CN108841993A

CN108841993A - 与水稻高杆qtl紧密连锁的ssr分子标记l10与应用

Info

Publication number: CN108841993A
Application number: CN201810860011.5A
Authority: CN
Inventors: 姚方印; 陈高; 张华�; 柳絮; 宣宁; 杨永义
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2018-11-20
Also published as: CN105648064B; CN105648064A; CN109652577A

Abstract

本发明涉及与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10与应用。与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10，上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明首次筛选出了与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08。上述SSR标记能够将水稻第1染色体高杆基因进行遗传分析和精细定位，可用于构建水稻高密度遗传图谱和品种指纹图谱。

Description

与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10与应用

技术领域

本发明涉及与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10与应用，特别涉及水稻简单重复序列(SSR，Simple sequence repeats)分析标记及其在水稻高杆基因遗传分析和精细定位中的应用，属于DNA分子标记技术和分子生物学技术领域。

背景技术

SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)，又叫微卫星位点(Microsatellites)，是由1-6个核苷酸的重复单元串联重复而成的序列(Sharma et al.,2007)，也是一种基于PCR(polymerase chain reaction)的DNA分子遗传标记，广泛分布于整个植物基因组。同一物种中不同材料的SSR基序重复次数不同，用重复区两侧相对保守的单拷贝序列设计引物，对基因组总DNA进行扩增，扩增片断的长度多态性可作为不同材料的特异分子标记。现已证实SSR存在于真核生物和绝大部分原核生物中。与RFLP、RAPD、AFLP等分子标记相比，SSR具有多态性高、结果重复性高、稳定可靠、操作简便等特点，已成为遗传分析和植物育种中应用最广泛的一类共显性分子标记(Plieske and Struss,2001)。传统获得SSR标记的方法需通过建立、筛选基因组文库、克隆测序、引物设计等一系列实验，耗费许多人力、物力。随着基因组测序越来越便捷，由基因组数据中直接开发SSR标记的方法也被运用得越来越多。目前已在大豆、玉米、水稻、小麦、番茄、棉花等许多作物中开发出大量的SSR引物，用于这些作物的遗传多样性评价以及其它工作中(Ziekiewicz et al.,1994；Varshney et al.,2005)。

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物，全世界约有1/2的人口以大米为主食。水稻也是一种重要的战略性物资，占我国粮食总产的一半以上，保障水稻生产对确保我国粮食安全和农业可持续发展有十分重要的战略意义。水稻由于具有基因组较小、遗传转化系统建立完善以及与其它禾本科植物存在较好的共性等优点，已经成为禾本科植物以及单子叶植物的模式植物(Izawa and Shimamoto,1996)。目前，根据水稻基因组测序结果已经开发了大量SSR标记(McCouch et al.,2002；Saini et al.,2004；Nonoue et al.,2008；Matsubara et al.,2008；Maas et al.,2010)，但对水稻SSR标记的开发仍未饱和。鉴于水稻在粮食安全和农业可持续发展方面重要性，开发新的特异性水稻SSR标记引物，对于构建高密度遗传图谱和品种指纹图谱具有重要意义，对于水稻分子育种、新品种开发、种子资源评价和栽培技术创新具有重要的指导意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10与应用。上述SSR分子标记为提供多态性，弥补目前水稻SSR标记较为缺乏的不足，为水稻种质鉴定研究及其群体遗传学提供了有力的研究工具。本发明提供了3对水稻第1染色体上SSR标记，并将它们应用于水稻高杆基因遗传分析和精细定位中。

本发明技术方案如下：

与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06，该分子标记为一对，上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06在构建水稻第1染色体高密度遗传图谱和品种指纹图谱中的应用。

上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06在水稻第1染色体高杆基因遗传分析和精细定位中的应用。

与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08，该分子标记为一对，上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08在构建水稻第1染色体高密度遗传图谱和品种指纹图谱中的应用。

上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08在水稻第1染色体高杆基因遗传分析和精细定位中的应用。

与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10，该分子标记为一对，上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在构建水稻第1染色体高密度遗传图谱和品种指纹图谱中的应用。

上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在水稻第1染色体高杆基因遗传分析和精细定位中的应用。

有益效果

本发明首次筛选出了3对与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06、SSR分子标记L08、SSR分子标记L10。通过对水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24和轮回亲本HJX74基因组DNA进行扩增，并利用6％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，发现上述3对与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，利用上述3对SSR标记能够将水稻高杆基因进行遗传分析和精细定位，可用于构建水稻第1染色体高密度遗传图谱和品种指纹图谱。

附图说明

图1为水稻单片段代换系上SSR标记亲本多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；

其中：1为轮回亲本HJX74，2为水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24，a为RM315多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，b为RM104亲本多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，c为RM529多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，d为PSM331多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，e为PSM423多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；

图2为水稻SSR标记PSM331，RM1068在F₂群体中的分离中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；

其中：(a)和(b)分别为利用SSR标记对PSM331和RM1068在HJX74(P1)和单片段代换系W27-14-1-2-03-24(P2)分离群体中的PH-1(t)基因扩增结果，1-20为F₂群体个体；

图3为轮回亲本HJX74与水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24杂交发展的作图群体定位的株高基因PH-1(t)的遗传图；

图4为水稻SSR标记L06，L08和L10在F₂群体中的分离中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；

其中：(a)、(b)和(c)分别为利用SSR引物对L06，L08和L10在HJX74(P1)和单片段代换系W27-14-1-2-03-24(P2)分离群体中的PH-1(t)基因扩增结果，1-20为F₂群体个体；

图5为显性高秆基因在水稻第1染色体短臂上的分子连锁图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护的范围不限于此。

实施例中涉及的生物材料来源如下：

水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24和轮回亲本HJX74购自华南农业大学农学院；

实施例中涉及的酶、试剂及试剂盒均为普通市售产品。

实施例1与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记的设计

1.1引物设计方法：

在需要发展微卫星标记的染色体区段进行分子标记的设计。从TIGR网站上(TheInstitute of Genome Research)(http://www.tigr.org/tdb/rice)下载该区域PAC/BAC克隆的序列。TIGR将IRGSP(International Rice Genome Sequencing Project，IRGSP)已测序的PAC/BAC克隆整合到了遗传图谱上，从目标区域下载的PAC/BAC克隆的序列首先需要利用重复序列搜索软件SSRIT(http://www.gramene.org/microsat/)进行微卫星序列的搜索，然后从中选择合适的微卫星序列(一般要求重复数在8以上，同时避免基序为AT)，下载包含有此微卫星序列的一小段基因组序列(350-500bp)，最后利用此序列进行PCR引物的设计。利用软件Primer Premier 5.0进行引物的设计。设计的引物一般要求GC含量在45-65％之间，Tm值在55-65℃之间，无错配、二聚体和发夹结构。

在需要发展缺失多态性标记的染色体区域，从TIGR网站上(The Institute ofGenome Research)(http://www.tigr.org/tdb/rice)下载该区域日本晴PAC/BAC克隆的序列。首先选择需要的PAC/BAC克隆，把每个克隆分割成2kb连续的小片段。然后利用这些2kb的序列与籼稻品种93-11进行序列比对，选择序列比对相似性高而只在某个区段有碱基缺失(碱基缺失一般在5个碱基以上)的序列做为候选序列，最后利用这些候选序列在碱基缺失的两端设计前后引物，扩增出的产物一般控制在100bp到300bp之间。其它按引物设计的一般要求。

分子标记的物理定位以IRSGP建立的日本晴的假染色体模型(Pseudomolecules)为参照对象。采用直接物理定位法，根据IRGSP发表的日本晴的假染色体模型将各个两个亲本间具有多态性的分子标记直接定位上去，以构建成分子图谱。具体方法如下：

通过NCBI网站BLAST比对工具，对各个分子标记的前后引物序列在日本晴的基因组序列上进行查找，以确定该分子标记所在的染色体或BAC克隆上，根据比对所得的结果即可获知该分子标记在各条染色体上的具体位置。

根据分子标记分析的结果，将具有HJX74和W27-14-1-2-03-24的亲本带型的个体分别赋值1和3，具有双亲带型(杂合带型)的个体赋值2。将微卫星分析的结果转换成数字形式，然后输入计算机以便采用MAPMAKER/EXP.Version 3.0软件对定位群体抽穗期和微卫星标记的分离数据进行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(Centimorgan，cM)，构建出目标基因的局部分子连锁图。

根据克隆末端的重复序列，BLASTn软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)把各克隆拼接起来，确定新引物所在克隆的物理位置，整合到遗传图上，并计算两标记间的物理位置。

利用Gramene网站上(http://www.gramene.org)提供的微卫星序列搜索工具SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool)找出BAC序列中的微卫星序列，然后用Primer Premier 5.0对微卫星的侧翼序列自动或人工设计出扩增长度为200-1000bp左右的上下游引物对，并进行筛选出3对SSR标记，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.2水稻SSR标记在水稻株高基因PH-1(t)精确定位中的应用

通过已公布的SSR标记进行多态筛选，将控制水稻高杆基因定位于水稻第1染色体短长臂PSM331和RM1068两个标记之间的区域(图1，图2)，具体实施方式如下：

根据已公布的SSR标记(如表1所示)进行多态筛选，发现RM315，PSM331，PSM423，RM104，RM529共5个SSR标记在两亲本之间均有多态。

根据分子标记分析的结果，利用MAPMAKER(EXP3.0b)软件进行分子数据的分析，并计算标记间的遗传距离。株高基因PH-1(t)被定位在第1染色体上，位于长臂一侧的微卫星标记RM1068、PSM423、RM104与PH-1(t)的遗传距离分别为为0.5cM、0.9cM、8.9cM，位于另一侧的微卫星标记PSM331、RM472、RM315与PH-1(t)的遗传距离分别为1.0cM、3.7cM、6.4cM(图3)。

表1 单片段代换系上SSR标记

为了进一步定位目标基因，根据PSM331和RM1068之间已公布的SSR标记，选取10对(如表2所示)对重组株进行扩增，其中RM11964，RM11966，RM11977在两亲本间具有多态，用这3对标记对PSM331和RM1068之间的重组株进行扩增，对其基因型和表现型进行分析，将高秆基因PH-1(t)定位于RM11977和RM1068之间，物理距离为68kb。

表2 PSM331和RM1068之间的SSR标记

为了进一步精确定位目标基因，根据已知的水稻全基因组序列，在水稻第1染色体上RM11977和RM1068之间的BAC序列上寻找微卫星序列，共设计了10对新的SSR标记，用这10对SSR标记检测引物对亲本进行扩增，从10对SSR标记中筛选出3对，均具有多态性(图4)。分别命名为SSR分子标记L06、SSR分子标记L08、SSR分子标记L10。通过进一步对RM11977和RM1068之间剩余重组株进行分析。分析发现1株高秆植株，1株半矮秆植株显示目标基因在SSR分子标记L06的上游，而3株高秆植株则显示目标基因在引物RM11977的下游。由此最终将基因PH-1(t)定位于RM11977和L06之间，物理距离为23kb。

SSR分子标记L06的上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SSR分子标记L08的上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；SSR分子标记L10的上游标记核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(如表3所示)。

表3 RM11977和RM1068之间新的SSR标记

实施例2水稻SSR分子标记L06、SSR分子标记L08、SSR分子标记L10的应用

2.1水稻基因组DNA提取

采用改良TPS简易法提取水稻基因组总DNA，具体步骤如下：

1、在分蘖盛期每个单株取上部1～2片幼叶，保存与-80℃冰箱中备用；

2、抽提DNA时取2～4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加TPS抽提液900ml，75℃水浴30～60min；

3、12000rpm离心10min，吸取上清约500ml转入新1.5ml离心管；

4、加入预冷异丙醇或无水乙醇加满。4℃过夜，12000rpm离心10min；

5、弃上清，干燥沉淀，加150μl灭菌水，4℃备用。

所述TPS抽提液组分如下：100mM Tris-HCL(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)、1MKCL。

2.2PCR扩增

PCR扩增在PE9700型热循环仪中进行。20μl反应体系组分如下：

2×Hifi PCR Mix 10μl，50～100ng的DNA模板1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，ddH₂O 7μl，总反应体系为20μl。

引物分别为SSR分子标记检测引物L06、SSR分子标记检测引物L08、SSR分子标记检测引物L10。

PCR反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及多态性检测

PCR产物用质量百分比为6％的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，基本操作包括以下三个步骤：

制胶：称取9.6g尿素，加45ml蒸馏水和8ml 10×TBE缓冲液，用玻棒搅拌使尿素完全溶解，然后加入12ml 40％丙烯酰胺溶液，搅匀，加入0.8ml 10％过硫酸胺和35μl TEMED，搅匀后立即倒入已用琼脂糖凝胶封口的玻璃板中，灌满后放平，使其与桌面成10°左右的倾角。插入梳子，静置1～2h使胶凝固。

上述10×TBE缓冲液组分如下：

108g Tris-HCl、55g硼酸、7.44g EDTA加蒸馏水溶解，定容至1000ml；

上述40wt％丙烯酰胺溶液组分如下：

38g丙烯酰胺、2g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，加水定容至100ml；

点样：待胶完全凝固后，小心拔出梳子，尽量保持点样孔完整。将玻璃板固定在垂直电泳槽上，加入适量的1×TBE电泳缓冲液；取电泳缓冲液反复冲洗点样孔，清除多余没有凝固的物质；取PCR扩增产物，每管PCR产物中加入4μl载样缓冲液，混匀后用微量进样器(购自上海医用激光仪器厂)取3～4μl注入点样孔。

上述载样缓冲液组分如下，均为重量百分比：

0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯氰、50％甘油，余量水。

电泳：调电压至250V，电泳时间约3～4h。

电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗两次；转移至0.1wt％AgNO₃溶液中染色，在摇床上轻摇10min；然后将凝胶转移至蒸馏水中漂洗两次；最后转入显色液中显色，着色后转入自来水中保存，记录带型结果或凝胶成像。

显色液组分如下：

6g氢氧化钠、0.076g四硼酸钠、1.6ml甲醛，加水定容至400ml。

由上述实验结果(图1～4)可以看出，水稻SSR标记PSM331，RM1068，L06，L08和L10的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，利用本发明设计的SSR分子标记L06、SSR分子标记L08、SSR分子标记L10对F2次级分离群体进行扩增将该显性株高基因定位于水稻第1染色体长臂RM1068和L06之间，物理距离为23kb。采用SSR标记并通过水稻基因组注释系统(RiceGAAS)对RM1068和L06之间23kb的染色体区域进行了基因预测及功能分析，在这区域内发现含有5个ORF，其中ORF3与赤霉素的合成有关，初步推测其为目标基因PH-1(t)(图5)。利用本发明设计的SSR分子标记引物对水稻高杆基因进行遗传分析和精细定位，同时也可用于水稻构建高密度遗传图谱和品种指纹图谱。

序列表

<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心

<120> 与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

aataagacgg atggtcaaac g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gcccaacgac aagtcaaaaa g 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

taacggggct tcctctcct 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

tcttcccaaa cccaaccat 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

catgttgcgc atttccttt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

ggctggctgg ttcctagtc 19

Claims

1.与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10，该分子标记为一对，上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在构建水稻第1染色体高密度遗传图谱和品种指纹图谱中的应用。

3.权利要求1所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在水稻第1染色体高杆基因遗传分析和精细定位中的应用。