CN108715828B - 呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法 - Google Patents

呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，包括以下步骤：配制细胞培养液；将猪小肠上皮细胞接种至细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；向待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin‑1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。本发明以呕吐毒素为诱导剂，成功建立猪小肠上皮细胞程序性坏死模型，具有操作简便、结果可靠、重复性好的优点。

Description

呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法
技术领域
本发明涉及细胞模型构建技术领域，特别涉及一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法。
背景技术
细胞程序性坏死是一种由死亡受体介导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡模式，通常在凋亡被抑制的情况下发生，死亡细胞具有明显的坏死特征。研究表明，细胞程序性坏死在缺血再灌注和炎症反应等多种因素导致的组织(如肝脏)损伤或坏死中发挥重要作用，有效抑制细胞程序性坏死对这些因素诱导的组织损伤或坏死具有重要的预防和治疗作用。肠道是机体营养物质消化吸收的重要场所，也是机体最大的免疫器官，在机体抵御病原微生物的入侵中发挥着重要作用，因此，建立肠细胞程序性坏死模型，对于研究肠道损伤机制和肠道疾病治疗具有十分重要的意义。
目前常用于诱导细胞程序性坏死的诱导剂包括融合蛋白、病毒转染系统和黍子籽粒蛋白，但是其中涉及复杂的诱导剂制备过程，包括构建载体、转染、诱导等许多步骤，以及涉及脱盐、阳离子交换层析和凝胶层析等繁琐步骤获得纯化蛋白的制备过程，因此，利用此类诱导剂构建细胞程序性坏死模型存在步骤繁琐或效果不稳定的缺点。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，旨在使猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的构建操作简便且效果稳定可靠。
为实现上述目的，本发明提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，包括以下步骤：
配制细胞培养液；
将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；
向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；
测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。
优选地，配制细胞培养液的步骤，具体包括：
向DMEM/F-12培养基中加入5％的胎牛血清、1％的青链霉素混合液、1％的谷氨酰胺、0.1％的转铁蛋白以及5μg/L的表皮细胞生长因子，混合后制得细胞培养液。
优选地，将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养后，获得待诱导细胞的步骤，包括：
将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞；
对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2～3代，获得待诱导细胞。
优选地，将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞的步骤，具体包括：
取冻存的猪小肠上皮细胞在37℃水浴中复苏后，按3～4×105个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞，其中，所述培养箱的培养条件设置为：CO2的体积浓度为5％、培养温度为37℃、培养时长为2～3天，每隔20～26h更换一次细胞培养液。
优选地，对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2～3代，获得待诱导细胞的步骤中：所述传代培养的培养时间为7～8天。
优选地，向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤中：
所述含有呕吐毒素的所述细胞培养液中，呕吐毒素的浓度为0.2～2μg/mL，诱导时长为24～72h。
优选地，向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤，具体包括：
将所述待诱导细胞接种至孔板中，加入所述细胞培养液进行培养至细胞贴壁且长到70～80％后，再向孔板中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞。
优选地，将待诱导细胞接种至孔板中，加入细胞培养液继续培养的步骤中：所述待诱导细胞接种至所述孔板中的接种量为3～4×104个/mL，所述细胞培养液在所述孔板中的添加量为80～120μL/孔。
优选地，测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达、以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用的步骤中：
所述程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1、受体相互作用蛋白3和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白。
本发明提供的技术方案中，以呕吐毒素为诱导剂、以猪小肠上皮细胞为模型细胞建立细胞程序性坏死模型，具有诱导剂来源广泛、成本低廉，且操作简便、效果稳定可靠的优点，该细胞程序性坏死模型的建立为研究肠道疾病的预防或治疗、以及相关药物的研究和开发应用提供了一条重要途径。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，所述呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法包括以下步骤：
步骤S10、配制细胞培养液；
其中，在本发明技术方案中，所述细胞培养液是针对猪小肠上皮细胞的培养而配制的。在本发明的一实施例中，步骤S10具体包括：向DMEM/F-12培养基(美国HyClone公司)中加入5％的胎牛血清(美国Gibco公司)、1％的青链霉素混合液(美国HyClone公司)、1％的谷氨酰胺(美国Gibco公司)、0.1％的转铁蛋白(美国Gibco公司)以及5μg/L的表皮细胞生长因子(美国Gibco公司)，混合后制得细胞培养液。具体操作时，可将如上述比例的各个组分混合均匀后置于75cm2的培养瓶中，并分装备用。
步骤S20、将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；
肠道是机体营养物质消化吸收的重要场所，也是机体最大的免疫器官，在机体抵御病原微生物的入侵中发挥着重要作用。目前常用于建立细胞程序性坏死模型的模型细胞有肿瘤细胞、人淋巴细胞和软骨细胞，而对于使用肠细胞建立细胞程序性坏死模型的方法尚未有明确报道。因此，建立肠细胞程序性坏死模型，对于研究肠道损伤机制和肠道疾病治疗具有十分重要的意义。本发明中选用猪小肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelialcells，IPEC-1，)作为模型细胞。
步骤S30、向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；
在实际生产中，谷物类饲料由于保存方式不当，常常容易发生霉变，而霉变饲料中所含有的有毒物质，即霉菌毒素，包括玉米赤霉烯酮、麦角毒素和呕吐毒素等。呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，化学名为3α,7α,15一三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物。由于它可以引起猪的呕吐而得名，对人体有一定危害作用，欧盟分类标准为三级致癌物。猪小肠上皮细胞作为吸收部位，极易受到DON的影响，引起肠道结构和功能的损伤。研究发现，DON刺激会抑制猪肠道的免疫功能，引起猪肠绒毛萎缩、溶解，影响肠道营养物质转运，抑制机体对葡萄糖的利用和肠黏膜对丙氨酸的吸收。DON也能通过改变细胞膜上的跨膜电位，影响猪肠黏膜的屏障功能，破坏细胞的完整性。此外，DON也能引起炎性细胞因子的合成和释放，诱导机体的炎症反应。
本发明技术方案中，在诱导剂的选择上，选用了动物生产实际中最常遇到的，由饲料发霉所产生的DON作为诱导剂，建立细胞程序性坏死模型，从而能够更好地将理论研究与生产实际相结合，例如，可以应用所建立的细胞程序性坏死模型筛选能够抑制DON的药物或饲料添加剂等。另外，以DON作为诱导剂，还具有诱导剂来源广泛、成本低廉的优点。
可选地，所述含有DON的所述细胞培养液中：DON的浓度为0.2～2μg/mL，诱导时长为24～72h。其中，以DON浓度为0.5μg/mL、诱导时长为48h的条件为最佳。具体操作时，可预先配制一定浓度的DON储存液，然后将DON储存液加入步骤S10中配制的所述细胞培养液中，形成含有DON的细胞培养液，再对待诱导细胞进行诱导处理，使之发生细胞程序性坏死。
步骤40、测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断DON诱导对IPEC-1程序性坏死的作用。
对所述待诱导细胞进行DON诱导处理后，检测其相关指标，通过相关指标水平，来判断DON诱导对IPEC-1程序性坏死的作用，其中，检测指标包括IPEC-1细胞活力、IPEC-1细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力、claudin-1蛋白(紧密连接蛋白)表达以及IPEC-1细胞程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，所述IPEC-1细胞程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1(RIP1)、受体相互作用蛋白3(RIP3)和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(MLKL)。
本发明提供的技术方案中，以DON为诱导剂、以IPEC-1为模型细胞建立细胞程序性坏死模型，具有诱导剂来源广泛、成本低廉，且操作简便、效果稳定可靠的优点，该细胞程序性坏死模型的建立为研究肠道疾病的预防或治疗、以及相关药物的研究和开发应用提供了一条重要途径。
可选地，步骤S20包括：
步骤S21、将IPEC-1接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞；
步骤S21在具体实施时，可采用如下方法进行：取液氮冻存的IPEC-1(由Texas A&MUniversity提供)在37℃水浴中复苏后，按3～4×105个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞，所述培养箱的培养条件设置为：CO2的体积浓度为5％、培养温度为37℃、培养时长为2～3天，每隔20～26h更换一次细胞培养液。
步骤S22、对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2～3代，获得待诱导细胞。
在培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％之后，再对所培养的细胞进行传代培养，培养7～8天后，使细胞传代至2～3代，即获得待诱导细胞，用于后续的诱导试验。
可选地，步骤S30具体包括：
将所述待诱导细胞接种至孔板中，加入所述细胞培养液进行培养至细胞贴壁且长到70～80％后，再向孔板中加入含有DON的所述细胞培养液，进行DON诱导，获得经过DON诱导处理后的诱导处理细胞。
其中，所述待诱导细胞接种至所述孔板中的接种量为3～4×104个/mL，所述细胞培养液在所述孔板中的添加量为80～120μL/孔。具体操作时可采用如下方法：将所述待诱导细胞按照3×104个/mL的接种量接种到96孔板中，每孔加入100μL的细胞培养液，轻微摇晃使细胞均匀分散在孔板中，继续培养2～3天后，待细胞贴壁且长到70～80％时，再向孔板中加入含有DON的所述细胞培养液，进行DON诱导刺激处理，经过24～72h的诱导处理后，即可完成DON诱导IPEC-1细胞程序性坏死模型的建立。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1DON对IPEC-1细胞活力的影响
(1)细胞培养液配制：向DMEM/F-12培养基(美国HyClone公司)中加入5％的胎牛血清(美国Gibco公司)、1％的青链霉素混合液(美国HyClone公司)、1％的谷氨酰胺(美国Gibco公司)、0.1％的转铁蛋白(美国Gibco公司)以及5μg/L的表皮细胞生长因子(美国Gibco公司)，混合后制得细胞培养液，备用。
(2)待诱导细胞培养：取液氮冻存的IPEC-1(由Texas A&M University提供)在37℃水浴中复苏后，按3×105个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养皿(100mm)中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，每隔24h更换一次培养液，培养2～3天至细胞汇合率达到70～80％后，再进行传代培养7～8天，至细胞传代至2～3代，即获得待诱导细胞，备用。
(3)将3×104个/mL的待诱导细胞接种到96孔板中，每孔加入100μL的细胞培养液，轻微摇晃使细胞均匀分散在孔板中，培养至细胞贴壁且长到70％-80％时，吸除孔板中的旧培养液，用PBS沿孔壁清洗两遍。
(4)取配制好的细胞培养液，向其中加入不同浓度的DON，制备成含有不同浓度DON的培养液，然后分别加入到孔板中，每孔100μL，使DON对IPEC-1进行诱导刺激；其中，试验分为5个处理组：对照组(0μg/mL DON)；0.2μg/mLDON组；0.5μg/mL DON组；1μg/mL DON组；2μg/mL DON组；每组8个重复。
(5)待DON诱导刺激24h、48h和72h后，吸除孔板中的旧培养液，用PBS沿孔壁清洗两遍后，向每个处理孔中加入100μL的含10％的CCK8试剂(Cell Counting Kit-8，武汉丁香园科技有限公司)的细胞培养液，放置在5％CO2、37℃的培养箱中孵育1h，然后取出，快速用酶标仪(Bio-Rad iMark，Bio-Rad，美国)测定在450nm处的OD值(吸光度)，测定结果如下表1所示。表1至表6中，同行上标含有不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
表1不同浓度DON对IPEC-1细胞活力的影响
Figure BDA0001681904420000071
细胞活力是指细胞群中活细胞所占的比率，可反应细胞的生长状况。结合表1的测定结果可知，当DON处理IPEC-1细胞时间为24、48和72h时，不同浓度(0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL)的DON均导致细胞活力显著降低(P<0.05)，且随着浓度的增加，细胞活力下降的幅度更大。
实施例2DON对IPEC-1细胞上清液乳酸脱氢酶活性的影响
(1)细胞培养液配制：与实施例1相同。
(2)待诱导细胞培养：与实施例1相同。
(3)将1×105个/孔的待诱导细胞接种到12孔板中，每孔加入1mL的细胞培养液，轻微摇晃使细胞均匀分散在孔板中，培养至细胞贴壁且长到70％-80％时，吸除孔板中的旧培养液，用PBS沿孔壁清洗两遍。
(4)取配制好的细胞培养液，向其中加入不同浓度的DON，制备成含有不同浓度DON的培养液，然后分别加入到孔板中，每孔1mL，使DON对IPEC-1进行诱导刺激；其中，试验分为5个处理组对照组(0μg/mL DON)；0.2μg/mLDON组；0.5μg/mL DON组；1μg/mL DON组；2μg/mLDON组；每组4个重复。
(5)待DON诱导刺激24h、48h和72h后，收集细胞培养液，转入1.5mL的离心管中，用微板法乳酸脱氢酶测定试剂盒(由南京建成生物工程研究所提供)测定细胞上清液LDH的活力。测试方法如下：样品分别设空白样、标准样、测定样和对照样。空白样加25μL双蒸水和25μL基质缓冲液；标准样加5μL双蒸水、20μL标准液(0.2mmpl/L)和25μL基质缓冲液；待测样本加20μL待测液、25μL基质缓冲液和5μL辅酶I；对照样加5μL双蒸水、20μL待测样和25μL基质缓冲液基质缓冲液；将上述样品分别混匀后在37℃温度下水浴15min，然后加入25μL的2，4-二硝基苯肼，混匀后继续水浴15min，最后加入25μL的NaOH溶液(0.4mol/L)，在室温静置5min后，用酶标仪(Bio-Rad iMark，Bio-Rad，USA)测定在450nm处的OD值，测定结果如表2所示。(其中，1000mL血清/浆在37℃温度下与基质作用15min，在反应体系中产生1μmol丙酮酸为1单位U。)
表2不同浓度DON对IPEC-1细胞上清液LDH活性的影响
Figure BDA0001681904420000081
Figure BDA0001681904420000091
LDH是生物体内糖酵解过程中一种重要的氧化还原酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内。当细胞受损时，细胞内的LDH会释放到培养液中，因此，通过检测细胞培养液中LDH的活性可作为评判细胞受损情况的指标。结合表2中的测定结果可知，与对照组相比，当DON处理IPEC-1细胞时间为24h时，0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL的DON均导致LDH活性显著上升(P<0.05)；当DON处理IPEC-1细胞时间为48和72h时，1μg/mL和2μg/mL的DON导致LDH活性显著上升(P<0.05)。
实施例3DON对IPEC-1细胞claudin-1蛋白表达的影响
(1)细胞培养液配制：与实施例1相同。
(2)待诱导细胞培养：与实施例1相同。
(3)将1×106个/mL的细胞接种到60mm的培养皿中，在每个培养皿加入500μL的细胞培养液，轻微摇晃使细胞均匀分散在培养皿中，培养至细胞贴壁且长到70％-80％时，再向其中加入含有不同浓度DON的细胞培养液，每个培养皿中添加4mL，试验分为5个处理组：对照组(0μg/mL DON)；0.2μg/mLDON组；0.5μg/mL DON组；1μg/mL DON组；2μg/mL DON组；每组4个重复。
(4)待DON诱导刺激48h后，吸除培养皿中的旧培养液，用PBS沿培养皿壁清洗两遍，向每个培养皿中加入100μL的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology公司)后，用细胞刮将蛋白裂解液涂抹均匀，并用力将细胞刮取并集中一处，再吸取转移到1.5mL的离心管中，震荡裂解；然后4℃、12000g条件下，离心15min，吸取上清液转移到新的1.5mL的离心管中，加入蛋白提取液(按照1mL Lysis Buffer、10μL磷酸酶抑制剂、1μL蛋白酶抑制剂、5μL100mM PMSF配制)，在4℃、12000g条件下，离心15min，吸取上清液转移到新的1.5mL的离心管中；然后用1mg/mL牛血清白蛋白液(BSA，江苏碧云天生物技术公司，中国)对蛋白样品进行定量后，分别取10μL蛋白样品于100℃沸水中煮5～8min使蛋白变性，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离后转至PVDF膜(杭州联科生物技术股份有限公司，中国)上，5％脱脂奶粉(Cell Signaling Technology公司)室温封闭1小时，Tris-HCl缓冲液(1‰Tween-20)洗膜3次，每次10min，后孵一抗，4℃过夜。
一抗为claudin-1(1:1000稀释，invitrogen公司，美国)，β-actin(1:1000稀释，Sigma公司，美国)。洗膜后加二抗室温下孵育2h，二抗分别为HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(1:5000稀释，武汉安特捷生物技术公司)和HRP-Goat Anti-Mouse IgG(1:5000稀释，武汉安特捷生物技术公司，中国)。然后用Tris-HCl缓冲液(1‰Tween-20)洗膜3次，每次10min，再用ECL试剂(Pierce公司，美国)荧光显色，于Alpha Innotech成像系统(ProteinSimple公司，美国)中检测及分析条带强度。claudin-1蛋白水平以claudin-1与β-actin的蛋白条带强度比值claudin-1/β-actin表示，测定结果如下表3所示。
表3不同浓度DON诱导刺激48h对IPEC-1细胞claudin-1蛋白表达的影响
Figure BDA0001681904420000101
紧密连接蛋白claudin-1是肠黏膜的主要组成成分之一，在黏膜屏障中发挥着重要的作用，当机体受到病原微生物的刺激，可导致肠黏膜紧密连接蛋白的表达量下降，肠细胞通透性增大。结合表3中的测定结果可知，与对照组相比，当DON处理IPEC-1细胞48h时，不同浓度DON均导致claudin-1的蛋白表达显著下降(P<0.05)，且随着浓度的增加，蛋白表达下降的幅度变大。
实施例4DON对IPEC-1细胞程序性坏死关键基因mRNA表达的影响
(1)细胞培养液配制：与实施例1相同。
(2)待诱导细胞培养：与实施例1相同。
(3)将1×105个/孔的细胞接种到12孔板中，轻微摇晃使细胞均匀分散在爬片上，培养至细胞贴壁且长到70％-80％时，再向每个处理孔中加入含有不同DON浓度的细胞培养液，试验分为2个处理组：对照组(0μg/mL DON)；0.5μg/mL DON组；每组4个重复。
(4)待DON诱导刺激48h后，弃去培养液，用PBS沿孔壁清洗两遍，向每个处理孔中加入500μL的RNAiso Plus裂解液，室温静置3min，最后吹打吸取细胞裂解液于1.5mL无菌离心管中，通过实时荧光定量PCR法测定IPEC-1细胞程序性坏死关键基因(包括RIP1、RIP3和MLKL)的mRNA表达。具体测定方法如下：
①按照RNAiso Plus说明书提取细胞总RNA：将细胞裂解液用冷冻离心机(Sigma公司)于12000g、4℃条件下离心5min；小心吸取上清液900μL移入新的1.5mL离心管中，向上清液中加入200μL氯仿，盖紧管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后(无分相现象)，室温静置5min，于12000g、4℃条件下离心15min；从离心机小心取出离心管，溶液分3层，吸取上清液400～500μL至另一新的1.5mL离心管，向上清液加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀后，15～30℃静置10min，于12000g、4℃离心10min；小心去除上清，缓慢沿管壁加入1mL 75％乙醇(勿吹起触及沉淀)，轻轻上下颠倒离心管洗涤，于12000g、4℃离心5min，小心弃去乙醇；室温干燥沉淀5min，加入40μL RNase Free dH2O溶解沉淀，用移液器轻吹沉淀，使RNA完全溶解；RNA浓度通过超微量分光光度计(Nanodrop 2000，Thermo Scientific公司)检测，纯度以吸光值260/280表示，范围在1.8～2.2，RNA的完整性通过Tanon-4100凝胶成像系统(上海天能)来检测，RNA样品放入-80℃保存。
②cDNA合成按照
Figure BDA0001681904420000111
RT reagent kit with gDNA eraser(cDNA合成试剂盒)(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)规定的步骤完成：
a、基因组DNA的除去：在200μL的离心管中，依次加入1μg RNA、2μL 5×gDNAEraser Buffer和1μL gDNA Eraser，并加入RNase Free dH2O至10μL。在42℃反应2min。
b、反转录反应：4μL
Figure BDA0001681904420000112
Buffer，1μL
Figure BDA0001681904420000113
RT enzyme mix，1.0μL RT primer mix，10μL步骤a中的反应液，加RNase free dH2O至20μL。反转录参数：37℃15min，85℃5s，4℃∞，反应结束置于-20℃冻存备用。
③实时荧光定量PCR按照
Figure BDA0001681904420000114
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(real-time PCR试剂盒，Takara，宝生物工程(大连)有限公司)方法步骤完成。20μL反应体系是由10.0μL
Figure BDA0001681904420000115
Premix Ex TaqTM(2×)、0.4μL ROX reference dye II(10×)、2.0μLcDNA、6.8μL RNase free dH2O、0.4μL上游引物(10μmol/L)、0.4μL下游引物(10μmol/L)组成。使用ABI 7500Real-time PCR仪(Applied Biosystems公司)进行扩增。循环参数：首先在95℃30s；随后进行95℃5s，60℃34s，40个循环。每份样本做3个重复。相对荧光定量PCR数据的计算采用2-ΔΔCT法，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因。各基因的mRNA相对表达量以相对于生理盐水组表达量的倍数来表示。
根据已发表的猪的RIP1、RIP3、MLKL和GAPDH的基因序列设计Real-Time PCR引物。利用Primer premier 5.0软件设计，由宝生物工程(大连)有限公司合成，相关基因的引物序列见表4。IPEC-1细胞程序性坏死关键因子RIP1、RIP3和MLKL的mRNA表达测定结果如表5所示。本试验的各基因扩增效率均接近100％。
表4实施例4中引物序列
Figure BDA0001681904420000121
表5 0.5μg/mL DON对IPEC-1细胞程序性坏死关键基因mRNA表达的影响
项目 对照组 0.5μg/mL DON P值
RIP1 1.00±0.08 2.28±0.24 0.001
RIP3 1.00±0.05 0.54±0.06 <0.001
MLKL 1.00±0.09 2.12±0.21 0.001
RIP1是RIP家族的成员之一，为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，它是首个被认定参与诱导细胞坏死的重要蛋白分子。RIP3是RIP家族另一个成员，也是一种蛋白激酶，其N末端激酶结构域与RIP1相似，C末端结构域蛋白质结构域是其独有的序列，RIP3是程序性坏死通路的关键信号分子。RIP3的激活对程序性坏死起决定性作用。MLKL是一种激酶样蛋白，其N端四个螺旋状结构域和C端激酶样区域由两个螺旋链连接而成，在程序性坏死通路中，MLKL作为RIP3的下游靶点，是程序性坏死的效应因子，磷酸化后的MLKL会作用于细胞膜执行程序性坏死。
结合表5的测定结果可知，0.5μg/mL DON可以显著提高RIP1和MLKL mRNA的表达量，但与对照组相比，0.5μg/mL DON显著降低了RIP3 mRNA的表达量。
实施例5DON对IPEC-1细胞RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达的影响
(1)细胞培养液配制：与实施例1相同。
(2)待诱导细胞培养：与实施例1相同。
(3)将1×106个/mL的细胞接种到60mm的培养皿中，然后加入3.5mL的细胞培养液，轻微摇晃使细胞均匀分散在培养皿中，培养至细胞贴壁且长到70％-80％时，再加入含有不同DON浓度的细胞培养液，每个培养皿中添加4mL，试验分为2个处理组：对照组(0μg/mLDON)；0.5μg/mL DON组；每组4个重复。
(4)待DON诱导刺激48h后，吸除培养皿中的旧培养液，用PBS沿培养皿壁清洗两遍，向每个培养皿中加入100μL的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology公司)后，用细胞刮将蛋白裂解液涂抹均匀，并用力将细胞刮取并集中一处，再吸取转移到1.5mL的离心管中，震荡裂解；然后4℃、12000g条件下，离心15min，吸取上清液转移到新的1.5mL的离心管中，加入蛋白提取液(按照1mL Lysis Buffer、10μL磷酸酶抑制剂、1μL蛋白酶抑制剂、5μL100mM PMSF配制)，在4℃、12000g条件下，离心15min，吸取上清液转移到新的1.5mL的离心管中；然后用1mg/mL牛血清白蛋白液(BSA，江苏碧云天生物技术公司，中国)对蛋白样品进行定量后，分别取10μL蛋白样品于100℃沸水中煮5～8min使蛋白变性，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离后转至PVDF膜(杭州联科生物技术股份有限公司，中国)上，5％脱脂奶粉(Cell Signaling Technology公司)室温封闭1小时，Tris-HCl缓冲液(1‰Tween-20)洗膜3次，每次10min，后孵一抗，4℃过夜。
一抗分别为RIP1(1:1000稀释，LifeSpan BioSciences公司，美国)，RIP3(SantaCruz Biotechnology公司，美国)，磷酸化MLKL(p-MLKL)(1:1000稀释，Cell SignalingTechnology公司，美国)，β-actin(1:1000稀释，Sigma公司，美国)。洗膜后二抗室温下孵育2h。二抗分别为HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(1:5000稀释，武汉安特捷生物技术公司)和HRP-Goat Anti-Mouse IgG(1:5000稀释，武汉安特捷生物技术公司，中国)。后用Tris-HCl缓冲液(1‰Tween-20)洗膜3次，每次10min，再用ECL试剂(Pierce公司，美国)荧光显色，于Alpha Innotech成像系统(ProteinSimple公司，美国)中检测及分析条带强度。RIP1、RIP3和p-MLKL蛋白水平以RIP1、RIP3和p-MLKL蛋白和β-actin蛋白条带强度比值表示，测定结果如下表6所示。
表6 0.5μg/mL DON对IPEC-1细胞RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达的影响
项目 对照组 0.5μg/mL DON P值
RIP1/β-actin 1.12±0.05 1.06±0.08 0.467
RIP3/β-actin 3.02±0.18 3.91±0.25 0.008
p-MLKL/β-actin 1.86±0.09 2.41±0.22 0.032
RIP1是RIP家族的成员之一，为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，它是首个被认定参与诱导细胞坏死的重要蛋白分子。RIP3是RIP家族另一个成员，也是一种蛋白激酶，其N末端激酶结构域与RIP1相似，C末端结构域蛋白质结构域是其独有的序列，RIP3是程序性坏死通路的关键信号分子。RIP3的激活对程序性坏死起决定性作用。MLKL是一种激酶样蛋白，其N端四个螺旋状结构域和C端激酶样区域由两个螺旋链连接而成，在程序性坏死通路中，MLKL作为RIP3的下游靶点，是程序性坏死的效应因子，磷酸化后的MLKL(p-MLKL)会作用于细胞膜执行程序性坏死。
结合表6的测定结果可知，0.5μg/mL DON可以显著增加RIP3蛋白的表达量(P<0.01)和磷酸化MLKL蛋白的表达量(P<0.05)。
综上所述，在本发明实施例中，以0.2～2μg/mL的DON作用于IPEC-1细胞，导致IPEC-1细胞活性下降、IPEC-1细胞上清液LDH活性上升、IPEC-1细胞claudin-1蛋白表达显著下降，以及提高了RIP1和MLKL mRNA的表达量，增加了RIP3蛋白的表达量和MLKL蛋白磷酸化，成功建立了IPEC-1细胞的程序性坏死模型，且具有诱导剂来源广泛、价格低廉，且操作简便、效果稳定可靠的优点，该细胞程序性坏死模型的建立为研究肠道疾病的预防或治疗、以及相关药物的研究和开发应用提供了一条重要途径。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制细胞培养液；
将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；
向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；
测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用；
其中，测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达、以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用的步骤中：
所述程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1、受体相互作用蛋白3和磷酸化混合系列蛋白激酶结构域样蛋白；
所述猪小肠上皮细胞为IPEC-1；
向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤中：所述含有呕吐毒素的所述细胞培养液中，呕吐毒素的浓度为0.5μg/mL，诱导时长为48h。
2.如权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，配制细胞培养液的步骤，具体包括：
向DMEM/F-12培养基中加入5%的胎牛血清、1%的青链霉素混合液、1%的谷氨酰胺、0.1%的转铁蛋白以及5μg/L的表皮细胞生长因子，混合后制得细胞培养液。
3.如权利要求2所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养后，获得待诱导细胞的步骤，包括：
将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70~80%，得培养细胞；
对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2~3代，获得待诱导细胞。
4.如权利要求3所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70~80%，得培养细胞的步骤，具体包括：
取冻存的猪小肠上皮细胞在37℃水浴中复苏后，按3~4×105个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70~80%，得培养细胞，其中，所述培养箱的培养条件设置为：CO2的体积浓度为5%、培养温度为37℃、培养时长为2~3天，每隔20~26h更换一次细胞培养液。
5.如权利要求3所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2~3代，获得待诱导细胞的步骤中：所述传代培养的培养时间为7~8天。
6.如权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤，具体包括：
将所述待诱导细胞接种至孔板中，加入所述细胞培养液进行培养至细胞贴壁且长到70~80%后，再向孔板中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞。
7.如权利要求6所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将所述待诱导细胞接种至孔板中，加入所述细胞培养液进行培养的步骤中：所述待诱导细胞接种至所述孔板中的接种量为3~4×104个/mL，所述细胞培养液在所述孔板中的添加量为80~120µL/孔。
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