CN108700516B - 光致发光成像的基于透射照明的自动聚焦的显微镜系统 - Google Patents

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Abstract

对包括生物细胞的样本进行成像的显微镜系统和方法。在示例性方法中,可针对第一组焦点位置检测透射通过所述样本的光以收集第一堆图像。可计算所述第一堆图像的焦点度量的值。可基于所述值确定候选焦点位置。可针对第二组焦点位置检测来自所述样本的光致发光以收集第二堆图像。所述第二组焦点位置可比所述第一组焦点位置限定的范围更小。所述第二组焦点位置中的至少一个焦点位置可以是基于所述候选焦点位置的。换句话说,候选焦点位置可用作寻找适当的光致发光焦点位置的引导。

Description

光致发光成像的基于透射照明的自动聚焦的显微镜系统
相关申请交叉引用
本申请要求于2015年10月19日提交的美国申请号14/886,998的优先权,其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
在许多研究和临床应用中成像细胞。例如,细胞可以以高通量筛选暴露于效应器、用作用于研究生理过程的模型系统或构成疾病诊断的临床样本等。通过用选择性地绑定到在细胞中或在其上存在的(一个或多个)局部目标的荧光染料染色,特别感兴趣的细胞特征能够被显现。通过利用激发光照射且然后检测所得到的荧光发射,染色后的细胞能够被成像。
细胞在自动环境中的荧光成像存在特别的挑战。细胞暴露于激发光能够随时间通过光漂白(photobleaching)将荧光染料永久地改变为非荧光形式。因此,在细胞在不同的焦点位置处成像以试图找到最佳焦点时,从细胞检测到的荧光信号通过光漂白被减弱。相关的挑战是确定图像收集的适当的曝光时间;染色的水平影响曝光时间并能够随着不同样本、试剂和/或染色过程而明显变化。在不存在可用于最佳焦点位置的估计时,难于针对视场中待收集的所有荧光图像找到适当的曝光时间。远离最佳焦点位置无意收集的荧光图像通常不为更靠近最佳焦点位置收集的随后的图像提供关于适当曝光时间的信息。需要用于细胞的光致发光成像的较好的自动聚焦方法。
发明内容
本公开提供对包括生物细胞的样本进行成像的显微镜系统和方法。在示例性方法中,可针对第一组焦点位置,检测透射通过所述样本的光以收集第一堆图像。可计算所述第一堆图像的焦点度量的值。可基于所述值确定候选焦点位置。可针对第二组焦点位置检测来自所述样本的光致发光以收集第二堆图像。所述第二组焦点位置可比所述第一组焦点位置限定的范围更小。所述第二组焦点位置中的至少一个焦点位置可基于所述候选焦点位置。换句话说,候选焦点位置可用作寻找适当的光致发光焦点位置的引导。
附图说明
图1A是根据本公开的方面的用于光致发光成像的示例性显微镜系统的示意图,其中,该系统配备有基于透射照明的图像自动聚焦机构,其中,系统被示出为在对样本的透射照明和对由透射光创建的图像的检测期间。
图1B是图1A的显微镜系统的另一示意图,其中,系统被示出为在与图1A中相同的视场和相同的样本的落射照明以及对由经由光致发光发射的光创建的光致发光图像的检测期间。
图2是根据本公开的方面的图1A和图1B的显微镜系统的沿系统的样本座的井截取的不完整的截面示意图,其中,井固定待成像的生物细胞,且其中,在相同的视图中透射光和发射光被一起示出以允许进行比较。
图3是绘出在图1A和图1B的显微镜系统中作为透射光(“T”)和发射光(“M”)的焦点位置的函数的焦点度量(focus metric)(即,对比度的测量)示意图。
图4是利用基于透射照明的自动聚焦机构获得样本的光致发光图像的示例性方法的流程图。
图5是示出利用图1A的显微镜系统的实施例获得的数据的图,其中,该图描绘了作为利用位于15微米的焦点位置间隔(步长)处的4倍物镜获得的相对密集堆的亮视场图像的焦点位置的函数的(如各点)对比度测量(Vol lath F4),且其中,单项高斯曲线被拟合到各点。
图6是示出如图5中获得的数据和拟合曲线的图,但是其中,在75微米的焦点位置间隔(步长)处获得相对稀疏图像堆。
图7是描绘作为焦点位置的函数的对比度测量(Vollath F4)的图,其中,利用图1A和1B的配备有20倍物镜的显微镜系统的实施例获得图中的数据,且其中,该图示出亮视场图像的拟合(“T拟合”)的高斯曲线和光致发光图像的单独的各点和拟合曲线(分别为“M图像”和“M拟合”)。
图8是描绘作为收集的光致发光图像的数量的函数的光致发光的最佳焦点位置的偏移的图,其中,利用图1A和1B的配备有4倍物镜的显微镜系统的实施例获得图中的数据。
图9是描绘作为收集的光致发光图像的数量的函数的光致发光的最佳焦点位置的偏移的图,其中,利用图1A和1B的配备有20倍物镜的显微镜系统的实施例获得图中的数据。
图10是图1A的显微镜系统的载物台的平面图,其中,载物台包括多个基准点并支撑样本座。
图11是图10的载物台和样本座的不完整的示图,其通常在基准点之一周围的图10中的“11”指示的区域处获得该图。
图12是图10的载物台和样本座通常沿图10的线12-12截取的一定程度的截面示意图。
具体实施方式
本公开提供包括对生物细胞的样本进行成像的显微镜系统和方法。在示例性方法中,可针对第一组焦点位置检测透射通过所述样本的光以收集第一堆图像。可计算所述第一堆图像的焦点度量的值。可基于所述值确定候选焦点位置。可针对第二组焦点位置检测来自所述样本的光致发光以收集第二堆图像。所述第二组焦点位置可比所述第一组焦点位置限定的范围更小。所述第二组焦点位置中的至少一个焦点位置可基于所述候选焦点位置。换句话说,候选焦点位置可用作寻找适当的光致发光焦点位置的引导。
提供对包括生物细胞的样本进行成像的另一示例性方法。可针对一组焦点位置检测透射通过所述样本的光以收集图像堆。可计算所述图像堆的焦点度量的值。可基于所述值确定候选焦点位置。可基于所述候选焦点位置获得光致发光焦点位置。可利用光致发光焦点位置检测所述样本的光致发光图像。在一些实施例中,光致发光焦点位置与候选焦点位置相同或通过预定偏移与候选焦点位置相关。
针对自动光致发光(如,荧光)成像,本公开的显微镜系统相对于其他显微镜系统可具有各种优势。首先,由于针对每个视场收集的光致发光图像数量较小,该系统可以能够更快地成像该视场。因为由于较短的曝光时间,透射照明图像能够收集的比光致发光图像更快,因此,该系统还可以更快。第二,使用透射照明检测候选焦点位置允许沿着光轴的更大的搜索范围,并且因此降低搜索范围将不包含最佳焦点的可能性。第三,(针对光致发光激发)透射照明可比落射照明产生更少的光漂白,因此,能够在任何实质的光漂白发生之前确定光致发光的适当焦点。第四,利用透射照明确定的候选焦点位置接近光致发光的最佳焦点,其允许收集该堆的初始图像的初始焦点位置处确定堆光致发光图像中的每个其他图像的适当的预定的曝光时间。针对该堆中的每个图像检测的光致发光的总强度不明显改变,因为每个图像相对接近最佳焦点。第五,亮视场(透射照明)图像堆中的两个或更多个图像和/或光致发光图像堆中的两个或更多个图像可通过图像处理至少部分彼此组合(还称为混合)以分别产生数字相位图像和/或最佳Z位置投影。
本公开的进一步的方面在以下部分中描述:(I)显微镜成像系统的概述,(II)基于自动聚焦的光致发光成像的方法,和(III)示例。
I.显微镜成像系统的概述
这部分提供了用于光致发光成像的示例性显微镜系统50的概述,其中,系统配备有基于透射照明的图像自动聚焦机构;见图1A、图1B、图2和图3。
图1A示出在利用由透射照明光源56(还称为亮视场光源)产生的透射光54(λT)对样本52透射照明期间的显微镜系统50。光54透射通过样本52并由图像检测器58检测到。图像检测器通过检测透射光收集样本52的图像。由透射照明产生的图像可互换地称为透射照明图像或亮视场图像。光源56可以是任何适当的光源,如,(一个或多个)发光二极管、汞弧灯、激光器等。
如本文所使用的,光可以包括任何适当波长的光学辐射。因此,光可以是可见辐射、紫外辐射和/或红外辐射的任何组合。
图像检测器58可以是用于收集样本图像的任何装置。示例性图像检测器包括电荷耦合装置(CCD)传感器、有源像素传感器(如,互补型金属氧化物半导体(CMOS)传感器、N型金属氧化物半导体(NMOS)传感器等)等。
样本可设置在平面中,通常是水平面(还称为xy平面),且光源56和图像检测器58可以(或可以不)位于该平面的彼此相对的相对侧上。例如,在描述的实施例中,光源56设置在xy平面和样本上方,且图像检测器58设置在xy平面和样本下方。在反向配置中,光源可设置在样本下方,而图像检测器可设置在样本上方。
系统50的光轴60从光源56延伸至图像检测器58。光轴可以沿着z轴垂直延伸穿过样本52。为了本公开的目的,光轴和z轴将被互换使用,即使光轴可以不沿着其所有长度(或任意长度)是垂直的。
透射光54可以经由照射光学器件62从亮视场光源56行进至样本52,并经由收集光学器件64从样本行进至图像检测器58。照射光学器件62和收集光学器件64中的每个可具有一个或多个光学元件。光学元件可以是任何装置或结构以收集、引导和/或聚焦光和/或部分阻挡光。光学元件可以通过任何适当机制(如,反射、折射、衍射和/或滤光等)起作用。示例性光学元件包括透镜、反射镜、光栅、棱镜、滤光器、光圈、光束分离器、透射光纤(光纤)等。
照射光学器件62可包括至少一个光学元件,如透镜或光圈,其基本上准直来自亮视场光源56的光。准直的光可(或可以不)稍微发散或稍微会聚(如,以形成关于光轴的小于5度、3度、2度或1度和/或大于0.5度、1度或2度等的锥角)。光的发散或会聚可改善从利用来自光源56的透射光收集的亮视场图像计算的焦点度量的质量。
在所描绘的实施例中,收集光学器件64包括物镜66、折叠反射镜68和镜筒透镜70。物镜66可以由一个或多个光学元件组成,其可相对于彼此固定在适当位置。样本52和物镜66相对于彼此的位置关系限定了系统的焦点位置(还称为焦点)。更具体地,物镜沿着z轴(和/或光轴)离样本的距离限定了焦点位置并确定样本在图像平面中是否清晰。可以通过移动样本52和物镜66或二者来调节焦点位置。在示例性实施例中,通过移动物镜调节焦点位置,如在72的箭头所示。物镜可以沿着z轴通过操作地连接到物镜的驱动机构74移动,而样本保持固定。在其他实施例中,驱动机构可操作地连接到载物台76,其支撑包含样本52的样本座78,使得调节焦点位置的同时保持物镜固定。在任何情况下,驱动机构可与数字处理器80通信并由其控制以允许自动调节焦点位置。
处理器80可以与系统50的装置的任何适当组合通信和/或对其操作进行控制,且可配备有用于系统的自动操作的任何适当算法。处理器可从图像检测器58接收图像数据并对其进行处理。处理器80还可以控制载物台驱动机构82,其驱动载物台76平行于xy平面的移动,如84处的箭头所示。载物台驱动机构82的控制可允许系统对多个样本、在同一样本内的多个位置和/或多个基准点进行自动成像等。处理器还可控制透射照明和落射照明之间的切换,并由此控制收集亮视场图像和光致发光之间的切换。
处理器80可以由计算系统或计算机86提供。计算机可包括显示器88、用户界面90、存储算法和数据的存储器等。
图1B示出在利用由激发光源102产生的激发光100(λχ)落射照明样本52的相同视场期间的显微镜系统50。激发光100激发样本中的光致发光体(如,荧光染料),其引起光致发光体进行光致发光,即,生成由图像检测器58检测的发射光104(λΜ)。图像检测器通过检测发射光104收集样本52的光致发光图像。光致发光包括任何光诱导的光发射,如,荧光、磷光等。
激发光100可经由照射光学器件106从激发光源102行进至样本52,并经由收集光学器件108从样本52行进至图像检测器58。然而,相比于图1A的透射照明配置,光学器件106和108中的一个或多个光学元件可彼此共享,因为激发光100和发射光104在样本下面或上面的相同路径上往返于样本52。照射光学器件106可包括光源相关的光学元件109(如,光圈或折射元件等)、激发滤光器110、光束分离器112和物镜66的任何组合。收集光学器件108可包括物镜66、光束分离器112、发射滤光器114、折叠反射镜68和镜筒透镜70的任何组合。
可以或可以不使用上述用于透射照明的系统50的其他组件。例如,可关闭亮视场光源56使得检测不到透射照明光。物镜驱动机构74、载物台驱动机构82和计算机86保持可操作。
样本52可以是任何适当材料、物质、分离物、提取物、微粒等。样本可包括待成像的生物细胞。生物细胞可以是真核的或原核的,且可以是活的或死的(如,固定的/凝固的)。示例性生物细胞包括移植生长的细胞(细胞系)、原代细胞、来自组织样本的细胞、来自临床样本(如,血液样本、流体抽出物、组织切片等)的细胞、菌细胞等。细胞可产生光致发光物质(如,绿色荧光蛋白(GFP))或可用光致发光体染色(如,在细胞已经凝固之后)。
样本座78可以是用于固定空间分离的各样本中的至少一个样本或任何阵列的任何装置。样本座可以提供培养基,其具有至少一个水平的面向上的表面区域(位置),其上可以安置有和/或附着有样本的生物细胞。样本座可以仅具有用于细胞附着的一个表面区域,或可具有彼此分离的多个表面区域或区室(compartment)。每个表面区域可包括涂层以促进细胞附着。例如,涂层可以是多熔素、胶原等。涂层可以位于样本座的主体上,其可由透明塑料或玻璃等形成。示例性样本座包括培养皿、多井板(如,具有4,6,8,12,24,32,48或96个井等)和提供单个区室或多个离散区室以固定细胞的载玻片等。
图2示出系统50的样本座78的一部分。样本座是具有多个井120的多井板,其每个井能够固定不同样本52(见图1)。在此示出示例性样本52存在于一个井120中。样本包括多个生物细胞122,其设置在形成该井的底的培养基124上且可选择地附着于培养基124。在细胞正在被成像时,细胞122可以保持由液体介质126(如,组织培养液、缓冲溶液、水等)覆盖。细胞可形成单层或可堆在彼此的顶上。细胞可以是平的或者可以不是平的,且被染色的细胞器(organelle)或其他细胞结构或组成可以在细胞内或细胞上的任何地方。在许多情况下,培养基在顶部可以不是平的(如,其可具有楔形或可以是弓形的)。
透射光54和发射光104在图2中一起示出以允许进行比较,即使通常在彼此不同的时间分别执行透射照明和落射照明。当光54通过细胞透射时,细胞122可以用作相物体(phase object)。光波54被细胞特征衍射并相移。当细胞在焦点位置时,相移通常不可检测,而在细胞稍微偏离焦点时,相移能够在图像平面处产生相长干涉和/或相消干涉。这种干涉增加了在图像稍微偏离焦点时收集的图像相对于在图像在焦点处时收集的图像的对比度。因此,透射照明允许针对细胞的近似垂直中心确定最佳的亮视场焦点。
发射光104可来自于位于细胞内、细胞上或细胞附近的光致发光体。例如,在所描绘的实施例中,光104从细胞122的染色的细胞核128发射。最佳的亮视场焦点是否可以与最佳的光致发光焦点相同取决于以下因素:细胞122的哪部分是光致发光的(和细胞的该部分的高度)、与否存在与透射光54和发射光104之间的波长差相关联的色差、或透射照明和落射照明之间的其他系统差异等。换句话说,最佳的光致发光焦点与最佳的亮视场焦点的偏移(如果存在的话)可以由样本、系统光学器件或其组合等确定。偏移可以不多于约20、10或5微米等。
图3示出绘出了针对相同视场的、作为利用图1A和图1B的显微镜系统收集的透射照明图像(“T”)和发射光图像(“M”)的焦点位置的函数的焦点度量的示意图。焦点度量可以是对比度测量,在针对透射照明在最佳焦点位置附近收集透射照明图像时,焦点度量减小。因此,从透射照明图像获得的焦点度量的值形成两个对比度峰130a、130b,其由对比度谷132隔开。从透射图像获得的焦点度量(可选地,相同的焦点度量)的值形成单个峰134,其与所述谷处于大致相同的焦点位置处。由于以上针对图2所述的理由中的任一个,单个峰的顶点和所述谷的最低点可位于彼此偏移的焦点位置处。
两个对比度峰130a,130b的存在有效地使系统的景深加倍。采样率能够减半;两个峰的存在允许使用混淆噪声以取得优势。因此,通过仅收集相对小数量的透射照明图像,可在大范围的焦点位置中搜索最佳焦点。
II.基于自动聚焦的光致发光成像的方法
这部分描述了依赖于从亮视场成像获得的候选焦点位置的光致发光成像的示例性方法;见图4。
图4示出利用基于透射照明的自动聚焦机构获得样本的光致发光图像的示例性方法的流程图150。此部分中描述的方法步骤可以任何适当组合和顺序执行且可以与本公开的任何其他适当步骤、结构和特征组合或执行,如,与第I部分的显微镜系统50的任何适当装置、配置和特征组合或执行。
在152处指出,可检测到通过样本透射的光以获得亮视场图像堆。例如,光可以是(一个或多个)任何适当波长的可见光。照射样本的光可以或可以不是充分相干的(如,至少25%,50%或75%相干)并可充分准直,但是可选择地为相对于理想的准直会聚或发散。样本可包括一个或多个生物细胞,其可设置在培养基上和/或附着于培养基。
亮视场图像可形成在显微镜系统的相应系列的焦点位置(如,z位置)处收集的z堆的图像。焦点位置可跨过任何适当范围,并可沿着光轴在相邻焦点位置之间具有任何适当步长(间隔),以针对该范围产生任何适当数量的图像。
可基于任何适当标准选择该范围。在一些实施例中,可以基于来自光学测量装置的测量值,来选择该范围的下限,该光学测量装置测量光轴上的样本座的底侧(和/或顶侧)的z位置。底侧z位置作为该范围的下限确保了样本在该范围的下限之上,因为样本从样本座的底侧抬高了样本座在光轴上的局部厚度。示例性光学测量装置是显微镜系统的基于激光器的测量装置。在其他实施例中,用户可将正使用的样本座的类型通信给计算机86,然后,计算机可基于样本座的类型和其已知的几何结构选择该范围的下限。替代地,样本座可以包括标记(如,条形码),其可由显微镜系统自动读取以确定样本座的类型和其已知的几何结构。在一些实施例中,用户可选择该范围的下限和/或上限、和/或在该范围内的焦点位置的步长、和/或在该范围内待收集的图像数量。该范围可自动或手动选择,且可足够大以涵盖由从收集的图像计算的焦点度量产生的两个对比度峰130a和130b的至少一部分或至少大多数(如,顶点)(如,见图3)。
在示例性实施例中,z堆的亮视场图像由至少5个、6个、7个、8个、9个或10个亮视场图像和/或不多于25个、20个、15个或12个亮视场图像(如,7-20个、8-15个或9-12个亮视场图像)等组成。亮视场图像可在范围的一端(或范围的末端中间)开始收集,其中,物镜行进到该范围的另一端(或该范围的两端)。在收集图像之前,物镜可在该范围内的每个选中的焦点位置处停止,或物镜可连续行进通过该范围的同时周期性地收集图像。如果物镜连续行进的同时收集图像,则可使用脉冲透射照明,以改善图像质量和/或控制曝光时间(还称为曝光持续时间)。可结合物镜的行进速度选择透射照明的闪光频率,以建立各连续图像之间的期望的步长。
在示例性实施例中,每个焦点位置的步长大小至少部分由物镜的放大率(和/或数值孔径(NA))确定,其中,较大步长适于低放大率的物镜,而较小步长适于中间放大率的物镜。低放大率的物镜可以为例如2倍、4倍、lO倍或2倍-10倍的物镜等,其提供指示的放大率。中间放大率的物镜可以为例如10倍、20倍、40倍或10倍-40倍的物镜等。随着物镜放大率增加,步长大小可减小。低放大率的物镜的示例性步长大小可至少为10,20,30,40,50或60微米或者小于10,20,30,40,50或60微米等。中间放大率的物镜的示例性步长大小可至少为1、2、3、4、5、7或10微米或者小于1、2、3、4、5、7或10微米等。在一些实施例中,可使用高放大率的物镜(40倍-100倍)。
154处指示,可计算z堆的每个亮视场图像的焦点度量的值。可使用任何适当的焦点度量。示例性焦点度量提供在每个图像内的对比度的测量。对比度的测量可以是任何适当的对比度指示、预测和/或相关性。提供焦点度量的适当算法是Vollath F4、Vollath F5、Tenengrad、Brenner、归一化方差、改进拉普拉斯能量和、拉普拉斯能量、熵、峰和谷的深度等。见Osibote,O.A.等人,J Microsc.2010年11月;240(2):155-163和Santos,A.等人,JMicrosc.1997年12月;188(3):264-272,其通过引用并入本文。
在156处指出,可根据z堆的亮视场图像的焦点度量的值确定光致发光成像的候选焦点位置。候选焦点位置可以是光致发光成像的最佳焦点位置的近似。(因此,在一些实施例中,候选焦点位置可被选择为名义上的最佳光致发光焦点位置)。候选焦点位置可以位于对比度峰130a,130b之间,即,在对比度谷132中(见图3)。候选焦点位置可以近似地或精确地在峰130a,130b之间的中点处。
可以通过将曲线拟合到z堆的亮视场图像的各数据点来获得候选焦点位置,其中,每个数据点由焦点位置和焦点度量的值限定。在透射照明情况下,曲线可以具有单个峰,而不是两个峰,其中,单个峰的顶点通常对应于对比度谷132的最低点和对比度峰130a,130b中间。例如,曲线可以由单项高斯函数限定。利用该方法,在候选焦点位置是其中焦点度量沿着曲线处于最大值的焦点位置。如下面示例1进一步描述的,使用单项高斯函数来寻找候选焦点位置允许在大范围的焦点位置上仅收集稀疏堆的亮视场图像。单项高斯函数可以限定偏置到透射照明的实际最佳焦点的左侧或右侧的候选焦点位置。在其他实施例中,可利用二项高斯函数。
在158处指出,可以基于候选焦点位置获得光致发光焦点位置。可直接从候选焦点位置获得光致发光焦点位置,可选择地,在进行任何进一步的成像之前,直接从候选焦点位置获得光致发光焦点位置。例如,针对相同视场(或其他视场)的样本的随后的光致发光成像,候选焦点位置可被选择为(名义上的)最佳光致发光焦点位置。作为另一示例,候选焦点位置可在数学上被调节预定的偏移,以针对相同视场(或其他视场)的样本的随后的光致发光成像产生(名义上的)最佳光致发光焦点位置。预定的偏移表示透射照明配置和落射照明配置之间的差异。该偏移可包括仪器偏移,其表示光学差异(如,色差)和/或机械差异等。或替代地偏移还还可以包括样本偏移,其表示沿着样本结构的光轴的不同的平均位置,该样本结构产生透射光相对于光致发光的样本结构的相移。
可替代地,可基于候选焦点位置发起最佳光致发光焦点位置的搜索。可基于候选焦点位置选择样本的光致发光成像的一组光致发光焦点位置。该组光致发光焦点位置用来通过提取(refine)候选焦点位置来搜索最佳光致发光焦点位置。该组光致发光焦点位置可以限定涵盖候选焦点位置的焦点位置的范围。光致发光的焦点位置的范围可以明显小于用于透射照明的焦点位置的范围,如,不大于透射照明范围的约3/4、2/3或1/2等,因为候选焦点位置通常为最佳光致发光焦点位置的相当准确的估计。在一些实施例中,光致发光焦点位置的范围可不大于光致发光的物镜的景深的约1.5倍、2倍、3倍或4倍。该组光致发光焦点位置的步长还可以明显小于透射照明的步长,如不大于透射照明步长的约3/4、2/3或1/2等。在一些实施例中,光致发光范围的至少一端可以在候选焦点位置的约10-30微米内。
该组光致发光焦点位置可以由预定的固定数量的焦点位置或至少是预定的但潜在变化数量的焦点位置组成。如果预定数量的焦点位置不足以找到最佳光致发光焦点位置,则可对该组添加一个或多个额外的焦点位置以扩大该组范围,直到能够识别对比度峰。(例如,预定数量的焦点位置的全都焦点位置可以大于或小于最佳光致发光焦点位置。)可以沿着对比度增加的方向扩展该组。
在160指出,在获得的(一个或多个)光致发光焦点位置处可以收集样本的(一个或多个)光致发光图像。如果直接从候选焦点位置获得焦点位置,则可以在单个光致发光焦点位置处收集一个或多个光致发光图像。替代地,可以在固定或可变范围的焦点位置上收集固定或可变组的光致发光图像,以产生用于提取候选焦点位置的z堆的光致发光图像。
可以针对光致发光堆的每个图像计算焦点度量的值,如上面针对透射照明图像所述的。然而,相比于透射照明,该堆的光致发光图像的焦点度量的值可仅产生单个峰。单个峰的顶点的焦点位置可通过任何适当方法确定,如将曲线拟合至数据点,如上面针对透射照明描述的。在单个峰的顶点处的焦点位置可被看做是光致发光的最佳焦点位置。
可以或可以不从样本的相同视场收集进一步的光致发光图像。在一些实施例中,来自z堆的一个或多个光致发光图像可以被选择为足够接近在对比度峰的顶点处的最佳(理论上的)焦点位置和/或作为具有足够的质量,且可以不进行在视场处的进一步成像。在一些实施例中,最佳理论上的焦点位置可以与针对z堆的光致发光图像测试的最近的焦点位置进行比较。如果最佳理论上的焦点位置不在测试的最近的焦点位置附近的阈值内,则可将显微镜系统调节至最佳光致发光焦点位置(对比度峰的顶点),且可收集至少一个额外的光致发光图像。
来自透射照明图像中的堆的两个或更多个图像和/或来自光致发光图像中的堆的两个或更多个图像可通过图像处理至少部分彼此结合以产生一个或多个额外图像。可以通过可选地在逐个像素的基础上组合透射照明图像堆中的两个或更多个,创建数字相位图像。相对于构成右侧对比度峰130b的对应图像,构成左侧对比度峰130a的图像可展示出对比度反转(contrast inversion)(见图3)。因此,可通过组合多个透射照明图像的堆以创建数字相位图像,该多个透射照明图像包括这样的一对图像:它们相对于彼此展示出对比度反转的和/或表示在其中针对图像堆发生局部对比度最小值(即,对比度谷132的最低点,见图3)的焦点位置之上或之下的焦点位置。例如,通过对多个透射照明图像的对应像素的强度值求和,可组合图像。替代地,或此外,可从堆的两个或更多个光致发光图像创建复合光致发光图像。复合图像可以是来自两个或更多个图像的具有较高对比度的各像素的z轴投影。换句话说,复合图像的每个区域可选择性地由这样的像素组成:根据该像素,各图像中的一个图像都在该区域具有最佳对比度。
所述方法步骤适于针对样本座和/或样本的初始视场寻找候选焦点位置和最佳(或名义上的最佳)光致发光焦点位置。在已经针对初始视场获得至少一个候选焦点位置和/或最佳光致发光焦点位置之后,针对相同样本座或样本内的随后的视场可以显著修改这些方法步骤。随后的视场表示样本座上的不同位置(如,井),其可以是或可以不是彼此流体隔离、空间分离或分散的。在一些实施例中,如,在低放大率的物镜的情况下,针对初始位置(和初始视场)获得的相同的候选焦点位置和/或相同最佳(或名义上的最佳)光致发光焦点位置可在不修改的情况下用于相同样本座的所有随后的位置。替代地,可针对一个或多个随后的位置单独确定候选焦点位置和/或最佳光致发光焦点位置。针对每一个随后的位置,测试的透射照明范围可具有端点,基于载物台的行进倾斜(travel tilt),相对于初始位置的范围调节该端点。在其他实施例中,相同的候选焦点位置可用于相同的样本座的所有随后的位置,而最佳光致发光焦点位置可根据针对每个随后的位置收集的z堆的光致发光图像来确定。在又一实施例中,候选焦点位置和/或最佳光致发光焦点位置可仅针对样本座的感兴趣的位置的子组来获得(如,板的每隔一个的井、最靠近板的角落的四个井等),且其他候选焦点位置或最佳光致发光焦点位置可通过插值和/或外推法确定。
可以测量载物台的行进倾斜以识别待施加到样本座的随后的位置的透射照明范围、候选焦点位置、光致发光范围和/或最佳光致发光焦点位置的适当偏移。为了利用具体示例来说明行进倾斜,96井板(8行*12列)可以具有9mm的井间距。行进倾斜可以确定为沿平行于列的方向的每72mm(8个井)的载物台行进存在24微米的z轴偏移(即,沿着每列井存在3微米/井的z偏移)以及平行于行的每108mm的载物台行进存在48微米的z轴偏移(即,沿着每行井存在4微米/井的z偏移)。因此,基于来自测试的初始井的(一个或多个)对应值或范围,指示的偏移可以被施加至板的其他井的透射照明范围、候选焦点位置、光致发光范围和/或最佳(或名义上的最佳)光致发光焦点位置。以此方式,可以对板的各井进行明显较快地成像。
基准点可被成像以确定载物台的行进倾斜和/或提供沿着z轴的样本的位置的估计(如,促进选择透射照明成像和/或光致发光成像的焦点位置的范围)。可由样本座或载物台提供各基准点。在示例5中描述示例性基准点。
III.示例
以下示例描述涉及本公开的利用基于透射照明的自动聚焦的显微镜成像系统和使用该显微镜成像系统的方法的选择的方面和实施例。这些示例被包括用于说明且不旨在限制或限定本公开的整个范围。
示例1.候选焦点位置的确定
该示例描述了基于在两个不同堆密度下获得的堆的亮视场图像的对比度值的光致发光成像的候选焦点位置的示例性确定;见图5和6。
图5示出呈现利用在透射照明配置中操作的图1A的显微镜系统的实施例获得的数据的图。该图示出对比度的测量(Vollath F4)(还称为焦点度量)与从96井板的井包含的HeLa(海拉)细胞收集的图像的焦点位置的关系。利用位于15微米的焦点位置间隔处的4倍物镜获得相对密集堆的亮视场图像。每个图像提供图上的点。具有单个峰的单项高斯曲线可以拟合到这些点,即使这些点构成两个对比度峰。测试的焦点位置的范围为600微米以产生40个图像。有效的景深接近100微米。单独确定的光致发光的最佳焦点接近306微米,其接近通过将数据点与曲线连接而概念地产生的对比度谷132的最低点170。谷132位于一对对比度峰130a、130b之间,如图3中所示。高斯曲线的单个宽峰的顶点172位于约270微米处,比谷132的最低点170大30微米。
图6示出呈现如在图5中获得的数据和拟合的曲线的另一图,但是其中,在75微米的焦点位置间隔处收集相对稀疏堆的亮视场图像。在此,仅收集九个图像,这是采样不足。然而,在收集仅五分之一多的图像之后,所指示的候选焦点位置在图5中找到的焦点位置的5微米内。在图5和6之间的候选焦点位置的差异小于透射照明景深的5%。与最佳光致发光焦点位置的总误差约40微米,其在光致发光景深内,以允许选择和使用候选焦点位置作为名义上的最佳光致发光焦点位置。
示例2.候选焦点位置和最佳焦点位置的确定
该示例描述针对光致发光成像的候选焦点位置和最佳焦点位置的示例性确定,其中,基于从亮视场(透射照明)图像的堆确定的候选焦点位置,选择光致发光图像的堆的焦点位置;见图7。
图7示出描绘作为焦点位置的函数的对比度的测量(Vollath F4)的图。利用图1A和1B的配备有20倍物镜(0.45NA)的且在透射照明模式下操作随后在落射照明模式下操作的显微镜系统的实施例获得图中的数据。图示出针对从包含在96井板的井中的细胞系(CHO、NIH3T3、PC-12或U20S)中的一个收集的亮视场图像的对比度的拟合的代表性的单项高斯曲线(“T拟合”)。另外,在针对从相同细胞系和视场收集的光致发光图像的堆的图上示出单独的数据点和拟合的、代表性的单项高斯曲线。箭头180、182标记亮视场图像和光致发光图像的对比度测量的相应顶点,且仅隔开约7微米。候选焦点位置由箭头180表示,且最佳光致发光焦点位置由箭头182表示。候选焦点位置用作用于选择光致发光图像的一组焦点位置的引导。对于对井中包含的各种细胞系执行的该组实验,使用10-15个图像找到每个候选焦点位置且使用多达7个图像找到每个最佳光致发光焦点位置。找到最佳光致发光焦点位置所需的图像数量可例如至少部分地由样本的特性确定,如,样本厚度和已经染色的(一个或多个)具体的细胞组成。
示例3.利用预定数量的图像的最佳焦点确定
该示例描述根据预定数量的光致发光图像、利用低放大率物镜(4倍)的光致发光成像的最佳焦点位置的示例性确定;见图8。
图8示出描绘作为收集的光致发光图像的数量的函数的光致发光的最佳焦点位置的偏移的图。该偏移是相对于利用示例1和2中的透射照明确定的候选焦点位置的。利用图1A和1B的配备有4倍物镜的且分别在透射照明模式和落射照明模式下操作的显微镜系统的实施例获得图中的数据。利用八个不同的细胞系且利用每个光致发光图像堆的五个光致发光图像的预设的最小值来执行该研究。未观察到各种细胞系的最佳焦点位置的一致的偏移。五个光致发光图像堆在每种情况下足以确定光致发光的最佳焦点位置。
结果示出在期望的景深内重新聚焦的需要是最小的。换句话说,从透射照明图像获得的候选焦点位置可直接用于光致发光成像,可选择地,其具有数学上施加的偏移。如果需要重新聚焦提取候选焦点位置,则在仅利用五个透射照明图像测试的每种情况下可实现该目的。
示例4.利用可变数量的图像的最佳焦点确定
该示例描述根据可变数量的光致发光图像、利用中间放大率物镜(20倍)的光致发光成像的最佳焦点的示例性确定;见图9。
图9示出描绘作为收集的光致发光图像的数量的函数的光致发光的最佳焦点位置的偏移的图。该偏移是相对于利用示例1和2中的透射照明确定的候选焦点位置的。利用图1A和1B的配备有20倍物镜的且分别在透射照明模式和落射照明模式下操作的显微镜系统的实施例获得图中的数据。利用八个不同的细胞系且利用每个堆中的五个光致发光图像的预定最小大小执行该研究。如果仅在五个图像的情况下,不能识别对比度峰的位置,则额外图像被相继添加到光致发光堆,直到光致发光对比度峰可以被识别。针对位置中的一个以外其他所有的位置,光致发光的最佳焦点位置利用七个或更少的图像在25微米的偏移的跨度上被找到。
示例5.倾斜补偿的基准点和/或z轴样本位置的估计
该示例描述示例性基准点及其使用。基准点可以促进补偿载物台的倾斜,当每个位置在光轴上时,其使样本座内的各位置沿着光轴彼此偏移。另外或替代地,可对基准点进行成像以估计沿着z轴的样本位置;见图10-12。
图10示出图1A的显微镜系统50的载物台76。载物台76支撑样本座78并包括多个光学可检测的基准点190。基准点可与载物台集成形成或可拆除,如由安置在载物台的主体上的可拆除框架保持。框架可经配置以接收和保持样本座。可存在三个或更多个基准点。在所描绘的实施例中,四个基准点190设置在样本座的外面但靠近其外围(如,靠近样本座的四个角)。
图11示出一个基准点190的放大视图。基准点可以具有主体192和形成在主体的顶侧(或底侧)上的图案194。例如,图案可以被蚀刻到主体中或可通过在主体上沉积材料层生成。示例性材料是铬。材料层可(例如,通过吸收、反射、折射或散射入射光等)改变通过主体的光的透射。图案可仅覆盖主体192的顶侧(或底侧)的一部分,使得图案中的各元素在其外围处产生高对比度的区域。因此,每个基准点的图案可以利用透射照明在的焦点位置的范围内被成像以识别透射光的最佳焦点。在载物台未展示出倾斜时,基准点可在z轴上具有相对于彼此已知的高度。例如,基准点可处于与保持理想水平的载物台相同的高度。因此,针对基准点确定的最佳透射照明焦点能够与不存在倾斜时的基准点的已知高度进行比较以确定载物台行进倾斜的程度(如果存在的话)。
图12示出图10的载物台76和样本座78的截面图。基准点190的最佳透射照明焦点可用来基于系统的已知垂直偏移来估计样本的最佳透射照明焦点位置。图案194在基准点上的高度对应于基准点190的最佳透射照明焦点。搁板198相对于图案194的垂直偏移196(如果存在的话)可以是已知的。在所描绘的实施例中,基本不存在垂直偏移。在搁板198上的样本座78的底部边缘200具有相同的垂直偏移。从底部边缘200到附近的井122的底204的垂直偏移202的值可从样本座的制造商获得。因此,可通过将垂直偏移196和202施加至针对基准点中的一个或多个获得的最佳透射照明焦点位置来获得井中的一个或多个的候选焦点位置的大致估计。
在其他实施例中,可利用位于显微镜系统的载物台76下面的光学测量装置210(如,基于激光器的装置)确定载物台倾斜。装置210可在样本座的多个位置处测量装置210与样本座的底侧214之间的垂直距离212。当不同位置位于光轴上时改变垂直距离指示载物台行进倾斜。
示例6.选择的实施例
本示例将本公开的选择的实施例描述为一系列索引的段落。
1.一种对包括生物细胞的样本进行成像的方法,所述方法包括:(A)针对第一组焦点位置检测透射通过所述样本的光以收集第一堆图像;(B)计算所述第一堆图像的焦点度量的值;(C)基于所述值确定候选焦点位置;以及(D)针对第二组焦点位置检测来自所述样本的光致发光以收集第二堆图像,其中,所述第二组焦点位置比所述第一组焦点位置限定的范围更小,并且其中,所述第二组焦点位置中的至少一个焦点位置是基于所述候选焦点位置的。
2.根据段落1所述的方法,其中,所述第二组焦点位置比所述第一组焦点位置具有更小的步长。
3.根据段落2所述的方法,其中,所述第一组焦点位置的步长比所述第二组焦点位置的步长大至少50%。
4.根据段落1-3中任一项所述的方法,进一步包括以下步骤:基于仅在所述第二组焦点位置中的初始焦点位置处检测到的光致发光来确定所述第二堆图像中的每个图像的曝光时间。
5.根据段落1-4中任一项所述的方法,进一步包括以下步骤:组合所述第一堆中的至少两个图像以创建所述样本的数字相位图像,其中,所述第一堆中的至少两个图像的对表示分别在所述候选焦点位置之上和之下的焦点位置。
6.根据段落1-5中任一项所述的方法,进一步包括以下步骤:组合所述第二堆中的多个图像以创建包括图像区域的复合光致发光图像,其中,所述图像区域中的每个主要地或唯一地由所述多个图像中的具有所述图像区域的最佳焦点的一个图像提供。
7.根据段落1-6中任一项所述的方法,其中,所述候选焦点位置在所述焦点度量的一对峰中间,并且其中,确定候选焦点位置的所述步骤包括以下步骤:(i)将曲线拟合到由所述第一堆图像的焦点度量的值和第一组焦点位置所限定的数据点;和(ii)从所述曲线获得所述候选焦点位置。
8.根据段落7所述的方法,其中,所述曲线具有在由所述第一组焦点位置限定的范围内的单个峰,并且其中,确定候选焦点位置的步骤包括寻找所述单个峰的顶点的焦点位置的步骤。
9.根据段落1-8中任一项所述的方法,其中,所述候选焦点位置在最佳焦点位置的约20微米内,以用于检测来自所述样本的光致发光。
10.根据段落1-9中任一项所述的方法,进一步包括以下步骤:(i)计算所述第二堆图像的焦点度量的值;和(ii)基于所述第二堆图像的值来寻找用于检测来自所述样本的光致发光的最佳焦点位置。
11.根据段落10所述的方法,进一步包括以下步骤:在寻找最佳焦点位置的步骤之后根据最佳焦点位置来调节焦点,以及在调节焦点之后收集样本的光致发光图像。
12.根据段落10或11所述的方法,其中,寻找最佳焦点位置的步骤包括以下步骤:识别在更小范围的焦点位置内的光致发光对比度的峰。
13.根据段落12所述的方法,其中,寻找最佳焦点位置的步骤包括以下步骤:选择所述第二组焦点位置中的一个焦点位置作为最接近所述峰的顶点的最佳焦点位置。
14.根据段落12所述的方法,其中,寻找最佳焦点位置的步骤包括以下步骤:选择与所述第二组焦点位置中的每个焦点位置不同的最佳焦点位置。
15.根据段落14所述的方法,其中,针对第二组焦点位置检测来自所述样本的光致发光的步骤包括以下步骤:检测来自预定数量的焦点位置的光致发光以收集一组光致发光图像,以及根据所述一组光致发光图像来确定是否能够识别对比度峰。
16.根据段落15所述的方法,进一步包括以下步骤:如果所述根据预定数量的焦点位置,而对比度峰不可识别,则增加一个或多个焦点位置至所述预定数量的焦点位置以创建一组或多组扩展的光致发光图像,直到根据一组扩展的光致发光图像能够识别对比度峰为止。
17.根据段落1-16中的任一项所述的方法,其中,检测光的步骤、计算值的步骤和确定候选焦点位置的步骤针对由样本座创建的两个或更多个位置执行,其中,所述两个或更多个位置彼此水平地隔开。
18.根据段落17所述的方法,其中,所述样本座由载物台支撑,所述载物台能够移动以将所述两个或更多个位置中的每个放置在光轴上,所述方法进一步包括以下步骤:基于通过所述两个或更多个位置透射的光的检测来确定所述载物台的倾斜。
19.根据段落18所述的方法,进一步包括以下步骤:基于所述载物台的倾斜来选择针对所述样本座的至少一个其他位置的焦点位置的范围。
20.根据段落1-19中的任一项所述的方法,其中,所述样本由受载物台支撑的样本座保持,其中,所述载物台能够移动以将所述样本座的不同位置放置在光轴上,并且其中,所述载物台包括多个基准点,所述方法进一步包括以下步骤:成像所述基准点以确定所述载物台的行进倾斜。
21.一种对包括生物细胞的样本进行成像的方法,所述方法包括(A)针对一组焦点位置检测透射通过所述样本的光以收集图像堆;(B)计算所述图像堆的焦点度量的值;(C)基于所述值确定候选焦点位置;(D)基于所述候选焦点位置获得光致发光焦点位置;以及(E)检测所述样本在所述光致发光焦点位置处的光致发光图像。
22.根据段落21所述的方法,其中,获得光致发光焦点位置的所述步骤包括以下步骤:(i)分配所述候选焦点位置作为所述光致发光焦点位置;或(ii)通过对所述候选焦点位置施加预定偏移来计算所述光致发光焦点位置。
23.根据段落21所述的方法,其中,所述候选焦点位置在所述焦点度量的一对峰中间,并且其中,确定候选焦点位置的所述步骤包括以下步骤:(i)将曲线拟合到由所述图像堆的焦点度量的值和一组焦点位置所限定的数据点;和(ii)根据所述曲线获得所述候选焦点位置。
24.根据段落23所述的方法,其中,所述曲线具有在由所述一组焦点位置限定的范围内的单个峰,并且其中,确定候选焦点位置的所述步骤包括寻找所述单个峰的顶点的焦点位置的步骤。
25.根据段落21-24中任一项所述的方法,其中,所述一组焦点位置为第一组焦点位置,且所述图像堆为第一堆图像,其中,获得光致发光焦点位置的步骤包括以下步骤:针对第二组焦点位置检测来自所述样本的光致发光以收集第二堆图像,且其中,第二组焦点位置中的至少一个焦点位置是基于候选焦点位置的。
上述公开可包含具有独立使用的多个不同发明。虽然这些发明中的每个已经以其(一个或多个)优选形式公开,但其在本文所公开的和例示的具体实施例不被认为是限制性的,因为各种变体是可能的。发明的主题包括本文所公开的各种元素、特征、功能和/或性质的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。随附权利要求具体指出被认为是新颖且非显而易见的某些组合和子组合在元素、特征、功能和/或性质的其他组合和子组合中实施的发明可在要求保护本申请或相关申请的优先权的应用中要求保护。这种权利要求无论是涉及不同发明还是相同发明且无论在范围上比原始权利要求更宽、更窄、相等还是不同也都被认为包括在本公开的发明的主题内。进一步地,识别的元素的原始指示,如,第一、第二或第三,用来区分元素,且不指示这些元素的具体位置或顺序,除非有具体说明。

Claims (20)

1.一种对包括生物细胞的样本进行成像的方法,所述方法包括:
针对第一组焦点位置检测来自亮视场光源的透射通过所述样本的光以收集第一堆图像;
计算所述第一堆图像的焦点度量的值;
基于所述值来确定候选焦点位置;以及
针对第二组焦点位置检测来自激发光源的所述样本的光致发光以收集第二堆图像,其中,所述第二组焦点位置比所述第一组焦点位置限定的范围更小,并且其中,所述第二组焦点位置中的至少一个焦点位置是基于所述候选焦点位置的。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第二组焦点位置比所述第一组焦点位置具有更小的步长。
3.根据权利要求1所述的方法,进一步包括以下步骤:基于仅在所述第二组焦点位置中的初始焦点位置处检测到的光致发光来确定所述第二堆图像中的每个图像的曝光时间。
4.根据权利要求1所述的方法,进一步包括以下步骤:组合所述第一堆中的至少两个图像以创建所述样本的数字相位图像,其中,所述第一堆中的至少两个图像的对表示分别在所述候选焦点位置之上和之下的焦点位置。
5.根据权利要求1所述的方法,进一步包括以下步骤:组合所述第二堆图像中的多个图像以创建包括图像区域的复合光致发光图像,其中,所述图像区域中的每个主要地或唯一地由所述多个图像中的具有所述图像区域的最佳焦点的一个图像提供。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述候选焦点位置在所述焦点度量的一对峰中间,并且其中,确定候选焦点位置的步骤包括以下步骤:(i)将曲线拟合到由所述第一堆图像的焦点度量的值和所述第一组焦点位置所限定的数据点;以及(ii)根据所述曲线获得所述候选焦点位置。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,所述曲线具有在由所述第一组焦点位置限定的范围内的单个峰,并且其中,确定候选焦点位置的步骤包括寻找所述单个峰的顶点的焦点位置的步骤。
8.根据权利要求1所述的方法,进一步包括以下步骤:(i)计算所述第二堆图像的焦点度量的值;和(ii)基于所述第二堆图像的值来寻找用于检测来自所述样本的光致发光的最佳焦点位置。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,寻找最佳焦点位置的步骤包括以下步骤:识别在更小范围的焦点位置内的光致发光对比度的峰。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,寻找最佳焦点位置的步骤包括以下步骤:选择所述第二组焦点位置中的一个焦点位置作为最接近所述峰的顶点的最佳焦点位置。
11.根据权利要求8所述的方法,其中,寻找最佳焦点位置的步骤包括以下步骤:选择与所述第二组焦点位置中的每个焦点位置不同的最佳焦点位置。
12.根据权利要求1所述的方法,其中,针对第二组焦点位置检测来自所述样本的光致发光的步骤包括以下步骤:检测来自预定数量的焦点位置的光致发光以收集一组光致发光图像,以及根据所述一组光致发光图像来确定是否能够识别对比度峰。
13.根据权利要求12所述的方法,进一步包括以下步骤:如果根据所述预定数量的焦点位置而不能够识别所述对比度峰,则将一个或多个焦点位置增加至所述预定数量的焦点位置以创建一组或多组扩展的光致发光图像,直到根据一组扩展的光致发光图像能够识别对比度峰为止。
14.根据权利要求1所述的方法,其中,检测光的步骤、计算值的步骤和确定候选焦点位置的步骤针对由样本座创建的两个或更多个位置执行,其中,所述两个或更多个位置彼此水平地隔开,并且其中,所述样本座由载物台支撑,所述载物台能够移动以将所述两个或更多个位置中的每个位置放置在光轴上,所述方法进一步包括以下步骤:基于通过所述两个或更多个位置透射的光的检测来确定所述载物台的倾斜。
15.根据权利要求14所述的方法,进一步包括以下步骤:基于所述载物台的倾斜来选择针对所述样本座的至少一个其他位置的焦点位置的范围。
16.根据权利要求1所述的方法,其中,所述样本由受载物台支撑的样本座保持,其中,所述载物台能够移动以将所述样本座的不同位置放置在光轴上,并且其中,所述载物台包括多个基准点,所述方法进一步包括以下步骤:对所述基准点进行成像以确定所述载物台的行进倾斜。
17.一种对包括生物细胞的样本进行成像的方法,所述方法包括:
针对一组焦点位置检测来自亮视场光源的透射通过所述样本的光以收集图像堆;
计算所述图像堆的焦点度量的值;
基于所述值确定候选焦点位置;
基于所述候选焦点位置获得光致发光焦点位置;以及
检测所述样本在所述光致发光焦点位置处的光致发光图像,其中所述光致发光图像是利用激发光源收集的。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,获得光致发光焦点位置的步骤包括以下步骤:(i)分配所述候选焦点位置作为所述光致发光焦点位置;或(ii)通过对所述候选焦点位置施加预定偏移来计算所述光致发光焦点位置。
19.根据权利要求17所述的方法,其中,所述候选焦点位置在所述焦点度量的一对峰中间,并且其中,确定候选焦点位置的步骤包括以下步骤:(i)将曲线拟合到由所述图像堆的焦点度量的值和所述一组焦点位置所限定的数据点;以及(ii)根据所述曲线来获得所述候选焦点位置。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,所述曲线具有在由所述一组焦点位置所限定的范围内的单个峰,并且其中,确定候选焦点位置的步骤包括:寻找所述单个峰的顶点的焦点位置的步骤。
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