CN108812079A - 一种羊肚菌菌种分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊肚菌菌种分离方法，属羊肚菌分离方法领域。利用这种方法，用特定规格透明长方体玻璃瓶作母种容器，按特定配方制得培养基。把基部带土的羊肚菌种菇削至见斑状菌肉，挑取0.3毫米见方菌土混合体，直接接菌到容器内培养基平面的后部。在特定温度下，经1‑2次提纯，即可得到羊肚菌纯菌丝体。与现有羊肚菌菌种分离方法相比，这种分离方法操作简单，成功率高，解决了羊肚菌生产中菌种分离成功率过低的技术瓶颈问题。

Description

一种羊肚菌菌种分离方法

技术领域

本发明涉及羊肚菌菌种分离方法领域，涉及一种羊肚菌的菌种分离方法。

背景技术

羊肚菌（Morchella deliciosa Fr.）是一种珍稀食药用菌，因子实体花纹酷似羊肚得名，是世界四大名菌之一。其味道鲜美、营养丰富、医用价值高，含有18种氨基酸，其中8种氨基酸是人体不能制造的，有 “蘑菇皇后”之称，具有珍贵的食用价值和突出的经济价值，目前市场价高达2000元/公斤以上。

羊肚菌传统上主要靠采集野生品种，近几年，人工栽培面积不断扩张，但栽培技术尚不完善，特别是菌种分离技术，成功率不足10%。现有羊肚菌菌种分离技术存在的主要不足和缺陷，一是母种培养面面积太小，加大了菌丝提纯难度；二是种菇分离部位选取不当。现有技术是用菌柄或菌帽做分离材料，这一部位活性差，分离成功率很低；三是培养温度偏高，使羊肚菌菌丝相对于杂菌菌丝失去生长优势，无法有效提纯。羊肚菌菌种分离上的这一技术短板加大了羊肚菌种植风险和种植成本，使菌种分离技术成为产业发展的一大瓶颈。

发明内容

菌种分离技术是羊肚菌栽培的关键环节，为了保护我国珍贵的野生羊肚菌资源，保护生态环境，推动羊肚菌产业的商业化种植，降低种植风险和种植成本，本发明提供了一种安全、高效、成功率可达90%以上的羊肚菌菌种分离方法。

本发明是以如下技术方案实现的：一种羊肚菌菌种分离方法的具体步骤为：一种羊肚菌菌种分离方法，具体分离步骤如下：

步骤1）选择母种容器：用长15厘米，宽6厘米，高4厘米，且瓶口为直径2.5厘米的高透明长方体玻璃瓶作母种容器；该母种容器设计与试管容器相比，有五大优势：一是方便对瓶内菌丝体观察、判断和记录；二是使菌丝体伸展有足够的空间；三是便于菌丝体的提纯复壮；四是培养基厚度一致，便于扩繁时发菌速度的一致性；五是菌丝体有效面积大，省工省时，有利于规模化生产。

步骤2）备制母种培养基：各原料及其用量为：纯净水1100毫升，新鲜去皮土豆200克，小麦50克，琼脂20克，葡萄糖18克，磷酸二氢钾0.2克，硫酸镁0.1克，维生素B1为3毫克；

母种培养基的制备方法为：在不锈钢锅里加水1100毫升，把新鲜去皮土豆200克切成0.5厘米薄片，和50克小麦一起加入水中，小火煮沸15分钟后过滤，取滤汁1000毫升，加入20克琼脂，小火煮至完全融化，然后加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1，得到母种培养基，即可装入母种容器，每瓶母种容器装母种培养基20毫升，用棉塞或透气胶塞封口，放入灭菌锅，在120°C保持15分钟后取出，平放进超净工作台或其它无菌处，凝固待用。

步骤3）挑选种菇：种菇的主要标准，一是要在头潮菇中选择；二是种菇的商品性和农艺性状要突出；三是子实体健壮、无畸形、无病虫害；四是选择6-8成熟的子实体；另外，种菇要带基质土一起拔出，在采摘后2小时内进行分离培养。

步骤4）母种分离方法：首先用刀片把种菇基部的土壤削至见60-70%菌肉，在无菌条件下，挑取种菇基部的菌肉和基质土混合物0.3立方厘米的方块，过酒精灯火焰后接入备好的母种培养基平面，靠底部放置，封口后培养。

步骤5）菌丝培养与提纯：将羊肚菌分离组织母种瓶放在提前消毒过的暗培养室培养，室内温度保持在16°C，其室内空间湿度保持在30-40%，培养 48-72小时，生长前端的菌丝体即是羊肚菌菌丝体，挑取前端的菌丝体接入新的母种培养基中，如此1-2次，即可获得纯的羊肚菌菌丝体，即羊肚菌母种；16°C是羊肚菌组织分离培养的最佳温度，同时又能延缓其他杂菌的发菌速度，这种菌丝生长速度差使羊肚菌菌丝在48-72小时内即可和其他杂菌分离开来，用这种方法分离得到的羊肚菌母种，经生物学鉴别和出菇试验后，即可用于生产。

作为本发明所述的羊肚菌菌种分离方法一种优化方案，获得的羊肚菌母种进行保藏时，在步骤2）做母种培养基时pH应调酸碱度至8，每瓶应加大至30毫升培养基，接入获得的羊肚菌母种，在母种菌丝布满瓶并形成菌核后，放入4℃冰箱保存。

本发明的有益效果是：

1、通过母种容器大小和形状的的改进，与之前试管容器相比，有五大优势：一是方便对瓶内菌丝体观察、判断和记录；二是使菌丝体伸展有足够的空间；三是更利于菌丝体的提纯复壮；四是培养基厚度一致，能使扩繁后菌包的发菌速度保持一致；五是使菌丝体的有效面积增加到四倍以上，省工省时，有利于规模化生产。

2、在母种培养基配方中，改普通自来水为纯净水，改1000毫升标准用量为1100毫升，增加小麦组份，每瓶培养基增加至20毫升，用于保存母种的培养基， pH应调酸碱度至8，每瓶装培养基30毫升。这些调整和优化，可使羊肚菌菌丝体发菌速度提高25%，菌丝量提到30%。

3、在种菇选择上，除常规种菇标准外，本方法要求种菇为6-8成熟度的子实体，要求种菇基部必须带基质土一起拔出，要求在采后2小时内尽快分离培养。这不但可最大限度减少杂菌污染机会，保证分离成功率达到90%以上，而且可保证分离后菌丝有充分的活力。

4、在分离方法上，本方法要求挑选菇基部菌-土混合组织作为分离材料，这一点和以往分离方法有较大区别。羊肚菌的这部分组织菌丝活力强，耐老化，更适合作为分离材料。用这部分组织作为分离材料，得到的菌丝体更健壮，出菇能力可提高20-25%，分离成功率在90%以上。

5、在菌丝培养与提纯环节，本技术要求把发菌空间温度控制在16°C。在这一温度下，一方面可保证羊肚菌菌丝的快速发菌速度，同时又能延缓和抑制杂菌的发菌速度，使羊肚菌菌丝在48-72小时内即可和其他杂菌分离开来，利于下一步对羊肚菌菌丝进行提纯复壮。

6、在羊肚菌母种上，本发明要求对需要保存的羊肚菌母种，在做母种培养基时pH应调酸碱度至8，大培养基含量至30毫升，在母种菌丝布满瓶并形成菌核后，把母种瓶的普通封口棉或封口胶棒更换成通气性弱、防潮和保湿效果好的封口物后，放入4°C冰箱保存。这样可延缓培养基失水和菌丝老化，延长菌丝保质期20-30天。

具体实施方式

以下实施例是对本发明效果的进一步说明。

实施例1

2016年在徐州沛县江苏馨野生态农业科技有限责任公司实施羊肚菌菌种分离6份。

选择母种容器阶段： 1月17日，在徐州飞昌玻璃制品有限公司定做特种母种容器10000个，高透明玻璃材料，规格：长15厘米，宽6厘米，高4厘米，瓶口直径为2.5厘米。

制备母种培养基：2月8日，制备母种培养基；

制备培养基的时间根据羊肚菌子实体的生长情况决定，一般提前分离适期2-3天制备；用纯净水2200毫升，新鲜土豆400克（去皮），小麦100克，琼脂40克，葡萄糖36克，磷酸二氢钾0.4克，硫酸镁0.2克，维生素B1为6毫克。用不锈钢锅制备。把去皮土豆400克切成0.5厘米薄片，和100克小麦一起加入水中（小麦无冲洗），小火煮沸15分钟后过滤，取滤汁2000毫升，加入40克琼脂，小火煮至完全融化，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1，得到母种培养基，即可装入母种容器，用于提纯的每瓶母种容器装母种培养基20毫升；用于保存的培养基调酸碱度至7.5，每瓶母种容器装母种培养基30毫升培养基。20毫升母种培养基装60瓶，30毫升母种培养基装10瓶，用棉塞封口，放入灭菌锅，在120°C保持15分钟，在80°C时取出，平放进经提前消毒的超净工作台，瓶上用消毒过的双层毛巾覆盖，使培养基缓慢凝固，凝固过快会使瓶壁气生水增多，空间湿度大，影响接菌后发菌。

挑选种菇：2月11日，首批羊肚菌子实体最大高度已达7.5厘米，成熟度60%。上午9点，种菇在6个试验品种中挑选，每个品种选2株子实体作为种菇，用竹片在根部带部分培养土一起翘起，9点20分采毕后集中运入接菌室。

母种分离：2月11日9点20分，开始做分离前准备：首先用刀片把种菇基部的土壤削至见60-70%菌肉，在无菌条件下，挑取种菇基部的菌肉和基质土混合物0.3立方厘米的方块，过酒精灯火焰后接入备好的母种培养基平面，靠底部放置，封口后，即可得到羊肚菌分离组织母种瓶。每个种菇菌株分离4瓶，并做好标标记，10点13分分离完毕。

菌丝培养与提纯阶段：分离过的羊肚菌分离组织母种瓶，立即放入暗培养室，培养室已提前消毒，培养空间温度保持16°C，空间湿度保持30-40%；2月13日下午3时，羊肚菌菌丝发菌平均已达4.21厘米，混合菌丝体平均速度约为2.27厘米，发菌速度差平均约为1.94厘米。利用低温下羊肚菌菌丝体发菌速度快的优势，把羊肚菌菌体前端生长点的纯羊肚菌菌丝体提纯出来，在温度16-20°C、空间相对湿度30-40%环境下培养，得到纯羊肚菌菌丝体。各品种种菇分离后的菌丝发菌速度数值，见表1。

羊肚菌母种保藏：本操作在2月21日上午进行。通过提纯得到的纯菌丝体，一部分用于扩繁原种，用于出菇试验，一部分转接入30毫升母种培养基中，在温度16-20°C、空间相对湿度30-40%环境下培养，2月30日布满菌丝并形成菌核，已放入4°C冰箱保存待用。

表1：沛县基地羊肚菌菌丝发菌速度数值表

注：表中数据为2月13日下午3时的发菌速度数值。（单位：厘米，精确到0.01）“+”表示分离出纯菌丝体（菌种）。

实施例2

2017年在徐州广浩食用菌专业合作社（徐州经济技术开发区徐庄村）实施羊肚菌菌种分离12份。

准备母种容器： 2月11日，购进高透明分离母种用玻璃瓶1000个，规格：长15厘米，宽6厘米，高4厘米，瓶口直径2.5厘米。

制备母种培养基：2月17日，制备母种培养基。用纯净水4400毫升，新鲜土豆800克（去皮），小麦200克，琼脂80克，葡萄糖72克，磷酸二氢钾0.8克，硫酸镁0.4克，维生素B1为12毫克；用不锈钢锅制备，把去皮土豆800克切成0.5厘米薄片，和200克小麦一起加入水中，小火煮沸15分钟后过滤，取滤汁4000毫升，加入80克琼脂，小火煮至完全融化，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1，装入特种母种容器，提纯培养基每瓶装培养基20毫升。用于母种保存的培养基调酸碱度至7.5，每瓶装30毫升培养基。20毫升培养基装100瓶，30毫升培养基装62瓶，用棉塞封口，放入灭菌锅，在120°C保持15分钟，在80°C时取出，平放进经提前消毒的接菌箱，瓶上用消毒过的双层牛皮纸覆盖。

挑选种菇：2月20日上午8时，在羊肚菌试验区3个不同菌株中选取种菇，为确保菌种分离的安全性，从每个菌株中选出4个种菇进行分离，共选出12个种菇；子实体成熟度65%左右，种菇菇体基部带土。

母种分离：2月20日上午9时10分，开始做分离前准备和母种分离。用美工刀把种菇基部的土壤削至见60-70%菌肉，在无菌条件下，挑取种菇基部的菌肉和基质土混合物0.3立方厘米的方块，过酒精灯火焰后接入备好的母种培养基平面，靠底部放置，封口后，即可得到羊肚菌分离组织母种瓶。每个菌株分离3瓶，共分离36瓶， 10点43分分离完毕。

菌丝培养与提纯：分离过的母种瓶，放入暗培养室（培养室已提前消毒），培养空间温度保持16°C，空间湿度保持在30-40%之间。2月22日下午1点30分测量计算（本次分离培养中，在36瓶中有两瓶出现根霉感染，未计入发菌速度统计），羊肚菌菌丝发菌平均已达4.23厘米，混合菌丝体平均速度为2.27厘米，发菌速度差平均为1.96厘米。低温下羊肚菌菌丝体发菌速度优势明显，把羊肚菌菌体前端生长点的纯羊肚菌菌丝体提纯出来，在温度16-20°C、空间相对湿度30-40%环境下培养，获得纯羊肚菌菌丝体。本次分离培养中，种菇7分离瓶在2月20检查中发现分离组织周围有木霉感染，未分离出羊肚菌菌丝体。分离成功率94.4%。各品种种菇分离后的菌丝发菌速度数值，见表2。

羊肚菌母种保藏：提纯获得的纯菌丝体，一部分用于扩繁原种，用于出菇试验和小范围生产；一部分于2月29日下午转接入30毫升母种培养基中，在温度16-20°C、空间相对湿度30-40%环境下培养，3月7日布满菌丝并形成菌核，口部经控养处理后放入4°C冰箱保存。

表2：徐庄基地羊肚菌菌丝发菌速度数值表

注：表中数据为2月22日下午1点30分的发菌速度数值。（单位：厘米，精确到0.01）“+”表示分离出羊肚菌纯菌丝体（菌种），“-”表示未分离出。

Claims (2)

1.一种羊肚菌菌种分离方法，其特征在于：具体分离步骤如下：

步骤1）选择母种容器：用长15厘米，宽6厘米，高4厘米，瓶口直径为2.5厘米的高透明长方体玻璃瓶作母种容器；

步骤2）备制母种培养基：各原料及其用量为：纯净水1100毫升，新鲜去皮土豆200克，小麦50克，琼脂20克，葡萄糖18克，磷酸二氢钾0.2克，硫酸镁0.1克，维生素B1为3毫克；

母种培养基的制备方法为：在不锈钢锅里加水1100毫升，把新鲜去皮土豆200克切成0.5厘米薄片，和50克小麦一起加入水中，小火煮沸15分钟后过滤，取滤汁1000毫升，加入20克琼脂，小火煮至完全融化，然后加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1，得到母种培养基，装入母种容器，每瓶装母种培养基20毫升，用棉塞或透气胶塞封口，放入灭菌锅，在120°C下保持15分钟后取出，平放进超净工作台或其它无菌处，凝固待用；

步骤3）挑选种菇：种菇的主要标准，一是要在头潮菇中选择；二是种菇的商品性和农艺性状突出；三是子实体健壮、无畸形、无病虫害；四是选择6-8成熟的子实体；种菇要带基质土一起拔出，在采摘后2小时内进行分离培养；

步骤4）母种分离方法：首先用刀片把种菇基部的土削至见60-70%菌肉，在无菌条件下，挑取种菇基部的菌肉和基质土混合物0.3立方厘米方块，过酒精灯火焰后接入备好的母种培养基平面，靠底部放置，封口后培养；

步骤5）菌丝培养与提纯：将做好分离的羊肚菌母种瓶放在提前消毒过的暗培养室培养，室内温度保持16°C，其室内空间相对湿度保持30-40%，培养 48-72小时；生长前端的菌丝体即是羊肚菌菌丝体；挑取前端的菌丝体接入新的母种培养基中，如此1-2次，即可获得羊肚菌纯菌丝体，即羊肚菌母种。

2.根据权利要求1所述的羊肚菌菌种分离方法，其特征在于：获得的羊肚菌母种进行保藏时，在步骤2）做母种培养基时pH应调酸碱度至8，每瓶应加大至30毫升培养基，接入获得的羊肚菌母种，在母种菌丝布满瓶并形成菌核后，放入4℃冰箱保存。