CN108732269B - 一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法，步骤包括：1)取他汀侧链及其异构加入溶剂配置系统适用性溶液；2)取待测他汀侧链样品加入溶剂稀释配置供试品溶液；3)取所述系统适用性溶液和所述供试品溶液注入气相色谱仪中，记录谱图；所述待测样品为

其中R₁为CH₂OH，CHO，CN，CH₂CH₂NH₂，CH₂CH₂Cl中的一种；R₂为C₁‑C₄烷基中的一种；R₃为C₁‑C₄烷基中的一种；R₄为C₁‑C₄烷基中的一种。本发明提供的一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法，能有效分离检测他汀侧链及其异构体，灵敏度高准，准确、快速。

Description

一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法。

背景技术

他汀类药物即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂，其本身或代谢物结构与HMG-CoA相似，因此可于胆固醇合成的早期阶段竞争性的抑制HMG-CoA还原酶的活性，而他汀类药物对此酶的亲和力比HMG-CoA强10000倍，从而使内源性胆固醇的合成减少，降低血浆中总胆固醇的水平。肝脏是内源性胆固醇合成的主要场所，由于肝细胞合成胆固醇减少而阻碍了极低密度脂蛋白的合成和释放；同时，通过自身调节机制，代偿性的增加了肝细胞膜上低密度脂蛋白受体的数目、活性以及与低密度脂蛋白的亲和力，使血浆中大量的低密度脂蛋白被摄取，经代谢排出体外，进一步降低了血浆低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平。大量临床证据表明他汀类药物可大幅度降血脂，采用他汀类药物治疗临床获益显著：(1)减少主要冠脉事件；(2)减少冠心病死亡率；(3)减少PCI/CABG需求；(4)减少中风；(5)减少总死亡率。

自从1976年第一个他汀类药物——美伐他汀在霉菌培养液中被分离，他汀类药物已发展至第三代。第一代用发酵法得到，包括洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀；第二代为人工合成的消旋体，代表药物为氟伐他汀；第三代为人工合成的对映体，有阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等。他汀类药物的结构可分为3个部分：一个与酶的底物HMG-CoA中HMG结构类似的的β，δ-二羟基戊酸结构，即侧链；一个与酶变构后产生的疏水性浅沟相结合的疏水性刚性平面结构，即主环；以及两者之间的连接部分。

他汀的合成一般采用主环加侧链的对接汇聚合成路线，CN102311376A公开了一种阿托伐他汀钙的制备工艺，第一步，在正庚烷、四氢呋喃、甲苯组成的混合溶剂中先加入(4R-cis)-6-氨乙基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯与特戊酸反应；第二步，再加入4-氟-α-[2-甲基-1-氧丙基]-γ-氧代-N,β-二苯基苯丁酰胺，升温反应。CN1687087公开了瑞舒伐他汀及其中间体的制备方法，该方法通过将侧链醛化合物与三苯基磷叶里德试剂化合物进行关键的缩合反应，高产率地制备得到瑞舒伐他汀化合物。因此，侧链的构型直接影响成品的构型。侧链的合成方法在专利文献中被公开，CN1876644A公开了一种(4R-cis)-6-甲酰基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-乙酸叔丁酯的合成方法；CN102180862A公开了一种(4R-cis)-6-取代-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的制备方法；CN105132477A公开了一种(4R-cis)-6-氯甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸异丙酯的制备方法；CN105503816A公开了一种固体(4R-cis)-6-甲酰基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-乙酸叔丁酯的制备方法。但是如何对侧链的异构体构型进行分离检测，尚无报道。

侧链常用作瑞舒伐他汀

匹伐他汀

氟伐他汀

等的起始原料，起始原料有四种异构体，分别是

通常Ia构型作为起始原料，为他汀合成中侧链所需要的构型，Ib与Ia互为对映异构体，Ic与Id为Ia的差向异构体，其余三种一般认为是杂质。侧链中的杂质直接影响最终成品原料的对映异构体和差向异构体的杂质，有必要对其控制，首先需要灵敏准确的分析方法。根据其结构式可知这四种材料为醇，四种异构体在紫外检测器上响应很低，难以检测，所以需要一种能够检测他汀侧链及其对映异构体的方法。

发明内容

本发明的所要解决的技术问题在于分离了检测他汀侧链及其异构体，对于他汀侧链中异构体能够有效地检测与控制。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题的：

一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法，步骤包括：1)取他汀侧链及其对映异构加入溶剂配置系统适用性溶液；2)取待测样品加入溶剂稀释配置供试品溶液；3)取所述系统适用性溶液和所述供试品溶液注入气相色谱仪中，记录谱图；

所述待测样品为

其中R₁为CH₂OH，CHO，CN，CH₂CH₂NH₂，CH₂CH₂Cl中的一种；R₂为C₁-C₄烷基中的一种；R₃为C₁-C₄烷基中的一种；R₄为C₁-C₄烷基中的一种；所述异构体包括对映异构体和/或差向异构体。

进一步地，所述系统适用性溶液中异构体的浓度为供试液浓度的0.05％～5％。异构体的浓度仅用于峰识别和计算，最低浓度不低于检测限约为8.63μg/ml，约为供试液浓度的0.06％；最高浓度无上限，为了计算准确性，一般不大于供试液浓度的5％，优选为供试液浓度的1％。

进一步地，所述供试品溶液浓度不小于10mg/ml，优选不低于15mg/ml。样品浓度越大，检测限越低，方法越灵敏。

进一步地，所述溶剂为二氯甲烷。

进一步地，所述气相色谱仪溶液进样量体积为0.5-2μl。进样体积可以影响检测限，体积越大，检测限越低，方法越灵敏。

进一步地，所述气相色谱仪中色谱柱固定液为25-35％七-(2,3-二-O-甲基-6-O-特丁基二甲基硅基)-β-环糊精毛细管柱。

进一步地，所述气相色谱仪检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，所述气相色谱仪柱温为135-155℃，FID温度为220-240℃，分流进样器(SPL)温度为220-240℃。

进一步地，所述气相色谱仪柱温为145℃，检测器温度为230℃，分流进样器温度为230℃。

进一步地，所述气相色谱仪柱流速为1.3-2.0ml/min。流速增加后，系统适用性分离度下降，无法达到分离检测目的。

进一步地，所述气相色谱仪分流比为35-45:1。

特别的，所述方法，1)取他汀侧链及其异构加入溶剂二氯甲烷配置系统适用性溶液，其中对映异构浓度0.5mg/ml；2)取待测他汀侧链样品加入溶剂二氯甲烷稀释配置供试品溶液，供试品溶液浓度15mg/ml；3)取所述系统适用性溶液和所述供试品溶液注入气相色谱仪中，记录谱图；所述待测样品为

其中R₁为CH₂OH；R₂为CH₃；R₃为CH₃；R₄为C(CH₃)₃；其中所述气相色谱仪的运行色谱条件为：色谱柱为固定液为30％七-(2,3-二-O-甲基-6-O-特丁基二甲基硅基)-β-环糊精毛细管柱，柱温145℃，载气为氮气，柱流速1.5ml/min，进样量为1.0μl，分流比为40：1，检测器为氢火焰离子化检测器，温度为230℃，分流进样器温度为230℃。

本发明的优点在于：

本发明提供的方法能有效分离检测他汀侧链及其对映异构体，灵敏度高准，准确、快速，可广泛用于他汀起始物料他汀侧链中对映异构体的检测与控制。还可同时检测他汀侧链的差向异构体。

附图说明

图1为本发明一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法实施例1专属性色谱对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

他汀侧链Ⅰ常用作瑞舒伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀等的起始原料，有四种异构体，结构如下，Ⅰa(起始原料)与Ⅰb互为对映异构体，Ⅰc与Ⅰd为Ⅰa的差向异构体，Ⅰa构型为他汀合成中侧链所需要的构型，其余三种一般认为是杂质。侧链中的杂质直接影响最终成品原料的对映异构体和差向异构体的杂质，有必要对其控制，首先需要灵敏准确的分析方法。根据其结构式，为醇，四种异构体在紫外检测器上响应很低，难以检测。

一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法,步骤包括：取系统适用性溶液和所述供试品溶液注入气相色谱仪中，记录谱图，进行分析。

1.优选的气相色谱条件

气相色谱仪：GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司)、AOC-20i自动进样器、GCsolution数据工作站。

色谱柱：固定液为30％七-(2,3-二-O-甲基-6-O-特丁基二甲基硅基)-β-环糊精毛细管柱(安捷伦CYCLOSIL-B，0.25mm×0.25μm×30m(手性柱))

2.优选的溶液制备方法

系统适用性溶液配置：取待测样品及其对映异构体Ⅰa、Ⅰb加二氯甲烷制成各0.5mg/ml的混合溶液；

供试品溶液配置：取待测样品适量，精密称定，以二氯甲烷为溶剂，加溶剂溶解并稀释制成15mg/ml的溶液。

3.他汀侧链待测样品为

其中R₁为CH₂OH；R₂为CH₃；R₃为CH₃；R₄为C(CH₃)₃；

此处需要说明的是，R₁不限于CH₂OH，还可以是CHO、CN、CH₂CH₂NH₂或CH₂CH₂Cl；R₂不限于CH₃，还可以是C₂-C₄烷基中的一种；R₃不限于CH₃，还可以是C₂-C₄烷基中的一种；R₄不限于C(CH₃)₃，还可以是C₁-C₃烷基中的一种或C₄烷基的其他结构。

对上述优选方法(如无另行说明，采用上述色谱条件)进行验证。

1)物质峰确认

取上述待测样品的四种异构体Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd配置定位溶液：

对映异构体Ⅰb(3S,5R)定位溶液：称取对映异构体Ⅰb(3S,5R)2.65mg，置进样小瓶中，加入1.5ml二氯甲烷，振摇使溶解，摇匀，即得；

差向异构体Ⅰc(3S,5S)定位溶液：称取差向异构体Ⅰc(3S,5S)3.93mg，置进样小瓶中，加入1.5ml二氯甲烷，振摇使溶解，摇匀，即得；

差向异构体Ⅰd(3R,5R)定位溶液：称取差向异构体Ⅰd(3R,5R)3.17mg，置进样小瓶中，加入1.5ml二氯甲烷，振摇使溶解，摇匀，即得；

他汀侧链待测样品Ⅰa(3R,5S)定位溶液：精密称取待测样品(3R,5S)20.66mg，置进样小瓶中，加入1.5ml二氯甲烷，振摇使溶解，摇匀，即得。

分别取四组1.0μl定位溶液注入气相色谱仪中，记录各组分的保留时间；

测试得到的各组分的保留时间如下表所示：

组分名称	Ⅰc(3S,5S)	Ⅰd(3R,5R)	Ⅰa(3R,5S)	Ⅰb(3S,5R)
					保留时间	28.643min	29.047min	31.237min	32.504min

由上述数据可知，Ⅰa与Ⅰb分离良好，且与Ⅰa、Ⅰd分离良好；而Ⅰc与Ⅰd之间有所重叠，即差向异构体将不能分离，后期二者之和作为比对，以一种构型替代研究。综合表明，优选色谱条件不仅可以同时分离检测侧链及其对映异构体，还可以同时分离检测其差向异构体(两种混合)，即a、Ⅰb、(Ⅰd和Ⅰd)可分离。其中Ⅰa与Ⅰb分离度可作为合适的系统评价指标，两者分离度应不小于1.5。

2)专属性测试

溶液配制：称取对映异构体Ⅰc(3S,5R)6.90mg，置10ml量瓶中，以二氯甲烷为溶剂，溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质母液；精密称取待测样品154.93mg，置10ml量瓶中，精密量取杂质母液5.0ml，置同一量瓶中，加溶剂适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即混合溶液。

试验方法：共用色谱定位的图谱，另取空白溶剂和混合溶液，分别注入气相色谱仪。试验结果如图1所示，其中，峰标号为4、3、1、2对应Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd四种构型。

由图1可知：空白溶剂无干扰；主成分与相邻组分间满足基线分离，对映异构体与相邻组分间满足基线分离。综上，表明专属性良好。

3)检测限

试验方法：精密称取差向异构体Ⅰb(3S,5S)5.05mg、Ⅰb对映异构体(3S,5R)6.90mg和待测样品Ⅰa28.81mg，分别置10ml量瓶中，以二氯甲烷为溶剂，溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液；逐级稀释，量取1.0μl注入气相色谱仪，以S/N≥3为检测限。得到物质检测限结果如下表所示：

由表可知：

(1)待测样品检测限浓度为7.20μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.05％；

(2)对映异构体检测限浓度为8.63μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.06％；

(3)差向异构体检测限浓度为11.35μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.08％；

(4)供试品溶液浓度为15mg/ml时，对映异构体、差向异构体的检出限均低于0.1％。

4)溶液稳定性

精密称取待测样品153.20mg，置10ml量瓶中，以二氯甲烷为溶剂，溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。将供试品溶液分别于0h、1h、2h、4h、6h和12h注入气相色谱仪，考察溶液稳定性。试验结果如下表：

由表可知，供试品溶液在12h内无新杂质产生，差向异构体与对映异构体均未检出，样品中单个杂质的RSD为2.54％，总杂质的RSD位1.80％，均小于5.0％，主成分色谱纯度RSD为0.01％，小于2.0％。综上，表明在12h内溶液稳定性良好。

5)耐用性

由于Ⅰa、Ⅰd分离良好，Ⅰc、Ⅰd难以分离，因此以Ⅰa、Ⅰb的分离度作为指标评价色谱条件耐用性，对上述色谱条件的某些参数(柱温、流速等)进行单因素改变，其余参数不变，采用专属性中混合溶液进样分析。结果如下

色谱条件变化	Ⅰa与Ⅰb分离度
		柱温135℃	3.0
柱温155℃	1.5
		流速1.3ml/min	1.8
流速1.5ml/min	2.0
		流速2.0ml/min	1.5

表明柱温在135～155℃范围内，该色谱条件分离良好；在流速1.3～2.0ml/min范围内该色谱条件分离良好。

6)精密度

取待测样品约150mg，精密称定，置10ml量瓶中，以二氯甲烷为溶剂，溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；共配制6份供试品溶液。注入液相色谱仪，除溶剂峰外，按面积归一化法计算各杂质的量及主成分色谱纯度。精密度检测结果如下表所示：

由表可知，精密度良好。

本实施例的优选检测方法，经完整的方法学验证，验证项目包括专属性、检测限、精密度、耐用性、稳定性能指标，各指标均符合检验方法要求。不仅可以同时检测他汀侧链及其对映异构体，还可以同时检出他汀侧链的差向异构体。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (1)

1.一种同时检测他汀侧链及其异构体杂质的方法，其特征在于，步骤包括：1)取他汀侧链及其异构体加入溶剂二氯甲烷配制系统适用性溶液，其中对映异构体浓度0.5mg/ml；2)取待测他汀侧链样品加入溶剂二氯甲烷稀释配制供试品溶液，供试品溶液浓度15mg/ml；3)取所述系统适用性溶液和所述供试品溶液注入气相色谱仪中，记录谱图；所述待测他汀侧链样品为

其中R1为CHO，CN，CH₂CH₂NH₂，CH₂CH₂Cl中的一种；R2为C1-C4烷基中的一种；R3为C1-C4烷基中的一种；R4为C1-C4烷基中的一种，所述异构体包括对映异构体和差向异构体；其中所述气相色谱仪的运行色谱条件为：色谱柱为固定液为30％七-(2,3-二-O-甲基-6-O-特丁基二甲基硅基)-β-环糊精的毛细管柱，柱温145℃，载气为氮气，柱流速1.5ml/min，进样量为1.0μl，分流比为40：1，检测器为氢火焰离子化检测器，温度为230℃，分流进样器温度为230℃。

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