Tween
Figure BDA0003190486050000453
的HEPES缓冲液。此步骤从芯片去除清洁剂。
19)在用不含
Figure BDA0003190486050000454
的HEPES缓冲液洗涤之后，去除750μL溶液，并且添加750μLdiH2O以去除来自HEPES缓冲液的盐。
20)随后将芯片分别地转移到含diH2O的6cm皮氏培养皿(Petri dish)，不使芯片干燥。
随后以45度角将芯片从水中取出，使水均匀地滑落，由此去除过量水，且随后风干。
实验结果
在芯片上培育人血浆样品中的细胞培养物来源的细胞外囊泡(EV)(例如胞外体)。芯片包含抗体捕获区域以将EV结合到芯片表面。在芯片上培育样品之后，遵循透化方案(如本文所描述的方案)或无透化。未透化的芯片暴露于2％PFA以固定10分钟并且在PBS中冲洗。使芯片与0.5％BSA接触1小时以封闭芯片的未点样区域(“封闭溶液”)。随后使芯片与在封闭溶液中稀释的抗体溶液接触1小时。使透化的芯片暴露于2％PFA以固定10分钟。随后将芯片在0.05％TritonTM中透化10分钟。使芯片与0.5％BSA(“封闭溶液”)接触1小时以封闭芯片的未点样区域。随后使芯片与在封闭溶液中稀释的抗体溶液接触1小时。
血浆包括在芯片上，并且EV在抗CD81、CD63、CD9、CD171和同型对照组点上捕获。无标记干涉式成像模态展示在抗CD63、CD9和CD171点上发生的EV捕获(图8)。随后，荧光成像模态用于确定这些捕获的粒子是否含有两种不同p-Tau蛋白质p-Tau Ser202和p-TauSer396(图9)。根据本文所描述的透化方案，将芯片与抗p-Tau Ser202-Alexa555和抗p-Tau396-Alexa647一起培育。有趣的是，发现p-Tau在CD171阳性胞外体上表达，所述胞外体对血浆中的神经元来源的EV富集(图8)。此外，即使通过CD63和CD9点捕获数千个囊泡，这些点对于p-Tau并不染色(图9)。这些结果展现增强的荧光检测，例如与增强的无标记检测组合，可用于研究来自复杂样品(如人血浆)的EV的不均匀性。
图10A展示使用抗CD63抗体结合到光学衬底(或芯片)的细胞外囊泡(EV)的荧光图像。用抗CD63(绿色；右图像)、同线蛋白(黄色；左图像)和ALIX(红色；中间图像)标记所捕获的EV。CD63为表面标记物，而同线蛋白和ALIX为内部标记物。底部图区为在芯片的同型对照区域上取得的一系列图像且充当阴性对照组。
图10B展示描绘用于鉴别CD63捕获的荧光通道中的每一个和阴性对照组中鉴别的荧光粒子的数目的图。数据表明，在无透化的情况下，仅在检测标记的CD63(其是粒子上的表面标记物)的绿色通道中检测到粒子。内部标记物和阴性对照组未展示标记。
图11A展示使用抗CD63抗体结合到光学衬底(或芯片)的细胞外囊泡(EV)的荧光图像。在对所捕获的EV进行本文所述的透化方案之后，用抗CD63(绿色)、同线蛋白(黄色；左图像)和ALIX(红色；中间图像)标记EV。CD63为表面标记物，而同线蛋白和ALIX为内部标记物。底部图区为在芯片的同型对照区域上取得的图像且充当阴性对照组。图像展示在透化之后，内部标记物上的荧光信号。
图11B展示描绘用于鉴别CD63捕获的荧光通道中的每一个和阴性对照组中鉴别的荧光粒子的数目的图。数据表明，在透化的情况下，在检测标记的CD63(其是表面标记物)的绿色通道中检测到粒子。在黄色和红色通道中检测到内部标记物。阴性对照组未展示标记。
图12展示描绘在包含针对CD63、CD81、CD9、CD171的固定化抗体和同型对照物的芯片上来自人血浆的细胞外囊泡(EV)捕获的图。本文所描述的成像系统(SP-IRIS成像)展示，大量粒子/EV捕获于CD63、CD9和CD171上。成像测量结果展示使用不同抗体(即，抗CD63、抗CD81、抗CD9、抗CD171抗体)中的每一种捕获大量细胞外囊泡。使用无标记的方法定量和鉴别细胞外囊泡。
图8展示描绘本文所描述的透化方案和用针对p-Tau Ser202(Alexa555，绿色)和p-Tau Ser396(Alexa647，红色)的抗体标记囊泡的图像。结合到CD171的EV对于p-tauSer202和p-Tau Ser396都为阳性，而同型阴性对照组未展示标记。
图9展示描绘在使用本文所述的透化方案且用针对p-Tau Ser202(绿色)和p-tauSer396(红色)的抗体标记囊泡之后，结合到CD63和CD9的EV对p-tau Ser202和p-tauSer396非阳性的图像。
实例2：细胞外囊泡的货物标记和透化的确定参数
本实例呈现展示如何确定过程参数，尤其透化和固定剂的浓度和培育时间，以便提供细胞外囊泡和其货物的有效固定、透化和标记的结果。如本文所描述，开发适合于细胞外囊泡的固定、透化和标记程序并不简单。例如可能适用于细胞的常规方案对于细胞外囊泡是不可行的。这些方案使用可能损坏细胞外囊泡样品和其在其表面上携带和/或表达的特定相关生物分子的特定试剂，如交联和固定剂的浓度，和培育时间。保持细胞外囊泡和相关生物分子的完整性对于成像和感测技术，如本文所描述的那些技术是关键的，所述技术旨在检测完整囊泡连同其所携带的双分子货物。本文中所展示的结果表明开发出实现此目标的方案，且可用以提供完整的细胞外囊泡和其货物的成像。
图7描绘描绘样品固定的重要性的图像。在PFA存在(右)或不存在(左)下培育样品。在室温下培育10分钟。透化方案在有和没有固定/交联剂的情况下进行。固定/交联提供EV内的内部分子货物的标记的显著改进，如展现较高水平的荧光信号的图像所展示。
图13描绘与抗体培育时间相关的图像。货物标记步骤进行不同时间长度(15、30、60分钟)。在15分钟时见到足够标记。然而，对应于内部货物的标记的荧光继续随时间增加。样品展示出60分钟的结合程度比在15分钟更高。
图14描绘与TritonTM-X浓度对透化的影响有关的图像。当TritonTM-X浓度从0.01％增加到0.05％时，透化得到改进。信号仍有可能在至多1％TritonTM-X的较高浓度下测量。然而，为了保护抗原的完整性，选择0.05％作为本文所描述的实验中所使用的浓度。
图15展示描绘培育时间对透化的影响的图像(无透化，5分钟，15分钟，30分钟，60分钟)。在选择0.05％浓度的TritonTM-X之后，在此浓度下改变透化时间。发现5分钟到60分钟的培育时间并不显著影响可检测信号。因此，为了保护EV的膜，本文所描述的实验选择10分钟培育时间。
实例3：在“原始”和SEC纯化人血浆中的同线蛋白的检测
本实例展现与经纯化人血浆样品和“原始”人血浆样品中的细胞外囊泡相关的蛋白质同线蛋白的检测。
通过使用尺寸排阻色谱(SEC)进一步处理人血浆来获得纯化的人血浆样品。尺寸排阻色谱为从生物样品或细胞调节培养基纯化细胞外囊泡的技术。
随后将样品在芯片表面上具有抗CD63、抗CD9或抗CD81捕获抗体的芯片(例如，如本文所描述的芯片)上培育。mIgG用作同型对照组。捕获抗体为将细胞外囊泡固定到芯片表面上的捕获剂。随后洗涤芯片以去除未结合的材料。结合到芯片的细胞外囊泡通过捕获抗体保持结合到芯片。细胞外囊泡随后根据本文所描述的方法固定，透化，并且标记。样品使用本文所描述的货物标记方案使用结合到
Figure BDA0003190486050000483
555的抗同线蛋白抗体荧光标记。
图18展示使用抗CD63、抗CD9和抗CD8抗体作为原始和经纯化人样品中的捕获剂，在衬底(例如，如本文所述的芯片)的表面上捕获的荧光标记的粒子(即细胞外囊泡)的数目的图。MIgG用作阴性/同型对照组。经纯化的血浆中的荧光标记的细胞外囊泡的数目针对使用SEC纯化细胞外囊泡时引入的稀释校正。
图19为从原始血浆样品获取的一系列图像。在顶部图区中，使用本文所描述的货物标记方案使用结合到
Figure BDA0003190486050000484
555的抗同线蛋白抗体荧光标记用抗CD9抗体在衬底上捕获的细胞外囊泡。在底部，展示芯片的同型对照区域，其充当阴性对照组。所述图像展示由CD9抗体捕获的EV中同线蛋白的存在和由IgG捕获的EV中同线蛋白的不存在。
实例4：在“原始”和SEC纯化人血浆中的同线蛋白的检测
本实例展现获自小鼠细胞系bEnd3和NIH 3T3的小鼠脑脊髓液和细胞培养基中的与细胞外囊泡相关的蛋白质同线蛋白的检测。
使用本文所述的方法和系统，将来源于小鼠脑脊髓液(图20A)、bEnd3细胞(小鼠脑内皮细胞)(图20B)和NIH 3T3细胞(小鼠成纤维细胞)(图20C)的胞外体在芯片表面上具有抗CD9或抗CD81捕获抗体的芯片(例如，如本文所述的芯片)上培育。大鼠IgG和仓鼠IgG用作同型对照组。捕获抗体为将细胞外囊泡固定到芯片表面上的捕获剂。随后洗涤芯片以去除未结合的材料。结合到芯片的细胞外囊泡通过捕获抗体保持结合到芯片。细胞外囊泡随后根据本文所描述的方法固定，透化，并且标记。样品使用结合到荧光团的抗小鼠同线蛋白和抗mCD9抗体免疫标记。
图20A-20C的图展现在来源于细胞系的EV中存在同线蛋白。CD9免疫标记用于展现可以同时检测内部和外部蛋白质，并且所鉴别的EV共表达已知的胞外体标记物。
图21A为衬底上的CD81捕获的来源于CSF的EV的荧光图像。CSF EV通过CD81捕获并且用抗mCD9和抗小鼠同线蛋白免疫标记。箭头展示CD9和同线蛋白阳性的EV。数据展示免疫标记基于CD9的存在检测囊泡。数据还展示EV携带同线蛋白。箭头展示CD9和同线蛋白信号共存的几个点。
图21B为CD81捕获的来源于bEnd3细胞的EV的荧光图像。bEnd3 EV通过CD81捕获并且用抗mCD9和抗小鼠同线蛋白免疫标记。箭头展示CD9和同线蛋白阳性的EV。数据展示免疫标记基于CD9的存在检测囊泡。数据还展示EV携带同线蛋白。箭头展示CD9和同线蛋白信号共存的几个点。
图21C为CD81捕获的来源于NIH3T3细胞的EV的荧光图像。NIH3T3 EV通过CD81捕获并且用抗mCD9和抗小鼠同线蛋白免疫标记。箭头展示CD9和同线蛋白阳性的EV。数据展示免疫标记基于CD9的存在检测囊泡。数据还展示EV携带同线蛋白。箭头展示CD9和同线蛋白信号共存的几个点。
实例5：无标记和荧光信号共定位
本实例展现使用本文所描述的方法和系统在相同细胞外囊泡上的无标记和荧光信号的共定位。
图22展示从荧光免疫标记的EV的图像确定的数据的一组图。使用抗CD63抗体将EV捕获在衬底上。稍后，所捕获的EV用抗CD9、抗CD81和抗CD63荧光标记(例如荧光免疫标记)。在某些实施例中，使用非货物标记方案(例如无固定和透化)进行程序。数据展示SP-IRIS和荧光数据的组合。SP-IRIS成像数据用于得到囊泡的直径，而荧光数据用于得到强度数据。
以下表1展示粒度(即，直径)相对于囊泡中的同线蛋白标记的荧光强度的数据的实例。
表1.荧光强度相对于粒度
Figure BDA0003190486050000491
Figure BDA0003190486050000501
F.囊泡、捕获和标记剂以及相关生物分子
通过粒子与衬底表面上捕获剂的相互作用，粒子结合到衬底表面。在某些实施例中，粒子为如本文所描述的囊泡(例如胞外体、细胞外囊泡、脂质体、病毒和病毒样粒子)。随后可对结合的囊泡进行成像，并且在某些实施例中，使用一或多种标记剂(例如荧光标记剂)进行标记，以观察囊泡内和/或表面上共定位的相关生物分子货物。在某些实施例中，含于此类囊泡内和/或存在于此类囊泡表面上的生物分子货物可以是但不限于蛋白质、核酸(例如DNA，例如RNA)、肽和其它相关生物分子。
i.囊泡
如本文所描述，样品内所含的一种特定囊泡类型为胞外体。胞外体是大小为40-150nm的小的膜结合囊泡(潘(Pan)等人,1985；特拉姆斯(Trams)等人,1981)。其由许多不同细胞类型分泌，如癌细胞、间充质细胞、凝血细胞(卡勒特(Kahlert)和卡卢里(Kalluri),《肿瘤微环境中的胞外体影响癌症进展和转移(Exosomes in tumor microenvironmentinfluence cancer progression and metastasis)》.《分子医学杂志(J.Mol Med.)》(柏林(Berl)),91:431-437,2013；海宁(Heijnen)等人,《激活的血小板释放两种类型膜囊泡：表面脱落的微囊泡和衍生自多泡体和α颗粒的胞吐作用的胞外体(Activated plateletsrelease two types of membrane vesicles:microvesicles by surface shedding andexosomes derived from exocytosis of multivesicular bodies and alpha-granules)》.《血液(Blood)》,94:3791-3799,1999；拉波索(Raposo)等人,《B淋巴细胞分泌抗原呈递囊泡(B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles)》.《实验医学杂志(The Journal of Experimental Medicine)》,183:1 161-1172,1996)、免疫细胞(泰里(Thery)等人,《胞外体：组成、生体合成和功能(Exosomes:composition,biogenesis andfunction)》.《自然评论·免疫学(Nat.Rev.Immunol)》,2:569-579,2002)，血小板(亚诺夫斯卡-维乔雷克(Janowska-Wieczorek)等人,《衍生自激活的血小板的微囊泡诱导肺癌的转移和血管生成(Microvesicles derived from activated platelets induce metastasisand angiogenesis in lung cancer)》.《国际癌症杂志(International Journal ofCancer)》,1 13:752-760,2005.哲泽(Jazieh)等人,《生物标记物在胰腺癌管理中的临床效用(The clinical utility of biomarkers in the management of pancreaticadenocarcinoma)》.《放射肿瘤学研讨会(Seminars in Radiation Oncology)》,24:67-76,2014)以及内皮细胞(赫根里德(Hergenreider)等人,《内皮细胞与平滑肌细胞之间通过miRNA进行的抗动脉粥样硬化通讯(Atheroprotective communication betweenendothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs)》.《自然·细胞生物学(Nature Cell Biology)》,14:249-256,2012)。胞外体生体合成中的第一步骤涉及从晚期内体的界膜内向出芽(特拉伊科维奇(Trajkovic)等人,《神经酰胺触发胞外体囊泡出芽成多泡内体(Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicularendosomes)》.《科学(Science)》,319:1244-1247,2008)。在此过程期间，胞外体经来自亲本细胞的RNA分子和蛋白质填充(特拉姆斯等人,《呈微囊泡形式的膜外酶剥离(Exfoliationof membrane ecto-enzymes in the form of micro-vesicles)》.《生物化学与生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)》,645:63-70,1981；特拉伊科维奇，前述)。在释放到细胞外空间之后，肿瘤衍生的胞外体可将具有致癌活性的蛋白质和RNA转移到接受者细胞(格兰奇(Grange)等人,《从人肾癌干细胞释放的微囊泡刺激血管生成和肺转移前微环境的形成(Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulateangiogenesis and formation of lung premetastatic niche)》.《癌症研究(CancerResearch)》,71:5346-5356,2011；佩纳多(Peinado)等人,《黑色素瘤胞外体通过MET指导骨髓祖细胞朝向促转移表型(Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cellstoward a pro-metastatic phenotype through MET)》.《自然·医学(NatureMedicine)》,18:883-891,2012)。由于胞外体在不同条件下极稳定，因此其可保护其生物货物免于在细胞外环境中降解和变性(泰勒(Taylor)和格赛尔-泰勒(Gercel-Taylor),《胞外体/微囊泡：癌症相关免疫抑制性微环境的介体(Exosomes/microvesicles:mediators ofcancer-associated immunosuppressive microenvironments)》.《免疫病理学研讨会(Seminars in Immunopathology)》,33:441-454,2011)。循环中的基因组DNA主要含于胞外体中(卡勒特等人,《在患有胰腺癌的患者的血清胞外体中鉴别跨所有染色体具有突变KRAS和p53 DNA的双链基因组DNA(Identification of double-stranded genomic DNAspanning all chromosomes with mutated KRAS and p53 DNA in the serum exosomesof patients with pancreatic cancer)》.《生物化学杂志(The Journal of BiologicalChemistry)》,289:3869-3875,2014)。来自星形细胞和成胶质细胞瘤细胞的胞外体携带线粒体DNA(圭斯奇尼(Guescini)等人,《C2C12成肌细胞释放含有参与信号转导的DNA和蛋白质的微囊泡(C2C12 myoblasts release micro-vesicles containing DNA and proteinsinvolved in signal transduction)》.《实验细胞研究(Experimental Cell Research)》,316:1977-1984,2010)。此外，已经证明来自成胶质细胞瘤细胞系的胞外体含有少量单链DNA以及高水平的转座元件(巴拉吉(Balaj)等人,《肿瘤微囊泡含有逆转录转座子元件和扩增的致癌基因序列(Tumour microvesicles contain retrotransposon elements andamplified oncogene sequences)》.《自然·通讯(Nature Communications)》,2:180,2011)。
胞外体发现于癌症患者的所有体液中，如血清、唾液、脑脊髓液、骨髓穿刺液、眼分泌物/泪液和腹水(佩纳多，前述；劳(Lau)等人,《胰腺癌衍生的胞外体在唾液生物标记物开发中的作用(Role of Pancreatic Cancer-derived Exosomes in Salivary BiomarkerDevelopment)》.《生物化学杂志》,288:26888-26897,2013；蔡(Choi)等人,《衍生自人结肠直肠癌腹水的微囊泡的蛋白质组学分析(Proteomic analysis of microvesiclesderived from human colorectal cancer ascites)》.《蛋白质组学(Proteomics)》,1 1:2745-2751,2011)。因此，胞外体是有前景的癌症诊断和预测生物标记物。然而，来自癌症患者的循环DNA的基因图谱研究被分离的DNA代表身体所有细胞的事实混淆，因此使突变和遗传缺陷具有挑战性(穆尔塔扎(Murtaza)等人,《通过对血浆DNA进行测序进行的对癌症疗法的获得性耐药的非创伤性分析(Non-invasive analysis of acquired resistance tocancer therapy by sequencing of plasma DNA)》.《自然》,497；108-1 12,2013；永(Yong),《癌症生物标记物：编写于血液中(Cancer biomarkers:Written in blood)》.《自然》,51 1:524-526,2014；柯克(Kirk),《乳腺癌：循环肿瘤DNA，较好的血液生物标记物(Breast cancer:Circulating tumour DNA the better of the blood biomarkers)》.《自然评论·临床肿瘤学(Nature Reviews,Clinical Oncology)》,10:247,2013；克劳利(Crowley)等人,《液体活检：监测血液中的癌症遗传学(Liquid biopsy:monitoringcancer-genetics in the blood)》.《自然评论·临床肿瘤学》,10:472-484,2013)。
已提出几种胞外体标记物，并且包括四次穿膜蛋白家族成员(CD9、CD63、CD81)、转运所需的内体分选复合物的成员(ESCRT；TSG101、Alix)以及热休克蛋白(Hsp60、Hsp70、Hsp90)(泰勒和格赛尔-泰勒，前述)。上皮肿瘤细胞分泌携带上皮细胞粘附分子(EpCAM)的胞外体(泰勒和格赛尔-泰勒，前述；席尔瓦(Silva)等人,《胞外体释放分析和其在人结肠直肠癌中的预后价值(Analysis of exosome release and its prognostic value inhuman colorectal cancer)》.《基因、染色体和癌症(Genes,Chromosomes&Cancer)》,51:409-418,2012；伦兹(Runz)等人,《卵巢癌患者的恶性腹水衍生的胞外体含有CD24和EpCAM(Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients containCD24and EpCAM)》.《妇科肿瘤学(Gynecologic Oncology)》,107:563-571,2007)。黑色素瘤衍生的胞外体含有肿瘤相关抗原Mart-1和酪氨酸酶相关蛋白-2(TYRP2)(佩纳多，前述；米尔斯(Mears)等人,《通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱法进行的黑色素瘤衍生的胞外体的蛋白质组学分析(Proteomic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry)》.《蛋白质组学》,4:4019-4031,2004；安德烈(Andre)等人,《恶性积液和免疫原性肿瘤衍生的胞外体(Malignant effusions and immunogenic tumour-derived exosomes)》.《柳叶刀(Lancet)》,360:295-305,2002)。来自胃癌、乳腺癌和胰腺癌的胞外体携带人表皮生长因子受体(HER)家族成员(亚当奇克(Adamczyk)等人,《从胰腺癌细胞释放的EGFR的可溶性和胞外体形式的表征(Characterization of soluble and exosomal forms of the EGFRreleased from pancreatic cancer cells)》.《生命科学(Life Sciences)》,89:304-312,2011；巴兰(Baran)等人,《胃癌患者血浆中的循环肿瘤衍生微囊泡(Circulating tumour-derived microvesicles in plasma of gastric cancer patients)》.《癌症免疫学与免疫疗法：CII(Cancer Immunology,Immunotherapy:CII)》,59:841-850,2010；西拉沃罗(Ciravolo)等人,《过表达HER2的胞外体在抵消基于曲妥珠单抗的疗法中的潜在作用(Potential role of HER2-overexpressing exosomes in countering trastuzumab-based therapy)》.《细胞生理学杂志(Journal of Cellular Physiology)》,227:658-667,2012)。
如本文所用，术语“微囊泡”和“胞外体”是指膜粒子，其中胞外体的膜的至少一部分直接获自细胞。最通常，胞外体将具有供体细胞大小的至多5％的大小(平均直径)。因此，尤其考虑的胞外体包括从细胞脱落的那些。
胞外体可在任何合适样品类型(例如体液)中检测或从其中分离。在一个实施例中，样品为血液样品，包括例如全血或其任何级分或组分。适合与所描述的技术一起使用的血液样品可从任何已知来源提取，所述来源包括血细胞或其组分，如静脉、动脉、外周、组织、脐带等。举例来说，样品可使用熟知且常规的临床方法(例如用于抽取和处理全血的程序)获得并处理。在一个实施例中，示范性样品可为从患癌的受试者抽取的外周血液。
胞外体还可从组织样品，如手术样品、活检样品、组织、粪便和经培养细胞中分离。在从组织来源中分离胞外体时，可需要均匀化所述组织以便获得单细胞悬浮液，接着是溶解细胞以释放胞外体。在从组织样品中分离胞外体时，重要的是，选择不导致胞外体破裂的均匀化和溶解程序。本文所考虑的胞外体优选地在生理学上可接受的溶液(例如缓冲生理盐水、生长培养基、各种水性培养基等)中从体液中分离。
胞外体可从刚收集的样品中或从已经冷冻或冷藏存储的样品中分离。虽然不必需，但是如果在与体积排除聚合物一起沉淀之前澄清液体样品以从样品中去除任何碎片，则可获得更高纯度胞外体。澄清的方法包括离心、超速离心、过滤或超过滤。最通常，胞外体可通过所属领域中众所周知的许多方法来分离。一种胞外体分离方法为从体液或细胞培养上清液中差速离心。用于分离胞外体的示范性方法描述于(露奇(Losche)等人,《血小板衍生的微囊泡将组织因子转移到单核细胞而非中性粒细胞(Platelet-derivedmicrovesicles transfer tissue factor to monocytes but not to neutrophils)》,《血小板(Platelets)》,15:109-1 15,2004；迈斯里(Mesri)和阿尔蒂里(Altieri),《由白细胞微粒进行的内皮细胞激活(Endothelial cell activation by leukocytemicroparticles)》,《免疫学杂志(J.Immunol)》,161:4382-4387,1998；莫雷尔(Morel)等人,《细胞微粒：生物活性血管效应子的播散存储库(Cellular microparticles:adisseminated storage pool of bioactive vascular effectors)》,《血液学当前观点(Curr.Opin.Hematol)》,1 1:156-164,2004)。替代地，胞外体还可通过如(孔布(Combes)等人,《血浆中血小板衍生的微囊泡定量的新流式细胞术方法(A new flow cytometrymethod of platelet-derived microvesicle quantitation in plasma)》,《血栓形成与止血(Thromb.Haemost.)》,77:220,1997)中所描述的流式细胞术分离。
一种公认的用于分离胞外体的方案包括超速离心，通常结合蔗糖密度梯度或蔗糖垫以使相对低密度胞外体漂浮。由于尺寸分布可能与其它微囊泡或大分子复合物重叠，通过顺序差速离心分离胞外体是复杂的。此外，离心可能无法提供基于囊泡大小分离囊泡的足够手段。然而，在与蔗糖梯度超速离心结合时，顺序离心可提供胞外体的高富集。
ii.抗体
如本文所描述，在某些实施例中，抗体用作结合或捕获剂。举例来说，在某些实施例中，提供于如本文所描述的衬底表面上的抗体(例如抗GLPC1)可用于捕获胞外体，其中GLPC1存在于胞外体表面上。在其它实施例中，提供于表面上的抗GLPC3可用于捕获包含GLPC3的胞外体。
抗体片段，例如功能片段，是抗体的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、结构域抗体(dAb)、可变片段(Fv)或单链可变片段(scFv)。功能抗体片段与完整抗体所识别的相同抗原结合。举例来说，抗胰岛素单克隆抗体片段结合到胰岛素。术语“抗体片段”或“功能性片段”还包括由可变区组成的分离的片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段；或重组单链多肽分子，其中轻链与重链可变区通过肽连接子连接(“scFv蛋白”)。在一些实施方案中，抗体片段不包括无抗原结合活性的抗体部分，如Fc片段或单一氨基酸残基。抗体片段包括功能片段并且由术语“抗体”或“抗体分子”涵盖。
示范性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如结构域抗体(dAb)、单链、Fab、Fab'和F(ab')2片段以及单链可变片段(scFv)。
scFv多肽分子是共价连接的可变重链(VH)::可变轻链(VL)异二聚体，其可由包括由肽编码连接子连接的VH和VL编码基因的基因融合体表达。参见例如休斯顿(Huston)等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc Nat Acad Sci USA)》85(16):5879-5883。VH和VL结构域的N到C端方向可呈任一方向，例如VH-VL或VL-VH。已创建大型原始人scFv文库，以提供针对多种目标分子的重排抗体基因的来源。为了分离疾病特异性抗体，可由患有某些疾病的个体构建文库。参见例如巴巴斯(Barbas)等人,《美国国家科学院院刊》89:9339-43(1992)；和西庇太(Zebedee)等人,《美国国家科学院院刊》89:3175-79(1992)。
本文还提供抗体融合蛋白，例如重组产生的抗原结合分子，其中一或多个具有相同或不同特异性的相同或不同单链抗体或抗体片段区段经连接。抗体(例如融合抗体蛋白)的价数指示抗体具有多少针对单一抗原或表位的结合臂或位点：即，单价、二价、三价或多价。抗体的多价性意指其可在结合到抗原时利用多个相互作用，因此提高与抗原结合的亲合力。特异性指示抗体能够结合多少抗原或表位，即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。举例来说，天然抗体(例如IgG)为二价，因为其具有两个结合臂，但为单特异性，因为其结合到一个表位。单特异性多价抗体(例如抗体融合蛋白)具有超过一个针对表位的结合位点，但仅与一个表位结合。融合蛋白可包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合或相同抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可另外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适合于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。示范性毒素包括但不限于核糖核酸酶(RNA酶)(例如重组RNA酶)、白喉毒素、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、单甲基奥瑞他汀E(auristatin E)或美坦辛(mertansine)。另外的示范性毒素在本文中描述。在实施例中，抗体分子(例如抗体或其功能片段)和治疗剂(例如毒素)由单一核酸分子编码。在实施例中，抗体分子(例如抗体或其功能片段)和治疗剂(例如毒素)安置于同一多肽上。在其它实施例中，抗体分子(例如抗体或其功能片段)和治疗剂(例如毒素)由单独的核酸分子编码。在实施例中，抗体分子(例如抗体或其功能片段)和治疗剂(例如毒素)安置于单独的多肽上。多种蛋白质或肽效应子可并入融合蛋白中。下文进一步论述与毒素的缀合物/融合体。
人源化、嵌合或完全人抗体分子
本文还提供人源化、嵌合或完全人抗体分子，例如全长抗体、抗体片段、抗体或抗体片段融合体或抗体或抗体片段缀合物。
人源化抗体是一种重组蛋白，其中来自一种物种的抗体(例如啮齿动物(例如大鼠或小鼠)抗体)的互补决定区(CDR)从所述啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移到人重链和轻链可变结构域中。抗体分子的恒定结构域衍生自人抗体的恒定结构域。
所属领域中已描述人源化非人抗体的方法。在实施例中，人源化抗体具有从非人来源引入到其中的一或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可以按照温特(Winter)和合作者的方法(琼斯(Jones)等人,《自然》,321:522-525(1986)；赖克曼(Reichmann)等人,《自然》,332:323-327(1988)；韦荷恩(Verhoeyen)等人,《科学》,239:1534-1536(1988))来进行，例如通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于完整的人可变结构域已由来自非人物种的相应序列取代。在实施例中，人源化抗体是其中一些高变区残基和可能一些FR残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的抗体。
欲用于制造人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择可在降低抗原性方面发挥作用。在一些实施例中，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库来筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。随后，将最接近于啮齿动物的序列的人序列接受为人源化抗体的人框架区(FR)(桑斯(Suns)等人,《免疫学杂志》,151:2296(1993)；科西亚等人,《分子生物学杂志》,196:901(1987))。在实施例中，另一方法使用衍生自轻或重链的特定子组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同框架可以用于若干不同人源化抗体(卡特(Carter)等人,《美国国家科学院院刊》,89:4285(1992)；普雷斯塔(Presta)等人,《免疫学杂志》,151:2623(1993))。
在实施例中，抗体被人源化，保留对抗原的高亲和力和其它有利生物特性。为了实现此目标，在某些实施例中，通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念性人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可获得。说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方式，可从接受者和输入序列选择并组合FR残基，使得实现所需抗体特征，如保留或提高对目标抗原的亲和力。一般来说，高变区残基直接且最显著参与影响抗原结合。
在实施例中，人源化抗体分子，例如本文所描述的人源化抗体分子包含一或多个非人(例如小鼠)CDR，并且包含人框架和恒定区(例如来自人免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的框架和恒定区)。
抗体产生
所属领域内已知的各种程序可用于产生针对所描述的技术的蛋白质或肽，或针对其衍生物、片段、类似物同源物或直系同源物的抗体分子，例如抗体或其功能片段。(参见例如《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,E哈洛(Harlow E)和D莱恩(Lane D),1988,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)，以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，自身抗原(例如胰岛自身抗原，例如本文所描述的胰岛自身抗原，例如胰岛素)、B细胞(例如自身抗原特异性B细胞，例如胰岛素特异性B细胞)或自身抗原::B细胞受体(BCR)复合物(例如胰岛素::BCR复合物)可在免疫特异性结合这些蛋白质组分的抗体分子的产生中用作免疫原。
抗体分子可通过众所周知的技术纯化，如使用蛋白A或蛋白G的亲和色谱，例如其提供免疫血清的IgG级分。随后或替代地，可将作为所寻找的免疫球蛋白的目标的特异性抗原或其表位固定于柱上，以通过免疫亲和色谱纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化例如由D.威尔金森(D.Wilkinson)(《科学家(The Scientist)》,由科学家公司(TheScientist,Inc.)出版,宾夕法尼亚州费城(Philadelphia Pa.),第14卷,第8期(2000年4月17日),第25-28页)论述。
可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如通过科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，《自然》,256:495(1975)所描述的方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂使仓鼠、小鼠或其它适当宿主动物免疫以引发产生或能够产生将特异性结合到免疫剂的抗体的淋巴细胞。替代地，淋巴细胞可以体外免疫。
在实施例中，免疫剂包括蛋白质抗原、其片段或其融合蛋白。根据本文所描述的组合物和方法，免疫剂包含自身抗原，例如胰岛自身抗原，例如本文所描述的胰岛自身抗原，例如胰岛素。一般来说，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。随后使用合适融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(戈丁(Goding),《单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)》,学术出版社(Academic Press),(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常是被转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。在实施例中，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适培养基中培养，所述培养基优选含有一或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。举例来说，如果亲本细胞不含酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的永生化细胞系是有效融合、支持选定的产抗体细胞稳定高水平表达抗体并且对如HAT培养基等培养基敏感的那些。示范性永生化细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，其可例如从加利福尼亚州圣迭戈的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute CellDistribution Center,San Diego,Calif.)以及弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Va)获得。还针对人单克隆抗体的产生描述人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见科兹博(Kozbor),《免疫学杂志》,133:3001(1984)；布罗德(Brodeur)等人,《单克隆抗体产生技术和应用(MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications)》,马塞尔德克公司(MarcelDekker,Inc.),纽约,(1987)第51-63页))。
然后，可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的存在。举例来说，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合分析确定，如放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、流式细胞术/FACS或表面等离激元共振。此类技术和分析是所属领域中已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过芒森(Munson)和波拉德(Pollard),《分析生物化学(Anal.Biochem.)》,107:220(1980)的斯卡查德分析(Scatchard analysis)确定。在实施例中，在单克隆抗体的治疗应用中，鉴别对目标抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体可能是重要的。
在鉴别出所需的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序对克隆株进行亚克隆，并通过标准方法使其生长。(参见戈丁,《单克隆抗体：原理和实践》,学术出版社,(1986)第59-103页)。适于此目的的培养基包括例如杜氏改良型伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。替代地，杂交瘤细胞可在哺乳动物中以腹水形式体内生长。
可以通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，从培养基或腹水分离或纯化出亚克隆株分泌的单克隆抗体。
单克隆抗体还可以通过重组DNA方法制备。编码本文所描述的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合到编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。在实施例中，杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，就可以将DNA放入表达载体中，然后将其转染到不会另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。还可以通过以下方式修饰DNA：例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替鼠类序列，或使非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价接合。此类非免疫球蛋白多肽可以取代所描述技术的抗体的恒定结构域，或可以取代所描述技术的抗体的一个抗原组合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
完全人抗体是轻链和重链(包括CDR)的整个序列都来源于人基因的抗体分子。抗体抗体在本文中称为“人”抗体或“完全人”抗体。人单克隆抗体可通过使用三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见科兹博等人,1983《今日免疫学(Immunol Today)》4:72)；以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见科尔(Cole)等人,1985在：《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)》,艾伦R.利斯公司(Alan R.Liss,Inc.),pp.77-96中)制备。可利用人单克隆抗体并且其可通过使用人杂交瘤(参见科特(Cote)等人,1983.《美国国家科学院院刊》80:2026-2030)或通过用埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)体外转化人B细胞(参见科尔等人,1985在：《单克隆抗体和癌症疗法》,艾伦R.利斯公司,第77-96页中)产生。
另外，还可使用额外技术，包括噬菌体展示文库来产生人抗体。(参见霍根布姆(Hoogenboom)和温特,《分子生物学杂志》,227:381(1991)；马克斯(Marks)等人,《分子生物学杂志》,222:581(1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的转基因动物(例如小鼠)来制备人抗体。攻击后，观察到人抗体产生，其在所有方面与人中所见到的密切相似，包含基因重排、组装和抗体库。此方法描述于例如马克斯等人,《生物技术(Bio/Technology)》10,779-783(1992)；隆伯格(Lonberg)等人,《自然》368 856-859(1994)；莫里森(Morrison),《自然》368,812-13(1994)；费雪威尔德(Fishwild)等人,《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》14,845-51(1996)；纽博格(Neuberger),《自然·生物技术》14,826(1996)；以及隆伯格和胡萨尔(Huszar),《国际免疫学评论(Intern.Rev.Immunol.)》13 65-93(1995)中。
可另外使用转基因非人动物产生人抗体，所述动物经修饰以便响应于抗原攻击生产完全人抗体而非动物的内源性抗体。(参见PCT公开WO94/02602)。非人宿主中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因已丧失能力，并且编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入到宿主基因组中。人基因例如使用含有必需的人DNA区段的酵母人工染色体并入。随后通过杂交育种含有少于修饰的全互补序列的中间转基因动物，获得提供所有所需修饰的动物作为子代。非人动物的一个实施例是小鼠，并且称为XenomouseTM。此动物产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。抗体可在用相关免疫原免疫之后直接从动物获得，作为例如多克隆抗体的制备物，或替代地，从衍生自动物的永生化B细胞，如产生单克隆抗体的杂交瘤获得。另外，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可经回收且表达以直接获得抗体，或可进一步修饰以获得抗体的类似物或片段，例如单链Fv(scFv)分子。
一种用于产生本文所描述的抗体的示范性方法。此方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养的一个哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入另一哺乳动物宿主细胞中，并且融合两个细胞以形成杂交细胞。杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。在一实施例中，一种用于鉴别免疫原上临床相关表位的方法，和一种用于选择以高亲和力免疫特异性结合到相关表位的抗体的相关方法。
载体
抗体分子可由含有编码抗体分子，例如本文所描述的抗体分子的DNA区段的载体表达。
此等可包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助DNA、基因枪、导管等。载体包括化学缀合物，如WO 93/64701中所描述，其具有靶向部分(例如细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)；病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)；融合蛋白，其为含有目标部分(例如对目标细胞具有特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白；质粒；噬菌体等。载体可为染色体、非染色体或合成的。
示范性载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼(moloney)鼠类白血病病毒。在实施例中，病毒载体是DNA病毒载体。示范性DNA载体包括痘载体，如正痘或禽痘载体；疱疹病毒载体，如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体(参见A.I.杰勒(Geller,A.I.)等人,《神经化学杂志(J.Neurochem)》,64:487(1995)；F.利姆(Lim,F.)等人,在《DNA克隆：哺乳动物系统(DNA Cloning:Mammalian Systems)》,D.格洛弗(D.Glover)编(牛津大学出版社(Oxford Univ.Press),英格兰牛津(Oxford England))(1995)中；A.I.杰勒等人,《美国国家科学院院刊》90:7603(1993)；A.I.杰勒等人,《美国国家科学院院刊》87:1149(1990)；腺病毒载体(参见勒加尔拉萨尔(LeGal LaSalle)等人,《科学》,259:988(1993)；戴维森(Davidson)等人,《自然·遗传学(Nat.Genet)》3:219(1993)；杨(Yang)等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》69:2004(1995)以及腺相关病毒载体(参见M.G.卡普利特(Kaplitt,M.G.)等人,《自然·遗传学》8:148(1994)。
痘病毒载体将基因引入到细胞细胞质中。禽痘病毒载体仅引起核酸短期表达。在实施例中，腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体用于将核酸引入到细胞中。腺病毒载体引起比腺相关病毒的表达(约4个月)短的表达(约2个月)，腺相关病毒的表达又比HSV载体短。所选择的特定载体将取决于目标细胞和所治疗的病状。引入可通过标准技术，例如感染、转染、转导或转化进行。基因转移的模式的实例包括例如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞显微注射和病毒载体。
载体可用以靶向基本上任何所需目标细胞。举例来说，立体定向注射可用于将载体(例如腺病毒、HSV)引导到所需位置。另外，可使用小型泵输注系统，如SynchroMed输注系统通过脑室内(icv)输注递送粒子。还证实基于总体流动的方法(称为对流)可有效将大分子递送到脑的延伸区域，并且可适用于将载体递送到目标细胞。(参见鲍勃(Bobo)等人,《美国国家科学院院刊》91:2076-2080(1994)；莫里森等人,《美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)》266:292-305(1994))。可使用的其它方法包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射以及口服或其它已知施用途径。
这些载体可用于表达抗体分子，例如本文所描述的抗体分子。技术可适合于产生对所描述技术的抗原蛋白具有特异性的单链抗体。另外，方法可适用于构建Fab表达文库(参见例如胡斯(Huse)等人,1989《科学》246:1275-1281)以允许快速并且有效鉴别具有针对蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同源物的所需特异性的单克隆Fab片段。含有针对蛋白质抗原的独特型的抗体片段可通过所属领域中已知的技术产生，包括但不限于：(i)通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段；(ii)通过还原F(ab′)2片段的二硫桥键产生的Fab片段；(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段以及(iv)Fv片段。
iii.捕获剂
在如本文所描述的某些实施例中，捕获剂存在于如本文所描述的衬底(例如光学衬底，例如反射衬底)的顶部表面上，使得捕获剂用以结合到相关目标。在某些实施例中，相关目标与囊泡相关，使得捕获剂与囊泡的结合用以将囊泡间接结合到衬底表面。作为说明而非限制，在某些实施例中，捕获剂可以是特异性抗体，如对癌症相关蛋白具有特异性的抗体(例如对四次穿膜蛋白家族成员具有特异性，例如抗CD 63抗体、抗CD 81抗体、抗CD 9抗体、抗CD171抗体)。
示范性捕获剂包括但不限于抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段，以及抗体片段，包括ScFv、F(ab)、F(ab')2、Fv)、同位素标记的肽、核酸探针、DNA或RNA适体以及使用点击化学用于目标引导合成(路易斯(Lewis)等人,《应用化学-国际版(Angewandte Chemie-International Edition)》,41,1053-,2002；马涅奇(Manetsch)等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》126,12809-12818,2004；拉姆斯特罗姆(Ramstrom)等人,《自然评论·药物发现(Nature Rev.Drug Discov.)》1,26-36,2002)、小分子化合物和聚合物。
iv.荧光染料
在某些实施例中，所公开的系统和方法使用标记有荧光团的蛋白质(例如抗体)检测货物标记物。此类荧光标记的蛋白质称为“荧光货物标记”。荧光团包含荧光染料、荧光染料猝灭剂分子、任何有机或无机染料、金属螯合物或任何荧光酶底物，包括蛋白酶可活化酶底物。在某些实施例中，荧光团包含长链亲碳花青。在其它实施例中，荧光团包含DiI、DiR、DiD等。荧光染料远红和近红外荧光染料(NIRF)。荧光染料包括但不限于羰花青和吲哚菁荧光染料。在某些实施例中，成像剂包含可商购的荧光染料，包括但不限于Cy5.5、Cy5和Cy7(通用电气医疗集团(GE Healthcare))；AlexaFlour660、AlexaFlour680、AlexaFluor750和AlexaFluor790(英杰(Invitrogen))；VivoTag680、VivoTag-S680和VivoTag-S750(维森医疗(VisEn Medical))；Dy677、Dy682、Dy752和Dy780(迪奥米克(Dyomics))；DyLight547、DyLight647(皮尔斯(Pierce))；HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680和HiLyte Fluor750(安肽生技(AnaSpec))；IRDye 800CW、IRDye 800RS和IRDye 700DX(理克(Li-Cor))；CF染料(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))；藻红蛋白(PE)；以及ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS(美国染料源(American Dye Source))和柯达(Kodak)X-SIGHT 650、柯达X-SIGHT691、柯达X-SIGHT 751(锐珂医疗(Carestream Health))。在某些实施例中，荧光团的分子量影响胞外体内部分子货物的标记效率。
G.计算机系统和网络环境
如图16中所示，展示和描述用于提供本文中所描述的系统和方法的网络环境1600的实施方案。简单概括来说，现参看图16，展示且描述示范性云计算环境1600的框图。云计算环境1600可包括一或多个资源提供者1602a、1602b、1602c(统称为1602)。每一资源提供者1602可包括计算资源。在一些实施方案中，计算资源可包括用以处理数据的任何硬件和/或软件。举例来说，计算资源可包括能够执行算法、计算机程序和/或计算机应用程序的硬件和/或软件。在一些实施方案中，示范性计算资源可包括具有存储和检索能力的应用程序服务器和/或数据库。每一资源提供者1602可连接到云计算环境1600中的任何其它资源提供者1602。在一些实施方案中，资源提供者1602可通过计算机网络1608连接。每一资源提供者1602可通过计算机网络1608连接到一或多个计算装置1604a、1604b、1604c(统称为1604)。
云计算环境1600可包括资源管理器1606。资源管理器1606可通过计算机网络1608连接到资源提供者1602和计算装置1604。在一些实施方案中，资源管理器1606可促进由一或多个资源提供者1602将计算资源提供到一或多个计算装置1604。资源管理器1606可从特定计算装置1604接收对计算资源的请求。资源管理器1606可鉴别能够提供计算装置1604所请求的计算资源的一或多个资源提供者1602。资源管理器1606可选择资源提供者1602来提供计算资源。资源管理器1606可促进资源提供者1602与特定计算装置1604之间的连接。在一些实施方案中，资源管理器1606可建立特定资源提供者1602与特定计算装置1604之间的连接。在一些实施方案中，资源管理器1606可将特定计算装置1604重导向到具有所请求计算资源的特定资源提供者1602。
图17展示可用于实施本公开中所描述的技术的计算装置1700和移动计算装置1750的实例。计算装置1700打算表示各种形式的数字计算机，例如膝上型计算机、桌上型计算机、工作站、个人数字助理、服务器、刀片服务器、大型机和其它适当的计算机。移动计算装置1750打算表示各种形式的移动装置，例如个人数字助理、蜂窝式电话、智能电话和其它类似计算装置。此处展示的组件、其连接和关系和其功能仅意图为实例，且并不意图为限制性的。
计算装置1700包括处理器1702、存储器1704、存储装置1706、连接到存储器1704和多个高速扩展端口1710的高速接口1708，以及连接到低速扩展端口1715和存储装置1706的低速接口1712。处理器1702、存储器1704、存储装置1706、高速接口1708、高速扩展端口1710和低速接口1712中的每一种使用各种总线互连，且可按需要安装在公共主板上或以其它方式安装。处理器1702可处理用于在计算装置1700内执行的指令，包括存储于存储器1704中或存储装置1706上的指令，以在外部输入/输出装置(例如耦接到高速接口1708的显示器1716)上显示GUI的图形信息。在其它实施方案中，可在适当时使用多个处理器和/或多个总线连同多个存储器和存储器类型。并且，可连接多个计算装置，其中每一装置提供必要操作的部分(例如作为服务器组、刀片服务器群组或多处理器系统)。因此，如术语在本文中使用，其中多个功能被描述为通过“处理器”执行，这涵盖其中多个功能通过任何数目的计算装置(一或多个)的任何数目的处理器(一或多个)执行的实施例。此外，在功能被描述为通过“处理器”执行的情况下，这涵盖其中所述功能通过(例如在分布式计算系统中)任何数目的计算装置(一或多个)的任何数目的处理器(一或多个)执行的实施例。
存储器1704将信息存储在计算装置1700内。在一些实施方案中，存储器1704为一或多个易失性存储器单元。在一些实施方案中，存储器1704是一或多个非易失性存储器单元。存储器1704还可为另一形式的计算机可读媒体，例如磁盘或光盘。
存储装置1706能够为计算装置1700提供大容量存储。在一些实施方案中，存储装置1706可为或含有计算机可读媒体，例如软盘装置、硬盘装置、光盘装置或磁带装置、闪存或其它类似固态存储器装置，或装置阵列，包括存储区域网络或其它配置中的装置。指令可存储于信息载体中。所述指令在由一或多个处理装置(例如处理器1702)执行时执行一或多个方法，例如上文所描述的那些方法。指令还可由一或多个存储装置，例如计算机或机器可读媒体(例如存储器1704、存储装置1706或处理器1702上的存储器)存储。
高速接口1708管理用于计算装置1700的带宽密集操作，而低速接口1712管理较不带宽密集操作。功能的所述分配仅是实例。在一些实施方案中，高速接口1708耦接到存储器1704、显示器1716(例如通过图形处理器或加速器)，且耦接到高速扩展端口1710，所述端口可接纳各种扩展卡(未图示)。在实施方案中，低速接口1712耦接到存储装置1706和低速扩展端口1714。可包括各种通信端口(例如USB、
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以太网、无线以太网)的低速扩展端口1714可例如通过网络适配器耦接到一或多个输入/输出装置，例如键盘、指向装置、扫描仪或联网装置，如交换器或路由器。
如图中所示，计算装置1700可以多个不同形式实施。举例来说，其可以按标准服务器1720的形式实施，或在所述服务器的群组中多次实施。另外，其可实施于个人计算机(例如膝上型计算机1722)中。其还可作为机架服务器系统1724的一部分实施。或者，来自计算装置1700的组件可与移动装置(未图示)(例如移动计算装置1750)中的其它组件组合。所述装置中的每一种可含有计算装置1700和移动计算装置1750中的一或多种，且整个系统可由彼此通信的多个计算装置构成。
移动计算装置1750包括处理器1752、存储器1764、例如显示器1754的输入/输出装置、通信接口1766和收发器1768以及其它组件。移动计算装置1750还可具备存储装置，例如微型驱动器或其它装置，以提供额外存储。处理器1752、存储器1764、显示器1754、通信接口1766和收发器1768中的每一种使用各种总线互连，且若干组件可按需要安装在公共主板上或以其它方式安装。
处理器1752可执行移动计算装置1750内的指令，包括存储于存储器1764中的指令。处理器1752可实施为包括个别和多个模拟和数字处理器的芯片的芯片组。处理器1752可提供例如移动计算装置1750的其它组件的协调，例如用户接口的控制、移动计算装置1750运行的应用程序和移动计算装置1750的无线通信。
处理器1752可通过耦接到显示器1754的控制接口1758和显示接口1756与用户通信。显示器1754可以是例如薄膜晶体管(TFT)液晶显示器或有机发光二极管(OLED)显示器，或其它适当的显示器技术。显示接口1756可包含用于驱动显示器1754将图形和其它信息呈现给用户的适当电路。控制接口1758可从用户接收命令且将其转换以提交到处理器1752。另外，外部接口1762可提供与处理器1752的通信，以便促进移动计算装置1750与其它装置的近区通信。外部接口1762可提供例如一些实施方案中的有线通信，或其它实施方案中的无线通信，且也可使用多个接口。
存储器1764在移动计算装置1750内存储信息。存储器1764可以按一或多个计算机可读媒体、一或多个易失性存储器单元或一或多个非易失性存储器单元中的一或多种的形式实施。也可以提供扩展存储器1774且通过扩展接口1772连接到移动计算装置1750，所述扩展接口可包括例如单列直插存储器模块(SIMM)卡接口。扩展存储器1774可提供移动计算装置1750的额外存储空间，或还可存储移动计算装置1750的应用程序或其它信息。特定来说，扩展存储器1774可包括用以执行或补充上文所描述的过程的指令，且还可包括安全信息。因此，举例来说，可以提供扩展存储器1774作为用于移动计算装置1750的安全模块，并且可以编程而具有使得安全使用移动计算装置1750的指令。另外，可以通过SIMM卡提供安全应用程序连同额外信息，例如以不可破解的方式将鉴别信息置于SIMM卡上。
存储器可包括例如闪存和/或非易失性随机存取存储器(NVRAM存储器)，如下所述。在一些实施方案中，指令存储于信息载体中。所述指令在由一或多个处理装置(例如处理器1752)执行时执行一或多个方法，例如上文所描述的那些方法。指令还可由一或多个存储装置，例如一或多个计算机或机器可读媒体(例如存储器1764、扩展存储器1774或处理器1752上的存储器)存储。在一些实施方案中，可例如通过收发器1768或外部接口1762接收在传播信号中的指令。
移动计算装置1750可以通过通信接口1766无线通信，所述通信接口必要时可以包括数字信号处理电路。通信接口1766可提供在各种模式或协议下的通信，例如全球移动通信系统(GSM)语音呼叫、短消息服务(SMS)、增强型消息接发服务(EMS)、或多媒体消息接发服务(MMS)消息接发、码分多址(CDMA)、时分多址(TDMA)、个人数字蜂窝(PDC)、宽带码分多址(WCDMA)、CDMA2000或通用无线分组业务(GPRS)和其它。所述通信可例如通过使用射频的收发器1768发生。另外，短程通信可例如使用
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Wi-FiTM或其它这类收发器(未图示)发生。另外，全球定位系统(GPS)接收器模块1770可以向移动计算装置1750提供额外的导航和位置相关无线数据，所述数据可以在适当时由移动计算装置1750上运行的应用程序使用。
移动计算装置1750还可以使用音频编解码器1760以音频方式通信，所述音频编解码器可以接收来自用户的口头信息并且将其转换为可用的数字信息。音频编解码器1760可以类似地为用户产生可听声音，例如通过例如移动计算装置1750的听筒中的扬声器。所述声音可以包括来自语音电话呼叫的声音，可以包括录制的声音(例如语音消息、音乐文件等)并且还可以包括通过在移动计算装置1750上操作的应用程序产生的声音。
如图中所示，移动计算装置1750可以多种不同形式实施。举例来说，其可实施为蜂窝式电话1780。其还可实施为智能手机1782、个人数字助理或其它类似移动装置的一部分。
此处描述的系统和技术的各种实施方案可在数字电子电路、集成电路、专门设计的专用集成电路(ASIC)、计算机硬件、固件、软件和/或其组合中实现。这些各种实施方案可以包括一或多个计算机程序中的实施方案，所述计算机程序可在可编程系统上执行和/或解译，所述可编程系统包括至少一个可编程处理器，其可以是专用的或通用的，经耦接以从存储系统、至少一个输入装置和至少一个输出装置接收数据和指令，并且向所述存储系统、至少一个输入装置和至少一个输出装置发送数据和指令。
这些计算机程序(也被称作程序、软件、软件应用程序或代码)包括用于可编程处理器的机器指令，并且可以高级程序和/或面向对象的编程语言和/或以汇编/机器语言实施。如本文所用，术语机器可读媒体和计算机可读媒体是指用于向可编程处理器提供机器指令和/或数据的任何计算机程序产品、设备和/或装置(例如磁盘、光盘、存储器、可编程逻辑装置(PLD))，包括作为机器可读信号接收机器指令的机器可读媒体。术语机器可读信号是指用于向可编程处理器提供机器指令和/或数据的任何信号。
为了提供与用户的交互，此处描述的系统和技术可在计算机上实施，所述计算机具有用于向用户显示信息的显示装置(例如阴极射线管(CRT)或液晶显示(LCD)监视器)以及用户可用来向计算机提供输入的键盘和指向装置(例如鼠标或轨迹球)。其它种类的装置也可用于提供与用户的交互；举例来说，提供到用户的反馈可为任何形式的感觉反馈(例如视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈)；且来自用户的输入可以任何形式接收，包括声学、语音或触觉输入。
本文描述的系统和技术可以在计算系统中实施，所述计算系统包括后端组件(例如作为数据服务器)，或包括中间件组件(例如应用程序服务器)，或包括前端组件(例如具有用户可借以与本文描述的系统和技术的实施方案进行交互的图形用户接口或网络浏览器的客户端计算机)，或所述后端组件、中间件组件或前端组件的任何组合。所述系统的组件可以通过任何形式或媒体的数字数据通信(例如通信网络)互连。通信网络的实例包括局域网(LAN)、广域网(WAN)和因特网。
计算系统可包括客户端和服务器。客户端和服务器通常彼此远离且典型地通过通信网络交互。客户端与服务器的关系借助于在各自计算机上运行且与彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序而产生。
在一些实施方案中，本文中所描述的任何模块可分离、组合或并入到单个或组合模块中。图中所描绘的模块并不打算将本文中所描述的系统限制于本文中所展示的软件架构。
本文中所描述的不同的实施方案的要素可以组合以形成上文未具体阐述的其它实施方案。要素可以从本文中所描述的过程、计算机程序、数据库等省略，而不会不利地影响其操作。另外，图中所描绘的逻辑流程不需要按所展示的特定次序或顺序次序来实现期望的结果。各种独立元件可以组合成一或多种个别元件以执行本文所描述的功能。
贯穿将设备和系统描述为具有、包括或包含特定组件，或将过程和方法描述为具有、包括或包含特定步骤的描述内容，经考虑另外存在基本上由所述组件组成或由所述组件组成的所描述技术的设备和系统，并且存在基本上由所述处理步骤组成或由所述处理步骤组成的根据所描述技术的过程和方法。
应理解，步骤的次序或用于进行某些动作的次序是不重要的，只要所描述的技术保持可操作即可。此外，两个或更多个步骤或动作可以同时进行。
虽然已参考具体实施例具体地展示和描述所描述的技术，但所属领域的技术人员应理解，可在不脱离如所附权利要求书所定义的所描述的技术的精神和范围的情况下在其中进行形式和细节上的各种改变。
以引用的方式并入
本文中所提及的所有公开和专利都以全文引用的方式并入本文中，如同特定且个别地指示每一个别公开或专利以引用的方式并入一般。
等效物
所属领域的技术人员将认识到，或能够使用不超过常规的实验来确定本文所描述的本发明的特定实施例的许多等效物。所述等效物打算由所附权利要求书涵盖。

Claims (81)

1.一种对囊泡和其生物分子货物进行分离、标记和成像的方法，所述方法包含：
(a)使衬底的顶部表面与包含所述囊泡的样品接触，从而捕获存在于所述样品中的一或多种囊泡；
(b)使囊泡与包含透化剂的透化溶液接触，由此透化所述囊泡；
(c)在步骤(b)之后，使囊泡与一或多种荧光货物标记接触，其中每种荧光货物标记：(i)对一或多种相关生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种，由此标记所述囊泡内的所述生物分子货物；
(d)将激发光导向所述衬底的所述顶部表面，由此激发标记所述囊泡的所述一或多种荧光货物标记；
(e)用一或多个检测器检测由于所述激发光的激发而从所述一或多种荧光货物标记发射的荧光；以及
(g)使用检测到的荧光来检测和/或定量存在于所述囊泡内的所述一或多种相关生物分子的至少一部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其包含在步骤(a)之后进行步骤(b)和(c)，以便在将所述囊泡捕获到所述衬底的所述顶部表面上之后对其进行透化和标记。
3.根据权利要求1所述的方法，其包含在步骤(a)之前进行步骤(b)和(c)，以便在将所述囊泡捕获到所述衬底的所述顶部表面上之前对其进行透化和标记。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述囊泡的直径小于或大致等于1微米。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述囊泡是细胞外囊泡。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞外囊泡是胞外体。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其包含使所述囊泡与交联剂接触，由此固定所述囊泡。
8.根据权利要求7所述的方法，其包含将所述囊泡与所述交联剂一起培育经选择以避免过度固定所述囊泡的持续时间。
9.根据权利要求7或8中任一权利要求所述的方法，其中所述交联剂的浓度经选择以避免过度固定所述囊泡。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包含将所述囊泡与所述透化剂一起培育经选择以维持所述囊泡的膜的完整性的持续时间。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述透化溶液中所述透化剂的浓度经选择以维持所述囊泡的膜的完整性。
12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述衬底的所述顶部表面包含一或多种捕获剂，每种捕获剂对与所述囊泡的至少一部分相关的一或多种目标因子的特定目标因子具有特异性。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特异于的所述特定目标因子是与特定疾病和/或病状相关的表面标记物。
14.根据权利要求12或13中任一权利要求所述的方法，其中：(i)所述一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体和/或(ii)所述一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白。
15.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质。
16.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种核酸。
17.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中步骤(c)包含使所述囊泡与一或多种货物标记溶液接触，每种溶液包含所述一或多种荧光货物标记中的至少一者和封阻剂。
18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度为约1微克/毫升或更小。
19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其包含：
使所述囊泡与对与所述囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性的荧光囊泡检测剂接触，由此用所述荧光囊泡检测剂标记所述囊泡；
在步骤(d)处，激发所述荧光囊泡检测剂；以及
在步骤(e)处，用一或多个检测器检测由于所述激发光的激发而从所述荧光囊泡检测剂发射的荧光。
20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中步骤(e)包含在一或多个荧光波长下对所述衬底的所述顶部表面进行成像，每个波长对应于荧光货物标记的发射波长，由此获得一或多个荧光图像，每个图像与特定荧光货物标记和所述特定荧光货物标记所特定针对的所述特定相关生物分子相关。
21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(g)包含：
由计算装置的处理器接收和/或访问所述一或多个荧光图像；
由所述处理器在所述一或多个荧光图像的至少一部分中的每一者内鉴别多个荧光发射的离散点，每个点确定为源自囊泡内；以及
由所述处理器使用所述荧光发射的离散点来检测和/或定量所述一或多种特定相关生物分子的所述部分。
22.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其包含：
(h)将照明光导向所述衬底的所述顶部表面，由此照射捕获的囊泡以及所述衬底；和
(i)用所述一或多个检测器检测对应于所述照明光的(A)由所述囊泡散射和/或
(B)由所述衬底反射的部分的无标记信号。
23.根据前述权利要求20至22中任一权利要求所述的方法，其中使用具有足够高放大率和分辨率的高放大率物镜进行所述成像，以检测从位于所述衬底的所述顶部表面上的荧光标记的囊泡发射的所述荧光。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述高放大率物镜的放大率在约4×到约100×范围内。
25.根据权利要求23或24中任一权利要求所述的方法，其中所述高放大率物镜的数值孔径在约0.1与约1.3范围内。
26.根据权利要求22至25中任一权利要求所述的方法，其中步骤(g)包含使用检测到的无标记信号以及检测到的荧光来检测和/或定量所述一或多种相关生物分子的所述部分。
27.根据权利要求22至26中任一权利要求所述的方法，其中步骤(i)包含在所述照明光的一或多个波长下对所述衬底的所述顶部表面进行成像，由此获得一或多个无标记图像，每个图像与特定照明波长相关。
28.根据权利要求27所述的方法，其中步骤(g)包含：
由计算装置的处理器接收和/或访问所述一或多个无标记图像；
由所述处理器使用所述一或多个无标记图像鉴别所述衬底的所述顶部表面上的多个囊泡位置；以及
使用所鉴别的囊泡位置来检测和/或定量所述一或多种特定相关生物分子的所述部分。
29.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述衬底是包含光学干涉涂层的反射衬底，所述光学干涉涂层包含一或多个层的堆叠，其中所述堆叠中的所述一或多个层中的每一者的厚度和/或材料使得：
(A)来自所述荧光货物标记中的一或多者的荧光的激发和/或发射得到增强，和/或
(B)通过检测所述囊泡响应于照明光的照射而散射的光而获得的无标记信号得到增强。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述反射衬底在一或多个特定波长下的反射率大于25％。
31.一种对囊泡和其生物分子货物进行分离、透化和标记的方法，所述方法包含：
(a)使衬底的表面与包含所述囊泡的样品接触，由此捕获存在于所述样品中的一或多种囊泡；
(b)使所述囊泡与包含透化剂的透化溶液接触，由此透化捕获的囊泡，其中所述囊泡与所述透化溶液一起培育的持续时间和/或所述透化溶液中所述透化剂的浓度经选择以维持所述囊泡的膜的完整性；以及
(c)在步骤(b)之后，使所述囊泡与一或多种荧光货物标记接触，其中每种荧光货物标记：(i)对所述囊泡内的一或多种相关生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种，由此标记所述囊泡内的所述生物分子货物。
32.根据权利要求31所述的方法，其包含在步骤(a)之后进行步骤(b)和(c)，以便在捕获所述囊泡之后对其进行透化和标记。
33.根据权利要求31所述的方法，其包含在步骤(a)之前进行步骤(b)和步骤(c)，以便在捕获所述囊泡之前对其进行透化和标记。
34.根据权利要求31至33中任一权利要求所述的方法，其中所述囊泡的直径小于或大致等于1微米。
35.根据权利要求31至34中任一权利要求所述的方法，其中所述囊泡是细胞外囊泡。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞外囊泡是胞外体。
37.根据权利要求31至36中任一权利要求所述的方法，其包含使所述囊泡与交联剂接触，由此固定所述囊泡。
38.根据权利要求37所述的方法，其包含将所述囊泡与所述交联剂一起培育经选择以避免过度固定所述囊泡的持续时间。
39.根据权利要求37或38中任一权利要求所述的方法，其中所述交联剂的浓度经选择以避免过度固定所述囊泡。
40.根据前述权利要求31至39中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包含将所述囊泡与所述透化剂一起培育经选择以维持所述囊泡的膜的完整性的持续时间。
41.根据前述权利要求31至40中任一权利要求所述的方法，其中所述透化溶液中所述透化剂的浓度经选择以维持所述囊泡的膜的完整性。
42.根据前述权利要求31至41中任一权利要求所述的方法，其中所述衬底的所述表面包含一或多种捕获剂，每种捕获剂对与所述囊泡的至少一部分相关的一或多种目标因子的特定目标因子具有特异性。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特定针对的所述特定目标因子是与特定疾病和/或病状相关的表面标记物。
44.根据权利要求中42或43任一权利要求所述的方法，其中：(i)所述一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体和/或(ii)所述一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白。
45.根据权利要求31至44中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质。
46.根据权利要求31至45中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种相关生物分子包含一或多种核酸。
47.根据权利要求31至46中任一权利要求所述的方法，其中步骤(c)包含使所述囊泡与一或多种货物标记溶液接触，每种溶液包含所述一或多种荧光货物标记中的至少一者和封阻剂。
48.根据权利要求31至47中任一权利要求所述的方法，其中所述荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度为约1微克/毫升或更小。
49.根据权利要求31至48中任一权利要求所述的方法，其包含：
使所述囊泡与对与所述囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性的荧光囊泡检测剂接触，由此用所述荧光囊泡检测剂标记所述囊泡。
50.一种用于对囊泡和其生物分子货物进行分离、透化和标记的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含透化剂的预混合透化溶液；和
(b)一或多种预混合货物标记溶液，每种溶液包含一或多种荧光货物标记，其中每种荧光货物标记(i)对一或多种相关生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其进一步包含一或多种预混合捕获剂溶液，每种溶液包含一或多种捕获剂，其中每种捕获剂对与所述囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性。
52.根据权利要求50所述的试剂盒，其进一步包含预点样衬底，其中所述预点样衬底包含一或多个捕获剂点，所述一或多个捕获剂点中的每一者包含对与所述囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性的特定捕获剂。
53.根据权利要求51或52中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特定针对的所述特定目标因子为与特定疾病和/或病状相关的表面标记物。
54.根据权利要求50至53中任一权利要求所述的试剂盒，其中：(i)所述一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体和/或(ii)所述一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白。
55.根据权利要求50至54中任一权利要求所述的试剂盒，其包含包括交联剂的固定溶液。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述固定溶液中所述交联剂的浓度经选择以避免过度固定所述囊泡。
57.根据前述权利要求50至56中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述透化溶液中所述透化剂的浓度经选择以维持所述囊泡的膜的完整性。
58.根据权利要求50至57中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质。
59.根据权利要求50至58中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种相关生物分子包含一或多种核酸。
60.根据权利要求50至59中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度为约1微克/毫升或更小。
61.根据权利要求50至60中任一权利要求所述的试剂盒，其包含囊泡检测溶液，所述囊泡检测溶液包含对特定目标因子具有特异性的荧光囊泡检测剂。
62.根据权利要求50至61中任一权利要求所述的试剂盒，其包含反射衬底，所述反射衬底包含光学干涉涂层，所述光学干涉涂层包含一或多个层的堆叠，其中所述堆叠中的所述一或多个层中的每一者的厚度和/或材料使得：
(A)来自所述荧光货物标记中的一或多者的荧光的激发和/或发射得到增强，和/或
(B)通过检测所述囊泡响应于照明光的照射而散射的光而获得的无标记信号得到增强。
63.根据权利要求62所述的试剂盒，其中所述反射衬底在一或多个特定波长下的反射率大于25％。
64.一种用于对囊泡和其生物分子货物进行分离、标记和成像的系统，所述系统包含：
(a)试剂盒，其用于对囊泡和其生物分子货物进行分离、透化和标记；
(b)安装架，其用于固持衬底；
(c)一或多个激发光源，其相对于所述安装架对准以便且将激发光导向所述衬底的顶部表面，以便提供位于所述衬底的所述顶部表面上的一或多种荧光标记的囊泡的激发；
(d)一或多个检测器，其相对于所述安装架对准且能够操作以检测从位于所述衬底的所述顶部表面上的所述荧光标记的囊泡发射的荧光；
(e)计算装置的处理器；以及
(f)存储器，其具有存储于其上的指令，其中所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器：
接收和/或访问对应于检测到的荧光的数据；和
使用对应于检测到的荧光的所述数据来检测和/或定量所述囊泡的所述生物分子货物。
65.根据权利要求64所述的系统，其中所述一或多个检测器各自相对于具有足够高放大率和分辨率的高放大率物镜对准，以检测从位于所述衬底的所述顶部表面上的所述荧光标记的囊泡发射的荧光。
66.根据权利要求65所述的系统，其中所述高放大率物镜的放大率在约4×到约100×范围内。
67.根据权利要求65或66所述的系统，其中所述高放大率物镜的数值孔径在约0.1与约1.3范围内。
68.根据权利要求64至67中任一权利要求所述的系统，其中所述试剂盒包含：
(A)包含透化剂的预混合透化溶液；和
(B)一或多种预混合货物标记溶液，每种溶液包含一或多种荧光货物标记，其中每种荧光货物标记(i)对一或多种相关生物分子的特定相关生物分子具有特异性，并且(ii)包含特定荧光物种。
69.根据权利要求68所述的系统，其中所述透化溶液中所述透化剂的浓度经选择以维持所述囊泡的膜的完整性。
70.根据权利要求68至69中任一权利要求所述的系统，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种蛋白质。
71.根据权利要求68至70中任一权利要求所述的系统，其中所述一或多种相关生物分子包含一或多种相关生物分子包含一或多种核酸。
72.根据权利要求68至71中任一权利要求所述的系统，其中所述荧光货物标记的至少一部分中的每一者的浓度为约1微克/毫升或更小。
73.根据权利要求64至72中任一权利要求所述的系统，其中所述试剂盒进一步包含一或多种预混合捕获剂溶液，每种溶液包含一或多种捕获剂，其中每种捕获剂对与所述囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性。
74.根据权利要求64至73中任一权利要求所述的系统，其中所述试剂盒进一步包含预点样衬底，其中所述预点样衬底包含一或多个捕获剂点，所述一或多个捕获剂点中的每一者包含对与所述囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性的特定捕获剂。
75.根据权利要求73或74中任一权利要求所述的系统，其中所述一或多种捕获剂的至少一部分中的每一者所特定针对的所述特定目标因子为与特定疾病和/或病状相关的表面标记物。
76.根据权利要求73至75中任一权利要求所述的系统，其中：(i)所述一或多种捕获剂包含对癌症相关蛋白具有特异性的抗体和/或(ii)所述一或多种目标因子包含一或多种癌症相关蛋白。
77.根据权利要求73至76中任一权利要求所述的系统，其中所述试剂盒包含固定溶液，所述固定溶液包含用于固定所述囊泡的交联剂。
78.根据权利要求77所述的系统，其中所述固定溶液中所述交联剂的浓度经选择以避免过度固定所述囊泡。
79.根据权利要求64至78中任一权利要求所述的系统，其中所述试剂盒包含囊泡检测溶液，所述囊泡检测溶液包含对与所述囊泡的至少一部分相关的特定目标因子具有特异性的荧光囊泡检测剂。
80.根据权利要求64至79中任一权利要求所述的系统，其包含反射衬底，所述反射衬底包含光学干涉涂层，所述光学干涉涂层包含一或多个层的堆叠，其中所述堆叠中的所述一或多个层中的每一者的厚度和/或材料使得：
(A)来自所述荧光货物标记中的一或多者的荧光的激发和/或发射得到增强，和/或
(B)通过检测所述囊泡响应于照明光的照射而散射的光而获得的无标记信号得到增强。
81.根据权利要求80所述的系统，其中所述反射衬底在一或多个特定波长下的反射率大于25％。
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