CN108727363A - 一种新型细胞周期蛋白依赖性激酶cdk9抑制剂 - Google Patents

一种新型细胞周期蛋白依赖性激酶cdk9抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞周期蛋白依赖性激酶CDK9的抑制剂，其具有式(I)的结构。本发明还提供使用该抑制剂治疗与CDK9活性相关的癌症或癌前病症的方法和用途。

Description

一种新型细胞周期蛋白依赖性激酶CDK9抑制剂
技术领域
本申请涉及作为细胞周期蛋白依赖性激酶CDK9的抑制剂的化合物、包含这些化合物的药物组合物、以及使用这些化合物或组合物抑制丝氨酸酸激酶活性的方法和用途。
背景技术
真核细胞的增殖分裂是一个精确而复杂的调控过程。增殖过程是通过细胞周期来完成的，细胞周期的有序进行是通过其严格的分子调控机制。目前已发现主要有三大类分子参与细胞周期调控：细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)、细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinaseinhibitors，CKI)，其中CDK处于中心地位。CDK家族已发现13个成员(CDK1-CDK13)，按其胞内功能不同分为两类：控制细胞周期的CDK和控制细胞转录的CDK。CDK9属于丝氨酸类激酶，它与对应细胞周期蛋白(cyclin)结合形成的复合物称为正性转录延长因子b(P-TEFb)，该复合物能够磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraseⅡ)和一些负性转录延长因子(NELF和N-TEF)从而使转录从起始部位得以延伸，是转录得以延长的核心分子(Sims RJ 3rd等GenesDev,2004,18:2437-68；Yamaguchi Y等Mol Cell Biol,2002,22:2918-27)。研究发现CDK9的表达水平或(和)激酶活性的异常会引起细胞内多种蛋白表达或(和)其mRNA水平异常。其中已经证实且与肿瘤密切相关的就有抗凋亡蛋白如Bcl-2、细胞周期相关调节蛋白如cyclin D1、p53途径相关蛋白、NF-κB途径的某些蛋白和以及与肿瘤微环境有关的蛋白如VEGF等。可以说CDK9是肿瘤发生发展过程中最关键分子之一(Shapiro GI.J Clin Oncol,2006,24:1770-83)。
发明内容
本发明涉及细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂。具体而言，本发明提供式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药：
其中Y选自对氟苯甲酰基、N任选被R3基团取代的trans-4-氨基环己基、和N任选被R3基团取代的trans-4-氨基环己基甲基；
Z选自NH、S和O；
R1选自氢和卤素；
R2选自氢、C1-C3烷基、C3-C6环烷基、任选被R4基团取代的C3-C6杂环烷基、和任选被R4基团取代的苯基；
R3选自C2-C6烷酰基和C1-C3烷氧基(C1-C3)烷基；
R4选自氰基和卤素。
本发明还提供一种药物组合物，其包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药，以及药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它治疗剂。
本发明还涉及式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药在制备用于治疗、预防或改善由丝氨酸激酶活性调节的或者受其影响的或者其中涉及细胞周期蛋白依赖性激酶活性的疾病、障碍或病症的药物中的用途。其中，该疾病、障碍或病症优选是癌症。
附图说明
图1a-1d示出化合物1在MV4-11(图1a)、OCI-AML-3(图1b)、HL-60(图1c)及NB4(图1d)细胞株中对细胞信号通路的影响；
图2a-2d示出化合物1在MV4-11(图2a)、OCI-AML-3(图2b)、HL-60(图2c)及NB4(图2d)细胞株中对细胞凋亡相关蛋白的影响；
图3a-3c示出化合物1在MV4-11(图3a)、HL-60(图3b)及NB4(图3c)细胞株中对细胞周期的影响。
图4a-4c示出化合物1在肿瘤小鼠模型中抑制肿瘤生长的实验结果，其中图4a显示皮下注入白血病细胞的小鼠的相对体重(以开始给药当天的体重作为基准来计算)随时间的变化；图4b显示小鼠荷载的肿瘤的大小随时间的变化；图4c显示最终计算出的各组的肿瘤抑制率(TGI)，图中显示的各个数据点的数值反映各个实验组的均值。
具体实施方式
术语
除非另外定义，所有本文使用的科技术语都具有与要求保护的主题所属领域的技术人员一般理解相同的含义。
除非另有说明，本发明采用本领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学等常规方法。除非提供具体的定义，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学等化学上相关的命名和实验室操作和技术，是本领域技术人员已知的。一般而言，前述技术和步骤可以通过本领域众所周知的和在各种一般文献和更具体文献中描述的常规方法来实施，这些文献在本说明书中被引用和讨论。
“烷基”是指脂肪族烃基团，可以是支链或直链的烷基。根据结构，烷基可以是单价基团或双价基团(即亚烷基)。在本发明中，烷基优选是具有1-6个碳原子的“低级烷基”，甚至更优选具有1-3个碳原子的“低级烷基”。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
“烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基如本文中定义。典型的烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。
术语“芳香基”是指平面环具有离域的π电子系统并且含有4n+2个π电子，其中n是整数。芳香基环可以由五、六、七、八、九或多于九个原子构成。芳香基可以是任选取代的。术语“芳香基”包括碳环芳基(例如苯基)和杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳香基”)基团(例如吡啶)。该术语包括单环或稠环多环(即共用相邻的碳原子对的环)基团。
本文使用的术语“芳基”是指芳香基环中每一个构成环的原子都是碳原子。芳基环可以由五、六、七、八、九或多于九个原子构成。芳基可以是任选取代的。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、菲基、蒽基、芴基和茚基。根据结构，芳基可以是单价基团或双价基团(即亚芳基)。
“烷基(芳基)”是指本文定义的烷基被本文定义的芳基取代。非限制性的烷基(芳基)包括苄基、苯乙基等。
术语“环烷基”是指单环或多环基，其仅含有碳和氢。环烷基包括具有3-10个环原子的基团。根据结构，环烷基可以是单价基团或双价基团(例如亚环烷基)。在本发明中，环烷基优选是具有3-8个碳原子的环烷基，更优选具有3-6个碳原子的“低级环烷基”。
“烷基(环烷基)”是指本文定义的烷基被本文定义的环烷基取代。非限制性的烷基(环烷基)包括环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。
术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
术语“卤代烷基”和“卤代烷氧基”包括烷基、或烷氧基的结构，其中至少一个氢被卤原子置换。在某些实施方式中，如果两个或更多氢原子被卤原子置换，所述卤原子彼此相同或不同。
本文使用的术语“氰基”是指式-CN基团。
术语“羰基”是由碳和氧两种原子通过双键连接而成的有机官能团(C＝O)。术语“烷酰基”或“烷基羰基”是指进一步被一个烷基取代的羰基。典型的烷酰基包括但不限于乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基等。
术语“氨基”是指基团-NH2。术语“烷基氨基”是指进一步被一个或两个烷基取代的氨基取代基，具体是指基团-NRR’，其中R和R’各自独立地选自氢或低级烷基，条件是-NRR’不是-NH2。术语“氨基烷基”是指进一步被一个或多个氨基取代的烷基取代基。术语“氰基烷基”是指进一步被一个或多个氰基取代的烷基取代基。本文使用的术语“杂烷基”是指本文定义的烷基中的一个或多个骨架链原子是杂原子，例如氧、氮、硫、硅、磷或它们的组合。所述杂原子(一个或多个)可以位于杂烷基内部的任意位置或在杂烷基与分子的其余部分相连的位置。
术语“杂芳基”是指芳基中包括一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子。含N“杂芳基”部分是指芳香基中环上至少有一个骨架原子是氮原子。根据结构，杂芳基可以是单价基团或双价基团(即亚杂芳基)。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基等。
本文使用的术语“杂环烷基”是指非芳香基环中一个或多个构成环的原子是选自氮、氧和硫的杂原子。杂环烷基环可以由三、四、五、六、七、八、九或多于九个原子构成。杂环烷基环可以是任选取代的。杂环烷基的实例包括但不限于内酰胺、内酯、环亚胶、环硫代亚胺、环氨基甲酸酯、四氢噻喃、4H-吡喃、四氢吡喃、哌啶、1,3-二噁英、1,3-二噁烷、1,4-二噁英、1,4-二噁烷、哌嗪、1,3-氧硫杂环己烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,4-氧硫杂环己烷、四氢-1,4-噻嗪、2H-1,2-噁嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、吗啉、三噁烷、六氢-1,3,5-三嗪、四氢噻吩、四氢呋喃、吡咯啉、吡咯烷、咪唑烷，吡咯烷酮、吡唑啉、吡唑烷、咪唑啉、咪唑烷、1,3-二氧杂环戊烯、1,3-二氧杂环戊烷、1,3-二硫杂环戊烯、1,3-二硫杂环戊烷、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷和1,3-氧硫杂环戊烷。根据结构，杂环烷基可以是单价基团或双价基团(即亚杂环烷基)。
术语“烷基(杂芳基)”是指本文定义的烷基被本文定义的杂芳基取代。
术语“烷基(杂环烷基)”是指本文定义的烷基被本文定义的杂环烷基取代。
术语“任选取代的”或“取代的”是指所提及的基团可以被一个或多个额外的基团取代，所述额外的基团各自并且独立地选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、羟基、烷氧基、氰基、卤素、酰胺基、硝基、卤代烷基、氨基、甲磺酰基等。
本文使用的GI50是指使50％细胞生长被抑制所需的药物浓度，即药物使50％细胞(如癌细胞)的生长得到抑制或控制时的药物浓度。
本文使用的IC50是指在测量某种效应的分析中获得最大效应的50％抑制时特定测试化合物的量、浓度或剂量。
本发明的CDK9激酶抑制剂
本发明涉及细胞周期蛋白依赖性激酶CDK9的抑制剂。具体而言，本发明涉及式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药：
其中Y选自对氟苯甲酰基、N任选被R3基团取代的trans-4-氨基环己基、和N任选被R3基团取代的trans-4-氨基环己基甲基；
Z选自NH、S、和O；
R1选自氢和卤素；
R2选自氢、C1-C3烷基、C3-C6环烷基、任选被R4基团取代的C3-C6杂环烷基、和任选被R4基团取代的苯基；
R3选自C2-C6烷酰基和C1-C3烷氧基(C1-C3)烷基；
R4选自氰基和卤素。
在某些优选的实施方式中，Y选自以下结构：
在优选的实施方式中，R1为氯。
在另外优选的实施方式中，R2选自氢、甲基、环丙基、环己基、任选被氰基取代的4-四氢吡喃基、和任选被氟取代的苯基。
在又一优选的实施方式中，R3选自乙酰基、2-甲氧基乙基、(R)-1-甲基-2-甲氧基乙基、和(S)-1-甲基-2-甲氧基乙基。
在本发明中，特别优选的化合物包括：
4-(((4-(5-氯-2-(((1R,4r)-4-(((R)-1-甲氧基丙基-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)四氢-2H-吡喃-4-甲腈；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺；
N-((1r,4r)-4-((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)乙酰胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己基-1,4-二胺；
(1S,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己基-1,4-二胺；
(1R,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺；
4-(2-((((1r,4r)-4-氨基环己基)甲基)氨基)-5-氯吡啶-4-基)-N-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻唑-2-胺；
N-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(甲基氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环己基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(4-(2-(苄氨基)噻唑-4-基)-5-氯吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((4-氟苄基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环丙基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
4-((4-(5-氯-2-(((1r,4r)-4-((2-甲氧基乙基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈；
4-(((4-(5-氯-2-(((1S,4r)-4-(((S)-1-甲氧基丙-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；和
(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)-N4-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺。
本发明的优选化合物的结构如下表所列。
尽管上表列出本发明的优选化合物的结构，但应该了解环己基上分别与对位氨基连接的两个碳原子并不是手性中心，和的化学键表示法仅为了表示与对位氨基连接的两个化学键相对于环己基基团呈反式结构，因此将这两个化学键和彼此交换而表示的化合物同样落在本发明的保护范围内。
本文描述的是新型的激酶抑制剂。本文也描述了此化合物的药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、药物活性代谢物和前药。
在另外的或进一步的实施方式中，将本文描述的化合物给予有需要的生物体后在其体内代谢产生代谢物，所产生的代谢物然后用于产生期望的效果，包括期望的治疗效果。
本文描述的化合物可以被制成和/或被用作药学可接受的盐。药学可接受的盐的类型包括但不限于：(1)酸加成盐，通过将化合物的游离碱形式与药学可接受的无机酸反应形成，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、偏磷酸等；或与有机酸反应形成，所述有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、反丁烯二酸、三氟乙酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、2-萘磺酸、叔丁基乙酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、水杨酸、羟基萘酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)碱加成盐，其在母体化合物中的酸性质子被金属离子置换时形成，例如碱金属离子(例如锂、钠、钾)、碱土金属离子(例如镁或钙)或铝离子；或与有机碱配位。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡萄糖胺，等等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。
药学可接受的盐的相应的平衡离子可以使用各种方法分析和鉴定，所述方法包括但不限于离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、电感耦合等离子体、原子吸收光谱、质谱或它们的任何组合。
使用以下技术的至少一种回收所述盐：过滤、用非溶剂沉淀接着过滤、溶剂蒸发、或水溶液的情况下使用冻干法。
筛选和表征药学可接受的盐、多晶型和/或溶剂化物可以使用多种技术完成，所述技术包括但不限于热分析、X射线衍射、光谱、显微镜方法、元素分析。使用的各种光谱技术包括但不限于拉曼(Raman)、FTIR、UVIS和NMR(液体和固体状态)。各种显微镜技术包括但不限于IR显微镜检术和拉曼显微镜检术。
本发明的药物组合物
本申请还提供药物组合物，其包含至少一种式(I)的化合物或所述化合物的药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、药物活性代谢物或前药，以及药学可接受的载体或赋形剂，以及者任选的其它治疗剂。
在治疗过程中，可以根据情况单独或与一种或多种其它的治疗剂组合使用。可以通过注射、口服、吸入、直肠和经皮施用中的至少一种将包含本发明化合物的药物施用给患者。
在本发明的实施方式中，在根据本发明对患者进行治疗时，给定药物的量取决于诸多因素，如具体的给药方案、疾病或病症类型及其严重性、需要治疗的受治疗者或宿主的独特性(例如体重)，但是，根据特定的周围情况，包括例如已采用的具体药物、给药途径、治疗的病症、以及治疗的受治疗者或宿主，施用剂量可由本领域已知的方法常规决定。通常，就成人治疗使用的剂量而言，施用剂量典型地在0.02-5000mg/天，例如约1-1500mg/天的范围。该所需剂量可以方便地被表现为一剂、或同时给药的(或在短时间内)或在适当的间隔的分剂量，例如每天二、三、四剂或更多分剂。本领域技术人员可以理解的是，尽管给出了上述剂量范围，但具体的有效量可根据患者的情况并结合医师诊断而适当调节。
本发明的药物的用途
式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药或者包含其的药物组合物可以用于抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinases，CDK)、细胞周期蛋白(cyclins)的活性尤其是CDK9的活性。式(I)所示化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药可用于治疗或者预防一种或多种选自下组的疾病：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌、神经胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、星形细胞瘤、尤因氏肉瘤、成视网膜细胞瘤、上皮细胞癌、结肠癌、肾癌、胃肠间质瘤、白血病、组织细胞性淋巴癌、和鼻咽癌。
更优选地，本申请所描述的式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药或者包含其的药物组合物可作为CDK9的抑制剂，其可以通过单独使用或者与其它治疗剂联合使用的方式用于治疗非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌、神经胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、星形细胞瘤、尤因氏肉瘤、成视网膜细胞瘤、上皮细胞癌、结肠癌、肾癌、胃肠间质瘤、白血病、组织细胞性淋巴癌、和鼻咽癌。
化合物的制备
使用本领域技术人员已知的标准合成技术或使用本领域已知的方法与本文描述的方法组合，可以合成式(I)的化合物。另外，本文给出的溶剂、温度和其它反应条件可以根据本领域技术而改变。作为进一步的指导，也可以利用以下的合成方法。
所述反应可以按顺序使用，以提供本文描述的化合物；或它们可以用于合成片段，所述片段通过本文描述的方法和/或本领域已知的方法随后加入。
在某些实施方式中，本文提供的是本文描述的丝氨酸激酶抑制剂化合物的制备方法及其使用方法。在某些实施方式中，本文描述的化合物可以使用以下合成的方案合成。可以使用与下述类似的方法，通过使用适当的可选择的起始原料，合成化合物。
用于合成本文描述的化合物的起始原料可以被合成或可以从商业来源获得。本文描述的化合物和其它相关具有不同取代基的化合物可以使用本领域技术人员已知的技术和原料合成。制备本文公开的化合物的一般方法可以来自本领域已知的反应，并且该反应可以通过由本领域技术人员所认为适当的试剂和条件修改，以引入本文提供的分子中的各种部分。
如果需要，反应产物可以使用常规技术分离和纯化，包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱等方法。这些产物可以使用常规方法表征，包括物理常数和图谱数据。
制备式(I)的化合物的合成方案的非限制性实施例如下描述。
实施例
以下具体的非限制性实施例将被解释为仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本公开。虽然无需进一步详细描述，但是可以相信本领域技术人员能基于本文的描述，完全利用本公开。
实施例1：4-(((4-(5-氯-2-(((1R,4r)-4-(((R)-1-甲氧基丙基-2-基)氨基)环己 基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)四氢-2H-吡喃-4-甲腈的合成
步骤一：5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶的合成
将5-氯-2-氟吡啶-4-硼酸(0.7g，4.46mmol)和频呐醇(0.63g，5.35mmol)加入甲苯50mL中，升温至120℃回流反应过夜，TLC显示剩余少量原料。反应液降至室温后浓缩，油泵抽干，得白色固体化合物5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶0.92g，收率80％，MS(ESI):m/z 258.1(M+H)+。
步骤二：(S)-1-甲氧基丙-2-基4-甲苯磺酰酯的合成
将60％的氢化钠NaH(6.52g，283mmol)加入到无水四氢呋喃THF(200mL)中，冰浴降温到0℃，氮气保护，滴加(S)-(+)-1-甲氧基-2-丙醇(21g，233mmol)，滴加完后升至室温搅拌1.5小时。反应液重新降温到0℃，滴加对甲苯磺酰氯(45.3g，283mmol)的四氢呋喃THF(200mL)溶液。加完后室温搅拌过夜。TLC显示原料反应完全。向反应液中加乙酸乙酯(500mL)稀释，冰浴冷却下滴加水(500mL)淬灭，分液，水相再用乙酸乙酯(200mL)萃取一次，合并有机相，水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤。以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得淡黄色油状物粗品43g，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)得(S)-1-甲氧基丙-2-基4-甲苯磺酰酯，淡黄色油状物37g，收率65.1％，MS(ESI):m/z 245.1(M+H)+。
步骤三：(1r,4R)-N1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
将(S)-1-甲氧基丙-2-基4-甲苯磺酰酯(5g，20.5mmol)和反式-1,4-环己二胺(5.84g，51.2mmol)加入50mL乙腈中，加热至90℃，反应过夜，TLC跟踪反应完全。将反应液冷却后过滤，滤液浓缩，残余物用二氯甲烷溶解，硅胶拌样柱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1)得浅黄色液体化合物(1r,4R)-N1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺2.5g，收率65％，MS(ESI):m/z 187.3(M+H)+。
步骤四：5-溴噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成
将5-溴噻唑-2-胺氢溴酸盐(105g，403mmol)悬浮在500mL四氢呋喃中，加入二甲基氨基吡啶(2.41g，20mmol)，形成白色浑浊，缓慢滴加二碳酸二叔丁酯(105.6g，484.6mmol)的四氢呋喃溶液，室温反应两天。反应液浓缩，再用二氯甲烷(300mL)溶解，硅胶拌样，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝10/1-6/1梯度洗脱)得5-溴噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯，类白色固体45g，收率40％，MS(ESI):m/z 278.98(M+H)+。
步骤五：4-溴噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成
将二异丙胺(64ml，446mmol)的200mL四氢呋喃溶液加入干燥三口瓶中，氮气保护，冷至0℃，滴加正丁基锂(2.5M，173ml，431.7mmol)，加毕反应1小时。于0℃滴加5-溴噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯的400mL四氢呋喃溶液，加毕反应2小时。TLC显示反应完全。0℃，缓慢滴加冰水(5mL)淬灭，搅拌30分钟，再加饱和氯化铵(500mL)水溶液，分液，水层用二氯甲烷(2×300mL)萃取，合并有机层，以饱和食盐水洗，以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用石油醚:乙酸乙酯＝30:1重结晶，的白色固体4-溴噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯31g，收率77.5％，MS(ESI):m/z 278.98(M+H)+。
步骤六：4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-碳酸甲酯的合成
将氰基乙酸甲酯(39.1g，395.3mmol)和2,2-二溴乙醚(100g，434.8mmol)加入600mL二甲基甲酰胺中，加入DBU(90g，593mmol)，加热到85℃反应3小时。TLC显示原料反应完全。过滤掉固体，固体加乙酸乙酯(2×300mL)洗涤，母液浓缩得褐色油状物，减压蒸馏，内温65-70℃接收馏分，为无色液体，放置析晶，得到白色固体4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-碳酸甲酯42g。收率62.8％，MS(ESI):m/z 178.2(M+H)+。
步骤七：4-(羟甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈的合成
将4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-碳酸甲酯(42g，248.4mmol)溶解在400ml乙二醇二甲醚和40ml甲醇中，冰浴冷却到0℃，分批加入硼氢化钠(11.1g，149mmol)，加完后自然升至室温搅拌16小时。TLC反应完全。反应液浓缩，加入甲醇再次浓缩淬灭多余的硼氢化钠，浓缩。柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)得4-(羟甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈，淡黄色油状物28g，收率：79.5％，MS(ESI):m/z 142.1(M+H)+。
步骤八：(4-溴噻唑-2-基)((4-氰基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将4-(羟甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈、4-溴噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯和三苯基磷加入无水四氢呋喃THF中，冷至0℃，滴加偶氮二甲酸二异丙酯DIAD。室温搅拌10分钟，升至40℃过夜，反应液浓缩，残余物加二氯甲烷溶解，硅胶拌样，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝50/1、30/1、20/1)得(4-溴噻唑-2-基)((4-氰基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，白色固体365mg，收率50％MS(ESI):m/z 402.1(M+H)+。
步骤九：(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶和碳酸钠加入二甲醚/H2O/二氧六环的混合液中，氮气置换体系两次，再加入(4-溴噻唑-2-基)((4-氰基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和四三苯基膦钯Pd(pph3)4，氮气置换体系三次，再升温到70℃，反应6小时，TLC显示只剩余一半原料，停止加热，处理反应。反应液降温到室温，加入乙酸乙酯，甲醇，过滤，用乙酸乙酯洗涤滤饼，滤液浓缩，残余物再用二氯甲烷溶解，加入饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加入硅胶拌样，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝30/1)得到(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，类白色泡沫状固体3.2g，收率为55％，MS(ESI):m/z 453.1(M+H)+。
步骤十：4-(((4-(5-氯-2-(((1R,4r)-4-(((R)-1-甲氧基丙-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)四氢-2H-吡喃-4-甲腈的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(3.2g，7.1mmol)、(1r,4R)-N1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺(3.9g，21.2mmol)和二异丙基乙胺DIPEA加入30mL二甲亚砜中，氮气保护，升温到100-110℃反应两天，TLC和LCMS跟踪反应，原料(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯已消失完全，有部分脱BOC后的中间体剩余，停止反应，反应液冷却后加乙酸乙酯(60mL)稀释，冰浴下加水(150mL)，分液，水层再用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，合并有机层，以饱和食盐水(100mL)洗，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。柱分离(乙腈/水/三氟乙酸＝80/20/0.001)，得产物4-(((4-(5-氯-2-(((1R,4r)-4-(((R)-1-甲氧基丙-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)四氢-2H-吡喃-4-甲腈，淡黄色固体700mg，收率：19.1％，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.38(s,1H),6.97(s,1H),5.92(brs,1H),4.45(d,J＝8.0Hz,1H),4.02(dd,J1＝2.8Hz,J2＝12Hz,2H),3.71-3.74(m,4H),3.54-3.56(m,1H),3.35(s,3H),3.21-3.25(m,2H),3.00-3.05(m,1H),2.50-2.60(m,1H),2.15(d,J＝9.6Hz,2H),2.04-2.07(m,1H),1.95(d,J＝12.8Hz,3H),1.74-1.82(m,3H),1.10-1.30(m,4H),1.00(d,J＝8.4Hz,3H),MS(ESI):m/z 519.3(M+H)+。
实施例2：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4- 基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：(4-溴噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将4-溴噻唑-2-氨基甲酸叔丁酯(12.53g，107.91mmol)、(四氢-2H-吡喃-4-基)甲醇(20g，71.94mmol)和三苯基磷加入360mL无水THF(重蒸)中，冷至-10℃，滴加偶氮二甲酸二异丙酯DIAD(21.82g，107.91mmol)。室温搅拌10分钟，升至50℃反应3h，TLC检测原料消失。反应液浓缩，残余物加二氯甲烷溶解，硅胶拌样，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝30/1、20/1)得(4-溴噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，白色固体21g，收率87.5％，MS(ESI):m/z 519.3(M+H)+。
步骤二：(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-溴噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(21g，1.51mmol)、5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(30g，3.0mmol)、Pd(dppf)Cl2(2.04g，0.151mmol)和Na2CO3(15g，3.78mmol)加入到500mL二氧六环和100mL水中，氮气保护，升温到90℃反应过夜，TLC和LC-MS跟踪反应，原料(4-溴噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯已消失完全，停止反应。反应液冷却后加水(100mL)，用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝30:1、25:1)，得产物(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，白色固体19.4g，收率：81.5％，MS(ESI):m/z 428.1(M+H)+。
步骤三：((1r,4r)-4-((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和(1r,4r)-(4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯加入DMSO中，加入二异丙基乙胺DIEA，升温到100℃，反应2天，TLC显示原料消失，停止加热，处理反应。反应液降温到室温，倒至冰水中，用二氯甲烷(3×200mL)萃取，加入饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，加入硅胶拌样，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝3/1、2:1、1:1)得((1r,4r)-4-((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯，淡黄色固体，3.6g，收率为40％，MS(ESI):m/z 522.2(M+H)+。
步骤四：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
将((1r,4r)-4-((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(2.9g,5.56mmol)加入四氢呋喃/二氯甲烷(20mL/20mL)中，氮气保护，冷至0℃，滴加20mL三氟乙酸，室温反应2h，TLC跟踪反应。反应液浓缩后，缓慢倒入冰水中，二氯甲烷萃取(3×30mL)，饱和食盐水洗，硫酸钠干燥，过滤、浓缩得粗品，用二氯甲烷:乙酸乙酯＝2:1打浆，过滤，抽干得白色固体状的(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺1.6g，收率：68％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.33(s,1H),6.96(s,1H),5.21-5.30(m,1H),4.32(d,J＝8.0Hz,1H)),3.99-4.03(m,2H),3.53-3.61(m,1H),3.38-3.44(m,2H),3.23(t,J＝6.4Hz,2H),2.68-2.74(m,1H),2.11-2.13(m,2H),1.85-2.13(m,3H),1.70-1.73(m,2H),1.10-1.45(m,7H)。MS(ESI):m/z 422.2(M+H)+。
实施例3：N-((1r,4r)-4-((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑- 4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)乙酰胺的合成
将(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(0.422g，1mmol)溶于二氯甲烷10mL中，氮气保护，滴加乙酰氯，析出大量固体，TLC检测原料基本反应完全。过滤，用甲基叔丁基醚打浆，抽干，得白色固体187mg，即为N-((1r,4r)-4-((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)乙酰胺，收率41％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.33(s,1H),6.96(s,1H),5.30-5.34(m,1H),5.20-5.30(m,1H),4.32(d,J＝8.0Hz,1H),3.99-4.03(m,2H),3.78-3.83(m,1H),3.62-3.64(m,1H),3.41(t,J＝12Hz,2H),3.24(t,J＝6.4Hz,1H),2.13-2.15(m,2H),2.00-2.09(m,2H),1.95(s,3H),1.70-1.73(m,2H),1.20-1.49(m,7H)。MS(ESI):m/z 464.1(M+H)+。
实施例4：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4- 基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己基-1,4-二胺的合成
将(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(0.357g，0.846mmol)、2-溴乙基甲基醚(0.118g，0.846mmol)和碳酸钾(0.116g，0.846mmol)加入10mL DMF中，氮气保护，升温到100℃反应两天，TLC和LCMS跟踪反应，停止反应后处理。反应液冷却后倒入冰水(20mL)，加入乙酸乙酯(3×20mL)萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。柱层析分离(二氯甲烷/甲醇＝20:1、15:1、10:1)，得产物(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己基-1,4-二胺，淡黄色固体0.070g，收率：17％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.33(s,1H),6.96(s,1H),5.65(brs,1H),4.40(d,J＝8.0Hz,1H),3.95-4.06(m,2H),3.49-3.70(m,3H),3.28-3.45(m,5H),3.18(t,J＝6.4Hz,1H),2.96-3.05(m,2H),2.76-2081(m,1H),2.14-2.28(m,6H),1.85-1.95(m,3H),1.70-1.73(m,2H),1.41-1.60(m,2H),1.13-1.40(m,5H)。MS(ESI):m/z 480.3(M+H)+。
实施例5：(1S,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4- 基)吡啶-2-基)-N4-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己基-1,4-二胺的合成
步骤一：(R)-1-甲氧基丙-2-醇4-甲基苯磺酸酯的合成
将氢化钠NaH(1.46g，0.037mmol)加入到无水四氢呋喃THF(1L)中，冰浴降温到0℃，氮气保护，滴加(R)-(-)-1-甲氧基丙-2-醇(3g，0.033mmol)，滴加完后升至室温搅拌1.5小时。反应液重新降温到0℃，滴加对甲苯磺酰氯TosCl(6.47g，0.034mmol)的四氢呋喃THF80mL溶液。滴加过程温度小于10℃。加完后于室温(32℃)搅拌过夜。TLC显示原料反应完全。冰浴冷却下滴加饱和氯化铵水溶液(20mL)淬灭，分液，水相再用乙酸乙酯(30mL)萃取两次，合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得淡黄色油状物粗品，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)得(R)-1-甲氧基丙-2-醇4-甲基苯磺酸酯，淡黄色油状物4.2g，收率52％，MS(ESI):m/z 245.1(M+H)+。
步骤二：(1S,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己基-1,4-二胺的合成
将将(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(600mg，1.2mmol)、(R)-1-甲氧基丙-2-醇4-甲基苯磺酸酯(293mg，1.42mmol)、碳酸钾(327mg，2.4mmol)加入到20mL乙腈中，氮气保护，升温至90℃搅拌过夜。LC-MS监控反应。反应液冷却至室温，过滤，浓缩得淡黄色油状物粗品，厚制备板分离(二氯甲烷/甲醇＝8/1)得(1S,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己基-1,4-二胺，白色固体30mg，收率4.3％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.29(s,1H),6.96(s,1H),5.59(brs,1H),4.36(d,J＝8.0Hz,1H),3.95-4.06(m,2H),3.49-3.65(m,2H),3.40-3.49(m,1H),3.22-3.39(m,6H),3.11-3.20(m,2H),2.95-3.10(m,1H),2.08-2.30(m,4H),1.79-1.96(m,2H),1.62-1.71(m,2H),1.09-1.40(m,12H),0.72-0.98(m,2H)。MS(ESI):m/z 494.3(M+H)+。
实施例6：(1R,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4- 基)吡啶-2-基)-N4-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：(S)-1-甲氧基丙-2-醇4-甲基苯磺酸酯的合成
将氢化钠NaH(60％，1.46g，0.037mol)加入到无水四氢呋喃THF(1L)中，冰浴降温到0℃，氮气保护，滴加(S)-(+)-1-甲氧基丙-2-醇(3g，0.033mol)，滴加完后升至室温搅拌1.5小时。反应液重新降温到0℃，滴加对甲苯磺酰氯TosCl的四氢呋喃THF溶液。滴加过程温度小于10℃。加完后于室温(32℃)搅拌过夜。TLC显示原料反应完全。冰浴冷却下滴加饱和氯化铵水溶液(20mL)淬灭，分液，水相再用乙酸乙酯(30mL)萃取两次，合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得淡黄色油状物粗品，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)得(S)-1-甲氧基丙-2-醇4-甲基苯磺酸酯，淡黄色油状物4.5g，收率55％。MS(ESI):m/z 245.1(M+H)+。
步骤二：(1R,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
将(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(422mg，1mmol)、(S)-1-甲氧基丙-2-醇4-甲基苯磺酸酯(122mg，0.5mmol)、碳酸钾(276mg，2mmol)加入到15mL乙腈中，氮气保护，升温至90℃搅拌过夜。LC-MS监控反应完成25％，反应液冷却至室温，过滤，浓缩得淡黄色油状物粗品，厚制备板分离(二氯甲烷/甲醇＝8/1)得(1R,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺，白色固体83mg，收率17％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.33(s,1H),6.96(s,1H),5.30(brs,1H),4.37(d,J＝8.0Hz,1H),3.99-4.03(m,2H),3.52-3.59(m,1H),3.25-3.49(m,4H),3.36(s,3H),3.16-3.25(m,2H),3.06-3.10(m,1H),2.60-2.65(m,1H),2.16(d,J＝10.8Hz,2H),2.00-2.08(m,2H),1.89-1.95(m,2H),1.33-1.45(m,4H),1.12-1.29(m,4H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H)。MS(ESI):m/z 494.2(M+H)+。
实施例7：4-(2-((((1r,4r)-4-氨基环己基)甲基)氨基)-5-氯吡啶-4-基)-N-((四 氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻唑-2-胺的合成
步骤一：((1r,4r)-4-(((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.7g，1.6mmol)、(1r,4r)-4-(氨基甲基)环己基氨基甲酸叔丁酯(0.748g，3.2mmol)、三乙胺(0.458g，4.8mmol)加入到二甲亚砜10mL中，加热至110℃，反应搅拌48小时，TLC监测原料消失。冷至室温，反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合并有机相，饱和食盐水洗，无水可硫酸钠干燥，过滤，浓缩。柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1、2:1)分离，为黄色固体状的((1r,4r)-4-(((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯，产率26％,MS(ESI):m/z 536.2(M+H)+。
步骤二：4-(2-((((1r,4r)-4-氨基环己基)甲基)氨基)-5-氯吡啶-4-基)-N-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻唑-2-胺的合成
将((1r,4r)-4-(((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)甲基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(230mg，0.43mmol)加入二氯甲烷10mL中，氮气保护，冷却至0℃，滴加三氟乙酸，室温反应1h，TLC跟踪反应。反应液浓缩后，缓慢倒入冰水中，二氯甲烷萃取(3×30mL)，饱和食盐水洗，硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，二氯甲烷:甲醇＝5:1厚制备板分离，得淡黄色油状的4-(2-((((1r,4r)-4-氨基环己基)甲基)氨基)-5-氯吡啶-4-基)-N-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻唑-2-胺0.065g，收率：34.8％。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.82(s,1H),7.11(s,1H),6.95(s,1H),3.84-3.88(m,2H),3.32(t,J＝11.2Hz,2H),3.16-3.17(m,2H),3.16(d,J＝6.8Hz,2H),3.04(d,J＝6.8Hz,2H),2.75-2.80(m,1H),1.81-1.92(m,5H),1.61-1.64(m,2H),1.49-1.51(m,1H),1.12-1.29(m,5H),0.92-1.05(m,2H)。MS(ESI):m/z 436.3(M+H)+。
实施例8：N-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2- 基)-4-氟苯甲酰胺的合成
将4-氟苯甲酰胺(0.65g,4.68mmol)溶于N,N二甲基甲酰胺DMF(15mL)，室温加入NaH(0.19g,4.68mmol)，反应液室温搅拌10min后，加入4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(1g,2.34mmol)，反应液升温至55℃反应4h，TLC监控，停止反应。反应液倒入水中，用EA萃取(3×20mL)，饱和食盐水洗，硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，PE:EA＝1:1厚制备板分离，得白色固体状的N-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺0.032g，收率：3.1％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.96(s,1H),8.52(s,1H),8.30(s,1H),7.93-7.96(m,2H),7.41(s,1H),7.19(t,J＝8.4Hz,2H),5.35-5.38(m,1H),4.00-4.04(m,2H),3.40-3.50(m,2H),3.24(t,J＝6.4Hz,2H),1.95-2.01(m,1H),1.72-1.76(m,2H),1.36-1.45(m,2H)。(ESI+):m/z 447.1[M+H]+。
实施例9：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(甲基氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲 氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：((1r,4r)-4-((2-甲氧基乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(1r,4r)-(4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯(10.0g，46.7mmol)、2-溴乙基甲基醚(5.2g，37.4mmol)和碳酸钾(12.9g,93.4mmol)加入乙腈(150mL)中，反应在80℃搅拌16小时。TLC监测反应，原料少量剩余，但停止反应。将反应液冷却至室温，过滤，滤液旋干，硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到黄白色固体状的((1r,4r)-4-((2-甲氧基乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯6.3g,产率：50％,MS(ESI):m/z 273.2(M+H)+。
步骤二：(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将((1r,4r)-4-((2-甲氧基乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(6g，22.0mmol)溶于稀盐酸-四氢呋喃(80mL)中,反应在室温搅拌2小时。有大量固体析出。将反应液过滤，滤饼干燥后得到白色固体(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(二盐酸盐)5.1g，产率：94.8％。MS(ESI):m/z 173.2(M+H)+。
步骤三：(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将4-溴噻唑-2-基氨基甲酸叔丁酯(20.0g，71.7mmol)、5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(37.0g，143.4mmol)、Pd(dppf)Cl2(2.6g,3.6mmol)和Na2CO3(22.8g,245mmol)溶于1,4-二氧六环/H2O(350mL/40mL)中，置换氮气3次，反应在90℃搅拌16小时。LCMS监测反应，原料有剩余，补加5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(18.5g，71.7mmol)，换氮气3次，反应继续在85℃搅拌18小时。LCMS监测反应，原料已有95％左右转化为产物。将反应液冷却至室温，过滤，滤液旋干，硅胶拌样，硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1)，得到白色固体状的(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯11.0g，产率：47％，另有粗产品10g。MS(ESI):m/z330.0(M+H)+。
步骤四：(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.61mmol)和三苯基膦(239mg，0.91mmol)溶于THF(4mL)，置换氮气3次，加入甲醇MeOH(78mg，2.43mmol)，室温搅拌1分钟后加入偶氮二甲酸二异丙酯DIAD(184mg，0.91mmol)，反应在室温搅拌2小时。TLC显示原料反应完毕。反应液制备-TLC层析，展开剂为石油醚/乙酸乙酯＝10:1，得到白色固体状的(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯205mg，收率：98％。MS(ESI):m/z 344.1(M+H)+。
步骤五：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(甲基氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将化合物(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.58mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(150mg，0.64mmol)、二异丙基乙胺DIEA(375mg，2.9mol)、氟化铯(265mg，1.74mmol)溶于二甲亚砜(3mL)中，反应在120℃搅拌2天。LCMS检测反应，有产物生成。向反应液中加入水(40mL)，用乙酸乙酯萃取(2×30mL)，萃取液用无水硫酸钠干燥，旋干后制备-TLC层析，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝6:1。得到产物(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(甲基氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺80mg，浅黄色固体，产率：35％、1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.97(s,1H),7.61-7.62(m,1H),7.29(s,1H),7.04(s,1H),6.70(d,J＝7.6Hz,1H),3.59-3.61(m,2H),3.37-3.42(m,3H),3.25(s,3H),2.87(d,J＝4.8Hz,2H),2.74-2.77(m,2H),1.90-1.96(m,4H),1.12-1.23(m,4H)。(ESI+):m/z396.2[M+H]+。
实施例10：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环己基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2- 基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(环己基甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.61mmol)和三苯基膦(239mg，0.91mmol)溶于THF(5mL)，置换氮气3次，加入环己基甲醇(207mg，1.82mmol)，室温搅拌5分钟后加入偶氮二甲酸二异丙酯DIAD(184mg，0.91mmol)，反应在室温搅拌2小时。TLC显示原料反应完毕，反应液制备-TLC层析，展开剂为石油醚/乙酸乙酯＝10:1，得到白色固体状的(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(环己基甲基)氨基甲酸叔丁酯255mg，收率：99％。(ESI+):m/z426.1[M+H]+。
步骤二：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环己基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(环己基甲基)氨基甲酸叔丁酯(250mg，0.59mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(288mg，1.17mmol)、二异丙基乙胺DIEA(379mg，2.93mol)，氟化铯(268mg，1.76mmol)溶于二甲亚砜(8mL)中，反应在120℃搅拌2天。LCMS检测反应，有产物生成。向反应液中加入水(30mL)，用二氯甲烷/异丙醇＝3:1萃取(2×30mL)，萃取液用食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干后硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50:1→20:1)，得到黄色油状的粗品，粗品用制备-TLC层析，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝8:1。得到产物(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环己基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺100mg，浅黄色固体，产率：30％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.97(s,1H),7.67-7.69(m,1H),7.25(s,1H),7.01(s,1H),6.71(d,J＝7.6Hz,1H),3.50-3.53(m,1H),3.36-3.47(m,2H),3.13(t,J＝6.0Hz,2H),2.94-2.97(m,2H),2.72-2.81(m,1H),1.99-2.02(m,4H),1.61-1.77(m,5H),1.19-1.33(m,7H),0.91-1.01(m,2H)。(ESI+):m/z 478.3[M+H]+。
实施例11：(1r,4r)-N1-(4-(2-(苄氨基)噻唑-4-基)-5-氯吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧 基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：苄基(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.61mmol)和三苯基膦(239mg，0.91mmol)溶于THF(5mL)，置换氮气3次，加入苄醇(131mg，1.21mmol)，室温搅拌5分钟后加入二异丙基乙胺DIAD(184mg，0.91mmol)，反应在室温搅拌2小时。TLC显示原料反应完毕。反应液制备-TLC层析，展开剂为石油醚/乙酸乙酯＝8:1，得到白色固体状的苄基(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯246mg，收率：97％。(ESI+):m/z420.1[M+H]+。
步骤二：(1r,4r)-N1-(4-(2-(苄氨基)噻唑-4-基)-5-氯吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将苄基(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(240mg，0.57mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(280mg，1.14mmol)、二异丙基乙胺DIEA(369mg，2.86mol)、氟化铯(268mg，1.71mmol)溶于二甲亚砜(8mL)中，反应在120℃搅拌3天。LCMS检测反应，有产物生成。向反应液中加入水(30mL)，用二氯甲烷/异丙醇＝3:1萃取(2×35mL)，萃取液用食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干后硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到黄色油状的粗品，粗品用制备-TLC层析，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝6:1。得到产物(1r,4r)-N1-(4-(2-(苄氨基)噻唑-4-基)-5-氯吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺100mg，浅黄色固体，产率：30％、1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.21(t,J＝6.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.26-7.40(m,6H),7.05(s,1H),6.72(d,J＝7.6Hz,1H),4.52(d,J＝5.6Hz,2H),3.46-3.53(m,4H),2.97(brs,2H),2.81(brs,1H),1.99-2.01(m,4H),1.18-1.34(m,4H)。(ESI+):m/z 472.1[M+H]+。
实施例12：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((4-氟苄基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)- N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(4-氟苄基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将化合物(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.61mmol)和三苯基膦(239mg，0.91mmol)溶于THF(5mL)，置换氮气3次，加入4-氟苄醇(153mg，1.21mmol)，室温搅拌5分钟后加入DIAD(184mg,0.91mmol)，反应在室温搅拌2小时。TLC显示原料反应完毕。反应液制备-TLC层析，展开剂为PE/EA＝10:1，得到浅黄色固体(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(4-氟苄基)氨基甲酸叔丁酯248mg，收率：93％。(ESI+):m/z 438.1[M+H]+。
步骤二：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((4-氟苄基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(4-氟苄基)氨基甲酸叔丁酯(240mg，0.55mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(268mg，1.10mmol)、二异丙基乙胺DIEA(353mg，2.74mol)、氟化铯(251mg，1.65mmol)溶于二甲亚砜/N,N-二甲基乙酰胺(3mL/3mL)中，反应在120℃搅拌3天。LCMS检测反应，有产物生成。向反应液中加入水(35mL)，用二氯甲烷/异丙醇＝3:1萃取(2×30mL)，萃取液用食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干后硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到黄色油状的粗品，粗品用制备-TLC层析，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝8:1。得到产物(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((4-氟苄基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺100mg，浅黄色固体，产率：30％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.22-8.24(m,1H),7.98(s,1H),7.41-7.44(m,2H),7.32(s,1H),7.18(t,J＝8.8Hz,2H),7.04(s,1H),6.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.50(d,J＝5.6Hz,2H),3.52-3.55(m,3H),3.29(s,3H),2.96(brs,2H),2.97(brs,1H),1.98-2.01(m,4H),1.21-1.23(m,4H)。(ESI+):m/z 490.2[M+H]+。
实施例13：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环丙基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2- 基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(环丙基甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基甲叔丁酸酯(200mg，0.61mmol)和三苯基膦(239mg，0.91mmol)溶于四氢呋喃(5mL)，置换氮气3次，加入环丙基甲醇(131mg，1.82mmol)，室温搅拌5分钟后加入偶氮二甲酸二异丙酯DIAD(184mg，0.91mmol)，反应在室温搅拌2小时。TLC显示原料反应完毕。反应液制备-TLC层析，展开剂为石油醚/乙酸乙酯＝10:1，得到黄白色固体状的(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(环丙基甲基)氨基甲酸叔丁酯230mg，收率：98％。(ESI+):m/z 384.1[M+H]+。
步骤二：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环丙基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)(环丙基甲基)氨基甲酸叔丁酯(220mg，0.57mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(280mg，1.15mmol)、二异丙基乙胺DIEA(370mg，2.86mol)，氟化铯(262mg，1.72mmol)溶于二甲亚砜/N,N-二甲基乙酰胺(3mL/3mL)中，反应在120℃搅拌2天。LCMS检测反应，有产物生成。向反应液中加入水(35mL)，用二氯甲烷/异丙醇＝3:1萃取(2×30mL)，萃取液用食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干后硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到黄色油状的粗品，粗品用制备-TLC层析，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝7:1。得到产物(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环丙基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺100mg，浅黄色固体，产率：35％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.97(s,1H),7.84(t,J＝5.6Hz,1H),7.28(s,1H),7.04(s,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,2H),3.52-3.55(m,3H),3.29(s,3H),3.17(t,J＝6.4Hz,2H),2.94(brs,1H),2.70-2.85(m,1H),1.97-2.01(m,4H),1.18-1.23(m,5H),0.46-0.49(m,2H),0.23-0.24(m,2H)。(ESI+):m/z 436.3[M+H]+。
实施例14：4-((4-(5-氯-2-(((1r,4r)-4-((2-甲氧基乙基)氨基)环己基)氨基)吡 啶-4-基)噻唑-2-基氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(250mg，0.55mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(270mg，1.10mmol)、二异丙基乙胺DIEA(355mg，2.75mol)、氟化铯(251mg,1.65mmol)溶于二甲亚砜/N,N-二甲基乙酰胺(3mL/3mL)中，反应在120℃搅拌3天。LCMS检测反应，有产物生成。向反应液中加入水(30mL)，用二氯甲烷/异丙醇＝3:1萃取(3×30mL)，萃取液用无水硫酸钠干燥，旋干后用硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到黄色固体的粗品，粗品用制备-TLC层析，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝5:1。得到产物4-((4-(5-氯-2-(((1r,4r)-4-((2-甲氧基乙基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈80mg，浅黄色固体，产率：28％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.13(t,J＝6.0Hz,1H),7.99(s,1H),7.35(s,1H),7.03(s,1H),6.71(d,J＝7.6Hz,1H),3.91-3.95(m,2H),3.67(d,J＝6.4Hz,2H),3.45-3.54(m,6H),3.30(s,3H),2.98(brs,2H),2.81(brs,1H),2.00-2.02(m,4H),1.86-1.89(m,2H),1.69-1.72(m,2H),1.19-1.32(m,5H)。(ESI+):m/z 505.3[M+H]+。
实施例15：4-(((4-(5-氯-2-(((1S,4r)-4-(((S)-1-甲氧基丙-2-基)氨基)环己 基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈的合成
步骤一：(1r,4S)-N1-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
将(R)-1-甲氧基丙-2-醇4-甲基苯磺酸酯(2.0g，8.2mmol)溶于乙腈(20mL)，加入trans-1,4-环己二胺(2.34g，20.5mmol)，反应在85℃搅拌回流16小时。TLC显示原料反应完全。将反应液冷却至室温，过滤，滤液旋干，硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇(含有0.1％的浓度为28％的氨水溶液)＝10:1)，得到黄色油状的(1r,4S)-N1-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺，600mg，产率：40％。(ESI+):m/z 187.2[M+H]+。
步骤二：4-(((4-(5-氯-2-(((1S,4r)-4-(((S)-1-甲氧基丙-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈的合成
将(4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)噻唑-2-基)((4-氰基-四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.44mmol)、(1r,4S)-N1-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺(200mg，1.08mmol)、二异丙基乙胺DIEA(284mg，2.9mol)，溶于二甲亚砜(2mL)中，反应在130℃搅拌2.5天。LCMS检测反应，有产物生成。向反应液中加入水(30mL)，用二氯甲烷/异丙醇＝3:1萃取(3×30mL)，萃取液用无水硫酸钠干燥，旋干后用硅胶拌样，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到棕色油状的粗品，粗品用制备-TLC层析，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝8:1。得到产物4-(((4-(5-氯-2-(((1S,4r)-4-(((S)-1-甲氧基丙-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈50mg，浅黄色固体，产率：22％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.12(t,J＝6.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.35(s,1H),7.03(s,1H),6.69(d,J＝8.0Hz,1H),3.91-3.95(m,2H),3.66(d,J＝6.4Hz,2H),3.55-3.65(m,1H),3.47-3.51(m,3H),3.29(s,3H),3.17(d,J＝4.8Hz,1H),1.86-1.99(m,6H),1.66-1.74(m,2H),0.99-1.26(m,8H)。(ESI+):m/z 519.3[M+H]+。
实施例16：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑-4-基) 吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：4-溴-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑的合成
将(四氢-2H-吡喃-4-基)甲醇(5.0g，20.8mmol)溶于50毫升四氢呋喃(50mL)中，加入NaH(996mg，24.9mmol)。室温下将混合物搅拌10分钟后，加入2,4-二溴噻唑(5.0g，20.8mmol)，然后室温搅拌过夜。向反应液中加入100毫升饱和氯化铵溶液后，加入乙酸乙酯萃取两次，每次50毫升。然后合并有机相并用无水硫酸钠干燥后旋干。残留物用柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝100:1)分离后得4.2g白色固体产物4-溴-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑。收率：73％。(ESI+):m/z 278.0[M+H]+。
步骤二：4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑的合成
将4-溴-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑(2.0g，7.22mmol)和5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(3.71g，14.44mmol)加入20毫升二氧六环和4毫升水的混合溶剂中，再加入Pd(dppf)Cl2(161mg，0.22mmol)和Na2CO3(2.3g，21.66mmol)。氮气保护下，将混合物加热到80℃，搅拌过夜。向反应液中加入50毫升水后，加入乙酸乙酯萃取两次，每次50毫升。然后合并有机相并用无水硫酸钠干燥后旋干。残留物用柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝30：1)分离后得1.45g白色固体产物4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑。收率：61.2％。(ESI+):m/z 329.1[M+H]+。
步骤三：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑(300mg，0.915mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(245mg，1.006mmol)和K2CO3(104mg，2.745mmol)加入5毫升DMSO中。然后，在搅拌下将混合物加热到100℃，反应48小时。LCMS监测反应，原料大部分反应完。将反应液冷却至室温后加入50毫升水。然后加入乙酸乙酯萃取两次，每次10毫升。合并有机相并用无水硫酸钠干燥后旋干。所得粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)分离。最终得111.0mg淡棕色固体产物(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺。收率：25.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07(s,1H),7.50(s,1H),6.95(s,1H),4.39(d,J＝8.0Hz,1H),4.31(d,J＝6.4Hz,2H),4.03(dd,J1＝3.2Hz,J2＝11.2Hz,2H),3.59-3.61(m,1H),3.54(t,J＝4.8Hz,2H),3.44-3.47(m,2H),3.37(s,3H),2.85(t,J＝5.2Hz,2H),2.53-2.54(m,1H),2.15-2.18(m,3H),2.00-2.03(m,2H),1.73-1.76(m,2H),1.46-1.52(m,2H),1.15-1.37(m,5H)。(ESI+):m/z 481.2[M+H]+。
实施例17：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑-4- 基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：4-(溴甲基)-四氢-2H-吡喃的合成
将(四氢-2H-吡喃-4-基)甲醇(8.12g，10mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺NBS(13.71g，2448mmol)加入400mL二氯甲烷中，冷却至0℃，分批缓慢加入三苯基磷。室温搅拌1-2小时，TLC检测原料消失。反应液倒入水(100mL)中，用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，硫酸钠干燥，柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝20/1)得4-(溴甲基)-四氢-2H-吡喃，无色液体6.2g，收率49％。(ESI+):m/z 179.0[M+H]+。
步骤二：硫代乙酸-S-(四氢-2H-吡喃-4-基)甲酯的合成
将4-(溴甲基)-四氢-2H-吡喃和硫代乙酸钾加入60mL DMF中，升温到90℃，反应2小时，TLC显示原料消失，停止加热，处理反应。反应液降到室温，倒至冰水中，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，加入饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，加入硅胶拌样，柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝30/1、20:1、10:1)得硫代乙酸-S-(四氢-2H-吡喃-4-基)甲酯，黄色液体，1.8g，收率为69％。(ESI+):m/z 175.1[M+H]+。
步骤三：(四氢-2H-吡喃-4-基)甲硫醇的合成
将硫代乙酸-S-(四氢-2H-吡喃-4-基)甲酯加入THF中，氮气保护，冷却至0℃，分批缓慢加入氢化铝锂，室温反应过夜，TLC跟踪反应。反应液加四氢呋喃(50mL)稀释，分批缓慢加入适量十水合硫酸钠，搅拌10分钟，过滤，浓缩，得粗品(四氢-2H-吡喃-4-基)甲硫醇，为黄色油状物0.68g，收率：100％。(ESI+):m/z 133.1[M+H]+。
步骤四：4-溴-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑的合成
将(四氢-2H-吡喃-4-基)甲硫醇(0.632g，4.8mmol)溶于四氢呋喃THF中，氮气保护，冷却至0℃，分批缓慢加入氢化钠NaH(0.2g，4.8mmol)，室温反应10min，滴加2,4-二溴噻唑的30mL四氢呋喃THF溶液，室温反应过夜。TLC检测基本反应完全，停止反应。反应液倒入饱和氯化铵中淬灭，加乙酸乙酯萃取(3×30mL)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝25:1、20:1)，得产物4-溴-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑，类白色固体0.7g，收率：60％。(ESI+):m/z 294.0[M+H]+。
步骤五：4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑的合成
将4-溴-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑(0.45g,1.512mmol)、5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(0.788g,3.0mmol)、四三苯基膦钯Pd(PPh3)4(0.18g,0.151mmol)和碳酸钠(0.405g,3.78mmol)加入到20mL二氧六环和4mL水中，氮气保护，升温到90℃反应过夜，TLC和LCMS跟踪反应，原料已消失完全，停止反应。反应液冷却后加水(80mL)，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝30:1、25:1)，得产物4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑，黄色油状物0.27g，收率：42％。(ESI+):m/z 345.0[M+H]+。
步骤六：(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺的合成
将4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑(0.27g，0.756mmol)、(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺(0.203g，0.831mmol)和碳酸钾(0.313g，2.268mmol)加入二甲亚砜中，氮气保护，升温到100℃反应两天，TLC和LCMS跟踪反应，原料4-(5-氯-2-氟吡啶-4-基)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑仍有剩余，停止反应。反应液冷却后加乙酸乙酯(20mL)稀释，冰浴下加水(800mL)，分液，水层再用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。层析分离(二氯甲烷/甲醇＝15:1)，得产物(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺，黄色固体0.135g，收率：34.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07(s,1H),7.98(s,1H),6.99(s,1H),4.42(brs,1H),3.91-4.10(m,2H),3.55-3.71(m,3H),2.83-3.52(m,12H),2.13-2.17(m,4H),1.95-2.05(m,1H),1.69-1.87(m,2H),1.31-1.56(m,5H),1.02-1.35(m,4H),0.79-0.95(m,1H)。(ESI+):m/z 497.2[M+H]+。
实施例18：(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)-N4-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基) 氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
步骤一：(4-(2-氯吡啶-4-基)噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-溴噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(1g，1.512mmol)、2-氯-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(0.95g，3.0mmol)、Pd(dppf)Cl2(0.22g，0.151mmol)和Na2CO3(0.703g，3.78mmol)加入到15mL二氧六环和3mL水中，氮气保护，升温到80℃反应过夜，TLC和LCMS跟踪反应，原料已消失完全，停止反应。反应液冷却后加水(50mL)，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝30:1)，得产物(4-(2-氯吡啶-4-基)噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯，黄色油状物0.27g，收率：42％。(ESI+):m/z 410.1[M+H]+。
步骤二：((1r,4r)-4-((4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(2-氯吡啶-4-基)噻唑-2-基)((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.388g，0.95mmol)、((1r,4r)-4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯(0.244g，1.14mmol)、Pd2(dba)3(0.026g，3.8mmol)、叔丁醇钠、(±)-2,2'-双-(二苯膦基)-1,1'-联萘BINAP(0.035g，0.0285mmol)加入到甲苯中，氮气保护，升温到120℃反应过夜，TLC跟踪反应，原料已消失完全，停止反应。反应液冷却后倒入饱和氯化铵水溶液(20mL)，分液，水层再用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得600mg黄褐色油状物((1r,4r)-4-((4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯，粗品直投下一步，收率在下一步计算。(ESI+):m/z 488.3[M+H]+。
步骤三：(1r,4r)-N1-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
将((1r,4r)-4-((4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(0.6g，0.95mmol)加入甲醇中，加入5mL盐酸(6N)，室温反应过夜。将反应液浓缩，加饱和碳酸氢钠调溶液pH＝7，水层再用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，水相浓缩，用二氯甲烷:甲醇＝10:1浸泡过夜，过滤，母液浓缩得到(1r,4r)-N1-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺，为淡黄色油状物0.12g，收率：31％(2步)。(ESI+):m/z 388.2[M+H]+。
步骤四：(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)-N4-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺的合成
将(1r,4r)-N1-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(0.66g，1.7mmol)、溴乙基甲醚(0.240g，1.7mmol)和碳酸钾(0.235g，1.7mmol)加入到N,N二甲基甲酰胺中，氮气保护，升温到100℃反应两天，TLC和LCMS跟踪反应，原料仍有剩余，停止反应。反应液冷却后加水(30mL)，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄褐色油状物粗品。厚制备板分离(二氯甲烷/甲醇＝8:1)，得产物(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)-N4-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺，黄色油状物0.057g，收率：15％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.95-8.02(m,1H),6.79-6.89(m,3H),5.48(brs,1H),4.65-4.85(m,1H),3.98-4.01(m,2H),3.57-3.61(m,3H),3.35-3.42(m,5H),3.18-3.20(m,2H),2.89-2.92(m,2H),2.61-2.68(m,1H),2.17-2.27(m,3H),2.04-2.08(m,3H),1.87-1.96(m,1H),1.69-1.73(m,2H),1.20-1.50(m,10H),0.79-0.95(m,2H)。(ESI+):m/z 446.3[M+H]+。
实施例19：CDK9抑制剂对癌细胞生长的影响
通过测试CDK9抑制剂对癌细胞的生长的影响，我们评估了化合物抑制癌细胞增殖的选择性。
实施例中我们选用了急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)OCI-AML-3、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4、MDS-RAEB(骨髓增生异常综合征-原始细胞增多型)细胞株SKM-1、人白血病细胞Nomo-1、急性髓系白血病细胞株MOLM14、急性髓系白血病细胞株MOLM13、急性髓系白血病细胞株MV4-11、急性髓系白血病细胞株HL-60、急性髓系白血病细胞株OCI-AML-2、组织细胞性淋巴瘤U-937、急性B细胞白血病细胞株MEC-1、急性B细胞白血病细胞株MEC-2、急性巨核细胞白血病CMK、仓鼠肺细胞CHL、仓鼠卵巢细胞CHO、人非小细胞肺癌细胞H1975、人非小细胞肺癌细胞H358、人小细胞肺癌细胞H209、人肺腺癌细胞H1395、人非小细胞肺癌细胞PC-9、人肺癌细胞H3122、人非小细胞肺癌细胞H2122、人非小细胞肺癌细胞H1915、人肺腺癌细胞H1355、人非小细胞肺癌细胞HCC827、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人乳腺癌细胞MDA-MB-468、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞T47D、人乳腺癌细胞SK-Br-3，以上细胞均购自ATCC。此外，采用Palbociclib(一种CDK4/6选择性抑制剂，购自上海皓元化学)、HY-16462(CDK9-IN-2，购自上海皓元)和Dinaciclib作为对照化合物(一种CDK1/2/5/9抑制剂，购自上海皓元化学)。
在实施例中将不同浓度(0.000508μM、0.00152μM、0.00457μM、0.0137μM、0.0411μM、0.123μM、0.370μM、1.11μM、3.33μM、10μM)的本发明化合物及对照化合物分别加入到上述细胞中，并孵育72小时，用Cell(Promega，美国)化学自发光法细胞活力检测试剂盒，通过对活细胞中的ATP进行定量测定来检测活细胞数目，并基于此来计算GI50和IC50，结果示于表1-3中：表1和表2显示本发明的化合物针对所测试的血液系统疾病细胞系的GI50；表3显示化合物1针对血液系统癌症以外的癌症类型的细胞的IC50。
根据表1和表2的结果，发现所测试的本发明化合物对测试的癌症细胞如白血病细胞、淋巴瘤细胞均有很强的抑制作用，并且其中化合物1和14还表现出良好的选择性：其对正常细胞CHL和CHO细胞基本没有抑制作用，而对照药Dinaciclib和HY-16462对CHL、CHO有一定的抑制作用。表3的结果还显示，本发明的化合物1对人非小细胞肺癌细胞、人小细胞肺癌细胞、肺腺癌细胞和乳腺癌细胞也表现出显著的抑制作用，而Palbociclib对所测试的癌症细胞没有明显的抑制作用。这些结果为化合物1作为一种毒性较小的选择性CDK9激酶抑制剂用于治疗上述癌症提供了重要的理论依据。
表1
化合物编号 CHO CHL CMK HL-60 MOLM-13 MOLM-14 MV4-11 NB4
1 1.6 1.1 0.049 0.032 0.025 0.025 0.014 0.035
2 2.8 3.5 0.37 0.55 0.15 0.14 0.14 0.056
5 1.2 3.6 1.5 0.39 0.64 0.49 0.44 0.46
6 0.4 1.1 0.35 0.065 0.13 0.11 0.14 0.11
8 1.6 0.93 0.15 0.31 0.2 0.53 0.55 0.22
9 1.2 1.9 1.8 0.42 1 0.68 0.53 0.7
10 0.78 8 0.98 0.41 0.82 0.33 1.1 0.49
11 0.37 1 0.47 0.073 0.28 0.16 0.33 0.27
12 0.47 1.1 0.72 0.19 0.29 0.31 0.88 0.41
13 0.77 1.4 1.1 0.32 0.44 0.33 0.74 0.34
14 1.1 1.2 0.036 0.056 0.012 0.0011 0.041 0.0079
16 1.3 3.3 1.4 0.45 0.57 0.62 0.63 0.58
17 0.61 5.6 1.1 0.16 0.34 0.36 1.1 0.35
18 4.1 1.2 4 0.98 1.2 1.2 0.91 1.3
HY-16462 0.29 0.2 0.042 0.037 0.032 0.033 0.027 0.032
Dinaciclib 0.16 0.18 0.0099 0.008 0.0033 0.0045 0.0076 0.01
表2
化合物编号 Nomo-1 OCI-AML2 OCI-AML3 SKM-1 U-937 MEC-1 MEC-2
1 0.045 0.033 0.033 0.033 0.017 0.047 0.025
2 0.59 9.1 0.14 0.085 0.12 0.27 0.14
5 1 0.47 0.82 0.35 0.43 1.3 0.77
6 0.29 0.12 0.15 0.097 0.11 0.31 0.13
8 1 2.9 0.72 0.15 1.4 3.6 0.83
9 1.3 0.65 1.1 0.75 0.85 1.4 1.1
10 0.6 0.6 0.56 0.33 0.34 0.85 0.66
11 0.96 0.33 0.22 0.17 0.22 0.47 0.32
12 0.92 0.41 0.39 0.2 0.39 0.45 0.48
13 0.87 0.6 0.42 0.26 0.32 0.89 0.66
14 0.11 0.0066 0.012 0.002 0.011 0.037 0.023
16 1.5 2.1 0.63 0.5 0.6 1.4 0.97
17 0.93 0.8 0.98 0.33 0.3 0.8 0.7
18 3 1.1 2.1 1.1 1.1 2.5 1.7
HY-16462 0.063 0.071 0.047 0.04 0.031 0.048 0.036
Dinaciclib 0.034 0.013 0.011 0.01 0.0036 0.011 0.01
表3
IC50(μM) 化合物1 Palbociclib Dinaciclib
H358 0.043 6.6 0.043
H209 0.086 ＞10 0.077
H1395 0.12 ＞10 0.056
H3122 0.011 1.2 0.011
PC-9 0.09 ＞10 0.013
H1975 0.042 ＞10 0.029
H2122 0.049 1.6 0.039
H1915 0.037 3.6 0.023
H1355 0.1 ～10 0.025
HCC827 0.06 ＞10 0.028
MDA-MB-231 0.074 5.1 0.063
MDA-MB-468 0.018 2.7 0.013
MCF-7 0.006 1.7 0.0082
T47D 0.055 4.1 0.054
SK-Br-3 0.04 3.2 0.015
实施例20：体外抑制CDK蛋白的酶活检定
将DMSO稀释的化合物1与化合物14分别与检测的CDK蛋白(Invitrogen，美国)混合，室温孵育30分钟；加入Kinase/Z′-LYTETM Peptide Substrate Mixture(Invitrogen，美国)与4×ATP混合，将混合体系转移至384孔白色不透明板中室温反应1小时；加入5μLDevelopment Solution(Invitrogen，美国)室温反应1小时，最后加入Stop Reagent(Invitrogen，美国)终止反应，采用MD SpectraMax I3X酶标仪(Molecular Devices，美国)读取荧光值。基于读取的荧光数值采用Prism 5.0(GraphPad Software,San Diego,CA)作图，计算化合物1和化合物14对所测试CDK蛋白的IC50值，如下表4所示。
表4
IC50(nM) 化合物1 化合物14
CDK1/细胞周期蛋白B 5410 1340
CDK2/细胞周期蛋白A 6850 2860
CDK3/细胞周期蛋白E1 >10,000 >10,000
CDK5/p25 6950 4640
CDK7/细胞周期蛋白HMNAT1 3700 1720
CDK8/细胞周期蛋白C >10,000 >10,000
CDK9/细胞周期蛋白T1 0.928 1.27
CDK11(非活性) >10,000 >10,000
CDK14/细胞周期蛋白Y 2710 1680
CDK16/细胞周期蛋白Y 195 292
实施例21：CDK9抑制剂对细胞信号通路的影响
在急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)OCI-AML-3、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)HL-60以及急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)MV4-11细胞株共计四株细胞(均购自ATCC)上，通过测定多个细胞生物化学终点和功能性终点，评估了化合物1对细胞中CDK9及与其信号通路相关的其他蛋白激酶，如RNAPII、XIAP、MCL-1、c-MYC、BCL-2等的影响。用不同浓度0μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM的化合物1(于DMSO中)、1μM的对照药Dinaciclib和HY-16462(CDK9-IN-2)(购自上海皓元)(于DMSO中)分别处理这些细胞株2小时后，收集样品。测定化合物1对这些细胞株中的CDK9、RNAPII、XIAP、MCL-1、c-MYC、BCL-2磷酸化的影响(图1a-d)。
在急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)OCI-AML-3、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)HL-60和急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)MV4-11这四株细胞中发现化合物1对CDK9蛋白直接下游RNAPII、MCL-1、c-MYC的磷酸化有明显的抑制作用。
实施例22：新型激酶抑制剂对细胞凋亡的影响
为了证明用药以后细胞的死亡是通过凋亡还是坏死，在急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)OCI-AML-3、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)HL-60和急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)MV4-11这四株细胞(均购自ATCC)上，检测了化合物1在细胞中对与细胞凋亡密切相关的DNA修复酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶PARP、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase 3蛋白剪切的影响。用不同浓度0μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM的化合物1(于DMSO中)，0.01μM的Dinaciclib(于DMSO中)，0.1μM的HY-16462(于DMSO中)处理不同的细胞，然后在24小时后收集细胞。用Western Blot检测不同浓度的药在不同时间段对DNA修复酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶PARP和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase3的剪切蛋白的影响。
实验结果如图2a-d所示：在急性髓系白血病细胞株(acutemyelocytic leukemia，AML)OCI-AML-3、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4、急性髓系白血病细胞株(acutemyelocytic leukemia，AML)HL-60和急性髓系白血病细胞株(acute myelocyticleukemia，AML)MV4-11这四株细胞中作用24小时后，明显看到有部分DNA修复酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶PARP或者PARP的下游Caspase 3的剪切。这证明了化合物1在急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)OCI-AML-3、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)HL-60、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)MV4-11这四株细胞中能够引起细胞的凋亡。
实施例23：新型激酶抑制剂对细胞周期的影响
为了研究用药后细胞被阻止在哪个生长周期，在急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)HL-60、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)MV4-11这三株细胞上，测试了化合物1对这些细胞株的细胞周期分布的影响。用不同浓度的0μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM(于DMSO中)的化合物1，0.01μM(于DMSO中)的CDK9激酶抑制剂Dinaciclib和0.1μM(于DMSO中)的HY-16462对细胞株分别作用HL-60、MV4-11、和NB-4细胞株12小时、24小时或48小时后，收集细胞，用1×PBS缓冲液洗涤两次，用75％的乙醇于-20℃固定24小时，1×PBS缓冲液再洗涤两次，加0.5mL 1×PBS缓冲液和0.5mL的PI染色液(购自美国BD Bioscience)到细胞中并将细胞放置于黑暗避光37℃染色15分钟，用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测细胞周期分布。结果参见图3a-c。
实验结果如图3a-c所示：在急性髓系白血病细胞株(acute myelocyticleukemia，AML)HL-60、急性髓系白血病细胞株(acute myelocytic leukemia，AML)MV4-11、急性早幼粒细胞白血病细胞株NB-4这三株细胞中分别作用12小时、24小时或48小时后，结果发现化合物1对这三株细胞的细胞周期均有影响，即化合物1将细胞阻止在G0-G1期。
实施例24：化合物1在人的急性粒性白血病MV4-11小鼠模型中的实验结果
从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买24只4-6周龄的Bal b/c雌性小鼠并饲养于SPF级实验室中，饮水及垫料均经高压消毒无菌处理，有关小鼠的所有操作均在无菌条件下进行。第0天分别在所有小鼠左侧背部皮下注入5×106个MV4-11急性粒性白血病细胞(购自ATCC)。第15天开始，将所有小鼠分成四组(每组6只小鼠)，每天向第一组小鼠口服给药甲基纤维素(HKI)溶剂；向第二组小鼠口服给药剂量为10mg/kg鼠重的化合物1；向第三组小鼠口服给药剂量为20mg/kg鼠重的化合物1；并向第四组小鼠口服给药剂量为30mg/kg鼠重的化合物1。从给药开始，每天用游标卡尺测量皮下肿瘤的长/宽，并每天记录小鼠体重，观察化合物1对小鼠体重的影响。第43天处死小鼠，取出皮下肿瘤，对肿瘤称重比较，之后用肿瘤样品组织制备出蛋白裂解液样品待用。统计16-43天内皮下肿瘤生长趋势，其中肿瘤体积计算方法：长×宽×宽/2mm3。
实验结果如图所示，结果表明：本发明公开的抑制剂化合物1，高剂量组(20、30mg/kg)会影响Bal b/c小鼠体重，但低剂量组(10mg/kg)明显就已经明显降低了皮下肿瘤的重量而且对小鼠的体重没有明显的影响；高剂量组(20、30mg/kg)的抑瘤率(TGI)可以达到98.7％。说明化合物1能有效抑制皮下肿瘤的生长(图4a-c)。

Claims (9)

1.一种式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药：
其中Y选自对氟苯甲酰基、N任选被R3基团取代的trans-4-氨基环己基、和N任选被R3基团取代的trans-4-氨基环己基甲基；
Z选自NH、S和O；
R1选自氢和卤素；
R2选自氢、C1-C3烷基、C3-C6环烷基、任选被R4基团取代的C3-C6杂环烷基、和任选被R4基团取代的苯基；
R3选自C2-C6烷酰基和C1-C3烷氧基(C1-C3)烷基；
R4选自氰基和卤素。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药，其中R1为氯。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药，其中R2选自氢、甲基、环丙基、环己基、任选被氰基取代的4-四氢吡喃基、和任选被氟取代的苯基。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药，其中R3选自乙酰基、2-甲氧基乙基、(R)-1-甲基-2-甲氧基乙基、和(S)-1-甲基-2-甲氧基乙基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药，其中所述化合物选自：
4-(((4-(5-氯-2-(((1R,4r)-4-(((R)-1-甲氧基丙基-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)四氢-2H-吡喃-4-甲腈；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺；
N-((1r,4r)-4-((5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)氨基)环己基)乙酰胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己基-1,4-二胺；
(1S,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((S)-1-甲氧基丙-2-基)环己基-1,4-二胺；
(1R,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-((R)-1-甲氧基丙-2-基)环己烷-1,4-二胺；
4-(2-((((1r,4r)-4-氨基环己基)甲基)氨基)-5-氯吡啶-4-基)-N-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻唑-2-胺；
N-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(甲基氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环己基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(4-(2-(苄氨基)噻唑-4-基)-5-氯吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((4-氟苄基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((环丙基甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
4-((4-(5-氯-2-(((1r,4r)-4-((2-甲氧基乙基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈；
4-(((4-(5-氯-2-(((1S,4r)-4-(((S)-1-甲氧基丙-2-基)氨基)环己基)氨基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-四氢-2H-吡喃-4-甲腈；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲氧基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；
(1r,4r)-N1-(5-氯-4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)巯基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)-N4-(2-甲氧基乙基)环己烷-1,4-二胺；和
(1r,4r)-N1-(2-甲氧基乙基)-N4-(4-(2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻唑-4-基)吡啶-2-基)环己烷-1,4-二胺。
6.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药，以及药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它治疗剂。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前药在制备用于治疗、预防或改善由丝氨酸激酶活性调节的或者受其影响的或者其中涉及细胞周期蛋白依赖性激酶活性的疾病、障碍或病症的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述疾病、障碍或病症是癌症。
9.根据权利要求8所述的用途，所述癌症选自：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌、神经胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、星形细胞瘤、尤因氏肉瘤、成视网膜细胞瘤、上皮细胞癌、结肠癌、肾癌、胃肠间质瘤、白血病、组织细胞性淋巴癌、和鼻咽癌。
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