CN108801744A - 一种血清中短链氯化石蜡的提取净化方法 - Google Patents

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徐甲知
张海军
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Abstract

本发明提供一种血清中短链氯化石蜡的提取净化方法，包括以下步骤，向血清中加入浓硫酸，除去血清中的蛋白和脂肪，再加入正己烷和/或二氯甲烷涡旋震荡，离心，获得上清提取液；采用多层硅胶柱对提取液进行净化洗脱；硅胶柱中填料由下至上为：无水硫酸钠，碱性硅胶，活性硅胶，酸化硅胶，无水硫酸钠；将含有短链氯化石蜡的流出液浓缩后氮气吹至近干，获得物中为血清中的短链氯化石蜡。经本方法处理后的血清样品采用气相色谱‑电子捕获负化学源/低分辨质谱进行分析。本发明首次对血清中SCCPs进行提取处理，并采用硫酸处理蛋白质和脂肪。该方法操作简便，重现性好，为研究血清中SCCPs浓度及人体暴露水平提供前处理方法。

Description

一种血清中短链氯化石蜡的提取净化方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种血清中短链氯化石蜡的提取净化方法。
背景技术
氯化石蜡是一类复杂的氯代烷烃化合物，包含超过10000种的同系物和异构体。商业化的氯化石蜡是由正构烷烃直接氯化而成，其氯含量在30％至70％之间，基于其链长可分为短链氯化石蜡，中链氯化石蜡和长链氯化石蜡。氯化石蜡在人类生产生活中具有广泛的应用，如润滑剂，金属切削液，阻燃剂以及PVC，橡胶，涂料，颜料和密封剂中的增塑剂等等。研究表明，氯化石蜡在环境中具有持久性，同时由于其半挥发性而易于在大气中长距离迁移。短链氯化石蜡能够通过食物链进行生物累积和生物放大，因而可能造成生态风险和野生生物及人类的健康风险。目前，短链氯化石蜡已经被列为斯德哥尔摩公约中POPs的候选物质，也被列入欧盟，日本，加拿大的有害物质排放清单(TRI,Toxics ReleaseInventory)。
自十九世纪三十年代以来，氯化石蜡的全球累计生产量已达1000万吨，虽然氯化石蜡在国外已经被列为限制生产的物质，但是中国却并没有出台对其生产进行限制的政策法令。研究表明，氯化石蜡在各种环境介质，如土壤，水，水生生物，植被，甚至在偏远的极地生物体内也均有检出。尽管氯化石蜡在各种环境介质中检出的报道甚多，但是人类暴露数据却是少之又少，这主要是由于氯化石蜡本身的复杂性以及在研究过程中所遇到的分析方法上的困难。近年来，有报道称，母乳中也存在短链氯化石蜡和中链氯化石蜡。其报道的母乳中氯化石蜡的脂肪含量在2.7％-5.0％之间，这与人体血清中的脂肪含量相当。然而，目前还未见血清中氯化石蜡的报道，这可能是由于目前没有成熟的血清中短链氯化石蜡的前处理及检测方法，且血清并不像母乳一样易于获得大体积样本。因而开发血清中氯化石蜡的提取净化方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清中短链氯化石蜡的提取净化方法，为今后血清中氯化石蜡的分析提供了一种参考方法，而且该前处理方法简单，省时，提取效率高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种血清中短链氯化石蜡的提取净化方法：
包括以下步骤：
1)样品提取：向血清中加入浓硫酸(除去血清中的蛋白和脂肪)，再加入正己烷和/或二氯甲烷涡旋震荡，离心，获得上清提取液；
2)样品净化：采用多层硅胶柱对提取液进行净化洗脱，先用组分1正己烷洗脱，再用正己烷：二氯甲烷体积比为4:1～1:2的组分2洗脱，组分1洗脱后的滤液为含杂质的弃液，组分2洗脱后的流出液含有短链氯化石蜡；
多层硅胶柱中填料由下至上为：无水硫酸钠，碱性硅胶，活性硅胶，酸化硅胶，无水硫酸钠；
3)将含有短链氯化石蜡的流出液浓缩后氮气吹至近干，获得物中为血清中的短链氯化石蜡。
使用气相色谱-电子捕获负化学源/低分辨质谱对血清提取净化得到的获得物进行定性定量分析。
血清提取净化得到的获得物用进样内标定容后待分析，进样内标为13C-α-HCH，浓度为50～100ppb，定容体积为10～20μL。
步骤1)中所述血清与浓硫酸的体积比为1:1～1:2，浓硫酸为质量分数大于或等于70％的硫酸溶液，优选为优级纯。
步骤1)中所述的正己烷与二氯甲烷的体积比为1:0～0:1。
步骤1)中涡旋转速为1500-2800rpm，涡旋时间为2～10min；
步骤1)中离心转速为2000～5000rpm，离心时间为5～10min。
所述血清可以来自人体，例如，12-82岁不同性别和健康状况的人。
步骤2)中硅胶柱填料由下至上，无水硫酸钠：碱性硅胶：活性硅胶：酸化硅胶：无水硫酸钠的质量比为5：2～3：1～2：3～5：6～10。
碱性硅胶填料用于除去残留的硫酸和血清中的碱不稳定物质；所述碱性硅胶为含有KOH的质量分数为2％的硅胶；碱性硅胶由活性硅胶与KOH水溶液完全混合后除去水制备而成；
活性硅胶由硅胶在550-650℃下高温焙烧4-12h制备而成；
酸化硅胶为含有硫酸的质量分数为22-44％的硅胶；酸化硅胶由活性硅胶与浓硫酸混合震荡2～3h制备而成。
所述硅胶的粒径为63-100μm。
本发明中的技术方案具有如下优点：
(1)本发明为首次应用于对血清中短链氯化石蜡的测定。
(2)本发明采用浓硫酸同时去除蛋白质和脂肪，操作简单，耗时短，去除效率高。
(3)本发明采用简单的硅胶柱净化，净化效果好，操作简单。
附图说明
图1为血清中SCCPs的总离子流图。
图2为血清中SCCPs的24个提取离子色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明使用的硅胶柱中：
2％碱性硅胶的制备：配制50g/L的氢氧化钾溶液(称5g氢氧化钾加入100mL蒸馏水)，充分溶解。取40mL 50g/L氢氧化钾溶液加入100g硅胶(平底烧瓶中)，充分震荡直到瓶底无吸附，硅胶中无结块为止。使用旋转蒸发器在50℃条件下蒸除大部分水后，将温度从50℃提高到80℃，脱水1h即可使用。
活性硅胶制备：硅胶(63-100μm，Sunchrom，德国)，在马弗炉中550-650℃焙烧4-12h，干燥器中冷却备用。
44％酸化硅胶的制备方法为：将200g活性硅胶和157g浓硫酸放于棕色瓶内，充分震荡2–3h，置于干燥器中保存。
实施例1
将全血离心后，分离出血清，称取1g血清，置于10mL玻璃离心管，加入1mL优级纯浓硫酸，待其反应完全(除去蛋白质和脂肪)并冷却；加入1mL DCM，涡旋(XW-80A，2800rpm)5min，以2000rpm离心10min，上清液转移至250mL平底烧瓶。重复三次，提取液浓缩至约1mL；装填硅胶柱由下至上：5g无水硫酸钠，2g 2％碱性硅胶，2g活性硅胶，5g酸化硅胶，10g无水硫酸钠，上样后弃去30mL Hex洗脱液，再接50mL Hex/DCM(1:1，v/v)和50mL Hex/DCM(1:2，v/v)洗脱液；将100mL洗脱液浓缩至约1mL后氮气吹至近干，用20μL 50ppb 13C-α-HCH定容后用HRGC-ECNI-LRMS进行分析。计算结果短链氯化石蜡的浓度结果为83.2ng每克血清。
实施例2
将全血离心后，分离出血清，称取1g血清，置于10mL玻璃离心管，加入1mL优级纯浓硫酸，待其反应完全并冷却；加入1mL hex，涡旋(XW-80A，2800rpm)5min，以2000rpm离心10min，上清液转移至250mL平底烧瓶。重复三次，提取液浓缩至约1mL；装填硅胶柱由下至上：5g无水硫酸钠，2g 2％碱性硅胶，2g活性硅胶，5g酸化硅胶，10g无水硫酸钠，上样后弃去30mL Hex洗脱液，再接50mL Hex/DCM(1:1，v/v)和50mL Hex/DCM(1:2，v/v)洗脱液；将100mL洗脱液浓缩至约1mL后氮气吹至近干，用20μL 50ppb 13C-α-HCH定容后用HRGC-ECNI-LRMS进行分析。计算结果短链氯化石蜡的浓度结果为40.7ng每克血清。
实施例3
将全血离心后，分离出血清，称取3g血清，置于50mL玻璃离心管，加入4mL优级纯浓硫酸，待其反应完全并冷却；加入10mL Hex/DCM(1/1,v/v)，涡旋(XW-80A，2800rpm)5min，以4000rpm离心10min，上清液转移至250mL平底烧瓶。重复三次，提取液浓缩至约2mL；装填硅胶柱由下至上：5g无水硫酸钠，2g 2％碱性硅胶，2g活性硅胶，5g酸化硅胶，10g无水硫酸钠，上样后洗脱液为50mL Hex，该组分为弃液，80mL Hex/DCM(1:1，v/v)，这一组分含有SCCPs，接流出液；将含有SCCPs的流出液浓缩至约1mL后氮气吹至近干，用10μL 50ppb 13C-α-HCH定容后用HRGC-ECNI-LRMS进行分析。计算结果短链氯化石蜡的浓度结果为31.3ng每克血清。
实施例4
将全血离心后，分离出血清，称取3g血清，置于50mL玻璃离心管，加入4mL优级纯浓硫酸，待其反应完全并冷却；加入10mL Hex/DCM(1/1,v/v)，涡旋(XW-80A，2800rpm)2min，以5000rpm离心5min，上清液转移至250mL平底烧瓶。重复三次，提取液浓缩至约2mL；装填硅胶柱由下至上：5g无水硫酸钠，2g 2％碱性硅胶，2g活性硅胶，5g酸化硅胶，10g无水硫酸钠，上样后弃去50mL Hex洗脱液，再接80mL Hex/DCM(1:1，v/v)洗脱液；将80mL洗脱液浓缩至约1mL后氮气吹至近干，用10μL 50ppb 13C-α-HCH定容后用HRGC-ECNI-LRMS进行分析。计算结果短链氯化石蜡的浓度结果为27.6ng每克血清。
注：实施例1、2为不同个体血清；实施例2、3为相同混合血清。
实施例5
加标回收实验
向提取六次的血清中加入10μL氯含量为55.5％的SCCPs标样后，静置36h,加入10mL Hex/DCM(1/1,v/v)，涡旋(XW-80A，2800rpm)5min，以5000rpm离心5min，上清液转移至250mL平底烧瓶。重复三次，提取液浓缩至约2mL；装填硅胶柱由下至上：5g无水硫酸钠，2g2％碱性硅胶，2g活性硅胶，5g酸化硅胶，10g无水硫酸钠，上样后弃去50mL Hex洗脱液，再接80mL Hex/DCM(1:1，v/v)洗脱液；将80mL洗脱液浓缩至约1mL后氮气吹至近干，用10μL50ppb 13C-α-HCH定容后用HRGC-ECNI-LRMS进行分析。平行6次，计算短链氯化石蜡的回收率为94～105％。
应用例1-50
表格中血清均为个体样品，来自大连市某医院。
将全血离心后，分离出血清，称取0.89-2.01g血清，置于50mL玻璃离心管，加入2mL优级纯浓硫酸，待其反应完全并冷却；加入10mL Hex/DCM(1/1,v/v)，涡旋(XW-80A，2800rpm)5min，以5000rpm离心5min，上清液转移至250mL平底烧瓶。重复三次，提取液浓缩至约2mL；装填硅胶柱由下至上：5g无水硫酸钠，2g 2％碱性硅胶，2g活性硅胶，5g酸化硅胶，10g无水硫酸钠，上样后弃去50mL Hex洗脱液，再接80mL Hex/DCM(1:1，v/v)洗脱液；将80mL洗脱液浓缩至约1mL后氮气吹至近干，用10μL 50ppb 13C-α-HCH定容后用HRGC-ECNI-LRMS进行分析。测得血清中SCCPs的浓度范围为10.57-199.45ng/g，平均值为30.95ng/g。
表1血清称样量及其SCCPs含量

Claims (10)

1.一种血清中短链氯化石蜡的提取净化方法，其特征在于：
包括以下步骤：
1)样品提取：向血清中加入浓硫酸，再加入正己烷和/或二氯甲烷涡旋震荡，离心，获得上清提取液；
2)样品净化：采用多层硅胶柱对提取液进行净化，先用组分1正己烷洗脱，再用正己烷：二氯甲烷体积比为4:1～1:2的组分2洗脱，组分1洗脱后的滤液为含杂质的弃液，组分2洗脱后的流出液含有短链氯化石蜡；
多层硅胶柱中填料由下至上为：无水硫酸钠，碱性硅胶，活性硅胶，酸化硅胶，无水硫酸钠；
3)将含有短链氯化石蜡的流出液浓缩后氮气吹至近干，获得物中为血清中的短链氯化石蜡。
2.根据权利要求1所述的提取净化方法，其特征在于：
使用气相色谱-电子捕获负化学源/低分辨质谱对血清提取净化得到的获得物进行定性定量分析。
3.根据权利要求2所述的提取净化方法，其特征在于：
血清提取净化得到的获得物用进样内标定容后待分析，进样内标为13C-α-HCH，浓度为50～100ppb，定容体积为10～20μL。
4.根据权利要求1所述的提取净化方法，其特征在于：步骤1)中所述血清与浓硫酸的体积比为1:1～1:2，浓硫酸为质量分数大于或等于70％的硫酸溶液，优选为优级纯。
5.根据权利要求1所述的提取净化方法，其特征在于：步骤1)中所述的正己烷与二氯甲烷的体积比为1:0～0:1。
6.根据权利要求1所述的提取净化方法，其特征在于：步骤1)中涡旋转速为1500-2800rpm，涡旋时间为2～10min；
步骤1)中离心转速为2000～5000rpm，离心时间为5～10min。
7.根据权利要求1所述的提取净化方法，其特征在于：所述血清来自人体。
8.根据权利要求1所述的提取净化方法，其特征在于：步骤2)中硅胶柱填料由下至上，无水硫酸钠：碱性硅胶：活性硅胶：酸化硅胶：无水硫酸钠的质量比为5：2～3：1～2：3～5：6～10。
9.根据权利要求8所述的提取净化方法，其特征在于：
所述碱性硅胶为含有KOH质量分数为2％的硅胶；碱性硅胶由活性硅胶与KOH水溶液完全混合后除去水制备而成；
活性硅胶由硅胶在550-650℃下高温焙烧4-12h制备而成；
酸化硅胶为含有硫酸质量分数为22-44％的硅胶；酸化硅胶由活性硅胶与浓硫酸混合震荡2～3h制备而成。
10.根据权利要求9所述的提取净化方法，其特征在于：所述硅胶的粒径为63-100μm。
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