JP5989109B2 - 蛍光顕微鏡システムの標準化 - Google Patents

Description

本発明は、一般的にデジタル病理学に関し、より具体的には、時間及び／又は環境変化に亘って個々の装置の感度を維持すると共に、同様な蛍光顕微鏡画像化装置のグループの感度を補正することに関する。

蛍光顕微鏡の頻繁に主張される利益の一つは、信号強度測定の定量的性質である。残念ながら、この主張される利益は、蛍光信号が、ある絶対強度基準と再度、容易に関連することができることを意味するように一般に誤解されている。実際には、不可能ではないにしても、絶対（較正）測定は、安定性の欠如により、構成された基準標準を実現することは困難である。

絶対感度の観点から、蛍光顕微鏡システム較正は、較正された基準標準の使用を必要とする。標本の準備の困難性、特に時間に亘るサンプルブリーチングの不可避の効果により、蛍光顕微鏡の較正に適した安定で有機ベースの標本を生成することは不可能である。いくつかの安定で無機の標本が取得可能であるが、スペクトル応答の変化により、これらは、正確な較正に適していない。

明視野顕微鏡とは異なり、蛍光信号の較正は、広帯域の光学伝送の関数が簡素ではないことにより複雑である。これは、波長とも強い関係を有する。蛍光色素は、非常に狭いスペクトル応答を有するように設計されており、それらの応答曲線が照明及び画像化経路内の複数のバンドパスフィルタの急激なエッジに重複する。蛍光色素又はフィルタ帯域幅における小さな変化でさえもシステムの感度を変化させる。そのため、個々の光学要素の較正に基づく特定の蛍光色素に対するシステム全体の感度を予測することは非常に困難である。

したがって、上述したように、従来のシステムにおいて見出されたこれらの重大な課題を解消するシステム及び方法が求められている。

本発明者らは、多くの場合、絶対較正が必要ではないと認識している。その代わりとして、一又はそれ以上の蛍光装置の応答を標準化することで十分である。より優れたアプローチは、システムとして装置全体を扱い、かつ標準化される必要がある蛍光色素を用いるシステムのエンド−トゥ−エンドでの反応性を測定することであり、それにより、サンプル及び画像化システム両方の特有のスペクトル特性を含む。しかし、サンプルフェーディングによる信号ドリフトの困難性は、この方法が、時間に亘って安定な基準標準を提供することを妨げる。本発明者らは、正規化及びドリフトの効果を分離することにより標準化が実現されることができると理解している。

以下の詳細な説明及び添付図面を検討することによって、本発明の他の特徴や利点が当業者にとってより容易に明確にできる。

以下の詳細な説明及び添付図面を検討することによって本発明の構造及び動作を理解することができ、ここにおいて、類似の参照符号は類似の部分を表す。
図１は、一実施形態に係る光学顕微鏡システムの第１実施形態のブロック図である。 図２は、一実施形態に係る光学顕微鏡システムの第２実施形態のブロック図である。 図３は、一実施形態に係る光学顕微鏡システムの第３実施形態のブロック図である。 図４は、一実施形態に係る図１から３のスキャナシステムにおけるモジュールのセットの一例を示すブロック図である。 図５は、本明細書に記載される様々な実施形態と結合して用いられる有線又は無線プロセッサイネーブルドシステムの一例を示すブロック図である。 図６は、一実施形態に係る蛍光顕微鏡スキャニング装置を標準化するプロセスの一例を示すフロー図である。

本開示に開示された特定のいくつかの実施形態は、同様の蛍光顕微鏡画像化装置のグループの感度を補正すると共に、時間及び／又は環境変化に亘る個々の装置の感度を維持することを提供する。この記載を読めば、様々な代替的な実施形態や代替的なアプリケーションにおいて本発明を実装する方法が当業者にとって明白になる。しかしながら、本発明の様々な実施形態について本開示に記載するが、これらの実施形態は単に例として示すのであって限定するものではないと理解すべきである。そのため、様々な代替実施形態の詳細な説明は、添付した請求の範囲で記載されている本発明の範囲ないし広がりを限定するように解釈されるべきではない。

上記で説明したように、本発明者らは、標準化が、正規化及びドリフトの効果を分離することにより実現されうることを理解している。

以下の用語は、本明細書において以下の定義を有する。

“標準化”は、２又はそれ以上のシステムを同一の感度を有するようにする一般的なプロセスをいう。これは、標準化及びドリフト補正を含む２段階のプロセスで実現されうる。

“正規化”は、２又はそれ以上の装置を特定の時点において同一の結果を提供するようにするプロセスをいう。

“ドリフト補正”は、時間及び／又は環境状態に亘って個々の装置それぞれの感度を変化させるプロセスをいう。

本発明者らは、標準化のこれらの２つの異なる態様（つまり、正規化及びドリフト補正）の分離が、補正の各タイプに最適化されている基準サンプルの使用を可能にすることを認識しています。特定の蛍光色素を用いるサンプルは、演算において一つのシステムを別のシステムにするために、フィルタ及び蛍光帯域幅の効果を包含することができる。

一方、ドリフトは、主にシステム間の帯域幅変動に反応せず、明示的に取得可能な広帯域基準サンプルを用いて実現されうる。このようなサンプルの一例は、色付けされたプラスチック顕微鏡スライドである。これらのスライドは、帯域幅の特性の標準化に適していないが、時間に亘って非常に安定であり、時間に亘る装置感度ドリフトに適した広帯域スペクトル応答を提供する。

画像標準化一実施形態では、２又はそれ以上の蛍光顕微鏡画像化装置Ａ及びＢは、各システムから導かれる強度が等しくなるように標準化される。この例では、Ａは、基準システムであり、Ｂは、標準化システムである。目的は、時間ｔでシステムＢから画像ピクセル強度を適用した時、時間０での露出Ｔ_Ａ（０）におけるシステムＡで得られるものに対する各強度を補正する式を導くことである。
Ｉ_Ａ（０）＝ｆ［Ｉ_Ｂ（ｔ）］

変数：
Ｉ_Ａ（０）＝時間０でのシステムＡのピクセル強度と等しい；
Ｉ_Ｂ（ｔ）＝時間（ｔ）でのシステムＢからのピクセル強度；
Ｇ_Ｂ＝Ａに対するシステムＢのガンマ（時間に亘って一定）；
Ｏ_Ｂ＝Ａに対するシステムＢのオフセット（時間に亘って一定）；
Ｄ_Ｂ（０）＝時間０でのシステムＢのドリフト要因；
Ｄ_Ｂ（ｔ）＝時間ｔでのシステムＢのドリフト要因；
Ｔ_Ｂ（０）＝時間０でのシステムＢの組織露出；及び
Ｔ_Ｂ（ｔ）＝時間ｔでのシステムＢの組織露出。

導出：
２つのリニアシステムＡ及びＢについては、時間０でのシステムＢとシステムＡとの強度測定に関連するガンマＧ_Ｂ及びオフセットＯ_Ｂを以下のように定義する。

とりわけ、時間０において、各システムは、特有の露出での画像を必要としているが、式（１）の露出補正を明示的に含む必要はない。なぜなら、任意の取り得る露出差が既にＧ及びＯに含まれるからである。

特定のシステムについて、当該システムの感度が（例えば、光源の劣化により）時間に亘ってドリフトする場合、時間ｔでの強度は、時間０で及び時間ｔの感度Ｄを知ること、及び任意の露出変数Ｔを補正することにより、時間０での強度から外挿されうる。

式（１）を用いて式（２）のＩ（０）を置換すると、以下の式になり、これは、任意の時間ｔでのシステムＡへのＢに関連する。

式（３）のＩ_Ａ（０）について解くと、Ｉ_Ｂ（ｔ）とＩ_Ａ（０）との所望の関係となる。

したがって、式（４）を用いて、補正パラメータのそれぞれを求めることにより蛍光顕微鏡システムの標準化が可能になる。

実際の適用：
図６は、実施形態に係る蛍光スキャニング装置を標準化する工程の一例を示す図である。一実施形態では、工程は、各システムの装置の標準化に続く初期基準ドリフトをキャプチャすることにより開始される。第１のシステムは、基準システムとして定義される（システムＡ）。残りの全てのシステム（システムＢ、Ｃ等）は、基準システムに対して標準化される。

ステップ（１）初期ドリフト基準
ドリフト基準画像は、色付けされたプラスチック又は他の“ドリフトスライド”を用いてキャプチャされる。時間０でのシステムＡのドリフト基準Ｄ_Ａ（０）は以下のように算出される。

とりわけ、各装置は、異なるドリフトスライドを使用しているが、各装置についての全ての後続のドリフトキャプチャは、その初期ドリフト基準のために用いられるスライドで行われるべきである。

ステップ（１）は、次に、各装置に対して繰り返され、各装置に対して初期ドリフト基準を算出する。ステップ（２）は、ステップ（１）及び（２）の間の任意の装置ドリフトを最小化するためにできるだけ早く完了すべきである。

ステップ（２）正規化
スライドは、正規化工程のために選択される。このスライドは、正規化される各システムにより一度に画像化される。この標本は、充分に準備され、標準化される蛍光色素の代表的なものとなる。これは、測定されるサンプルと同様の広い範囲のピクセル強度を有するべきである。また、これは、複数の露出により生じるフォトブリーチに対してできるだけ安定であるべきである。これは、長い周期に亘って安定である必要はなく、初期装備の標準化が完了した後には必要なくなる。

標準化基準スライドの画像がキャプチャされる。この画像は、各システムについてのガンマ及びオフセットを求めるために使用される。基準スライドの同一の領域は、装置ごとにキャプチャされるべきである。この領域の変化は、補正誤差を増大させうる。

ステップ（３）ガンマ値及びオフセット値の算出
各システムは、当該システムに特有のガンマ値及びオフセット値に関連付けられる。これは、非常に大きな変更が装置の照明又は画像化経路になされない限り変化せず、この場合、標準化工程全体が繰り返される。

規定により、システムＡが基準システムであるため、ガンマ値は、１．０に設定され、オフセット値は、０に設定される。

全ての残りのシステムのために、ガンマ値及びオフセット値は、標準化基準スライドの画像から得られうる。各装置からの画像のわずかな違いが存在するため、スケール要因の違い又は他のワーピングエフェクトにより、画像ピクセルは、別のシステムでキャプチャされるような同一のピクセルに正確に重畳されない。これらは、サブピクセルレジストレーションエラーと呼ばれる。したがって、１つのシステムからの個々のピクセル強度を他のシステムからの対応するピクセルと直接比較することによりガンマ値及びオフセット値を得られない場合がある。それに替えて、一実施形態では、２つの異なるシステム（例えば、基準システム及び標準化されるシステム）でキャプチャされた２つの画像の強度ヒストグラムを比較する統計的なアプローチが用いられる。

画像ヒストグラムの算出は、等しい領域が各画像で識別されることを必要とする。相関ベースの方法が用いられることができ、ここで、画像の１つにおける矩形領域は、基準領域として選択される。その後、第２の画像の等しいサイズの対象領域のためのサーチがなされる。各候補対象領域について、基準及び対象強度値は、ピクセルごとに比較され、二乗平均平方根（ｒｏｏｔ−ｍｅａｎ−ｓｑｕａｒｅｄ （ＲＭＳ））の差が算出される。最も小さいＲＭＳ差を有する対象領域は、ヒストグラムの算出において、基準領域に沿って、使用される対象領域として選択されることができる。

一実施形態では、“ヒストグラムマッチング”法は、ヒストグラムから標準化されるシステムのガンマ値及びオフセット値を求める根拠として用いられる。この方法では、各画像ヒストグラムについての累積分布関数（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ （ＣＤＦ））が算出される。（ガンマ）マッピングは、累積周波数がマッチする各画像における対応する強度を見出すことにより求められる。

ガンマ関数ディレクトリを用いることによるドローバックは、それ以降の画像に遭遇する全ての強度値のサンプルではなく、そのため、いくつかの形態の外挿が必要となる。また、ガンマ関数は、ガンマ関数の細部における誤差を導く（ヒストグラムビンの数と等しい）多数の自由度を有することができる。一実施形態では、これらのドローバックは、線形回帰を、ガンママッピングからスロープ及びオフセットにより規定される直線への数値のテーブルを低減するガンマ関数に適用することにより解消することができる。スロープ及びオフセットは、式（１）のＧ_Ｂ及びＯ_Ｂである。

回帰もまた、一次方程式（線形式）の誤差を推定する機会を提供する。例えば、直線とガンマ関数とのＲＭＳ差は、線形予測の標準誤差を推定する方法の１つである。ガンマ関数と回帰線との目視比較もまた、装置間に存在する非線形バイアスを明らかにしうる。

ステップ（３）が完了すると、各システムは、基準システムに対して正規化され、各システムの初期ドリフト基準が求められる。

ステップ（４）標準化画像の生成
ユーザの精度要求及び画像化システムのドリフト特性に応じて、“ドリフト補正”が各装置に対して一定間隔で行われるべきである。多くの場合、この補正は、１日ごと、又はシステムを使用するごとに行われうる。有色プラスチックスライド又はステップ（１）からの他の適切な“ドリフトスライド”を用いて、ドリフト補正画像がキャプチャされる。時間ｔでのシステムのドリフト補正Ｄ（ｔ）は、以下の式（６）で算出される。

Ｄ（ｔ）が得られると、システムは、ステップ（２）で行われる正規化に用いられるのと同一の特性を有する標本の画像をキャプチャするために用いられうる。

式（４）は、画像ファイルに保存されたピクセル強度を補正するために用いられる、又はそれに替えて、画像が変化せずに保存され、ピクセル値が読み出されたときにピクセル強度を補正するために画像分析を可能にする又はソフトウェアを閲覧する。得られた画像補正が、どの画像フォーマットが可能か分からない見かけ上の強度を増加させうる場合があるため、この方法は、飽和時に生じるピクセル値“オーバーフロー”を回避しながら、最良な信号対ノイズ比を維持する利益を有するが、元の画像ピクセルは、飽和しない。

このアプローチの利益
２又はそれ以上のシステムの標準化から導かれる明らかな利益に加えて、このアプローチは、キャリブレーションスライドの損失又は損傷又は任意のシステムへの意図的な変更の後に回復することも可能にする。これは、また、標準化セットに加えられる新たなシステムもサポートする。装置のグループが標準化されると、元の基準システムは、次回以降の標準化にはもはや必要ではない。なぜなら、任意の標準化システムが元の基準装置の代わりとして用いられうるためである。これは、装置を（仮想的な）基準装置と比較することにより、装置の標準化を可能にし、それにより、元のシステムを参照し直す。

一実施形態では、基準装置は、工場で選別されることができ、いくつかの所望の許容範囲内での全てのサイトにおける全ての装置のパフォーマンスを維持するために、任意の他の装置が常にいつでも再度標準化されるように、複数の標準化された装置が維持されうる。

スキャニング装置の例
なお、この時に、本明細書に記載された様々なスキャニング装置がサンプルデータを画像化するためのラインスキャンカメラを用いるが、サンプルのデジタル画像を生成する任意の型のスキャニングシステムが、蛍光顕微鏡システムを標準化する本システム及び方法で用いるために適切であることを留意すべきである。

ここで、本願の標準化技術に用いられうるスキャニング装置の例の説明に移り、図１は、光学顕微鏡システム１０の一実施形態のブロック図を示す。システム１０の重要個所は、標本又はサンプル１２を走査しデジタル化する役割を有する顕微鏡スライドスキャナー１１である。サンプル１２は、光学的顕微鏡によって調べることができるもののいずれであってもよい。例えば、サンプル１２は、顕微鏡スライドであってもよく、あるいは光学的顕微鏡によって調べることができる他のサンプルの種類であってもよい。顕微鏡スライドは、組織及び細胞、染色体、ＤＮＡ、タンパク質、血液、骨髄、尿、バクテリア、ビード、生検材料、あるいは死んでいるか生きているかにかかわらず（例えば、蛍光色素を用いて）染色されているかいないかにかかわらずラベリングされているかラベリングされていないかにかかわらず他の種類の生物学的な材料又は物質を含む標本のための閲覧用基板として頻繁に用いられている。また、サンプル１２は、マイクロアレイとして一般に知られるいずれのサンプル及びすべてのサンプルを含むいずれの種類のスライド又は基板に載せられたｃＤＮＡ又はＲＮＡ又はタンパク質のような、ＤＮＡ又はＤＮＡに関連する物質のいずれの種類のアレイであってもよい。サンプル１２は、９６ウェルのプレートのようなマイクロタイタープレートであってもよい。サンプル１２の他の例としては、集積回路ボード、電気泳動レコード、ペトリ皿、フィルム、半導体物質、法医学用の材料又は機械加工部品を含む。

スキャナー１１は、モーター駆動ステージ１４、顕微鏡対物レンズ１６、ライン走査カメラ１８及びデータプロセッサ２０を含む。サンプル１２は、走査のためにモーター駆動ステージ１４に配置される。モーター駆動ステージ１４は、ステージコントローラー２２に接続され、これは次にデータプロセッサ２０に接続される。データプロセッサ２０は、ステージコントローラー２２によってモーター駆動ステージ１４上のサンプル１２の位置を判断する。現状の好ましい実施形態において、モーター駆動ステージ１４は、サンプル１２の平面内の少なくとも２つの軸（ｘ／ｙ）においてサンプル１２を動かす。光学的Ｚ軸に沿ったサンプル１２の精密な移動は、焦点制御のようなスキャナー１１の特定なアプリケーションのためにも必要であることがある。Ｚ軸の運動は、Ｐｏｌｙｔｅｃ ＰＩから販売されているＰＩＦＯＣ又はＰｉｅｚｏｓｙｓｔｅｍ Ｊｅｎａから販売されているＭＩＰＯＳ ３のようなピエゾポジショナー２４によって実現することが好ましい。ピエゾポジショナー２４は、顕微鏡対物レンズ１６に直接取り付けられ、ピエゾコントローラー２６を介してデータプロセッサ２０に接続され、データプロセッサ２０によって指示される。粗い焦点調整を提供する手段も必要であることがあり、これは、モーター駆動ステージ１４の一部としてＺ軸運動によってあるいは手動のラックピニオン粗焦点調整（図示せず）によって提供することができる。

現状の好ましい実施形態において、モーター駆動ステージ１４は、スムースな運動及び優れた直線及び平坦度の精度を提供するために、ボールベアリングの線形路を有する高精度の位置決めテーブルを備える。例えば、モーター駆動ステージ１４は、一方が他方の上に積み重ねられた２つのＤａｅｄａｌ ｍｏｄｅｌ １０６００４のテーブルを含むことができる。また、他のタイプのモーター駆動ステージ１４もスキャナー１１のために適切であり、これには、ボールベアリングではない方法に基づいた積み重ねられた単一の軸のステージ、サンプルの下からの透過用照明に特に適し中央において開く単一又は複数の軸のポジショニングステージ、又は複数のサンプルをサポートすることができる大きなステージが含まれている。現状の好ましい実施形態において、モーター駆動ステージ１４は、各々が２ｍｍの親ねじ及びＮｅｍａ−２３ステッピングモーターに接続された２つの積み重ねられた単一軸のポジショニングテーブルを含む。最大の親ねじ速度が１秒当たり２５回転で、モーター駆動ステージ１４上のサンプル１２の最大速度は、秒速５０ｍｍである。５ｍｍのような大きい直径の親ねじを選ぶことによって、毎秒１００ｍｍよりも大きな最大速度まで増やすことができる。モーター駆動ステージ１４は、機械的又は光学的な位置エンコーダを備えることができるが、これは、システムの費用を相当に増やすという欠点がある。したがって、現状の好ましい実施形態は、位置エンコーダを備えない。しかしながら、ステッピングモーターの代わりにサーボモーターを使用するのであれば、適切な制御のために位置フィードバックを使用しなければならないだろう。

データプロセッサ２０からの位置コマンドは、ステージコントローラー２２においてモーター電流又は電圧コマンドへと変換される。現状の好ましい実施形態において、ステージコントローラー２２は、二軸サーボ／ステッパーモーターコントローラー（Ｃｏｍｐｕｍｏｔｏｒ ６Ｋ２）及び２つの４アンペアのマイクロステッピングドライブ（Ｃｏｍｐｕｍｏｔｏｒ ＯＥＭＺＬ４）を備える。マイクロステッピングは、比較的大きな単一の１．８度モーターステップよりもはるかに小さな増分でステッピングモーターを指示する手段を提供する。例えば、１００のマイクロステップで、サンプル１２は、０．１μｍしか動かないように指示することができる。本発明の現状の好ましい実施形態において、２５，０００のマイクロステップが使用される。また、より小さなステップ幅も可能である。モーター駆動ステージ１４及びステージコントローラー２２の最適な選択は、サンプル１２の性質、サンプルのデジタル化の所望の時間、及びサンプル１２の結果として得られるデジタル画像の所望の解像度のような多くの要因に依存することは明白である。

顕微鏡対物レンズ１６は、一般的に入手可能な任意の顕微鏡対物レンズであることができる。当業者は、どの対物レンズを用いるかという選択が特定の状況に依存するということを理解するであろう。本発明の好ましい実施形態において、顕微鏡対物レンズ１６は、無限大補正された種類である。

サンプル１２は、光源３０及び照明用光学部品３２を含む照明系２８によって照らされる。実施形態における光源３０は、光出力を最大にするための凹面反射鏡及び熱を抑えるためのＫＧ−１フィルタを有する可変強度ハロゲン光源を備える。しかしながら、光源３０は、アークランプ、レーザー又は他の光源のいずれの種類であってもよい。実施形態における照明用光学部品３２は、光学軸に直交する２つの共役な平面を有する標準的なケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）照明系を備える。照明用光学部品３２は、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｎｉｋｏｎ， Ｏｌｙｍｐｕｓ， 又はＬｅｉｃａのような会社によって販売されている商業的に入手可能な複合的な顕微鏡の多くに見られる明視野照明光学部品を代表するものである。共役な平面の一組は、（ｉ）光源３０によって照明されたフィールド絞りアパーチャ、（ｉｉ）サンプル１２の焦点面によって規定されるオブジェクト平面、及び（ｉｉｉ）ライン走査カメラ１８の光応答性要素で囲む平面を含む。第２の共役平面は、（ｉ）光源３０の一部であるバルブのフィラメント、（ｉｉ）照明用光学部品３２の一部である集光レンズ（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）光学部品の直ぐ前に位置する集光レンズ絞りのアパーチャ、及び（ｉｉｉ）顕微鏡対物レンズ１６の後焦点面を含む。実施形態において、サンプル１２は、ライン走査カメラ１８がサンプル１２によって送られる光エネルギーを検出したり、あるいは逆に、サンプル１２によって吸収された光エネルギーを検出するような伝送モードで照明されイメージングされる。

スキャナー１１は、サンプル１２から反射される光エネルギーを検出するのに等しくふさわしく、その場合、光源３０、照明光学部品３２及び顕微鏡対物レンズ１６は、反射イメージングとの適合性に基づいて選択されなければならない。したがって、可能性のある一実施形態は、サンプル１２の上に位置する光ファイバの束を介しての照明である。他の可能性としては、モノクロメーターによってスペクトル的に条件付けされる励起を含む。顕微鏡対物レンズ１６が位相コントラスト顕微鏡に適合するように選択される場合、照明用光学部品３２の一部である集光レンズ（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）光学部品において少なくとも１つの位相ストップを取り入れることによって、スキャナー１１を位相コントラスト顕微鏡のために用いることが可能になる。当業者分野における通常の熟練のうちの１つに、差分干渉コントラスト及び共焦点マイクロスコピーのような他の種類のマイクロスコピーのために必要な変更は、当業者にとって容易に明白になるであろう。光学的マイクロスコピーの既知のモードのいずれにおけるマイクロスコピーのサンプルの調べのために、全体として、既知の変更を適切に加えたスキャナー１１は、適切である。

顕微鏡対物レンズ１６及びライン走査カメラ１８の間には、顕微鏡対物レンズ１６によって捕捉された光信号をライン走査カメラ１８の光統制要素上に焦点を合わせるライン走査カメラ焦点合わせ光学部品３４が位置する。現代的な無限補正された顕微鏡において、顕微鏡対物レンズと接眼光学部品の間、又は顕微鏡対物レンズと外部イメージングポートの間の焦点合わせ光学部品は、顕微鏡の観察管の一部であるチューブレンズとして知られる光学要素からなる。コマ又は非点収差が発生することを防ぐために、チューブレンズは多くの場合多数の光学要素からなる。伝統的な有限チューブ長の光学部品から無限補正された光学部品への比較的最近の変化の動きの１つは、サンプル１２からの光エネルギーが平行である物理的な空間を増やすことであり、これは、この光エネルギーの焦点が無限大にあることを意味する。この場合、ダイクロイックミラー又はフィルタのような付属的な要素を、光路の拡大率を変えず、あるいは望まない光学的なアーティファクトを発生させずに、無限大空間に挿入することができる。

無限大補正された顕微鏡対物レンズには通常、無限大の印が刻印される。無限大補正された顕微鏡対物レンズの拡大率は、チューブレンズの焦点距離を対物レンズの焦点距離で割った商によって与えられる。例えば、９ｍｍの焦点距離の対物レンズを使用する場合、１８０ｍｍの焦点距離のチューブレンズであれば２０倍の拡大率を得られる。異なる顕微鏡の製造業者によって製造された対物レンズの互換性がない１つの理由は、チューブレンズの焦点距離における標準化がなされていないという理由である。例えば、１８０ｍｍのチューブレンズの焦点距離を用いる会社であるオリンパスから販売されている２０倍の対物レンズは、それとは異なる２００ｍｍのチューブ長さの焦点距離に基づくニコンの顕微鏡では２０倍の拡大率を発生させない。代わりに、このような２０倍で９ｍｍの焦点距離の形を有するオリンパスの対物レンズの有効拡大率は、２２．２倍になり、２００ｍｍのチューブレンズ焦点距離を９ｍｍの対物レンズの焦点距離で割ることによって得ることができる。伝統的な顕微鏡においてチューブレンズを変更することは、顕微鏡を分解せずには実質的に不可能である。チューブレンズは顕微鏡の重大なる固定された要素の一部である。異なる製造業者によって製造された対物レンズと顕微鏡の間の互換性の無さに影響する別の要因は、接眼光学部品、すなわち、標本を観察する双眼顕微鏡、の設計にある。ほとんどの光学的補正は、顕微鏡対物レンズ向けに設計されているが、顕微鏡ユーザのほとんどは最良の可視的画像を得るにはある製造業者の双眼顕微鏡をその同じ製造業者の顕微鏡対物レンズと一致させることに何らかの利益があるという確信を未だ持っている。

ライン走査カメラの焦点合わせ光学部品３４は、機械的な管の内部にマウントされたチューブレンズ光学部品を含む。好ましい実施形態におけるスキャナー１１が、伝統的な視覚的な観察のための双眼顕微鏡又は接眼レンズを備えないので、対物レンズと双眼顕微鏡の間の可能性のある互換性のなさという伝統的顕微鏡によって発生する問題が当然になくなる。当業者は、顕微鏡の接眼部と表示モニター上のデジタル画像の間の焦点同一性を実現するという課題も、接眼部を一切持たないことによって同様になくなるということを理解できるであろう。サンプル１２の物理的な境界によってのみ実際的に制限される視野を与えることによってもスキャナー１１が伝統的な顕微鏡の視野の制限を克服するので、本スキャナー１１によって与えられるような全てがデジタルイメージングの顕微鏡における拡大率の重要性は制限されたものになる。サンプル１２の一部を一旦デジタル化すれば、拡大率を増やすためにサンプル１２の画像に、電気的なズームとしても知られることがある電子的な拡大を適用することが直接的である。画像の拡大率を電子的に増やすことは、画像を表示するために用いるモニター上における画像の大きさを増やすという効果を有する。電子ズームを過度に用いた場合、表示モニターは拡大された画像の一部分のみを示すことしかできない。しかしながら、電子拡大を用いて当初デジタル化されていた元々の光信号にはない情報を表示することは可能ではない。スキャナー１１の目的の１つは、顕微鏡の接眼部を介する視覚的な観察に代えて高品質のデジタル画像を提供することであるため、スキャナー１１によって取得された画像の内容が、できるかぎり多くの画像の詳細を含むということが重要である。分解能という用語は通常、そのような画像の詳細を説明するために用いられ、回析限界という用語は、光信号において利用可能な波長限界の最大の空間的な詳細を説明するために用いられる。スキャナー１１は、ライン走査カメラ１８のような光検出カメラにおける個別の画像要素の大きさと、及び顕微鏡対物レンズ１６の開口数との両方に対して周知のナイキスト（Ｎｙｑｕｉｓｔ）標本抽出基準に従ってマッチされたチューブレンズの焦点距離を選択することによって回折限界のデジタルイメージングを提供する。顕微鏡対物レンズ１６の分解能を制限する性質が拡大率ではなく開口数であることはよく知られている。

ライン走査カメラの焦点合わせ光学部品３４の一部であるチューブレンズの焦点距離の最適な選択を説明するために以下の１つの例が寄与するであろう。前述の９ｍｍの焦点距離の２０倍の顕微鏡対物レンズ１６を再び考え、この対物レンズが０．５０の開口数を有するものと想定する。認識できる集光レンズからの劣化がないと想定すると、波長５００ｎｍのこの対物レンズの回折限界の解像力は、周知のアッべ（Ａｂｂｅ）の関係を用いて、約０．６μｍである。さらに、サンプル１２の一部を検出するために、好ましい実施形態において複数の１４μｍ四方のピクセルを有するライン走査カメラ１８を用いるものと想定する。サンプリングの理論によれば、少なくとも２つのセンサーピクセルが解像可能な最も小さい空間的特徴の範囲を定める必要性がある。この場合、拡大率４６．７倍を実現するようなチューブレンズを選択する必要があり、これは、２つの１４μｍのピクセルに対応する２８μｍを、最も小さい解像可能な特徴の大きさである０．６μｍで割ることによって得ることができる。したがって、最適なチューブレンズの光学的焦点距離は約４２０ｍｍであり、これは、４６．７に９を乗算することによって得ることができる。したがって、４２０ｍｍの焦点距離を有するチューブレンズ光学部品を備えたライン走査焦点合わせ光学部品３４は、可能性のある最良の空間的分解能で画像を取得することができ、このことは、同じ２０倍の対物レンズを用いて顕微鏡で標本を見ることによって観察されるものと同様である。繰り返すと、スキャナー１１は、回折限界のデジタル画像を取得するために、この例では約４７倍であるより大きな拡大率の光学的な構成において伝統的な２０倍の顕微鏡対物レンズ１６を用いる。例えば、０．７５であるより大きな開口数の伝統的な２０倍の拡大率の対物レンズ１６が用いられた場合、回折限界のイメージングのために必要なチューブレンズの光学的な拡大率は約６１５ｍｍであり、これは、全体の光学的拡大率６８倍に対応する。同様に、２０倍の光学レンズの開口数が０．３しかなければ、最適なチューブレンズの光学的拡大率は約２８倍だけになり、これは、約２５２ｍｍのチューブレンズの光学的焦点距離に対応する。ライン走査カメラの焦点合わせ光学部品３４は、スキャナー１１のモジュール的要素であり、必要に応じて最適なデジタルイメージングのために入れ換えることができる。回折限界のデジタルイメージングの利点は、いくつかのアプリケーションにとって特に顕著となり、例えば、拡大率の増加を伴う信号の輝度の減少を適切に設計された照明系２８の強度を増加させることによって容易に補うことができるような明視野顕微鏡において顕著である。

本スキャナー１１のために説明したように、解析限界イメージングを実現するようにチューブレンズの拡大率を有効に増加するために外部の拡大率を増加させる光学部品を伝統的な顕微鏡ベースのデジタルイメージングシステムに取り付けることが原則的にはできる。しかしながら、結果として発生する視野の減少は、受容できないことが多く、これによってこのアプローチが非現実的ではなくなる。さらに、顕微鏡のユーザの多くは通常、回折限界のイメージングの技術を自分で有効に利用する程にいるためには回折限界のイメージングの詳細について十分に理解していない。実際において、接眼部を通して見ることができるものまで視野の大きさを増やすことを試みるために、デジタルカメラには拡大率を減少させる光学的カプラーと共にデジタルカメラが顕微鏡の口に取り付けられる。拡大率を減らす高額を加える標準的な実務は、目標が回折限界のデジタル像を得ることであれば、間違った方向に進む一方になってしまう。

伝統的な顕微鏡では、異なるパワーの対物レンズが異なる分解能及び拡大率の標本を見るために通常使われる。標準的な顕微鏡には、５つの対物レンズを保持するレンズ台がある。本スキャナー１１のようなオールデジタルのイメージングシステムにおいて、望ましい最も高い空間分解能に対応する開口数を有するただ１つの顕微鏡対物レンズ１６があればよい。スキャナー１１の実施形態は、ただ１つの顕微鏡対物レンズ１６を備える。この分解能で回折限界デジタル像が一旦捕捉された後は、所望の任意の減少した分解能及び拡大率においても像情報を提示するために、標準的なデジタル画像処理技術を用いることが直接的である。

スキャナー１１の現状の好ましい実施形態は、線形アレイに１０２４のピクセル（画素）が配置されその各ピクセルが１４×１４μｍを有するようなＤａｌｓａ ＳＰＡＲＫライン走査カメラ１８に基づいている。また、カメラの一部としてパッケージングされているかイメージング用電子モジュールにカスタム集積されているかにかかわらず、他の種類の線形アレイのいずれをも用いることができる。現状の好ましい実施形態における線形アレイは、８ビットの量子化を有効に提供するが、より高い又はより低い量子化を提供する他のアレイも用いることができる。３チャネルの赤緑青（ＲＧＢ）カラー情報又は時間遅延積分（ＴＤＩ）に基づく代替的なアレイを用いることができる。ＴＤＩアレイ以前にイメージングした標本の領域から強度データを足し合わせることによって出力信号において相当により良い信号対雑音比（ＳＮＲ）を与え、これによって積分のステージの数の平方根に比例するＳＮＲを増加させることができる。ＴＤＩアレイは、複数のステージの線形アレイを含むことができる。ＴＤＩアレイは、２４、３２、４８、６４、９６又はより多くのステージを用いて利用することができる。また、スキャナー１１は、様々なフォーマットで製造される変形アレイをサポートし、これには、５１２ピクセルのもの、１０２４のピクセルのもの、及び４０９６ものピクセルを有する他のものが含まれる。照明系２８及びライン走査カメラの焦点合わせ光学部品３４に対する適切であるが周知な変更が、より大きなアレイを収容するために必要であることがある。様々なピクセルの大きさの線形アレイもスキャナー１１において用いることができる。いずれかの種類のライン走査カメラ１８の選択における重要な必要条件は、サンプル１２が、先行技術中で既知の、従来の想像するタイルを張るアプローチの静的な要求を克服するので、高品質の画像を得るためにサンプル１２のデジタル化の間にライン走査カメラ１８に対して動くことができるということがあり、これによって、従来技術において知られている伝統的なイメージングタイリングアプローチの静的な必要条件を克服することができる。

ライン走査カメラ１８の出力信号は、データプロセッサ２０につながれている。実施形態におけるデータプロセッサ２０は、イメージングボードやフレームグラバーのような少なくとも１つの信号をデジタル化するエレクトロニクスボードをサポートするために、マザーボードのような補助的なエレクトロニクスと共に中央演算装置を有する。現状の好ましい実施形態において、イメージングボードは、ＥＰＩＸ ＰＩＸＣＩＤ２４のＰＣＩバスイメージングボードである。しかし、様々な製造業者からのＥＰＩＸボードの代わりに用いることができる他の多くの種類のイメージングボード又はフレームグラバーがある。代替実施形態としては、Ｆｉｒｅｗｉｒｅとしても知られているＩＥＥＥ １３９４のようなインターフェースを用いてイメージングボード全体をバイパスしてハードディスクのようなデータ記憶装置３８に直接データを格納するようなライン走査カメラがある。

また、データプロセッサ２０は、データの短期間の記憶のためにランダムアクセス記憶装置（ＲＡＭ）のようなメモリ３６に、及び長期間のデータ記憶のためにハードドライブのようなデータ記憶装置３８にも接続されている。また、データプロセッサ２０は、通信ポート４０に接続されており、これは、ローカル領域ネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、メトロポリタンエリアネットワーク（ＭＡＮ）、イントラネット、エクストラネット又は世界的なインターネットのようなネットワーク４２に接続されている。また、メモリ３６及びデータ記憶装置３８は、互いに接続されている。また、データプロセッサ２０は、ライン走査カメラ１８及びステージコントローラー２２のようなスキャナー１１の重要な要素を制御するため、あるいは様々な画像処理機能、画像分析機能又はネットワーキングのために、ソフトウェアの形態のコンピュータプログラムを実行することができる。データプロセッサ２０は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、ＯＳ／２、Ｍａｃ ＯＳ及びＵｎｉｘ（登録商標）のようなオペレーティングシステムを含む任意のオペレーティングシステムに基づくことができる。現状の好ましい実施形態では、データプロセッサ２０は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴオペレーティングシステムに基づいて動作する。

データプロセッサ２０、メモリ３６、データ記憶装置３８及び通信ポート４０はそれぞれ、伝統的なコンピュータにおいて見られる要素である。一例は、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標） ＩＩＩ ５００ ＭＨｚプロセッサ及び７５６メガバイト（ＭＢ）以内のＲＡＭの仕様を有するＤｅｌｌ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ＸＰＳ Ｔ５００のようなパーソナルコンピュータである。現状の好ましい実施形態において、コンピュータ、並びにデータプロセッサ２０、メモリ３６、データ記憶装置３８及び通信ポート４０のような要素はすべてスキャナー１１の内部にあり、これにより、システム１０の他の要素へのスキャナー１１の接続が通信ポート４０だけということになる。スキャナー１１の代替的実施形態では、コンピュータ要素がスキャナー１１の外部にあり、コンピュータ要素とスキャナー１１の間に対応する接続を有する。

本発明の現状の好ましい実施形態において、スキャナー１１は、光学的顕微鏡、デジタルイメージング、電動サンプルポジショニング、コンピューティング及びネットワークベースの通信を単一の囲いのユニット内に一体化される。スキャナー１１を単一の囲いを有するユニットとして通信ポート４０とともにパッケージングする主な利点としては、複雑さが減り、信頼性が増すということがある。スキャナー１１の様々な要素は共にはたらくように最適化されており、これは、顕微鏡、光源、モーター駆動ステージ、カメラ及びコンピュータが通常異なるベンダーによって提供され相当なインテグレーションや保守を必要とするような伝統的な顕微鏡ベースのイメージングシステムとは非常に対照的である。

通信ポート４０は、ネットワーク４２を含むシステム１０の他の要素との迅速な通信の手段を提供する。通信プロトコル４０のための例示的な通信プロトコルは、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）のような搬送波検出多重アクセス方式衝突検出プロトコルを伝送制御及びインターネットワーキングのためのＴＣＰ／ＩＰプロトコルと共に用いることである。スキャナー１１は、ブロードバンド、ベースバンド、同軸ケーブル、ツイストペア、ファイバオプティクス、ＤＳＬ又は無線のような任意のタイプの伝送媒体で動作するように意図されている。

実施形態では、スキャナー１１の制御、及びスキャナー１１によって捕捉された像データのレビューが、ネットワーク４２につながれたコンピュータ４４に対して行われる。現状の好ましい実施形態では、コンピュータ４４は、オペレーターに像情報を提供するために表示モニター４６につながれている。複数のコンピュータ４４がネットワーク４２に接続されていてもよい。現状の好ましい実施形態では、コンピュータ４４は、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔからのＩｎｔｅｒｎｅｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ又はＡＯＬからのＮｅｔｓｃａｐｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｏｒのようなネットワークブラウザを使用してスキャナー１１と通信する。画像は、ほとんどの商用ブラウザに既に組み込まれている標準的な画像展開方法と互換性のある画像フォーマットであるＪＰＥＧのような一般的な圧縮フォーマットでスキャナー１１に記憶される。また、標準的又は非標準、不可逆又は可逆の他の画像圧縮フォーマットも用いることができる。現状の好ましい実施形態では、スキャナー１１は、スキャナー１１からコンピュータ４４へ送られるウェブページに基づくオペレータインターフェースを提供するウェブサーバーである。画像データのダイナミックなレビューのために、スキャナー１１の現状の好ましい実施形態は、コンピュータ４４に接続された表示モニター４６においてレビューするために、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔからのＭｅｄｉａ Ｐｌａｙｅｒ、Ａｐｐｌｅ ＣｏｍｐｕｔｅｒからのＱｕｉｃｋｔｉｍｅ又はＲｅａｌ ＮｅｔｗｏｒｋｓからのＲｅａｌＰｌａｙｅｒのような標準的な複数のフレームをサポートするブラウザと互換性があるソフトウェアパッケージを用いて像データの複数のフレームを再生することに基づく。現状の好ましい実施形態では、コンピュータ４４におけるブラウザは、伝送制御のためのＴＣＰとともにハイパーテキスト伝送プロトコル（ｈｔｔｐ）を使用する。

スキャナー１１がコンピュータ４４又は複数のコンピュータと通信することができる多くの異なる手段やプロトコルが現在存在し、そして将来発生するであろう。現状の好ましい実施形態は、標準的な手段及びプロトコルに基づいているが、アプレットとして知られている一又は複数のカスタマイズされたソフトウェアモジュールを開発するアプローチもまた同様に実現可能性が高く、スキャナー１１の選択された将来のアプリケーションにとって望ましい可能性がある。また、コンピュータ４４がパーソナルコンピュータ（ＰＣ）のような特定の種類であるという制約はなく、Ｄｅｌｌのような特定の会社によって製造されるべきであるという制約もない。標準化されたコミュニケーションポート４０の利点の１つとして、一般的なネットワークブラウザソフトウェアが動作する任意のタイプのコンピュータ４４もスキャナー１１と通信することができるということが挙げられる。

スペクトル分解された画像を得ることを望むのであれば、スキャナー１１に対していくらかの変更を行うことで可能である。スペクトル分解された画像は、画像ピクセルごとにスペクトル情報が評価される画像である。スペクトル分解された画像は、スキャナー１１のライン走査カメラ１８を光学的スリット及びイメージングスペクトログラフで置き換えることによって得ることができる。イメージングスペクトログラフは、二次元ＣＣＤ検出装置を使用してその検出装置の行ごとに光学的スリットに焦点を合わせられた光信号を分散させるためにプリズム又はグレーティングを用いることによって画像ピクセルの列に対する波長固有の強度データを捕捉する。

図２は、本発明に係る光学的顕微鏡システム１０の第２の実施形態のブロック図を示す。このシステム１０では、スキャナー１１は図１に示した現状の好ましい実施形態よりも複雑で高価である。図示したスキャナー１１のさらなる属性は、適切に機能するために代替的実施形態のすべてにおいて存在する必要はない。図２は、スキャナー１１に組み入れることができる付加的な特徴及び能力の合理的な例を提供することを意図している。

図２の代替的実施形態は、図１の現状の好ましい実施形態よりはるかに大きなレベルの自動化を提供する。データプロセッサ２０と、照明系２８の光源３０及びイルミネーション光学部品３２の両方との間の接続によって、照明系２８のより完全なレベルの自動化を達成することができる。その光源３０への接続は、光源３０の強度を制御するために、開ループ又は閉ループの方法で電圧又は電流を制御することができる。現状の好ましい実施形態において光源３０がハロゲンバルブであることを思い出してほしい。データプロセッサ２０とイルミネーション光学部品３２の間の接続は、最適のケーラー照明が維持されることを確実にする手段を提供するために、フィールド絞りアパーチャ及び集光レンズ絞りの閉ループ制御を提供することができる。

蛍光イメージングのためのスキャナー１１の使用は、容易に認識できる光源３０、照明光学部品３２及び顕微鏡対物レンズ１６に対する変更が必要となる。図２の第２の実施形態は、励起フィルタ、ダイクロイックフィルタ及びバリヤーフイルターを含む蛍光フィルタキューブ５０をさらに備える。蛍光フィルタキューブ５０は、顕微鏡対物レンズ１６とライン走査カメラの焦点合わせ光学部品３４の間に存在する、無限大に補正されたビーム経路に位置する。蛍光イメージングの一実施形態は、市場で入手可能な様々な蛍光染料やナノ結晶のために適切なスペクトル励起を提供するために、照明光学部品３２にフィルタホイールやチューナブルフィルタを加えることを含んでいてもよい。

少なくとも１つのビームスプリッター５２をイメージングパスへ加えることによって、光信号を少なくとも２つのパスに分割することが可能になる。以前に議論したように、ライン走査カメラ１８による回折限界のイメージングを可能にするために、主要なパスはライン走査カメラの焦点合わせ光学部品３４を経由する。エリア走査カメラ５６によるイメージングのために、エリア走査カメラの焦点合わせ光学部品５４を経由する第２のパス（補助的なパス）が提供される。これらの２つの焦点合わせ光学部品を適切に選択することによって、異なるピクセルサイズを有する２つのカメラセンサーによる回折限界のイメージングを確実にすることができることは容易に明白に理解できるであろう。エリア走査カメラ５６は、単純色ビデオカメラ、高性能な冷却機能付きＣＣＤカメラ、又は可変積分時間高速フレームカメラのような、現在入手可能な多くのタイプのうちの１つとすることができる。エリア走査カメラ５６は、スキャナー１１のための伝統的なイメージングシステムの構成を提供する。エリア走査カメラ５６はデータプロセッサ２０に接続される。例えば、ライン走査カメラ１８及びエリア走査カメラ５６である、２台のカメラを使用する場合、その２つの種類のカメラは、単一の二つの機能を兼ねたイメージングボード、２つの異なるイメージングボード又はＩＥＥＥ１３９４ Ｆｉｒｅｗｉｒｅインターフェースのいずれかを使用してデータプロセッサに接続することができ、その場合には、イメージングボードの一方又は両方が必要ではないことがある。また、撮像センサをデータプロセッサ２０に接続する他の関連する方法も利用可能である。

コンピュータ４４へのスキャナー１１の主要なインターフェースがネットワーク４２を介するが、表示モニター５８のようなローカルの出力装置にスキャナー１１を直接接続し、かつ、スキャナー１１のデータプロセッサ２０に直接接続されるキーボードとマウス６０のようなローカル入力デバイスを提供することが有益なことが、例えば、ネットワーク４２の故障の際にある。この場合、適切なドライバソフトウェア及びハードウェアも用意する必要があるであろう。

図２に示した第２の実施形態は、はるかに大きなレベルの自動化されたイメージングの性能も与える。オートフォーカスの周知の方法を使用して、ピエゾポジショナー２４、ピエゾコントローラー２６及びデータプロセッサ２０を含む焦点合わせ制御ループを閉じることにより、スキャナー１１のイメージングの自動化を向上させることができる。第２の実施形態は、いくつかの対物レンズを収容するためのモーター駆動レンズ台６２を用いる。モーター駆動レンズ台６２は、レンズ台コントローラー６４を介して、データプロセッサ２０に接続し、また、データプロセッサ２０によって指示される。

組み込むことができるスキャナー１１の特徴及び能力は他にもある。例えば、サンプル１２のｘ／ｙ平面において実質的に固定されている顕微鏡対物レンズ１６に対してサンプル１２を走査するプロセスは、固定されたサンプル１２に対して顕微鏡対物レンズ１６の走査を行うことを含むように変更することができる。前述のようにサンプル１２の同じ大規模な連続したデジタル画像を提供することができるスキャナー１１の可能性のある実施形態として、サンプル１２の走査、あるいは顕微鏡対物レンズ１６の走査、あるいはサンプル１２及び顕微鏡対物レンズ１６の両方の同時走査がある。

スキャナー１１は、多くのタイプの顕微鏡ベースの分析を自動化するための汎用プラットホームも提供する。レーザー励起でサンプル１２を走査することを可能にするために、伝統的なハロゲンランプ又はアークランプからレーザーベースの照明系へと照明系２８を変更することができる。ライン走査カメラ１８又はエリア走査カメラ５６に加えて又はその代わりに、光電子増倍管又は他の非イメージング検出装置を組み入れることを含む変更を、レーザーエネルギーのサンプル１２との相互作用によって発生する光信号を検出する手段を提供するために使用することができる。

図３は、一実施形態に係る光学的顕微鏡システム１０の第３の実施形態のブロック図である。図示した実施形態において、蛍光スキャナシステム４０は、例えば、揮発性または固定のコンピュータ可読記憶装置媒体を含むことができるデータ格納領域４５と通信可能に連結されるプロセッサ２４５を備える。プロセッサ２４５は、データ記憶装置２４５において、プログラミングされたモジュールを実行して、マクロカメラ２４０、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５、焦点合わせ光学系２１０、電動式フィルタキューブターレット２１５、および対物レンズ２２５に連結される対象ポジショナー２２０を制御する。プロセッサはまた、データ記憶装置２４５において、プログラミングされたモジュールを実行し、照明モジュール２３５、モーションコントローラ２５０、および試料２３０を支持する電動式ステージ２５５を制御する。プロセッサはまた、データ記憶装置２４５において、プログラミングされたモジュールを実行し、光源２６５、落射蛍光照明光学系２７０および任意のビーム成形光学系２７５を備える最適化された落射蛍光照明モジュール２９０、ならびに電動式励起フィルタホイール２８０を制御する。

動作において、蛍光スキャナシステム１１と、メモリ３６及び／又はデータストレージ３８に格納されたプログラミングされたモジュールは、蛍光試料２３０の自動スキャニングおよびデジタル化を有効にする。顕微鏡スライド（図示せず）は、蛍光試料２３０を支持するためのプラットホームとしてしばしば用いられ、試料２３０をスキャンするための蛍光スキャナシステム１１の電動式ステージ２５５上に固定されて配置可能である。プロセッサ２４５の制御下では、電動式ステージ２５５は、試料２３０を、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によって感知するために、実質的に一定速度まで加速させ、ここでそのステージの速度は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５のライン速度と同期される。画像データのストライプのスキャニングの後、電動式ステージ２５５は、減速されて、さらなる同じストライプまたは異なるストライプの前に、試料２３０を実質的に完全に停止させる。

試料２３０は、蛍光染料または蛍光色素を用いて標識付けされている任意の種類の標本であってよく、例えば、例を挙げれば、組織、細胞、ＤＮＡ、およびタンパク質がそうした種類の試料である。蛍光試料２３０はまた、例えば、組織切片、ＤＮＡ、または基板上に配置されるＤＮＡ関連の物質等の一通りの標本であってよい。当業者によって理解されるように、蛍光光学顕微鏡によって調べることのできる任意の蛍光の標本はまた、蛍光試料２３０のデジタルスライド画像を生成するために、蛍光スキャナシステム１１によってスキャン可能である。

蛍光分子は特定の波長（励起）において光を吸収可能である光子高感度分子である。これらの光子高感度分子はまた、より高い波長（発光）で光を発する。このフォトルミネセンス現象の効率性は非常に低く、発せられた光の量は非常に低い。低い量の発せられた光は、試料２３０をスキャニングおよびデジタル化するための従来の技術を妨げてしまう。有利にも、複数の線形のセンサアレイを備えるＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用により、試料２３０の同じ領域をＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形センサアレイに露出することによってカメラの感度を上昇させる。低い発光での淡い蛍光試料をスキャンする場合に、これは特に有益である。代替的な実施形態において、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、６４個、９６個、または１２０個の線形センサアレイを含んでよく、これは、電荷結合素子（「ＣＣＤ」）であってよい。

一実施形態において、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラであるが、本明細書に記載するシステムおよび方法はモノクロのカメラに限定されない。有利にも、モノクロの画像は、蛍光顕微鏡検査法においては理想的なものである。なぜならば、それは、試料上にある様々なチャネルから実際の信号のさらなる正確な表示を提供するからである。当業者に理解されるように、蛍光試料２３０は、いわゆる「チャネル」と呼ばれる、異なる波長において光を発する複数の蛍光染料で標識付け可能である。

さらに、様々な蛍光試料のローエンドおよびハイエンドの信号レベルは、感知すべきＴＤＩラインスキャンカメラ２０５に対して広帯域の波長を提示するので、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５が感知できるローエンドおよびハイエンドの信号レベルが同様に広いことが望ましい。従って、一実施形態において、蛍光スキャニングシステム１１において用いられるＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、モノクロ１０ビットの６４ステージＴＤＩラインスキャンカメラである。ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５には、様々なビット深度が、蛍光スキャニングシステム１１との使用に用いることができる。

一実施形態において、蛍光スキャニングシステム４０は、高精度かつ目が細かく調整された（ｔｉｇｈｔｌｙ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）ＸＹグリッドを用い、電動式ステージ２５５上での試料２３０の位置付けを助ける。一実施形態において、電動式ステージ２５５はＸおよびＹ軸の両方で用いられる高精度エンコーダを用いて、リニアモータベースのＸＹステージである。例えば、５０ナノメートルのエンコーダは、この軸上で、スキャニング方向において用いることができ、５ナノメートルのエンコーダは、スキャニング方向と直交する方向にあって、かつ同一平面上にある軸上で用いることができる。対物レンズ２２５はまた、５０ナノメートルのエンコーダを有して、光学軸上にあるリニアモータを利用する対象保定装置２２０上に搭載される。一実施形態において、３つのＸＹＺ軸が調節され、運動制御駆動（図示せず）および運動制御ボード（図示せず）を含むモーションコントローラ２５０を用いて、閉ループの形態で制御される。制御および調整は、プロセッサ２４５によって維持され、プロセッサ２４５はスキャニングシステム１１の動作のための、コンピュータが実行可能なプログラミングされた工程を含む情報および命令を格納するためのデータ格納領域４５を用いる。

一実施形態において、対物レンズ２２５は、蛍光顕微鏡検査法に適切なＰｌａｎＡＰＯ無限遠補正の対物レンズ（例えばオリンパス ×２０、０．７５ＮＡ）である。有利にも、対物レンズ２２５は色収差および球面収差を補正することができる。対物レンズ２２５は無限遠補正であり、他の光学コンポーネント、例えばフィルタ、倍率切替レンズ等は、対物レンズ２２５の上方にある光学経路内に配置されることができ、ここで、対物レンズを通過する光線はコリメートされた光線となる。焦点合わせ光学系２１０と組み合わされた対物レンズ２５５は、蛍光スキャニングシステム４０に、総合倍率を提供し、また、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の表面に焦点を合わせる。焦点合わせ光学系２１０は、チューブレンズおよび任意の２倍の倍率切替器を含む。一実施形態においては、２倍の倍率切替器は、４０倍の倍率で試料２３０をスキャンするために、元々が２０倍である対物レンズ２５５を可能にする。

蛍光顕微鏡検査法を効果的に行うためのスキャニングシステム１１のためには、適切な光源２６５が用いられる必要がある。代替的な実施形態において、例えば水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプまたはＬＥＤ光源等のアーク灯がこの目的のために用いることができる。一実施形態において、光源２６５は、２００ワットの水銀ベースのＤＣ稼動およびプロセッサ制御の光源等のアークベースの光源である。有利にも、光源２６５により、プロセッサ２４５はシャッター制御およびアイリスコントロールを管理することができる。一実施形態において、リキッドライトガイド（図示せず）は、光を、対物レンズ２２５の視野（ここでスキャンが行われる）に運ぶために用いることができるか、または、蛍光スキャニングシステム１１内の他の所望の位置に光を運ぶために用いることができる。例えば、３ｍｍコアのリキッドライトガイドが光を運ぶために用いることができる。

蛍光スキャニングシステム１１は、さらに、落射蛍光照明光学系２７０を含む照射光学系と、最適化された落射蛍光照明２９０として集合的に示される任意のビーム成形光学系２７５を含む。落射蛍光照明光学系２７０は、対物レンズ２２５を介して試料２３０上に励起光を集中させる。落射蛍光照明における場合のように、試料から発された光はまた、同じ対物レンズ２２５で集められる。落射照射を用いることの１つの特定の利点は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサに達する励起光の閉塞を最大化することである。同様に、このことはまた、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサに達する、発された光の量を最大化する。

落射照射光学系２７０は、波長依存の反射性および透過性を提供するダイクロイックミラーを用いて実施することができる。結果として、励起光は、ダイクロイックミラーの表面から反射して、対物レンズ２２５を介して案内されて、試料２３０に到達する。しかしながら、より高い波長にある試料２３０から発せられた光は、ダイクロイックミラーを通過し、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサに達する。

落射蛍光照明光学系２７０はまた、光源２６５からの光をコリメートする。代替的な実施形態において、このことは、ケーラー照明または臨界照明を用いて達成される。ケーラー照明は、デジタルスライド画像においてシェーディングを最小化するために、試料２３０上に最も均一な光照明を提供し、他方で、臨界照明は、画像化に必要な露出時間を低減するために、試料上への光強度を提供する。ケーラー照明および臨界照明の双方とも、蛍光スキャニングシステム４０によって利用可能である。

一実施形態において、落射蛍光照明光学系２７０は、リキッドライトガイド（図示せず）を介して、光源２６５から受け取られた光をコリメートし、その光を試料２３０へと伝達するように設計されているリレーレンズ・チューブ光学系（図示せず）を含む。この実施形態において、試料上の光のプロファイルは、対物レンズ２２５を介した画像化の視野内での最小のロールオフを有する。

代替的な実施形態において、光線成形光学系２７５は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサによって感知される部分のみを照明するように作動する。有利にも、光線成形光学系２７５は、照明領域を、元々の円形状から、方形のセンサ領域に非常に近くなる薄い楕円形状に再形成する。再形成された照明領域は、有利にも、増加した光のエネルギーを受け取る。照明領域を再形成することは、従来のマスキングに対して広範な改良となり、これは、方形のマスクの外側の全ての光エネルギーを取り除く。光線成形光学系２７５の利点は（ａ）励起光への余分な露出から試料を保護し、それにより、試料の光退色を最小化し、かつ（ｂ）試料上の照明領域へ運ばれる光エネルギーを増加させ、それにより、デジタルスライド画像を生成するために、試料２３０のスキャニングの間、より短い露出時間（例えば、より高いライン速度）を可能にすることを含む。組み合わせると、これら２つは重要な利点を提供することができる。

蛍光スキャニングシステム１１はまた、様々なフィルタの構成および使用を促進する電動式の励起フィルタホイール２８０を備える。蛍光顕微鏡検査法の効率を上昇させるのに利用可能である所定のフィルタを有することが所望される。所望されるフィルタの一部は（ａ）光源２６５から生成された広帯域の光を、試料２３０の励起に必要な特定帯域へと狭める励起フィルタ、（ｂ）ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の線形アレイセンサの１つ以上に達し得る過剰な光および、場合によっては励起光をフィルタリングする発光フィルタ、（ｃ）落射蛍光照明と共に使用するために上述で記載したようなダイクロイックミラーを含む。他のフィルタもまた含めることができる。

一実施形態において、蛍光スキャニングシステム１１は、励起フィルタのための電動式ホイール、発光フィルタのための電動式ホイール、およびダイクロイックミラーのための電動式ホイールを含む。ホイールの代わりにスライダーを用いることもできる。代替的な実施形態において、蛍光スキャニングシステム１１は、発光フィルタおよびダイクロイックミラーを含む電動式励起フィルタホイール２８０および電動式フィルタキューブターレット２１５を含む。励起フィルタを発光フィルタおよびダイクロイックミラーから分離する１つの特定の利点は、モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用に関連する。詳細には、モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用により、試料２３０の各ストライプ領域が複数回、スキャンおよびデジタル化される。すなわち、調べられる各発光波長（すなわちチャネル）毎である。単一のストライプの複数スキャンの登録は、それゆえ、複数のスキャンを各チャネルからの情報を含む単一の画像へと統一することを可能にするために極めて重要である。

さらに、電動式のフィルタキューブターレット２１５は発光フィルタおよびダイクロイックミラーを含むので、電動式フィルタキューブターレット２１５は、複数の帯域フィルタキューブ（ダイクロイックミラーおよび発光フィルタ）および単一の帯域の励起フィルタが組み合わせて用いられる（「ピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）」構成）フィルタ構成を実施することができる。ピンケル構成を有利に利用することによって、複数回、試料２３０をスキャニングおよびデジタル化でき、他方で、電動式の励起フィルタホイール２８０を用いた励起フィルタのみを変更できる。結果として、機械的または光学的な登録の問題は、試料上の同じストライプの画像の間で観察されない。なぜならば、画像化経路中には移動するコンポーネントは存在しないからである。これは、複数回、試料２３０の同じ領域をスキャンし、かつ結果として複数の画像を結合するラインスキャンカメラ（例えばＴＤＩラインスキャンカメラ２０５）を用いた場合、励起フィルタを、発光フィルタおよびダイクロイックミラーから分離する重要な利点である。

一実施形態において、電動式励起フィルタホイール２８０は、標準の２５ｍｍフィルタを収容可能な６箇所配置のホイールである。電動式の励起フィルタホイール２８０はプロセッサ２４５の制御下にある。当業者に理解されるように、任意の標準の蛍光フィルタを用いることができる。好ましくは、ハードコートされたフィルタが、スキャニングシステム１１と共に用いられる。なぜならば、それらはより耐久性があり、かつ洗浄するのに容易だからである。

一実施形態において、電動式のフィルタキューブターレット２１５はまた、フィルタキューブを保持する６箇所配置のターレットであり、例えば標準のオリンパス・フィルタキューブを用いることができる。電動式のフィルタキューブターレット２１５はプロセッサ２４５の制御下にある。電動式のフィルタホイール２８０および電動式のフィルタキューブターレット２１５のフィルタは、試料２３０上の特定の蛍光色素、および蛍光スキャニングシステム４０内で構成される利用可能なフィルタに依存して、プロセッサ２４５の制御下の照明経路または画像化経路内に自動的に配置される。

蛍光試料を画像化する場合に１つの特に困難なことは、顕微鏡スライド上の試料２３０を認識し、デジタルスライド画像へとスキャンされデジタル化される領域を決定することである。さらに、蛍光試料は、しばしば、透明に見えるので、このことがこの困難性を大きくする。なぜなら、通常の照明を用いた蛍光試料の通常の画像化は、スライド上の標本を認識するための手段を必ずしも提供しないからである。したがって、照明モジュール２３５は、斜めからの照明を蛍光試料２３０に適用するように構成される。マクロカメラ２４０は、それが照明モジュール２３５によって斜めからの照明で照らされた後、試料の画像をキャプチャするように構成される。有利にも、その結果の画像における組織は十分なコントラストをもって認識できるものである。

一実施形態において、照明モジュール２３５は、適切な角度で、試料２３０を照明するために、ある角度で配置されたビーム拡散器（図示せず）と統合した白色ＬＥＤモジュール（図示せず）を利用する。一実施形態において、３０度の角度で斜めからの照明が用いられる（顕微鏡スライドの表面に対して測定される）。しかしながら、０度から８５度の範囲の任意の角度で斜めからの照明を用いることができる。ゼロ度の角度（例えば、スライドの厚さを通した試料２３０を照明する等）は、例えば、線形のファイバを用いて達成することができる。一実施形態において、照明モジュール２３５周囲のさらなる囲い（ｓｈｒｏｕｄｉｎｇ）が、試料２３０の表面を打つ斜めからの光をより良く導くために提供される。マクロカメラ２４０周囲の囲い（ｓｈｒｏｕｄｉｎｇ）がまた提供されて、マクロカメラ２４０によってキャプチャされた試料２３０からの反射された光の量を増加させ、同時にまた、マクロカメラ２４０によってキャプチャされた照明光の量を最小化する。

プロセッサ２４５は、当業者によって理解されるように、１つ以上のプロセッサのコアを備えてよい。さらなる別個のプロセッサもまた、提供されてよく、特定のコンポーネントを制御するか、または特定の機能を実行する。例えば、さらなるプロセッサは、データ入力を管理する補助プロセッサ、浮動小数点演算を実行する補助プロセッサ、信号処理アルゴリズム（デジタル信号プロセッサ）の迅速な実行に適したアーキテクチャを有する特定用途向けプロセッサ、メインプロセッサに従属するスレーブプロセッサ（たとえばバックエンドプロセッサ）、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を制御するためのさらなるプロセッサ、ステージ２５５、対物レンズ２２５、またはディスプレイ（図示せず）を備えてもよい。そのような追加のプロセッサは、完全に別個のプロセッサであってもよく、またはプロセッサ２４５に一体化されていてもよい。

プロセッサ２４５は、蛍光スキャニングシステム４０の制御、調整、および全体的な管理を提供するために、蛍光スキャニングシステム１１の様々なコンポーネントに好ましくは電気的に連結される。あるいは、プロセッサ２４５は、蛍光スキャニングシステム１１の様々なコンポーネントの１つ以上と無線通信可能である。

メモリ３６及びデータ格納領域３８は、プロセッサ２４５上で実行するプログラムのためのデータおよび命令の記憶装置を提供する。メモリ３６及び／又はデータ格納領域３８は、データおよび命令の揮発性記憶装置および固定記憶装置を好ましくは備え、ならびに、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、ハードディスクドライブ、リムーバブル記憶装置ドライブ等を含んでよい。

スキャニングシステム１１はまた、スキャニングシステム１１と、ネットワーク６０と直接に接続した外部デバイス（例えばプリンター）、または、ネットワーク４２を介して接続した一又はそれ以上のオペレーター又はユーザステーション４４、および画像サーバステーションシステム５０等の外部デバイスとの間でソフトウェアおよびデータを転送可能な通信インターフェースを備えてもよい。

一実施形態において、コンピュータが実行可能な命令（例えば、プログラミングされたモジュールおよびソフトウェア）はデータ格納領域３８内に格納され、実行するときに、スキャニングシステム１１が本明細書に記載の様々な機能を実行することを可能にする。本明細書の記載において、用語「コンピュータが読み取り可能な記憶媒体」とは、プロセッサ２４５による実行のために、コンピュータが実行可能な命令をスキャニングシステム１１に保存および提供するために用いられる任意の媒体のことをいうために用いられる。これらの媒体の例としては、例えば、ネットワーク６０を介して、直接または間接に、スキャニングシステム１１と通信可能に接続されるデータ格納領域３８および任意のリムーバブルまたは外部の記憶媒体（図示せず）を含む。

図４は、本発明の一実施形態に係る蛍光スキャナシステム１１におけるモジュールの例示的なセットを示すブロック図である。例示的な実施形態において、モジュールは、組織発見モジュール３０５、オートフォーカスモジュール３１０、自動露出モジュール３１５、スキャニング・ワークフローモジュール３２０、シェーディング補正モジュール３２５、ストライプアライメントモジュール３３０、データ管理モジュール３３５、ならびに視覚化および分析モジュール３４０を含む。特定の組み合わせにおいて、さまざまな図示したモジュールを併せて、スライド蛍光スキャニング全体を実行させる。様々なモジュールは、例えば、メモリ３６及び／又はデータストレージ３８に記憶され、プロセッサ２０又は２４５により実行されてもよい。

組織発見モジュール３０５は、顕微鏡スライド上での試料２３０の位置を決定するために動作する。試料の位置は、前述した、電動式のステージのためのＸＹ座標に関連して決定される。組織発見モジュール３０５は、マクロカメラ２４０からの画像データを分析して、組織の位置を決定する。有利にも、試料２３０の斜めからの照明の結果、マクロカメラ２４０は、試料２３０の高コントラスト画像を組織発見モジュール３０５に提供する。組織発見モジュール３０５は、試料２３０の位置を決定するために、マクロカメラ２４０から高コントラスト画像を分析する。例えば、最も高いコントラストの領域は、標本のペリメータを規定してよく、組織発見アルゴリズム３０５が試料２３０の輪郭を決定することを可能にする。一実施形態において、組織発見モジュール３０５は、閾値化アルゴリズムを利用し、これは、黒いピクセル（組織が存在しない領域を表す）および白いピクセル（組織が存在する領域を表す）から主に構成された画像が与えられた場合、白いピクセル（「閾値」）の最小のピクセルの強度を計算する。閾値は、次いで、組織であるものとして、または、組織ではないものとしてのマクロ画像中の各ピクセルを分類するために用いられる。この選ばれた閾値は、以下の式：ω_ｎｔσ_ｎｔ＋ω_ｔσ_ｔの結果を最小化する。

ここでω_ｎｔは、ピクセルが組織ではないものとして分類される可能性であり、σ_ｎｔは、組織ではないものとして分類されたピクセルの輝度の分散であり、ω_ｔは、ピクセルが組織であるとして分類される可能性であり、σ_ｔは組織であるとして分類されたピクセルの輝度の分散である。

オートフォーカスモジュール３１０は、試料２３０の表面の焦点マップを生成するように動作し、その結果、試料をスキャニングした結果として生成されるデジタルスライド画像は最適な焦点を有する。オートフォーカスモジュール３１０はまず、ＸＹ座標を用いて試料上の一連の点を決定する。次に、各点はＴＤＩラインスキャンカメラによって巡回され、各点における対物レンズのための最適なフォーカスの高さが決定される。一実施形態において、ＸＹの点のための最適なフォーカスの高さは、対物レンズのＺ範囲の上側の端から対物レンズのＺ範囲の底側の端までの試料上のＸＹの点をスキャンし、かつ、対物レンズのＺ範囲の底側の端から対物レンズのＺ範囲の上側の端までの試料上の同じ点をスキャンし、次いでその２点を平均化することによって決定可能である。スキャンされた画像データ内の最も高いコントラストを提供する対物レンズの高さは、次いで、双方のスキャン（すなわち上側から下側および下側から上側）で決定され、平均の高さが次いで、そのＸＹの点についての最適なフォーカスの高さとして計算される。

代替的な実施形態において、ＸＹの点についての最適なフォーカスの高さは、対物レンズのＺ範囲の上側の端からその対物レンズのＺ範囲の底側の端まで、またはその逆の試料上の点をスキャンすることによって決定可能である。スキャンされた画像データにおける最も高いコントラストを提供する対物レンズの高さが、次いで、そのＸＹの点についての最適なフォーカスの高さとして決定される。

ＸＹの点についての最適なフォーカスの高さを決定するためのいずれかの技術の結果は、各々がＸＹの位置およびフォーカスの高さを含む一連のフォーカス点である。一連のフォーカス点は、次いで、スキャン領域を覆う、非平面の焦点表面を計算するために利用される。スキャン領域は、試料２３０全体または試料２３０の一部を含むことができる。

試料２３０上のＸＹの点について最適なフォーカスの高さを決定することの１つの特定の困難な点は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用から生じる。なぜならば、ＴＤＩラインスキャンカメラは、均一な配置での平行した形態で、並んで配置される複数のリニア感知アレイ（例えば６４または９６）を備える。相対的な動きのスキャニングの間、試料２３０はリニア感知アレイに垂直に動くので、試料２３０は、第１のアレイに、次いで第２等によって感知される。有利にも、これは、試料がセンサに相対的に動くので、試料２３０の各領域の複数の露出が提供される。複数の露出は、次いで、結果としての画像を生成するように結合されるが、これは、スキャニングの速度を犠牲にすることなく、露出時間を増加させる利益を生じる。この増加した露出時間は、上で説明したように、淡い蛍光試料について用いる場合には特に有用である。

しかしながら、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５のこの利点は、試料上のＸＹの点について最適なフォーカスの高さを決定する場合と同じように、試料およびリニア感知アレイの垂直の相対的な動きが取り除かれる場合には不利益となるものである。例えば、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５がそのＺ範囲の上側の端から底側の端まで移動すると、複数のリニア感知アレイの各々は、それが「見る」ことができる試料２３０の部分に対しての画像データをキャプチャする。ＴＤＩカメラ２０５が適切に様々なリニア感知アレイからの画像データを統合すると、その画像データは、試料２３０の同じ正確な部分からではなくなる。従って、様々なリニア感知アレイからの画像データは、結果としての画像を生成するように結合されて、その結果としての画像はぼやけたようになる。これは、空間的曇り（ｓｐａｔｉａｌ ｂｌｕｒｒｉｎｇ）といわれる。

ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を利用した場合の関連する問題は、時間的曇り（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｂｌｕｒｒｉｎｇ）といわれる。時間的曇りにおいては、問題は、対物レンズがそのＺ範囲を介して移動すると、最初のリニアアレイセンサが時間ｔ１において、その画像データをキャプチャすることである。この画像データは、次いで、時間ｔ２において、第２のリニアアレイセンサによってキャプチャされる画像データ等に統合される。９６番目のリニアアレイセンサがその画像を９６番目にキャプチャする頃には、対物レンズのＺレベルは異なる焦点面上へと十分に変化している。このように、時間的曇りはまた、試料２３０上のＸＹの点についての最適なフォーカスの高さを特定するのには困難性となるものである。

従って、オートフォーカスモジュール３１０は、各ＸＹのフォーカス位置について、対物レンズはそのＺ範囲の上側の端からそのＺ範囲の底側の端へと移動し、次いで、そのＺ範囲の底側の端からそのＺ範囲の上側の端へとさらに移動する。上側から下側へのスキャンおよび下側から上側のスキャンの結果は、次いで、最適なフォーカスの高さを決定するために平均化される。これは、フォーカス点において、最適なフォーカスの高さを特定するために、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を用いることに関連する時間的曇りの諸問題を効果的に取り除き、かつ、オートフォーカスモジュール３１０が、各ＸＹ点についての最適なフォーカスの高さとして、上側から下側にスキャンされた画像データおよび下側から上側にスキャンされた画像データにおける最大のコントラストを提供する、対物レンズの平均の高さを用いることを可能にする。

代替の実施形態において、上側から下側のスキャンの間および下側から上側のスキャンの間に、時間的曇りに付随する諸問題を取り除くために、各Ｚ位置においてキャプチャされたリニア感知アレイの各々から（例えば９６個全てのアレイから）の画像データがデータの単一のラインへと統合される。この方法において、空間的曇りはまだ存在するが、時間的曇りは取り除かれる。

自動露出モジュール３１５は、蛍光スキャニングシステム４０によってスキャンされる試料上の蛍光色素の各々についての最適な露出時間を決定するように動作する。露出時間の決定のプロセスは、通常は、試料２３０全体および特定の蛍光色素（すなわち特定のチャネル）を表す試料２３０の小さな領域を用いる。自動露出モジュール３１５は、試料２３０の小さな領域から、フォーカスされた画像データを取得し、試料２３０の小さな領域についての推定された最適な露出時間を計算するために画像データを分析する。スキャン、分析、および計算のプロセスは、次いで、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によって用いられる実際の露出時間が、計算されたその推定の最適な露出時間と略等しくなるまで繰り返される。

最適な露出時間が１つの蛍光色素（すなわちチャネル）に対していったん計算されると、自動露出モジュール３１５は、スキャンの間に、後の使用のために、データ格納領域内にその露出時間を格納する。自動露出モジュール３１５は、次いで、試料２３０上に、任意の残りの蛍光色素について、最適な露出時間を続けて決定する。有利にも、スキャニングシステム１１は、モノクロＴＤＩラインスキャンカメラ２０５、ならびに別個の励起フィルタホイールおよび発光フィルタホイールを用い、各蛍光色素についての露出時間は、他の蛍光色素とは独立して計算されることができる。蛍光スキャニングシステム１１のこの配置構成は、１つのスキャニングの動きの間に、複数の蛍光色素から画像データをキャプチャすることを試みるといった、蛍光スキャニングシステムに対する重要な利点を提供する。

スキャニング・ワークフローモジュール３２０は、蛍光スキャニングシステム４０を用いて、蛍光試料２３０のデジタルスライド画像を生成するための全体のプロセスを管理するように作動する。前述したように、スキャニングシステム１１は、最適な画像化の性能を達成するために、高い感度および高いビット深度を用いたモノクロＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を用いる。しかしながら、蛍光試料２３０は、通常は、複数の蛍光色素を用いてマーキングされ、これにより、光は、複数の波長（すなわちチャネル）において、試料２３０から発せられる。従って、複数のチャネルの蛍光試料２３０をスキャンする場合、チャネルの分離は、特定のフィルタの使用により、蛍光スキャニングシステム１１によって達成される。最大の柔軟性のために、上述のように、励起フィルタが、発光フィルタとは別々に搭載される。これにより、１つ以上の発光フィルタキューブを有するフィルタキューブターレットと組み合わされる１つ以上の励起フィルタを有するフィルタホイールにより、複数のフィルタの組合せを可能にする。フィルタホイールは電動式のデバイスなので、スキャニング時間を最小限にするためには、フィルタホイールの回転を最小限にすることもまた好適である。

スキャニングワークフローモジュール３２０は、フィルタホイールの回転の数を有利にも最小限にする非常に効率的なプロセスを実施する。例えば、従来の画像角度調節システムと比較して、スキャニング・ワークフローモジュール３２０は、６０倍〜１２０倍で、フィルタホイールの回転数を低減する。従来の画像角度調節システムにおいては、あらゆる小さな画像タイルについて、フィルタホイールは、「Ｎ」回、配置される必要があり、ここでＮはチャネルの数に等しい。タイル毎の１０ミリ秒の通常の露出時間に対しては、実際に画像を感知して経過するよりも、フィルタホイールをＮ回、回転して経過するほうが著しく時間が経過する。蛍光スキャニングシステム４０は、対照的に、各々スキャンされたストライプに対して、Ｎ回のみ、フィルタホイールを回転させる。通常のスキャンした画像タイルは、おおよそ１メガピクセルであり、これに対して、通常のスキャンされたストライプはおおよそ６０メガピクセルであるので、最初のものを超える各々のチャネルについては、スキャンワークフローモジュール３２０によって実施されるプロセスの効率性に起因して、フィルタホイール回転数が６０から１へと低減する。

シェーディング補正モジュール３２５は、落射蛍光照射光学およびＴＤＩラインスキャンカメラ２０５における非均一性を補正するように動作する。シェーディング補正モジュール３２５は、試料が存在しない特定のＸＹ座標において、スライドの試料３２０（例えば１ｍｍ）の小さな領域をスキャンする。一実施形態において、スキャンは、試料３２０について決定されていた特定のフォーカスパラメータを用いて実行される。スキャンは、スライド（バックグラウンド蛍光）上に存在する任意の残留色素によって発せられる光をキャプチャするために、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の最大露出時間において実行される。そのスキャンにおいて、各ピクセルのカラムについての平均の輝度は、正確な照明のプロファイルが計算できるように保証するように計算および確認がされて、次いで、シェーディング補正モジュール３２５は、各々のピクセルのカラムの平均の輝度と、画像に存在する最大の平均の輝度と比較することによって照明の補正プロファイルを計算する。このプロファイルは、蛍光スキャニングシステム４０によってスキャンされる各蛍光色素（すなわちチャネル）に対して計算される。

ストライプ調整モジュール３３０は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によってキャプチャされた画像データの隣接するストライプを並べるように動作する。一実施形態において、電動式ステージ２５５の高精度のＸＹの精密さにより、画像データの各ストライプは、結果としての単一のファイルのデジタルスライド画像において、その隣接の画像と接することができる。ステージ２５５の高精度のＸＹの精密さは、それゆえ、画像データのコンテンツの分析に依存した、任意のソフトウェアが実施するアライメントを必要とすることなく、十分にアライメントされた隣接のストライプを提供する。このことは、生じる蛍光試料２３０について、画像データのストライプのソフトウェアベースのアライメントに関する特定の問題を解決する。なぜならば、蛍光試料の画像データは、通常は、隣接のストライプの重複領域において、十分なコントラストを含まず、蛍光試料の画像データのストライプのソフトウェアベースのアライメントを可能にするからである。

代替の実施形態において、スキャニングシステム１１は、蛍光試料画像データにおける十分なコントラストが存在する場合、ストライプのソフトウェアベースのアライメントを用いる。この実施形態において、隣接するストライプのアライメントは、隣接のストライプの重複領域における最も高いコントラストを有するように決定された特定数のピクセルに基づいては決定されない。その代わり、ストライプ調整モジュール３３０は、隣接するストライプの重複領域全体のコントラスト分布を計算する。ストライプ調整モジュール３３０は、次いで、重複領域のコントラスト分布におけるコントラストのピークを特定して、そのコントラストのピーク周囲の帯域を規定する。最適なストライプ調整は、コントラストのピーク周囲の帯域に対応するピクセルに基づいて決定される。有利にも、過飽和のピクセルは、コントラスト分布を計算する場合、無視される。

さらに、マルチチャネルの蛍光試料２３０について、隣接するストライプ間の最適なストライプのアライメントは、各チャネルについて計算可能であり、最も強いアライメントを提供するチャネルが利用可能である。有利にも、様々なチャネルに対応するストライプからの画像データはデジタルスライド画像に結合されるので、隣接するストライプ間のたった１つのチャネルのアライメントが必要とされる。さらに、ストライプ調整モジュール３３０は、一度、スキャニング方向に対して垂直の方向においてストライプ調整を計算する。これは、画像データキャプチャの始まりと組み合わせて、ステージ２２５の高精度のＸＹの精密さに基づいて計算され、これは、全てのチャネルに対して同じであるべきである。

データ管理モジュール３３５は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によって生成されるマルチチャネル画像データ、関連の画像データ、およびメタデータ情報を管理するように動作する。まず、明視野デジタルスライド画像と同様に、蛍光デジタルスライド画像スキャンは、単一のデジタルスライド画像ファイルに保存可能である。試料２３０が複数のＺレベルにおいてスキャンされる場合、様々なＺレベルの各々についての画像はまた、デジタルスライド画像ファイルへと組み込まれる。

さらに、蛍光スキャンは通常、複数のチャネルからの画像データを含み、各々のチャネルは、同じ試料２３０に関連するので、単一のデジタルスライド画像ファイルにマルチチャネル画像データを格納することは有利である。さらに、関連するサブ画像データおよび機器取得設定に関連するメタデータ、画像データ記述子、ならびに、デジタルスライド画像ファイルにおける試料情報を格納することもまた有益である。さらに、任意の公知の、またはスキャン時間が計算された、画像間の関係もまた、デジタルスライド画像ファイルに格納可能である。

関連するサブ画像は、スライドラベルの画像（例えばバーコード）、スライド全体のマクロ画像、および取得された画像のサムネイルを含んでよい。機器取得設定に関連するメタデータは、露出時間、フィルタ仕様、光源仕様、および較正情報を含んでよい。画像データ記述子に関連するメタデータは、画像ピクセルの輝度の分布、自動的に決定される関連領域および非関連領域、コントラスト分布等の画像特性、周波数特性、メリットのある構造および形状を含んでよい。試料情報に関連するメタデータは、組織の種類、および調合品、ならびに標的となる生物学的特性を含んでよい。画像間の関係とは、移動および画像の回転についてのデータを含む。

一実施形態において、蛍光デジタルスライド画像ファイルは、タイル状の複数層画像として構造化され、格納される。ベース層は、元々のスキャン分解能であり、以降の層は、画像ピラミッドを形成するサブサンプリングされた分解能である。各層は１つ以上のタイルからなり、１つの層の各タイルは、ディスクおよびメモリの利用を改善し、ファイル転送速度およびネットワーク画像サービング速度を改善するために、可逆圧縮アルゴリズムまたは非可逆圧縮アルゴリズムで圧縮可能である。

マルチチャネルデジタルスライド画像については、ベース層および各々のその後の層が、各チャネルに対して画像データを含む。例えば、４つのチャネルデジタルスライド画像は、四象限へと分けられるベース層を有し、ここで、各象限は、その四象限の１つにおいて、試料２３０の完全な画像を含む。

デジタルスライド画像は、データ格納領域、例えば、ネットワーク４２を通じてスキャニングシステム１１に通信接続される、スキャニングシステム１１のデータ格納領域４５、または画像サーバシステム５０のデータ格納領域５５内に格納される。一実施形態において、データ管理モジュール３３５は、付随する患者、標本、およびスライドに対して、スキャンされた画像を、各々を項目にして記し、また、格納されたデジタルスライド画像に関連する定量分析の結果を記録してもよい。データ管理モジュール３３５はまた、格納された情報の全てをユーザに提供してもよく、ならびに、データを共有させるために、インターフェースに、病院の情報システムおよび研究室の情報システムを提供してもよい。

代替の実施形態において、別個のデジタルスライド画像は、標本２３０がスキャンされた各チャネルに対して生成可能である。このような実施形態において、関連するデジタルスライド画像ファイルを参照するセカンダリ（補助）ファイルが生成される。セカンダリファイルは、画像間の関係ならびに、視覚化の好みおよび調節（以下で記載する）を含む。このセカンダリファイルは、融合画像（ｆｕｓｅｄ ｉｍａｇｅ）と呼ばれる。

視覚化および分析モジュール３４０は、蛍光デジタルスライド画像ファイルの閲覧および分析を容易にするように動作する。各々の蛍光デジタルスライド画像は、様々な別個のチャネルの各々において閲覧可能であり、および／または、融合画像として閲覧可能であり、ここで、様々な別個のチャネルからの画像データは、２つ以上のチャネルを含む試料を単一の閲覧となるようにオーバーレイされる。デジタルスライド画像が閲覧される場合（別個または融合されたチャネルにおいて）、試料２３０全体の画像は、リアルタイムでの画像ナビゲーション、回転、ズーミング、拡大、およびＺレベルの深度トラバースに利用可能である。

一実施形態において、複数の蛍光色素のチャネルは、それらを並べて配置することによって、または、格子状に並べることによって同時に閲覧されてもよい。有利には、画像は、同期したナビゲーションを有効にするように登録される。例えば、４つのチャネルスキャンは、四象限のレイアウトにおいて配置されてよい。一実施形態において、１つの画像をズーミングすることにより、４象限全てが同様にズームする。さらに、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）が１つの象限にあるのであれば、例えば、パンは４象限全てにある等となる。

明るさ、コントラスト、ガンマ、擬似色彩等の画像閲覧調整は、格納された画像記述子および取得設定を用いて自動的に決定される。一実施形態において、閲覧調整は、ユーザにより、個々の画像および／または融合画像（すなわち、２つ以上の個々のチャネル画像が結合した画像）に対して、ユーザステーション４４において、なされることができる。さらに、融合画像を閲覧する場合、相対的な移動および回転の補正が調整されてよい。

インタラクティブ画像の探索ツールもまた、細胞学的なベースにおける蛍光反応に即座にアクセスするために、デジタルによる視覚化および分析モジュール３４０によって可能にされる。さらに、所定の関連領域は、ユーザに対して、有意味の生物学的反応を示すか、または自動的に、定量的に分析をするために、ユーザステーション４４において、表示されることができる注釈を含んでよい。さらに、視覚化および分析モジュール３４０は、ユーザステーション４４のユーザに、関連領域に注釈を付け、次いで、ベース層画像に関連するデジタルスライド画像ファイル内にその注釈を格納するためのツールを提供してよい。有利にも、そのような注釈は、画像内のドキュメントのアーティファクト、画像内の関連領域へと案内するのに有益であるか、または、報告の分析または定量的な分析のための画像の領域を特定するのに有益であってよい。

さらに、視覚化および分析モジュール３４０は、コンテンツベースの画像検索技術を用いた類似の画像データまたはパターンを位置づけるために、あらかじめ決められた、もしくは、そうでなければ、特定済みの画像特性を利用してよい。有利にも、このユーティリティは、ユーザステーション４４のユーザに、関連のケース情報および画像データを提供することができる。

一実施形態において、クライアント−サーバのアーキテクチャにより、ユーザステーション４４のユーザは、必要な場合に応じて、特定のピラミッドレベルにおいて、圧縮された画像タイルをリクエストすることによって、かつ、ユーザリクエストを見越して、クライアント側でのタイルのキャッシングを行うことによって、画像サーバシステム５０またはスキャニングシステム１１に位置付けられた蛍光デジタルスライド画像を閲覧することができる。

デジタルの視覚化および分析モジュール３４０は、さらに、蛍光デジタルスライド画像のスライドの定量分析全体を容易にするように動作し、その画像は象限のスタイルの画像または融合のスタイルの画像である。一実施形態において、デジタルの視覚化および分析モジュール３４０は、デジタルスライド画像全体の代わりに、特定の関連領域の定量分析を容易にすることができる。分析結果は、データ管理およびデータ報告と共に利用するためのデータ格納領域３８，５５、またはオペレーター又はユーザステーション４４等のデータ格納領域内に格納できる。

図５は、本開示に記載された様々な実施形態に関連して使用されることがありうる例示的な有線又は無線プロセッサイネーブルシステムを示すブロック図である。例えば、システム５５０は、図１−３に示されるスキャニング装置と共に使用されてもよい。当業者に明らかなように他のプロセッサイネーブルドシステム及び／又はアーキテクチャも使用することができる。

コンピュータシステム５５０は、プロセッサ５６０のような一又はそれ以上のプロセッサを備えることが好ましい。更なるプロセッサを用いることができ、これには、例えば、入出力を管理する補助プロセッサ、追加のプロセッサを提供することがある、浮動小数点の数学的演算を行う補助プロセッサ、信号処理アルゴリズム（例、デジタルシグナルプロセッサ）の高速実行に適したアーキテクチャを有する特殊用途のマイクロプロセッサ、メイン処理システムに従属するスレーブプロセッサ（例、バックエンドプロセッサ）、二重又は多重プロセッサシステムのための付加的なマイクロプロセッサ又はコントローラー、又はコプロセッサがある。このような補助プロセッサは、個別のプロセッサであることがあり、又はプロセッサ５６０とともに集積されることができる。

プロセッサ５６０を通信バス５５５に接続することが好ましい。通信バス５５５は、記憶装置とシステム５５０の他の周辺コンポーネントとの間の情報転送を促進するためにデータチャネルを含むことができる。通信バス５５５は、プロセッサ５６０との通信に使用される信号のセットをさらに提供することがあり、データバス、アドレスバス及び制御バス（図示せず）を含む。通信バス５５５は、任意の標準又は非標準のバスアーキテクチャーを備えていてもよく、例えば、ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ（ＩＳＡ）、ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ（ＥＩＳＡ）、Ｍｉｃｒｏ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ（ＭＣＡ）、Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔ（ＰＣＩ）ローカルバス、又はＩＥＥＥ ４８８汎用インターフェースバス（ＧＰＩＢ）、ＩＥＥＥ ６９６／Ｓ−１００などのような米国電気電子学会（ＩＥＥＥ）によって発行された標準に準拠するバスアーキテクチャーを備えていてもよい。

システム５５０は、メインメモリ５６５を含むことが好ましく、さらに補助メモリ５７０を含むことができる。メインメモリ５６５は、プロセッサ５６０で実行するプログラムに命令及びデータの記憶装置を供給する。メインメモリ５６５は、通常、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）及び／又はスタティックランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）のような半導体ベースのメモリである。他の半導体ベースのメモリタイプは、例えば、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）を含む、シンクロナスダイナミックランダムアクセスメモリ（ＳＤＲＡＭ）、ＲａｍｂｕｓダイナミックＲＡＭ（ＲＤＲＡＭ）、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ（登録商標））などを含む。

補助メモリ５７０は、内部メモリ５７５及び／又はフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、コンパクトディスク（ＣＤ）ドライブ、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）ドライブなどのリムーバブル媒体５８０をオプションで含むことができる。リムーバブル媒体５８０は、周知な方法で、読み取り及び／又は書き込む。リムーバブル記憶媒体５８０は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ＣＤ、ＤＶＤ、ＳＤカードなどであることができる。

リムーバブル記憶媒体５８０は、コンピュータが実行可能なコード（つまりソフトウェア）及び／又はデータが記憶されたコンピュータが読み取り可能な媒体であることが好ましい。リムーバブル記憶媒体５８０に格納されたコンピュータソフトウェア又はデータは、プロセッサ５６０によって実行され、システム５５０に読み込まれる。

代替実施形態では、補助メモリ５７０は、コンピュータプログラム又は他のデータ又は命令がシステム５５０にロードされることを可能にする他の同様な手段を含むことができる。このような手段には、例えば、外部記憶媒体５９５及びインターフェース５７０が含まれうる。外部記憶媒体５９５の例として、外部ハードディスクドライブ又は外部光ドライブ、及び外部光磁気ドライブが挙げられる。

補助メモリ５７０の他の例として、ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｒｅａｄ−ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ（ＰＲＯＭ）、ｅｒａｓａｂｌｅ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｒｅａｄ−ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ（ＥＰＲＯＭ）、ｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｒａｓａｂｌｅ ｒｅａｄ−ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ（ＥＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリ（ＥＥＰＲＯＭに類似するブロック式メモリ）のような半導体ベースのメモリが挙げられる。また、外部媒体５９５からシステム５５０へとソフトウェアとデータが転送されることを可能にする他の任意のリムーバブルストレージ媒体５８０及び通信インターフェース５９０も含むことができる。

システム５５０は、通信インターフェース５９０も含むことができる。通信インターフェース５９０は、システム５５０と、外部装置（例、プリンター）、ネットワーク又は情報源との間でソフトウェア及びデータを転送することを可能にする。例えば、ネットワークサーバーからシステム５５０へと通信用インターフェース５９０を介してコンピュータソフトウェア又は実行可能なコードを転送することができる。通信インターフェース５９０の例を少し挙げると、モデム、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、通信ポート、ＰＣＭＣＩＡスロット及びカード、赤外線インターフェース及びＩＥＥＥ １３９４ ｆｉｒｅ−ｗｉｒｅが挙げられる。

通信インターフェース５９０は、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標） ＩＥＥＥ ８０２標準、Ｆｉｂｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌ、デジタル加入者線（ＤＳＬ）、非同期デジタル加入者線（ＡＤＳＬ）、フレームリレー、非同期転送モード（ＡＴＭ）、統合デジタルサービスネットワーク（ＩＳＤＮ）、パーソナルコミュニケーションズサービス（ＰＣＳ）、トランスミッションコントロールプロトコル／インターネットプロトコル（ＴＣＰ／ＩＰ）、シリアルラインインターネットプロトコル／ピントツーポイントプロトコル（ＳＬＩＰ／ＰＰＰ）などのような業界によって普及されたプロトコルを実装することが好ましいが、カスタマイズされたインターフェースプロトコル又は非標準のインターフェースプロトコルを同様に実装することができる。

通信インターフェース５９０経由で転送されたソフトウェアとデータは、概して、電気的な通信信号６０５の形態である。これらの信号６０５は、通信チャネル６００を介して通信インターフェース５９０に提供されることが好ましい。一実施形態では、通信チャネル６００は、様々な有線又は無線ネットワーク、又は任意の他の通信リンクであってもよい。通信チャネル６００は、様々な有線又は無線の通信手段を用いて信号６０５を運び、実装することができ、その例を少し挙げると、有線ないしケーブル、ファイバオプティクス、伝統的な電話線、移動体電話リンク、無線データ通信リンク、無線周波数（ＲＦ）リンク又は赤外線リンクが挙げられる。

コンピュータが実行可能なコード（すなわち、コンピュータプログラム又はソフトウェア）は、メインメモリ５６５及び／又は補助メモリ５７０に格納される。コンピュータプログラムは、通信インターフェース５９０を介して受信され、メインメモリ５６５及び／又は補助メモリ５７０に格納することができる。このようなコンピュータプログラムは、実行された際に、システム５５０が前述の本発明の各種機能を実行することを可能にする。

本開示において、「コンピュータが読み取り可能な媒体」の用語は、システム５５０にコンピュータが実行可能なコード（例、ソフトウェアとコンピュータプログラム）を提供するために使用される任意の媒体を意味するように使用される。これらの媒体の例として、メインメモリ５６５、補助メモリ５７０（内部メモリ５７５、リムーバブル記憶媒体５８０及び外部記憶媒体５９５を含む）、及び通信インターフェース５９０に通信可能なようにつながれた任意の周辺機器（ネットワーク情報サーバ又は他のネットワークデバイスを含む）を含む。これらのコンピュータが読み取り可能な媒体は、システム５５０に実行可能コード、プログラミング命令及びソフトウェアを提供するための手段である。

ソフトウェアを使用して実装される実施形態では、ソフトウェアは、リムーバブル記憶媒体５８０、Ｉ／Ｏインターフェース５８５又は通信インターフェース５９０を利用して、コンピュータが読み取り可能な媒体に格納され、システム５５０にロードすることができる。このような実施形態では、ソフトウェアは電気的な通信信号６０５の形態でシステム５５０にロードされる。ソフトウェアは、プロセッサ５６０によって実行された際に、プロセッサ５６０に対して本開示の上で記載した創造性のある特徴及び機能を行わせることが好ましい。

システム５５０は、また、音声及びデータネットワークによる無線通信を容易にする追加の無線通信コンポーネントを含んでもよい。無線通信コンポーネントは、アンテナシステム６１０、無線システム６１５及びベースバンドシステム６２０を含む。通信装置５５０において、無線周波数（“ＲＦ”）信号は、無線システム６１５の管理下でのアンテナシステム６１０により空気中を通じて送受信される。

一実施形態において、アンテナシステム６１０は、スイッチング機能を行って、アンテナシステム６１０に送受信信号経路を提供する一又はそれ以上のアンテナ及び一又はそれ以上のマルチプレクサ（図示せず）を含んでもよい。受信経路において、受信されたＲＦ信号は、マルチプレクサから、受信されたＲＦ信号を増幅し、増幅された信号を無線システム６１５へ送信する低雑音増幅器（図示せず）に接続されうる。

他の実施形態において、無線システム６１５は、様々な周波数で通信するように構成される一又はそれ以上の無線を含んでもよい。一実施形態において、無線システム６１５は、復調器（図示せず）及び変調器（図示せず）を１つの集積回路（“ＩＣ”）に組み合わせてもよい。復調器及び変調器は、また、別の構成要素であってもよい。到来経路において、ベースバンド受信音声信号を残し、ＲＦキャリア信号を取り除く復調器ストリップは、無線システム６１５からベースバンドシステム６２０へ送られる。

受信された信号が音声情報を含む場合、その後ベースバンドシステム６２０は、信号をデコードし、アナログ信号へ変換する。その後、信号は、増幅され、スピーカへ送られる。ベースバンドシステム６２０は、また、マイクロフォンからアナログ音声信号を受信する。これらのアナログ音声信号は、ベースバンドシステム６２０によりデジタル信号へ変換され、エンコードされる。ベースバンドシステム６２０は、また、伝送のためにデジタル信号をコード化し、オーディオシステム６１５の変調器部分に送られるベースバンド送信音声信号を生成する。変調器は、ベースバンド送信音声信号とＲＦキャリア信号を混成し、アンテナシステムへ送られ、パワー増幅器（図示せず）を介して通過してもよいＲＦ送信信号を生成する。パワー増幅器は、ＲＦ送信信号を増幅し、送信のために信号がアンテナポートへ切り替えられるアンテナシステム６１０へ送る。

ベースバンドシステム６２０は、また、プロセッサ５６０に通信接続される。中央演算ユニット５６０は、データストレージ領域５６５及び５７０へアクセスする。中央演算ユニット５６０は、メモリ５６５又は二次メモリ５７０で記憶されうる命令（すなわち、コンピュータプログラム又はソフトウェア）を実行するように構成されることが好ましい。コンピュータプログラムは、また、ベースバンドプロセッサ６１０から受信され、かつデータストレージ領域５６５又は二次メモリ５７０に記憶され、又は受信をもって実行される。このようなコンピュータプログラムは、実行した場合、システム５５０が前述した本発明の様々な機能を行うことを可能にする。例えば、データストレージ領域５６５は、図２において前述した様々なソフトウェアモジュール（図示せず）を含んでもよい。

例えば、特定用途向けＩＣ（ＡＳＩＣ）又はフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）のような部品を用いて、主としてハードウェアにおいて様々な実施形態を実装することができる。本開示に記載された機能を実行することができるハードウェアの状態マシンの実装は、当業者にとって明白であろう。ハードウェアとソフトウェアの両方の組み合わせを使用して様々な実施形態を実装することもできる。

さらに、本開示に開示され上で説明した図面及び実施形態に関連して記載された様々な論理ブロック、モジュール、回路及び方法ステップが、電子ハードウェア、コンピュータソフトウェア又はそれらの組合せとしてしばしば実装することができることを当業者は理解できるであろう。このようにハードウェアやソフトウェアを入れ替えることができるということをわかりやすく示すために、様々な実例となる部品、ブロック、モジュール、回路及びステップが、概してそれらの機能性の観点から上で説明した。それらの機能がハードウェア又はソフトウェアとして実装されるかということは、特定のアプリケーション及びシステム全体に課せられた設計上の制約に依存する。熟練者は、特定のアプリケーションそれぞれのための様々な方法で上記の機能を実装することができるが、このような実装の判断は本発明の範囲からの逸脱を発生させるものとして解釈されるべきでない。また、モジュール、ブロック、回路又はステップの中における機能のグループ分けは、記載を簡潔にするために行ったものである。特定の機能又はステップを、１つのモジュール、ブロック又は回路から別のものへと本発明から逸脱せずに移動することができる。

また、本開示に開示された実施形態に関連して記載された様々な論理ブロック、モジュール及び方法を、本開示で記載された機能を行うために設計された、汎用プロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、ＡＳＩＣ、ＦＰＧＡ又は他のプログラマブルロジックデバイス、離散的なゲート又はトランジスターロジック、離散的なハードウェア部品又はこれらの任意の組み合わせによって実装したり実行することができる。汎用プロセッサは、マイクロプロセッサであることができるが、代わりに、プロセッサは任意のプロセッサ、コントローラー、マイクロコントローラ又はステートマシンであってもよい。また、プロセッサは、コンピューティングデバイスの組合せとして実装することもでき、これは、例えば、ＤＳＰとマイクロプロセッサの組合せ、複数のマイクロプロセッサ、ＤＳＰコアと共に動作する一又は複数のマイクロプロセッサ、又は他のこのような任意の構成である。

また、本開示に開示された実施形態に関連して記載された方法又はアルゴリズムのステップは、ハードウェアにて直接具現化することができ、プロセッサによって実行されるソフトウェアモジュールにて具現化することもでき、又はこれら２つの組合せで具現化することができる。ソフトウェアモジュールは、ＲＡＭメモリ、フラッシュメモリ、ＲＯＭメモリ、ＥＰＲＯＭメモリ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、レジスター、ハードディスク、リムーバブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ又はネットワークストレージ媒体を含む他の形態の記憶媒体にて存在することができる。例示的な記憶媒体は、プロセッサが記憶媒体から情報を読み込むことができ、記憶媒体へと情報を書き込むことができるようにプロセッサに結合されることができる。代わりに、記憶媒体は、プロセッサと一体化していてもよい。プロセッサと記憶媒体は、ＡＳＩＣに存在していてもよい。

開示した実施形態についての上記の説明は、いずれの当業者も本発明を作製又は使用することができるように提供した。これらの実施形態に対する様々な変更は、当業者にとって極めて明白であり、本開示に記載された包括的な原理は、本発明の精神又は範囲から逸脱せずに他の実施形態にも適用することができる。したがって、本開示に開示された説明及び図面は、本発明の現状の好ましい実施形態を表し、よって、本発明によって広く解釈されるように意図された主題を表すものであると理解すべきである。また、本発明の範囲が当業者にとって自明となることがある他の実施形態を完全に包含し、それによって本発明の範囲が制限されないと理解すべきである。

Claims (22)

1. 蛍光顕微鏡画像化システムを標準化する方法であって、
   標準化される第１の画像化システムにより、ドリフト基準スライドの画像を含むドリフト画像をキャプチャするステップであって、前記ドリフト基準スライドは、色付けされた顕微鏡スライドを含み、ドリフトは、時間及び／又は環境状態に亘る蛍光顕微鏡の変化を示す、ステップと、
   前記ドリフト画像を用いてドリフト測定値を算出するステップと、
   前記第１の画像化システムにより、正規化スライドの画像を含む第１の正規化画像をキャプチャするステップであって、前記正規化スライドは、蛍光色素により調製された標本を含む、ステップと、
   基準画像化システムにより、前記正規化スライドの画像を含む基準正規化画像をキャプチャするステップと、
   前記第１の正規化画像を前記基準正規化画像と比較するステップと、
   前記比較に基づいて、前記第１の画像化システムのガンマ値及びオフセット値を求めるステップであって、前記ガンマ値及びオフセット値は、所定の時間における前記第１の画像化システムと前記基準画像化システムとのピクセル強度測定値に関連する、ステップと、を含み、
   前記ドリフト測定値を算出するステップは、前記ドリフト画像の平均ピクセル強度と前記ドリフト画像の露出時間との比を算出することを含む
   方法。
2. 前記第１の正規化画像をキャプチャするステップ、前記第１の正規化画像を前記基準正規化画像と比較するステップ及び前記第１の画像化システムの前記ガンマ値及び前記オフセット値を求めるステップは、複数の前記正規化スライドのそれぞれに対して全て実行され、前記複数の正規化スライドのそれぞれは、異なる蛍光色素により調製された標本を含む請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の正規化画像及び前記基準正規化画像は、前記正規化スライドの同一領域の画像を含む請求項１に記載の方法。
4. 前記基準画像化システムについて、前記ガンマ値を１に設定し、前記オフセット値を０に設定するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
5. 前記第１の正規化画像を前記基準正規化画像と比較するステップは、
   前記第１の正規化画像に基づいて第１のヒストグラムを算出するステップと、
   前記基準正規化画像に基づいて基準ヒストグラムを算出するステップと、
   前記第１のヒストグラムを前記基準ヒストグラムと比較するステップと、を含む請求項１に記載の方法。
6. 前記第１の正規化画像を前記基準正規化画像と比較するステップは、更に、
   前記基準正規化画像の基準領域を識別するステップであって、前記基準領域は、前記基準正規化画像における矩形領域を含む、ステップと、
   前記基準領域に対する前記第１の正規化画像の一又はそれ以上の候補領域のそれぞれの二乗平均平方根の差を算出するステップであって、前記候補領域は、前記第１の正規化画像における矩形領域を含む、ステップと、
   前記基準領域に対する二乗平均平方根の差の最小値を有する一又はそれ以上の候補領域の１つを識別するステップと、を含む請求項５に記載の方法。
7. 前記第１のヒストグラムを前記基準ヒストグラムと比較するステップは、
   前記基準ヒストグラムについての基準累積分布関数を算出するステップと、
   前記第１のヒストグラムについての第１の累積分布関数を算出するステップと、
   前記第１の累積分布関数及び前記基準累積分布関数が一致する前記第１の正規化画像及び前記基準正規化画像における一又はそれ以上の対応するピクセル強度を求めるステップと、を含む請求項５に記載の方法。
8. 前記第１の画像化システムの前記ガンマ値及び前記オフセット値を求めるステップは、
   前記一又はそれ以上の対応するピクセル強度に基づいてガンマ関数を求めるステップと、
   前記ガンマ値及び前記オフセット値を含む１次方程式を生成するために線形回帰を前記ガンマ関数に適用するステップと、を含む請求項７に記載の方法。
9. 前記線形回帰における標準誤差を推定するステップを更に含む請求項８に記載の方法。
10. 前記第１の画像化システムにより、サンプルのデジタル画像をキャプチャするステップであって、前記デジタル画像は、複数のピクセルを含み、各ピクセルは、ピクセル強度値と関連付けられる、ステップと、
    前記ドリフト測定値、前記ガンマ値及び前記オフセット値に基づいて前記ピクセル強度値の一又はそれ以上を変更するステップと、を更に含む請求項１に記載の方法。
11. 前記ピクセル強度値を変更せずに、前記デジタル画像を記憶するステップを更に含む請求項１０に記載の方法。
12. 前記デジタル画像に画像処理を適用するステップであって、前記一又はそれ以上のピクセル強度値の変更は、前記画像処理の適用が行われたときに行われる、ステップを更に含む請求項１１に記載の方法。
13. 前記デジタル画像を表示するステップであって、前記一又はそれ以上のピクセル強度値の変更は、前記デジタル画像が表示されるときに行われる、ステップを更に含む請求項１１に記載の方法。
14. 前記基準画像化システムにより、前記ドリフト基準スライドの画像を含む基準ドリフト画像をキャプチャするステップと、前記基準ドリフト画像を用いて基準ドリフト測定値を算出するステップと、を更に含む請求項１に記載の方法。
15. 前記基準ドリフト測定値を記憶するステップを更に含む請求項１４に記載の方法。
16. 前記基準正規化画像を記憶するステップを更に含む請求項１５に記載の方法。
17. 蛍光顕微鏡画像化システムを標準化するシステムであって、
    少なくとも１つのハードウェアプロセッサと、
    前記少なくとも１つのハードウェアプロセッサにより実行されたときに、
    第１の画像化システムによりキャプチャされるドリフト基準スライドの画像を含むドリフト画像を受信し、前記ドリフト基準スライドは、色付けされた顕微鏡スライドを含み、ドリフトは、時間及び／又は環境状態に亘る蛍光顕微鏡の変化を示し、
    前記ドリフト画像を用いてドリフト測定値を算出し、
    前記第１の画像化システムによりキャプチャされた正規化スライドの画像を含む第１の正規化画像を受信し、前記正規化スライドは、蛍光色素により調製された標本を含み、
    基準画像化システムによりキャプチャされた前記正規化スライドの画像を含む基準正規化画像を受信し、
    前記第１の正規化画像を前記基準正規化画像と比較し、
    前記比較に基づいて、前記第１の画像化システムのガンマ値及びオフセット値を求める、少なくとも１つの実行可能なモジュールと、を備え、
    前記ガンマ値及びオフセット値は、所定の時間における前記第１の画像化システムと前記基準画像化システムとのピクセル強度測定値に関連し、
    前記ドリフト測定値の算出は、前記ドリフト画像の平均ピクセル強度と前記ドリフト画像の露出時間との比を算出することを含む
    システム。
18. 前記第１の正規化画像を前記基準正規化画像と比較することは、
    前記第１の正規化画像に基づいて第１のヒストグラムを算出し、
    前記基準正規化画像に基づいて基準ヒストグラムを算出し、
    前記第１のヒストグラムを前記基準ヒストグラムと比較することを含む請求項１７に記載のシステム。
19. 前記第１の正規化画像を前記基準正規化画像と比較することは、更に、
    前記基準正規化画像の基準領域を識別し、前記基準領域は、前記基準正規化画像における矩形領域を含み、
    前記基準領域に対する前記第１の正規化画像の一又はそれ以上の候補領域のそれぞれの二乗平均平方根の差を算出し、前記候補領域は、前記第１の正規化画像における矩形領域を含み、
    前記基準領域に対する二乗平均平方根の差の最小値を有する一又はそれ以上の候補領域の１つを識別することを含む請求項１８に記載のシステム。
20. 前記第１のヒストグラムを前記基準ヒストグラムと比較することは、
    前記基準ヒストグラムについての基準累積分布関数を算出し、
    前記第１のヒストグラムについての第１の累積分布関数を算出し、
    前記第１の累積分布関数及び前記基準累積分布関数が一致する前記第１の正規化画像及び前記基準正規化画像における一又はそれ以上の対応するピクセル強度を求めることを含む請求項１８に記載のシステム。
21. 前記第１の画像化システムの前記ガンマ値及び前記オフセット値を求めることは、
    前記一又はそれ以上の対応するピクセル強度に基づいてガンマ関数を求め、
    前記ガンマ値及び前記オフセット値を含む１次方程式を生成するために線形回帰を前記ガンマ関数に適用することを含む請求項２０に記載のシステム。
22. 前記少なくとも１つの実行可能なモジュールは、更に、前記第１の画像化システムにより、キャプチャされたサンプルのデジタル画像を受信し、前記デジタル画像は、複数のピクセルを含み、各ピクセルは、ピクセル強度値と関連付けられており、前記ドリフト測定値、前記ガンマ値及び前記オフセット値に基づいて前記ピクセル強度値の一又はそれ以上を変更する請求項１７に記載のシステム。
    

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