CN108699556A - 使用靶向myd88或tlr3的rna复合物治疗老年性黄斑变性 - Google Patents
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Abstract
在某些方面,本文提供RNA复合物,所述RNA复合物抑制髓样分化初级应答基因88(MyD88)和/或Toll样受体3(TLR3),并且在老年性黄斑变性(AMD)的治疗中是有用的。在某些方面,本文提供包括这样的RNA复合物的药物组合物和使用这样的RNA复合物和药物组合物的方法。
Description
相关申请
本申请要求于2015年11月16日提交的美国临时专利申请序列号62/255,878的优先权权益,其以引用方式被整体并入本文。
背景
老年性黄斑变性(AMD)是由眼的黄斑中的视网膜色素上皮衬里的变性造成的疾病,所述疾病导致视力丧失。黄斑是视网膜中的一个小区域,由排列在眼的后部的感光组织组成,并且在中央视觉中起关键作用。AMD是全世界失明的主要起因之一。
AMD以“湿性”和“干性”形式发生。湿性AMD是视网膜中异常的血管生长的结果。在湿性AMD中,增加量的血管内皮生长因子(VEGF)有助于此新血管形成,因此治疗选择包含使用VEGF抑制剂。然而,许多用VEGF抑制剂治疗的患者在治疗的几年内发展为地图样萎缩(GA),地图样萎缩是晚期干性黄斑变性的主要症状。干性AMD的疾病发病机制不清楚,并且目前没有可用于干性AMD的医学治疗。因此,需要可以治疗湿性黄斑变性和干性黄斑变性两者的治疗剂的开发。
概述
MyD88和TLR3在干性AMD和湿性AMD两者的发病中起重要作用。不同于在治疗干性黄斑变性中无效的VEGF抗体,靶向MyD88或TLR3的治疗剂可以被用于治疗湿性黄斑变性和干性黄斑变性两者。
在某些方面,本文提供RNA复合物,所述RNA复合物抑制髓样分化初级应答基因88(MyD88)和/或Toll样受体3(TLR3),并且在老年性黄斑变性(AMD)(例如,湿性AMD和/或干性AMD)的治疗中是有用的。在某些方面,本文提供包括这样的RNA复合物的药物组合物和使用这样的RNA复合物和药物组合物的方法。
在某些方面,本文提供RNA复合物,所述RNA复合物包括反义链和有义链,所述反义链具有与MyD88的mRNA序列(例如,人MyD88的mRNA序列)的序列互补性,所述有义链具有与反义链的序列互补性。在一些实施方案中,RNA复合物能够抑制细胞MyD88表达。在某些实施方案中,RNA复合物能够抑制细胞MyD88生成。在一些实施方案中,RNA复合物是不对称短干扰RNA(asiRNA)。在一些实施方案中,RNA复合物是长不对称短干扰RNA(lasiRNA)。
在一些实施方案中,反义链的长度为至少19个核苷酸(nt)。在一些这样的实施方案中,反义链的长度为19至21nt(即,长度为19、20或21nt)。在其他这样的实施方案中,反义链的长度为至少24nt(例如,长度为24至121nt),例如,长度为31nt。在某些实施方案中,反义链的至少13、14、15、16、17、18、19、20或21nt与MyD88mRNA序列互补。在一些实施方案中,有义链的长度为15至17nt(即,长度为15nt、长度为16nt或长度为17nt)。在某些实施方案中,有义链的至少15nt、至少16nt或至少17nt与反义链的序列互补。代表性的RNA复合物包含表1、表2、表3、表4、表5或表6中列出的RNA复合物。
在某些方面,本文提供RNA复合物,所述RNA复合物包括反义链和有义链,所述反义链具有与TLR3的mRNA序列(例如,人TLR3的mRNA序列)的序列互补性,所述有义链具有与反义链的序列互补性。在一些实施方案中,RNA复合物能够抑制细胞TLR3表达。在某些实施方案中,RNA复合物能够抑制细胞TLR3生成。在一些实施方案中,RNA复合物是不对称短干扰RNA(asiRNA)。在一些实施方案中,RNA复合物是长不对称短干扰RNA(lasiRNA)。
在一些实施方案中,反义链的长度为至少19个核苷酸(nt)。在一些实施方案中,反义链的长度为19至21nt(即,长度为19、20或21nt)。在其他这样的实施方案中,反义链的长度为至少24nt(例如,长度为24至121nt)。在某些实施方案中,反义链的至少13、14、15、16、17、18、19、20或21nt与TLR3的mRNA序列互补。在一些实施方案中,有义链的长度为15至17nt(即,长度为15nt、长度为16nt或长度为17nt)。在某些实施方案中,有义链的至少15nt、至少16nt或至少17nt与反义链的序列互补。代表性的RNA复合物包含表7、表8或表10中列出的RNA复合物。
在一些实施方案中,本文提供的RNA复合物包括化学修饰,其中在不存在递送运载体的情况下,修饰便利穿透细胞膜。在一些实施方案中,修饰是2’-O-甲基化核苷、硫代磷酸酯键和/或胆甾醇部分。在一些这样的实施方案中,2’-O-甲基核苷被定位于有义链的3’末端。在一些这样的实施方案中,有义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷(例如,3’末端的6个核苷内的2、3、4、5或6个2’-O-甲基化核苷)。在其他实施方案中,2’-O-甲基核苷被定位于反义链的3’末端。在一些这样的实施方案中,反义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷(例如,3’末端的6个核苷内的2、3、4、5或6个2’-O-甲基化核苷)。在一些实施方案中,有义链的3’末端区和反义链的3’末端区两者都包括多个2’-O-甲基化核苷。代表性的RNA复合物包含表3、表4、表5、表6、表8或表10中列出的经修饰的RNA复合物。在某些实施方案中,RNA复合物不是细胞毒的。
在一些实施方案中,本文提供的RNA复合物包括硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,RNA复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为硫代磷酸酯键。在一些这样的实施方案中,RNA复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的键全部都为硫代磷酸酯键。类似地,在一些实施方案中,RNA复合物的反义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为硫代磷酸酯键。在一些这样的实施方案中,RNA复合物的反义链中核糖核苷酸之间的键全部都为硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中,本文提供的RNA复合物包括胆甾醇部分。在一些实施方案中,胆甾醇部分被附连至有义链的3’末端。
在某些方面,本文提供包括本文提供的RNA复合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中,药物组合物被配制用于施用至眼(例如,作为滴眼剂)。在一些实施方案中,药物组合物被配制用于玻璃体内递送。
在某些方面,本文提供抑制细胞MyD88表达和/或细胞TLR3表达的方法,所述方法包括使细胞与本文提供的RNA复合物和/或药物组合物接触。在一些实施方案中,细胞存在于人受试者(例如,具有湿性AMD或干性AMD的人受试者)的眼中。在某些方面,本文提供治疗人受试者的AMD(例如,湿性AMD和/或干性AMD)的方法,所述方法包括向受试者(例如,向眼)施用本文提供的RNA复合物和/或药物组合物。在一些实施方案中,通过玻璃体内注射将RNA复合物和/或药物组合物施用至眼。
附图简要说明
图1示出靶向MyD88的示例性asiRNA的基因沉默效率。将asiRNA以0.3nM的浓度转染到HeLa细胞中,并且在24小时之后,使用实时PCR测定MyD88mRNA表达的程度。描绘了三次重复实验的平均值和标准偏差。
图2示出靶向MyD88的示例性asiRNA的基因沉默效率。将asiRNA以0.3nM、0.1nM、0.03nM和0.01nM的浓度转染到HeLa细胞中,并且在24小时之后,使用实时PCR测定MyD88mRNA表达的程度。描绘了三次重复实验的平均值和标准偏差。
图3示出靶向MyD88的具有不同反义链长度(19、21或31个核苷酸)的示例性asiRNA的基因沉默效应。将asiRNA以0.1nM、0.03nM或0.01nM的浓度转染到HeLa细胞中,并且在24小时之后,使用实时PCR测定MyD88mRNA表达的程度。描绘了三次重复实验的平均值和标准偏差。
图4示出靶向MyD88的示例性asiRNA的MyD88蛋白质表达的抑制。将asiRNA以3nM或10nM的浓度转染到A549或HeLa细胞中,并且在48小时之后,提取蛋白质并且进行免疫印迹。图片(a)描绘了转染后48小时A549细胞中的MyD88蛋白表达水平。图片(b)描绘了转染后48小时HeLa细胞中的MyD88蛋白表达水平。(NT=无处理,L2K=转染对照)。
图5示出含有2’-O-甲基化修饰的示例性asiRNA的基因沉默效率。将asiRNA以0.1nM或0.03nM的浓度转染到HeLa细胞中,并且在24小时之后,使用实时PCR测定MyD88mRNA表达的程度。
图6示出示例性MyD88靶向细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA或cp-asiMyD88)的基因沉默效率,各种各样的化学修饰已经被应用于所述MyD88靶向细胞穿透asiRNA。在无转染运载体且HeLa细胞存在的情况下,将cp-asiRNA以1μM的浓度孵育,并且在48小时之后,使用实时PCR测定MyD88mRNA表达的程度。描绘了三次重复实验的平均值和标准偏差。
图7示出示例性cp-asiRNA的MyD88蛋白质表达的抑制。在无转染运载体的情况下,将cp-asiRNA与HeLa细胞接触,并且在48小时后,提取蛋白质并且进行免疫印迹。(NT=无处理)。
图8示出示例性cp-asiRNA的基因沉默效率,各种各样的化学修饰已经被应用于所述cp-asiRNA。在无转染运载体且HeLa细胞存在的情况下,将cp-asiRNA以1μM的浓度孵育,并且在48小时之后,使用实时PCR测定MyD88mRNA表达的程度。描绘了三次重复实验的平均值和标准偏差。
图9示出示例性cp-asiRNA的MyD88蛋白质表达的抑制。在无转染运载体的情况下,使cp-asiRNA与HeLa细胞接触,并且在48小时之后,提取蛋白质并且进行免疫印迹。(NT=无处理,RiM=仅转染试剂,NC=阴性对照)。
图10示出具有不同反义链长度(21或19个核苷酸)并且含有2’-O-甲基化修饰的cp-asiRNA的基因沉默效率。在无转染运载体且HeLa细胞存在的情况下,将每种cp-asiRNA以1μM的浓度孵育,并且在48小时之后,使用实时PCR测定MyD88mRNA表达的程度。
图11示出示例性cp-asiRNA的MyD88蛋白质表达的抑制。在无转染运载体且HeLa细胞存在的情况下,将cp-asiRNA以1μM或3μM的浓度孵育,并且在48小时之后,提取蛋白质并且进行免疫印迹。(NT=无处理)。
图12示出靶向Toll样受体3(TLR3)的示例性asiRNA的基因沉默效率。将asiRNA以0.1nM的浓度转染到HaCaT细胞中,并且在24小时之后,使用qRT-PCR测定TLR3mRNA表达的程度。描绘了两次重复实验的平均值和标准偏差。
图13示出靶向TLR3的示例性asiRNA的基因沉默效率。将asiRNA以0.1nM的浓度转染到HaCaT细胞中,并且在24小时之后,使用qRT-PCR测定TLR3mRNA表达的程度。描绘了两次重复实验的平均值和标准偏差。
图14示出靶向TLR3的示例性asiRNA的基因沉默效率。将asiRNA以0.3nM的浓度转染到HaCaT细胞中,并且在24小时之后,使用qRT-PCR测量TLR3mRNA表达的程度。
图15示出示例性asiRNA的TLR3蛋白质表达的抑制。将asiRNA以10nM的浓度转染到HaCaT细胞中,并且在48小时之后,使用免疫印迹测定TLR3蛋白质表达的程度。
图16示出由示例性cp-asiRNA处理24小时的HaCaT细胞的图像。将cp-asiRNA以1μM孵育,并且在24小时之后,通过ECLIPSE 100(Nikon)使HaCaT细胞的形态成像。
图17示出示例性TLR3-靶向细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA或cp-asiTLR3)的基因沉默效率,各种各样的化学修饰已经被应用于所述TLR3-靶向细胞穿透asiRNA。将浓度为1μM的cp-asiRNA与HaCaT细胞孵育,并且在48小时之后,使用qRT-PCR测量TLR3mRNA表达的程度。描绘了两次重复实验的平均值和标准偏差。
图18示出示例性cp-asiRNA的TLR3蛋白质表达的抑制。在无转染运载体的情况下,将指定的cp-asiRNA与HaCaT细胞接触,并且在48小时之后,提取蛋白质并且进行免疫印迹。(NT=未处理)。
图19示出示例性cp-asiRNA的TLR3mRNA和蛋白质表达的抑制。在无转染运载体的情况下,将指定的cp-asiRNA与HaCaT细胞接触,并且在48小时之后,使用qRT-PCR和免疫印迹测定TLR3表达的程度。
图20示出示例性cp-asiRNA的TLR3蛋白质表达的抑制。在无转染运载体的情况下,将指定的cp-asiRNA与HaCaT细胞接触,并且在48小时之后,提取蛋白质并且进行免疫印迹。(NT=无处理)。
详细说明
综述
在某些方面,本文提供不对称RNA复合物(例如,asiRNA或lasiRNA),所述不对称RNA复合物抑制MyD88和/或TLR3表达,并且因此对于AMD(例如,湿性AMD和/或干性AMD)的治疗是有用的。在一些实施方案中,RNA复合物被化学修饰以能够在不需要转染运载体的情况下穿透细胞。在一些实施方案中,RNA复合物为表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8或表10中列出的RNA复合物。在某些方面,本文提供包括这样的RNA复合物的药物组合物,和使用这样的RNA复合物和药物组合物的方法。
MyD88是作为激活免疫应答的蛋白质之一在干性AMD和湿性AMD两者的发作中起重要作用的蛋白质。不同于在治疗干性黄斑变性中无效的靶向VEGF的先前的AMD疗法,靶向MyD88的疗法可以用于治疗湿性AMD和干性AMD两者。下面提供示例性人MyD88 cDNA序列。
人MyD88 cDNA序列。
Toll样受体3(TLR3)作为1型跨膜信号分子在固有免疫系统中起关键作用。TLR3配体包含由RNA病毒的增殖形成的双链RNA和聚肌胞苷酸(polyI:C)(一种dsRNA类似物)。在患有干性AMD的个体中,alu-RNA(dsRNA的一种类型)在视网膜上皮细胞中累积。与健康个体相比,患有湿性AMD的人在外周血单核细胞中具有TLR3的高表达的水平,表明TLR3与干性AMD和湿性AMD两者的发病机制密切相关。下面提供示例性人MyD88 cDNA序列。
人TLR3 cDNA序列。
在一些实施方案中,本文所描述的RNA复合物是asiRNA或lasiRNA。如本文所使用的,术语asiRNA指双链不对称短干扰RNA分子,所述双链不对称短干扰RNA分子具有19-21nt的反义链和13-17nt的有义链。asiRNA上的附加的信息可以在美国专利公布号2012/0238017和Chang et al.,Mol.Ther.17:725-732(2009)中找到,其中的每个以引用的方式被整体并入本文。如本文所使用的,术语lasiRNA指双链长不对称干扰RNA分子,所述双链长不对称干扰RNA分子具有13-21nt的有义链和大于24nt的反义链。lasiRNA上的附加的信息可以在美国专利公布号2013/0273657中找到,其以引用的方式被整体并入本文。
在一些实施方案中,本文所描述的RNA复合物使用递送运载体(如脂质体、阳离子聚合物、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导域(PTD)、抗体和/或适配体)被递送至细胞。在一些实施方案中,本文所描述的RNA复合物被化学修饰以便不需要使用这样的递送运载体介导细胞中的MyD88和/或TLR3抑制。这样的RNA复合物在本文中被称为细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)或细胞穿透lasiRNA(cp-lasiRNA)。
定义
为了方便起见,此处收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。
本文中使用冠词“一(a)”和“一(an)”指所述冠词的一个或多于一个(即,至少一个)语法对象。举例来说,“一要素”意指一个要素或多于一个要素。
如本文所使用的,术语“施用”意指向受试者提供药剂或药物组合物,并且包含,但不限于由医疗技术人员施用和自我施用。
如本文所使用的,术语“干扰核酸”、“抑制核酸”可互换地被使用。干扰核酸通常包含环状亚基的序列,每个具有碱基配对部分,通过亚基间连锁连接,所述亚基间连锁允许碱基配对部分与核酸(通常RNA)中的靶标序列通过Watson-Crick碱基配对杂交,以形成核酸:靶标序列内的寡聚体异源双链体。干扰RNA分子包含,但不限于,反义分子、siRNA分子、asiRNA分子、lasiRNA分子、单链siRNA分子、miRNA分子和shRNA分子。这样的干扰核酸可以被设计以阻断或抑制mRNA的翻译或抑制天然前体mRNA拼接加工,或诱导被靶向的mRNA的降解,并且可以被称作“被指向”或“被靶向针对”靶标序列,所述干扰核酸与所述靶标序列杂交。干扰核酸可以包含,例如,肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、2’-O-甲基寡核苷酸和RNA干扰剂(siRNA剂)。RNAi分子通常通过与靶标分子形成异源双链体起作用,所述靶标分子被选择性地降解或“解体”,由此使靶标RNA失活。在一些情况下,干扰RNA分子也可以通过抑制转录本翻译和/或抑制转录本的转录使靶标转录本失活。当干扰核酸以上文所描述的方式靶向针对靶标的核酸时,干扰核酸更普遍地被称作“被靶向针对”生物学相关的靶标(如蛋白质)。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地被使用。它们指核苷酸的聚合体形式,不论任何组合和任何长度的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构,并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体(vector)、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸,如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话,对核苷酸结构的修饰可以在聚合物的组装之前或之后被赋予。多核苷酸可以被进一步修饰,如通过与标记组件偶联。在本文提供的全部核酸序列中,U核苷酸与T核苷酸是可互换的。
如本文所使用的,术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或运载体,如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料。
如果寡聚体在生理条件下与靶标杂交,则寡核苷酸与靶标多核苷酸“特异性杂交”,并且Tm大幅度大于45℃,或至少50℃,或至少60℃-80℃或更高。这样的杂交对应于严格的杂交条件。在给定的离子强度和pH,Tm是温度,在所述温度下,50%的靶标序列与互补多核苷酸杂交。此外,这样的杂交可以以反义寡聚物与靶标序列的“近似的”或“大体上的”互补以及精确的互补发生。
如本文所使用的,术语“受试者”意为选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
如本文所使用的,短语“治疗有效的量”和“有效量”意为对于以适用于任何医学治疗的合理的益处/风险比率在受试者中的至少亚群体的细胞中产生期望的治疗效果是有效的药剂的量。
“治疗”受试者中的疾病或“治疗”患有疾病的受试者指使受试者经受药物治疗(例如,药物的施用),使得疾病的至少一种症状被减轻或防止恶化。
如本文所使用的,“预防”紊乱或病况的治疗剂指化合物,当在紊乱或病况发作之前被施用至统计样品时,相对于未经处理的对照样品,所述化合物降低经处理的样品中的紊乱或病况的发生,或相对于未经处理的对照样品,所述化合物延迟紊乱或病况的一种或更多种症状的发作或降低紊乱或病况的一种或更多种症状的严重度。
RNA复合物
在某些方面,本文提供RNA复合物,所述RNA复合物靶向MyD88或TLR3 mRNA并且抑制细胞MyD88或TLR3表达。人MyD88和TLR3mRNA的核酸序列在本公开的结尾处列出的序列中被提供。
在某些方面,本文提供一种包括反义链和有义链的RNA复合物,所述反义链具有与MyD88或TLR3 mRNA序列(例如,人MyD88或TLR3 mRNA序列)的序列互补性,所述有义链具有与反义链的序列互补性。在一些实施方案中,RNA复合物能够抑制细胞MyD88或TLR3表达。在一些实施方案中,RNA复合物是不对称短干扰RNA(asiRNA)。在一些实施方案中,RNA复合物是长不对称短干扰RNA(lasiRNA)。在一些实施方案中,RNA复合物是表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8或表10中列出的RNA复合物。本文所描述的RNA复合物可以含有RNA碱基、非RNA碱基或RNA碱基和非RNA碱基的混合物。例如,本文提供的某些RNA复合物可以主要由RNA碱基组成,但是也含有DNA碱基或非天然存在的核苷酸。
在一些实施方案中,反义链的长度为至少19个核苷酸(nt)。在一些实施方案中,反义链的长度为19至21nt(即,长度为19、20或21nt)。在一些实施方案中,反义链的至少13、14、15、16、17、18、19、20或21nt与MyD88或TLR3mRNA序列互补。完美的互补性不是必需的。在一些实施方案中,反义链与MyD88或TLR3mRNA序列完美地互补。
在一些实施方案中,反义链的长度为至少24nt(例如,长度为至少25nt、长度为至少26nt、长度为至少27nt、长度为至少28nt、长度为至少29nt、长度为至少30nt或长度为至少31nt)。在一些实施方案中,反义链的长度不大于124nt(例如,长度不大于100nt、长度不大于90nt、长度不大于80nt、长度不大于70nt、长度不大于60nt、长度不大于50nt或长度不大于40nt)。在一些实施方案中,反义链的长度为31nt。在一些实施方案中,反义链的至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、29、30或31nt与MyD88或TLR3mRNA序列互补。完美的互补性不是必需的。在一些实施方案中,反义链与MyD88或TLR3mRNA序列完美地互补。
在一些实施方案中,有义链的长度为15至17nt(即,长度为15nt、长度为16nt或长度为17nt)。在一些实施方案中,有义链的至少15nt、至少16nt或至少17nt与反义链的序列互补。在一些实施方案中,有义链与反义链的序列完美地互补。
在一些实施方案中,反义链和有义链形成复合物,其中所述反义链的5’端和所述有义链的3’端形成平端。在一些实施方案中,反义链和有义链形成复合物,其中所述反义链的5’端悬突于所述有义链的3’端(例如,通过1、2、3、4、或5nt)。在一些实施方案中,反义链和有义链形成复合物,其中所述有义链的5’端悬突于所述反义链的3’端(例如,通过1、2、3、4、或5nt)。
在一些实施方案中,RNA复合物的反义链和/或有义链具有选自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8或表10中列出的序列的有义链序列和/或反义链序列。
在一些实施方案中,本文提供的RNA复合物包括化学修饰,其中所述修饰便利在不存在递送运载体的情况下穿透细胞膜。在一些实施方案中,修饰是2’-O-甲基化核苷、硫代磷酸酯键或胆甾醇部分。在一些实施方案中,RNA复合物是表2或表4中列出的经修饰的RNA复合物。在某些实施方案中,RNA复合物不是细胞毒的。
本文所描述的RNA复合物可以采用各种各样的寡核苷酸化学成分。寡核苷酸化学成分的实例包含(不限于)肽核酸(PNA)、联核酸(LNA)、硫代磷酸酯、2’O-Me-修饰的寡核苷酸和吗啉代化学成分,包含前述中任何的组合。通常,由于相对于2’O-Me寡核苷酸,PNA和LNA化学成分的相对高的靶标结合强度,其可以利用较短的靶标序列。硫代磷酸酯和2’O-Me-修饰的化学成分经常被结合以生成2’O-Me-修饰的寡核苷酸,所述2’O-Me-修饰的寡核苷酸具有硫代磷酸酯主链。参见,例如,PCT公布号WO/2013/112053和WO/2009/008725,其中的每个以引用方式被整体并入本文。
肽核酸(PNA)是DNA的类似物,其中主链与脱氧核糖主链在结构上是同形的,由N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成,嘧啶和嘌呤碱基被附连到所述N-(2-氨乙基)甘氨酸单元。含有天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA遵从Watson-Crick碱基配对规则与互补寡核苷酸杂交,并且根据碱基对识别模拟DNA。PNA的主链由肽键而不是硫代磷酸酯键形成,使其非常适合反义应用(参见以下结构)。主链是不带电荷的,引起PNA/DNA或PNA/RNA双链体显示出大于正常的热稳定性。PNA不能被核酸酶或蛋白酶识别。
尽管天然结构发生彻底的结构变化,但是PNA能够以螺旋形式与DNA或RNA序列特异性结合。PNA的特性包含对互补DNA或RNA的高的结合亲和力、由单碱基错配引起的失稳作用、对核酸酶和蛋白酶的耐受性、不依赖于盐浓度与DNA或RNA的杂交以及与同型嘌呤DNA形成三股螺旋。PANAGENE.TM已经开发了其专利的Bts PNA单体(Bts;苯并噻唑-2-磺酰基基团)和专利的寡聚工艺。使用Bts PNA单体的PNA寡聚由脱保护、偶联和加帽的重复循环组成。PNA可以使用任何本领域已知的技术被合成生产。参见,例如,美国专利号6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。也参见用于PNA制备的美国专利号5,539,082;5,714,331;以及5,719,262。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen etal.,Science,254:1497-1500,1991中找到。前述中的每个通过引用被整体并入本文。
干扰核酸也可以含有“锁核酸”亚基(LNAs)。“LNAs”是被称为桥接核酸(BNA)的一类修饰的成员。BNA的特征在于共价键,所述共价键锁定了C3-内(北)糖折叠中的核糖环的构象。对于LNA,桥由2’-O和4’-C位置之间的亚甲基组成。LNA增强主链预组织和碱基堆积以增加杂交和热稳定性。
LNA的结构可以在例如Wengel,et al.,Chemical Communications(1998)455;Tetrahedron(1998)54:3607和Accounts of Chem.Research(1999)32:301;Obika,et al.,Tetrahedron Letters(1997)38:8735;(1998)39:5401以及Bioorganic MedicinalChemistry(2008)16:9230中找到。本文提供的化合物可以并入一种或更多种LNA;在一些情况下,化合物可以完全由LNA组成。用于个体LNA核苷亚基的合成及其并入寡核苷酸的方法在例如美国专利号7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499和6,670,461中被描述,其中的每个通过引用被整体并入本文。典型的亚基间连接体包含磷酸二酯和硫代磷酸酯部分;可替代地,可以采用不含磷的连接体。一个实施方案是含LNA化合物,其中每个LNA亚基被DNA亚基分开。某些化合物由交替的LNA和DNA亚基组成,其中亚基间连接体是硫代磷酸酯。
在某些实施方案中,RNA复合物被连接至胆甾醇部分。在一些实施方案中,胆甾醇部分被附连至有义链的3’末端。在一些实施方案中,胆甾醇部分被附连至反义链的3’末端。在一些实施方案中,胆甾醇部分被附连至有义链的5’末端。在一些实施方案中,胆甾醇部分被附连至反义链的5’末端。
在一些实施方案中,RNA复合物包括2’-O-甲基化核苷。2’-O-甲基化核苷在核糖分子的2’-OH残基处带有甲基。2’-O-Me-RNA显示出与RNA相同的(或类似的)行为,但被保护免受核酸酶降解。也可以将2’-O-Me-RNA与硫代磷酸寡核苷酸(PTO)组合用于进一步稳定化。可以根据本领域的常规技术合成2’-O-Me-RNA(磷酸二酯或硫代磷酸)(参见,例如,Yoo etal.,Nucleic Acids Res.32:2008-16,2004,其以引用方式被并入本文)。
在一些实施方案中,2’-O-甲基核苷被定位于有义链的3’末端。在一些实施方案中,有义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷(例如,3’末端的6个核苷内的2、3、4、5或6个2’-O-甲基化核苷)。在一些实施方案中,2’-O-甲基核苷被定位于反义链的3’末端。在一些实施方案中,反义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷(例如,3’末端的6个核苷内的2、3、4、5或6个2’-O-甲基化核苷)。在一些实施方案中,有义链的3’末端区和反义链的3’末端区两者都包括多个2’-O-甲基化核苷。在一些实施方案中,有义链包括2’-O-甲基化核苷,所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。在一些实施方案中,有义链包括2、3、4、5、6、7或8个2’-O-甲基化核苷的连续序列,所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。在一些实施方案中,反义链包括2’-O-甲基化核苷,所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。在一些实施方案中,反义链包括2、3、4、5、6、7或8个2’-O-甲基化核苷的连续序列,所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。
在一些实施方案中,RNA复合物包括硫代磷酸酯键。“硫代磷酸酯”(或S-oligos)是正常DNA的变体,其中非桥接氧中的一个被硫代替。核苷酸间键的硫化减少核酸内切酶和核酸外切酶的活动,所述核酸内切酶和核酸外切酶包含5’至3’和3’至5’DNA POL 1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、RNA酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯通过两个主要途径被制造:通过二硫化碳中的元素硫的溶液对氢膦酸酯的作用,或通过用二硫化四乙基秋兰姆(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯的方法(参见,例如,Iyer et al.,J.Org.Chem.55,4693-4699,1990)。后面的方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中的不溶性和二硫化碳的毒性问题。TETD和BDTD方法也产生较高纯度的硫代磷酸酯。
在一些实施方案中,RNA复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,RNA复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的键全部为硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中,RNA复合物的反义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,RNA复合物的反义链中的核糖核苷酸之间的键全部为硫代磷酸酯键。
可以将本文所描述的RNA复合物与细胞接触或者施用至有机体(例如,人)。可替代地,可以将编码RNA复合物的构建体和/或载体(vector)与细胞或有机体接触或引入细胞或有机体。在某些实施方案中,使用病毒、逆转录病毒或慢病毒载体(vector)。
本文所描述的RNA复合物可以通过本领域中已知的任何合适的方法制备。例如,在一些实施方案中,本文所描述的RNA复合物通过化学合成或体外转录被制备。
在某些方面,本文提供一种药物组合物,所述药物组合物包括本文提供的RNA复合物和药学上可接受的载体。在某些实施方案中,药物组合物被配制用于递送至眼(例如,作为滴眼剂)。在一些实施方案中,药物组合物被配制用于玻璃体内递送。
在一些实施方案中,药物组合物还包括用于治疗AMD的第二药剂(例如,抗VEGF治疗剂,如贝伐单抗、雷珠单抗、哌加他尼(pegaptanib)和/或阿柏西普(aflibercept))。在某些实施方案中,药物组合物不包括转染运载体。在一些实施方案中,药物组合物包括递送运载体(例如,脂质体、阳离子聚合物、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导域(PTD)、抗体和/或适配体)。在一些实施方案中,组合物包含本文所描述的多种(例如,两种或更多种)RNA复合物的组合。
制备这些剂型或组合物的方法包含使本文所描述的RNA复合物与载体以及,可选地,一种或更多种辅助成分结合的步骤。通常,剂型通过使本文所描述的药剂与液体载体均匀地且紧密地结合来制备。
治疗方法
在某些方面,本文提供一种抑制细胞MyD88和/或TLR3表达的方法,所述方法包括使细胞与本文提供的RNA复合物接触。在一些实施方案中,RNA复合物是经修饰的RNA复合物,并且细胞在不存在转染运载体的情况下与RNA复合物接触。在一些实施方案中,细胞在存在递送运载体(例如,脂质体、阳离子聚合物、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导域(PTD)、抗体和/或适配体)的情况下与RNA复合物接触。在一些实施方案中,细胞存在于人受试者的眼中。在一些实施方案中,受试者患有AMD(例如,湿性AMD或干性AMD)。
在某些方面,本文提供治疗人受试者的AMD(例如,湿性AMD或干性AMD)的方法,所述方法包括向受试者施用本文提供的RNA复合物或药物组合物。在某些实施方案中,RNA复合物或药物组合物被施用至受试者的眼。在一些实施方案中,RNA复合物或药物组合物由受试者自我施用。
在本发明的方法中,本文所描述的RNA复合物可以被施用至受试者,例如,作为无递送运载体情况下的核酸(例如,对于cp-asiRNA和cp-lasiRNA)、与递送试剂组合、和/或作为包括表达本文所描述的RNA复合物的序列的核酸。在一些实施方案中,任何本领域已知的核酸递送方法可以被用于本文所描述的方法中。适合的递送试剂包含,但不限于,例如,Mirus Transit TKO亲脂性试剂;转化脂(lipofectin);阳离子脂质体(lipofectamine);细胞转染剂(cellfectin);聚阳离子(例如,聚赖氨酸)、缺端胶原、nanoplexe和脂质体。Minakuchi et al.Nucleic Acids Res.,32(13):e109(2004);Hanai et al.Ann NY AcadSci.,1082:9-17(2006);和Kawata et al.Mol Cancer Ther.,7(9):2904-12(2008)中描述了将缺端胶原用作核酸分子的递送运载体,其中的每个被整体并入本文。美国专利号8,283,461、8,313,772、8,501,930、8,426,554、8,268,798和8,324,366中提供了示例性的干扰核酸递送系统,其中的每个以引用方式被整体并入本文。
在本文所描述方法的一些实施方案中,脂质体被用于将本文所描述的RNA复合物递送至受试者。适用于本文所描述的方法的脂质体可以由标准囊泡形成脂类形成,所述标准囊泡形成脂类通常包含中性的或带负电的磷脂和甾醇(如胆甾醇)。通常由考虑因素(如期望的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期)来指导脂类的选择。已知用于制备脂质体的各种各样的方法,例如,如Szoka et al.(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467;和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的,其的全部公开内容通过引用被并入本文。
用于本发明方法的脂质体也可以被修饰以便避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。这样的经修饰的脂质体具有表面上或被并入到脂质体结构中的调理素作用抑制部分。
用于制备本文所描述的脂质体的调理素作用抑制部分通常是被结合至脂质体膜的大亲水性聚合物。如本文所使用的,当调理素作用抑制部分以化学方法或以物理方法被附连至膜(例如,通过将脂溶性锚定物嵌入膜自身,或通过直接与膜脂的活性基团结合)时,调理素作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理素作用抑制亲水性聚合物形成保护表面层,所述保护表面层通过MMS和RES显著降低脂质体的摄取;例如,如美国专利号4,920,016中所描述的,其全部公开内容通过引用被并入本文。
在一些实施方案中,适于修饰脂质体的调理素作用抑制部分是水溶性聚合物,所述水溶性聚合物具有从约500至约40000道尔顿,或从约2000至约20000道尔顿的数均分子量。这样的聚合物包含聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物;例如,甲氧基PEG或PPG,以及PEG或PPG硬脂酸酯;合成聚合物(如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮);线性的、支化的或树枝状的聚酰胺;聚丙烯酸;多元醇(例如,聚乙烯醇和聚木糖醇,羧基基团或氨基基团以化学方法被连接至聚乙烯醇和聚木糖醇),以及神经节苷脂(如神经节苷脂GM1)。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外,调理素作用抑制聚合物可以是PEG和聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理素作用抑制聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖,例如,半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、藻酸、角叉菜胶;胺化多糖或寡糖(线性的或支化的);或羧基化多糖或寡糖,例如,与碳酸的衍生物反应,生成羧基基团连接。在一些实施方案中,调理素作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
本文公开的药物组合物可以通过任何合适的施用途径被递送,所述施用途径包含局部、玻璃体内、口服和肠胃外。在某些实施方案中,药物组合物通常被递送(例如,经由口服或肠胃外施用)。在某些其他实施方案中,药物组合物通过直接施用至眼被局部递送。
药物组合物中RNA复合物的实际剂量水平可以变化,以便获得RNA复合物的量,所述RNA复合物的量对实现特定患者、组合物和施用模式的期望的治疗响应是有效的,而对患者没有毒性。
所选择的剂量水平将取决于各种各样的因素,所述因素包含所采用的特定药剂的活性、施用途径、施用时间,正在被采用的特定化合物的排泄或代谢的速率、治疗的持续时间、与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在被治疗的患者的年龄、性别、体重、病情、总体健康状况和先前的病史,以及医学领域中众所周知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师可以容易地确定和开出所需要的药物组合物的有效量。例如,医师或兽医可以以低于所需的水平开出和/或施用药物组合物中采用的药剂的剂量,以实现期望的治疗效果并且逐渐增加剂量,直到实现期望的效果。
通常,本文所描述的RNA复合物的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的RNA复合物的量。这样的有效剂量将通常取决于上述因素。
示例
实施例1:筛选MyD88特异性不对称小干扰RNA
为了鉴定高效抑制MyD88的不对称小干扰RNA(asiRNA),合成并且筛选了44种asiRNA。筛选的asiRNA的核酸序列提供在表1中。
表1:示例性MyD88-靶向asiRNA的核酸序列
将表1中列出的asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(STpharm)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选,使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天,将2.0×104个HeLa细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用0.3nM的asiRNA转染HeLa细胞。
转染后24小时,使用实时PCR测量经转染的细胞中的MyD88mRNA水平。具体地,根据制造商的说明,使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取全部RNA,然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems),将500ng提取的RNA用于cDNA合成。稀释合成的cDNA,然后根据制造商的说明使用StepOne实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量实时PCR。使用powerSYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)检测MyD88基因的扩增。将GAPDH扩增为内部对照。使用以下引物序列:
人GAPDH-正向5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′
人GAPDH-反向5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′
人MyD88-正向5′-AAG TTA TTT GTT TAC AAA CAG CGA CCA-3′
人MyD88-反向5′-GGA AGA ATG GCA AAT ATC GGC T-3′
图1中提供了44种asiRNA中每种的MyD88抑制的水平。三种asiRNA序列asiMyD88(26)、asiMyD88(27)和asiMyD88(32)被选择用于后续研究。
实施例2:使用MyD88-靶向asiRNA抑制MyD88 mRNA表达水平
测试三种asiRNA序列asiMyD88(26)、asiMyD88(27)和asiMyD88(32)在不同浓度下抑制MyD88表达的能力。将asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(STpharm)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选,使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天,将2.0×104个HeLa细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用asiRNA转染HeLa细胞。
图2中提供了不同浓度的3种asiRNA的MyD88抑制的水平。如图2中所示,低浓度的asiMyD88(26)和asiMyD88(27)表现出最高水平的MyD88抑制。asiMyD88(26)和asiMyD88(27)被选择用于后续研究。
实施例3:asiRNA的修饰
合成具有不同反义链长度的多种潜在的asiMyD88结构并且测试其抑制MyD88表达的能力。(表2)
表2.附加的asiRNA序列
MyD88#26(S):5′GUGACUUCCAGACCAA 3′ |
MyD88#26(19AS):5′UUGGUCUGGAAGUCACAUU 3′ |
MyD88#26(21AS):5′UUGGUCUGGAAGUCACAUUCC 3′ |
MyD88#26(31AS):5′UUGGUCUGGAAGUCACAUUCCUUGCUCUGCA 3′ |
MyD88#27(S):5′UGUGACUUCCAGCCA 3′ |
MyD88#27(19AS):5′UGGUCUGGAAGUCACAUUC 3′ |
MyD88#27(21AS):5′UGGUCUGGAAGUCACAUUCCU 3′ |
MyD88#27(31AS):5′UGGUCUGGAAGUCACAUUCCUUGCUCUGCAG 3′ |
将表2中列出的asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(STpharm)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选,使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天,将2.0×104个HeLa细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用0.3nM的asiRNA转染HeLa细胞。
转染后24小时,使用实时RT-PCR测量经转染的细胞中的MyD88mRNA水平。具体地,根据制造商的说明,使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取全部RNA,然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems),将500ng提取的RNA用于cDNA合成。稀释合成的cDNA,然后根据制造商的说明使用StepOne实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量实时PCR。使用power SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)检测MyD88基因的扩增。将GAPDH扩增为内部对照。
图3中提供了6种asiRNA中每种的MyD88抑制的水平。asiMyD88(26)和asiMyD88(27)的21个反义核苷酸表现出最高水平的MyD88抑制。21个反义核苷酸被选择用于后续研究。
实施例4:使用MyD88-特异性asiRNA抑制MyD88蛋白质
检测asiMyD88对MyD88蛋白质的抑制的效力。
将asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(STpharm)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
使用A549细胞(ATCC)和HeLa细胞(ATCC),所述A549细胞(ATCC)和HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天,将5.0×104个A549细胞或HeLa细胞接种在12孔板中。根据制造商的说明,使用LipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen)用10nM和3nM的asiRNA转染A549细胞和HeLa细胞。在24小时之后,用含有血清的培养基代替OPTI-MEM培养基。
在48小时的asiRNA转染之后,经由免疫印迹测定MyD88蛋白质表达的水平。简单地说,用RIPA缓冲液(GE)裂解经转染的A549细胞和HeLa细胞。A549细胞的15μg的总蛋白质提取物或HeLa细胞的30μg的总蛋白质提取物被装载到12%的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后,将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-rad),所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用5%脱脂乳(Seoul Milk)封闭1小时,并且然后在4℃在含有抗MyD88抗体(Abcam)和抗β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz)的5%脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次,并且在室温在5%脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟,并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对MyD88和β-肌动蛋白条带成像。
图4中描绘了免疫印迹测定的结果。在A549细胞和HeLa细胞的全部asiMyD88转染细胞系中,80%或更多的MyD88蛋白质抑制被确认。(图4)。
实施例5:MyD88asiRNA的化学修饰
将化学修饰应用于asiRNA。如下所述,某些修饰改进asiRNA的内吞作用和稳定性。在HeLa细胞中测试了四种asiRNA(表3)的MyD88mRNA抑制。
表3.经修饰的asiRNA序列。m=2’-O-甲基RNA
MyD88#26(16S-1):5′mGUmGAmCUmUCmCAmGAmCCmAA 3′ |
MyD88#26(19AS-1):5′UUGGUCUGGAAGUCmAmCmAmUmU 3′ |
MyD88#26(21AS-1):5′UUGGUCUGGAAGUCmAmCmAmUmUmCmC 3′ |
MyD88#27(16S-1):5′mUGmUGmACmUUmCCmAGmACmCA3′ |
MyD88#27(19AS-1):5′UGGUCUGGAAGUCAmCmAmUmUmC 3′ |
MyD88#27(21AS-1):5′UGGUCUGGAAGUCAmCmAmUmUmCmCmU 3′ |
使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天,将2.0×104个HeLa细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。24小时之后,测定HeLa细胞中的MyD88mRNA水平。
图5中提供了asiRNA中每种的MyD88抑制的水平。经修饰的MyD88(27)表现出最高水平的MyD88抑制。
实施例6:用于自我递送的asiRNA的化学修饰
将化学修饰应用于asiRNA,并且在不存在其他递送运载体的情况下测试经修饰的asiRNA的细胞递送。如下所述,某些修饰改进asiRNA的内吞作用和稳定性。这样的细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)能够在不存在递送运载体的情况下被递送到细胞中。
筛选了20种潜在的cp-asiRNA(表4),用于HeLa细胞中的MyD88mRNA抑制。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送运载体的情况下以1μM与HeLa细胞孵育,并且通过实时PCR测量MyD88mRNA水平。
表4.被测试自我递送和MyD88抑制的经修饰的asiRNA序列。
m=2’-O-甲基RNA,*=硫代磷酸酯键。
HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。
将表4中列出的潜在的cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认潜在的cp-asiRNA的适当的链退火。
在转染前一天,将2.0×104个HeLa细胞接种在24孔板中。在立即处理前,用1×DPBS(Gibco)洗涤HeLa细胞,然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
在48小时的asiRNA处理之后,测定MyD88mRNA表达的水平。
图6中提供了20种潜在的cp-asiRNA中每种的MyD88抑制的水平。在测试的潜在的cp-asiRNA中,cp-asiRNA(26)-1和cp-asiRNA(27)-7表现出最高水平的MyD88抑制。
实施例7:使用MyD88-特异性cp-asiRNA抑制MyD88蛋白质
测试cp-asiRNA对MyD88蛋白质的抑制的效力。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送运载体的情况下以1μM与HeLa细胞孵育,并且通过免疫印迹测量MyD88蛋白质水平。
使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。将cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。在转染前一天,将5.0×104个HeLa细胞接种在12孔板中。在立即处理前,用1×DPBS(Gibco)洗涤HeLa细胞,然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
在48小时的asiRNA处理之后,经由免疫印迹测定MyD88蛋白质表达的水平。简单地说,用RIPA缓冲液(GE)裂解经处理的HeLa细胞。30μg的总蛋白质提取物被装载到12%的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后,将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-rad),所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用5%脱脂乳(Seoul Milk)封闭1小时,并且然后在4℃在含有抗MyD88抗体(Abcam)和抗γ-微管蛋白(Bethyl)的5%脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次,并且在室温在5%脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟,并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对MyD88和γ-微管蛋白条带成像。
图7中描绘了免疫印迹测定的结果。全部cp-asiMyD88(27)-4和cp-asiMyD88(27)-7孵育的细胞系表现出60%或更多的MyD88蛋白质抑制(图7)。
实施例8:使用MyD88-特异性cp-asiRNA抑制MyD88蛋白质
合成在反义链中具有不同数量的硫代磷酸酯键的多种潜在的cp-asiMyD88结构并且测试其抑制MyD88表达的能力(表5)。
表5.附加的cp-asiRNA序列。
m=2’-O-甲基RNA,*=硫代磷酸酯键。
测试表5中列出的1μM的潜在的cp-asiRNA中的每种抑制HeLa细胞中的MyD88mRNA的能力。使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。将表5中列出的潜在的cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。在转染前一天,将2.0×104个HeLa细胞接种在24孔板中。在立即处理前,用1×DPBS(Gibco)洗涤HeLa细胞,然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。在48小时的asiRNA处理之后,测定MyD88mRNA表达的水平。
如图8中所示,在有义链上含有3个硫代磷酸酯键并且在反义链上含有4个硫代磷酸酯键的MyD88mRNA的潜在的cp-asiRNA(26)、在有义链上含有3个硫代磷酸酯键并且在反义链上含有3个2’-O-甲基化和4个硫代磷酸酯键的MyD88mRNA的潜在的cp-asiRNA(27)表现出最高水平的MyD88抑制。
实施例9:使用附加的MyD88-特异性cp-asiRNA抑制MyD88蛋白质
测试cp-asiRNA对MyD88蛋白质的抑制的效力。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送运载体的情况下以3μM与HeLa细胞孵育,并且通过免疫印迹测量MyD88蛋白质水平。使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。将cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。在转染前一天,将5.0×104个HeLa细胞接种在12孔板中。在立即处理前,用1×DPBS(Gibco)洗涤HeLa细胞,然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
在48小时的asiRNA处理之后,经由免疫印迹测定MyD88蛋白质表达的水平。简单地说,用RIPA缓冲液(GE)裂解经处理的HeLa细胞。30μg的总蛋白质提取物被装载到12%的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后,将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-rad),所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用5%脱脂乳(Seoul Milk)封闭1小时,并且然后在4℃在含有抗MyD88抗体(Abcam)和抗γ-微管蛋白(Bethyl)的5%脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次,并且在室温在5%脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟,并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对MyD88和γ-微管蛋白条带成像。
图9中描绘了免疫印迹测定的结果。全部cp-asiMyD88孵育的细胞系表现出50%或更多的MyD88蛋白质抑制。此外,cp-asiMyD88(26)-10和cp-asiMyD88(27)-2显示出在MyD88抑制能力中比其他cp-asiMD88具有更高的效率(图9)。
实施例10:附加的MyD88cp-asiRNA结构
合成具有不同链长以及2’-O-甲基化修饰的数量和硫代磷酸酯键的数量的各种潜在的cp-asiMyD88结构,并且测试其抑制MyD88表达的能力(表6)。
表6.附加的cp-asiRNA序列(m=2’-O-甲基RNA,*=硫代磷酸酯键)。
cp-asiMyD88#26-13(S):5′GUGACUUCCAGACC*A*A*胆甾醇3′ |
cp-asiMyD88#26-13(AS):5′UUGGUCUGGAAGUCmA*mC*mA*mU*U*C*C 3′ |
cp-asiMyD88#26-19(S):5′GUGACUUCCAGACC*A*A*胆甾醇3′ |
cp-asiMyD88#26-19(AS):5′UUGGUCUGGAAGU*C*mA*mC*mA*mU*U 3′ |
cp-asiMyD88#27-14(S):5′mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*胆甾醇3′ |
cp-asiMyD88#27-14(AS):5′UGGUCUGGAAGUCAmC*mA*mU*mU*C*C*U 3′ |
cp-asiMyD88#27-15(S):5′mUGmUGmACmUUmCCmAGmAC*mC*A*胆甾醇3′ |
cp-asiMyD88#27-15(AS):5′UGGUCUGGAAGUC*A*mC*mA*mU*mU*C 3′ |
测试表6中列出的1μM或3μM的潜在的cp-asiRNA中的每种抑制HeLa细胞中MyD88mRNA的能力。使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。将表6中列出的潜在的cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。在转染前一天,将2.0×104个HeLa细胞接种在24孔板中。在立即处理前,用1×DPBS(Gibco)洗涤HeLa细胞,然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。在48小时的asiRNA处理之后,测定MyD88mRNA表达的水平。
如图10中所示,在21个核苷酸反义链上含有4个2’-O-甲基化和6个硫代磷酸酯键的MyD88mRNA的潜在的cp-asiRNA(26)、在19个核苷酸反义链上含有4个2’-O-甲基化和6个硫代磷酸酯键的MyD88mRNA的潜在的cp-asiRNA(27)表现出最高水平的MyD88抑制。
实施例11:使用附加的MyD88-特异性cp-asiRNA抑制MyD88蛋白质
测试cp-asiRNA对MyD88蛋白质的抑制的效力。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送运载体的情况下以1μM和3μM与HeLa细胞孵育,并且通过免疫印迹测量MyD88蛋白质水平。使用HeLa细胞(ATCC),所述HeLa细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10%胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。将cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
在转染前一天,将5.0×104个HeLa细胞接种在12孔板中。在立即处理前,用1×DPBS(Gibco)洗涤HeLa细胞,然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。在48小时的asiRNA处理之后,经由免疫印迹测定MyD88蛋白质表达的水平。简单地说,用RIPA缓冲液(GE)裂解经处理的HeLa细胞。30μg的总蛋白质提取物被装载到12%的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后,将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-rad),所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用5%脱脂乳(Seoul Milk)封闭1小时,并且然后在4℃在含有抗MyD88抗体(Abcam)和抗γ-微管蛋白(Bethyl)的5%脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次,并且在室温在5%脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟,并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对MyD88和γ-微管蛋白条带成像。
图11中描绘了免疫印迹测定的结果。全部3μM的cp-asiMyD88孵育的细胞系表现出50%或更多的MyD88蛋白质抑制。此外,cp-asiMyD88(26)-13显示出在MyD88抑制能力中比其他cp-asiMD88具有更高的效率(图11)。
实施例12:筛选Toll样受体3特异性不对称小干扰RNA
为了鉴定高效地抑制Toll样受体3的不对称小干扰RNA(asiRNA),合成并且筛选了100种asiRNA。筛选的asiRNA的核酸序列提供在表7中。
表7:示例性Toll样受体3靶向asiRNA的核酸序列
将表7中列出的asiRNA在退火缓冲液(Bioneer Inc.Korea)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。使用UV透照器经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选,将5.0×103个HaCaT细胞(ATCC)接种到96孔板中,所述HaCaT细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)中被培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)含有10%胎牛血清(FBS,Gibco)以及100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。根据制造商的说明,使用RNAiMAX(Invitrogen Inc.)用0.1nM的asiRNA转染HaCaT细胞。在转染后24小时,使用qRT-PCR测量经转染的细胞中的TLR3mRNA水平。具体地,使用TOYOBO裂解试剂提取全部RNA,并且然后使用TOYOBO RT试剂(TOYOBO SuperPrep),将1/5体积的反应混合物用于cDNA合成。稀释合成的cDNA,并且然后使用Probe qPCRMix(TOYOBO)进行定量RT-PCR。使用TLR3Probe(Hs01551078_m1)和18SProbe(Hs03928985_g1)检测靶标基因的扩增。
图12中提供了100种asiRNA中每种的TLR3抑制的表达水平。17种asiRNA序列asiRNA(13)、asiRNA(25)、asiRNA(26)、asiRNA(28)、asiRNA(32)、asiRNA(33)、asiRNA(37)、asiRNA(38)、asiRNA(39)、asiRNA(53)、asiRNA(58)、asiRNA(60)、asiRNA(71)、asiRNA(77)、asiRNA(78)、asiRNA(82)和asiRNA(83)被选择用于后续研究。
实施例13:用于自我递送的asiRNA的化学修饰
将化学修饰应用于实施例12中选择的asiRNA,并且在不存在其他递送运载体的情况下测试经修饰的asiRNA的细胞递送。如下所述,某些修饰改进asiRNA的内吞作用和稳定性。这样的细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)能够在不存在递送运载体的情况下被递送到细胞中。如使用上述方法测定的,图13和14中提供了细胞TLR3mRNA的表达,并且图15中提供了TLR3蛋白质水平。图16中描绘了细胞的形态。
筛选了潜在的cp-asiRNA(表8),用于在HaCaT细胞中Toll样受体3(TLR3)mRNA抑制。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送运载体的情况下以1μM和3μM与HaCaT细胞(人皮肤角质形成细胞细胞系)孵育,并且通过qRT-PCR和免疫印迹研究测量TLR3表达水平。
表8.被测试自我递送和TLR3抑制的经修饰的asiRNA序列。(m=2’-O-甲基RNA。*=硫代磷酸酯键。)
名称 | 有义(5’至3’) |
TLR3cp-asiRNA S 25 | mUGmCAmCUmCUmGUmUUmGC*mG*A*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 25(2,4) | UCGCAAACAGAGUGmCmAU*G*G*U*U |
TLR3cp-asiRNA AS 25(4,4) | UCGCAAACAGAGUGmCmAmU*mG*G*U*U |
TLR3cp-asiRNA AS 25(7,4) | UCGCAAACAGAGUGmCmAmU*mG*mG*mU*mU |
TLR3cp-asiRNA S 28 | mACmUCmUGmUUmUGmCGmAA*mG*A*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 28(2,4) | UCUUCGCAAACAGAmGmUG*C*A*U*G |
TLR3cp-asiRNA AS 28(4,4) | UCUUCGCAAACAGAmGmUmG*mC*A*U*G |
TLR3cp-asiRNA AS 28(7,4) | UCUUCGCAAACAGAmGmUmG*mC*mA*mU*mG |
TLR3cp-asiRNA S 32 | mUGmUUmUGmCGmAAmGAmGG*mA*A*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 32(2,4) | UUCCUCUUCGCAAAmCmAG*A*G*U*G |
TLR3cp-asiRNA AS 32(4,4) | UUCCUCUUCGCAAAmCmAmG*mA*G*U*G |
TLR3cp-asiRNA AS 32(7,4) | UUCCUCUUCGCAAAmCmAmG*mA*mG*mU*mG |
TLR3cp-asiRNA S 33 | mGUmUUmGCmGAmAGmAGmGA*mA*U*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 33(2,4) | AUUCCUCUUCGCAAmAmCA*G*A*G*U |
TLR3cp-asiRNA AS 33(4,4) | AUUCCUCUUCGCAAmAmCmA*mG*A*G*U |
TLR3cp-asiRNA AS 33(7,4) | AUUCCUCUUCGCAAmAmCmA*mG*mA*mG*mU |
TLR3cp-asiRNA S 39 | mGAmAGmAGmGAmAUmGUmUU*mA*A*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 39(2,4) | UUAAACAUUCCUCUmUmCG*C*A*A*A |
TLR3cp-asiRNA AS 39(4,4) | UUAAACAUUCCUCUmUmCmG*mC*A*A*A |
TLR3cp-asiRNA AS 39(7,4) | UUAAACAUUCCUCUmUmCmG*mC*mA*mA*mA |
TLR3cp-asiRNA S 53 | mGGmCCmAGmUUmCAmGAmAA*mG*A*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 53(2,4) | UCUUUCUGAACUGGmCmCA*G*U*U*C |
TLR3cp-asiRNA AS 53(4,4) | UCUUUCUGAACUGGmCmCmA*mG*U*U*C |
TLR3cp-asiRNA AS 53(7,4) | UCUUUCUGAACUGGmCmCmA*mG*mU*mU*mC |
TLR3cp-asiRNA S 58 | mGUmUCmAGmAAmAGmAAmCG*mG*A*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 58(2,4) | UCCGUUCUUUCUGAmAmCU*G*G*C*C |
TLR3cp-asiRNA AS 58(4,4) | UCCGUUCUUUCUGAmAmCmU*mG*G*C*C |
TLR3cp-asiRNA AS 58(7,4) | UCCGUUCUUUCUGAmAmCmU*mG*mG*mC*mC |
TLR3cp-asiRNA S 60 | mUCmAGmAAmAGmAAmCGmGA*mU*A*胆甾醇 |
TLR3cp-asiRNA AS 60(2,4) | UAUCCGUUCUUUCUmGmAA*C*U*G*G |
TLR3cp-asiRNA AS 60(4,4) | UAUCCGUUCUUUCUmGmAmA*mC*U*G*G |
TLR3cp-asiRNA AS 60(7,4) | UAUCCGUUCUUUCUmGmAmA*mC*mU*mG*mG |
将HaCaT细胞(ATCC)在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)中培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)含有10%胎牛血清(FBS,Gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素。将表8中列出的潜在的cp-asiRNA在Opti-MEM(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。通过凝胶电泳确认潜在的cp-asiRNA的适当的链退火。
在cp-asiRNA处理当天,将5×104个细胞接种在24孔板中,并且然后在Opti-MEM中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有cp-asiRNA的Opti-MEM培养基。24小时之后,使用qRT-PCR测定HaCaT细胞中的TLR3mRNA水平。具体地,使用(TaKaRa)提取全部RNA,并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems),将500ng的反应混合物用于cDNA合成。稀释合成的cDNA,并且然后使用power SYBR green PCR master Mix(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。使用以下引物序列:
表9:引物序列。
在48小时的cp-asiRNA孵育之后,经由免疫印迹测定TLR3蛋白质表达的水平。简单地说,用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(GE Healthcare)裂解经处理的HaCaT细胞。10μg的总蛋白质提取物被装载到8%的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后,将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-rad),所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。膜在室温用5%脱脂乳(Seoul Milk)封闭1小时,并且然后在4℃在含有抗TLR3抗体(Abcam)和抗γ-微管蛋白抗体(Bethyl)的5%脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用TBST洗涤10分钟3次,并且在室温在5%脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体(Santa Cruz)孵育1小时。膜被用TBST洗涤10分钟,并且用ECL底物(Thermo scientific)处理。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对靶标蛋白质条带成像。
图17和18中提供了24种潜在的cp-asiRNA中每种的TLR3抑制的水平。从测试的潜在的cp-asiRNA中,选择cp-asiTLR339(2,4)用于进一步研究。
实施例14:附加的TLR3 cp-asiRNA结构
合成具有不同链长度的其他潜在的cp-asiTLR3结构,并且测试其抑制TLR3表达的能力(表10)。
表10.附加的cp-asiRNA序列(m=2’-O-甲基RNA。*=硫代磷酸酯键)。
测试表10中列出的潜在的cp-asiRNA中的每种剂量依赖性地抑制HaCaT细胞中TLR3表达的能力。将HaCaT细胞在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)中培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)含有10%胎牛血清(FBS,Gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素。将表10中列出的潜在的cp-asiRNA在Opti-MEM(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。通过凝胶电泳确认潜在的cp-asiRNA的适当的链退火。在cp-asiRNA处理当天,将5×104个细胞接种在24孔板中,然后在Opti-MEM中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时,此时,用含有血清的培养基代替含有cp-asiRNA的Opti-MEM培养基。24小时之后,测定HaCaT细胞中的TLR3表达水平。
如图19中所示,由21个核苷酸反义链组成的TLR3表达潜在的cp-asiRNA和由19个核苷酸反义链组成的TLR3表达潜在的cp-asiRNA表现出相似水平的TLR3抑制。cp-asiTLR3(39)21和cp-asiTLR3(39)19被选择用于进一步实验。
测试低浓度的cp-asiTLR3(39)21和cp-asiTLR3(39)19对TLR3蛋白质的生成的效力。将cp-asiRNA在Opti-MEM(Gibco)中在95℃孵育2分钟,并且在37℃孵育1小时。通过凝胶电泳确认潜在的cp-asiRNA的适当的链退火。将HaCaT细胞在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)中培养,所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)含有10%胎牛血清(FBS,Gibco)以及100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。在处理当天,将5×104个HaCaT细胞接种在12孔板中,然后在Opti-MEM中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养。
24小时之后,经由免疫印迹测定HaCaT中的TLR3蛋白质水平。简单地说,用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(GE Healthcare)裂解经处理的HaCaT细胞。10μg的总蛋白质提取物被装载到8%的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后,将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-rad),所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。膜在室温用5%脱脂乳(Seoul Milk)被封闭1小时,并且然后在4℃在含有抗TLR3抗体(Abcam)和抗γ-微管蛋白抗体(Bethyl)的5%脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用TBST洗涤10分钟3次,并且在室温在5%脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体(Santa Cruz)孵育1小时。膜被用TBST洗涤10分钟,并且用ECL底物(Thermo scientific)处理。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对靶标蛋白质条带成像。
如图20中所示,具有21个核苷酸反义链的TLR3表达的潜在的cp-asiRNA和具有19个核苷酸反义链的TLR3表达的潜在的cp-asiRNA在低浓度下表现出相似水平的TLR3抑制。
通过引用并入
本文提到的所有出版物、专利和专利申请全部以引用方式被整体并入本文,犹如每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地表明通过引用被并入。在冲突的情况下,本申请(包含本文中的任何定义)将受约束。
等同物
本领域技术人员将认识到或能够使用仅仅常规实验来确定本文中描述的本发明的具体的实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求涵盖。
Claims (58)
1.一种RNA复合物,所述RNA复合物包括具有与MyD88mRNA序列的序列互补性的长度为至少19个核苷酸(nt)的反义链和具有与所述反义链的序列互补性的长度为15至17nt的有义链,其中所述反义链和所述有义链形成复合物,其中所述反义链的5’端和所述有义链的3’端形成平端。
2.一种RNA复合物,所述RNA复合物包括具有与TLR3mRNA序列的序列互补性的长度为至少19个核苷酸(nt)的反义链和具有与所述反义链的序列互补性的长度为15至17nt的有义链,其中所述反义链和所述有义链形成复合物,其中所述反义链的5’端和所述有义链的3’端形成平端。
3.如权利要求1或2所述的RNA复合物,其中所述反义链的长度为19至21nt。
4.如权利要求1或2所述的RNA复合物,其中所述反义链的长度为19nt。
5.如权利要求1或2所述的RNA复合物,其中所述反义链的长度为20nt。
6.如权利要求1或2所述的RNA复合物,其中所述反义链的长度为21nt。
7.如权利要求1或2所述的RNA复合物,其中所述反义链的长度为至少24nt。
8.如权利要求6所述的RNA复合物,其中所述反义链的长度为24至121nt。
9.如权利要求1或2所述的RNA复合物,其中所述反义链的长度为31nt。
10.如权利要求1至9中任一项所述的RNA复合物,其中所述有义链的长度为15nt。
11.如权利要求1至9中任一项所述的RNA复合物,其中所述有义链的长度为16nt。
12.如权利要求1至9中任一项所述的RNA复合物,其中所述有义链的长度为17nt。
13.如权利要求1至12中任一项所述的RNA复合物,其中所述反义链具有选自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8和表10中列出的反义链序列的序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的RNA复合物,其中所述有义链具有选自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8和表10中列出的有义链序列的序列。
15.如权利要求1和3至14中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物能够抑制细胞MyD88表达。
16.如权利要求2至14中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物能够抑制细胞TLR3表达。
17.如权利要求1至16中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物包括化学修饰。
18.如权利要求17所述的RNA复合物,其中所述RNA修饰为2’-O-甲基化核苷、硫代磷酸酯键或胆甾醇部分。
19.如权利要求18所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物包括胆甾醇部分。
20.如权利要求19所述的RNA复合物,其中所述胆甾醇部分被附连至所述有义链的3’末端。
21.如权利要求17至20中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物包括2’-O-甲基化核苷。
22.如权利要求21所述的RNA复合物,其中所述2’-O-甲基化核苷被定位于所述有义链的所述3’末端。
23.如权利要求21所述的RNA复合物,其中所述有义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷。
24.如权利要求21所述的RNA复合物,其中所述2’-O-甲基化核苷被定位于所述反义链的3’末端。
25.如权利要求21所述的RNA复合物,其中所述反义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷。
26.如权利要求21的RNA复合物,其中所述2’-O-甲基化核苷被定位于所述有义链的所述3’末端和所述反义链的3’末端。
27.如权利要求21所述的RNA复合物,其中所述有义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷,并且所述反义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷。
28.如权利要求17至27中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物包括硫代磷酸酯键。
29.如权利要求28所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25%为硫代磷酸酯键。
30.如权利要求28所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少50%为硫代磷酸酯键。
31.如权利要求28所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少75%为硫代磷酸酯键。
32.如权利要求28所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键全部都为硫代磷酸酯键。
33.如权利要求28至32中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述反义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25%为硫代磷酸酯键。
34.如权利要求38至32中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少50%为硫代磷酸酯键。
35.如权利要求28至32中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少75%为硫代磷酸酯键。
36.如权利要求28至32中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键全部都为硫代磷酸酯键。
37.如权利要求28至36中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物能够在不存在递送运载体的情况下穿透细胞的细胞膜。
38.如权利要求1至37中任一项所述的RNA复合物,其中所述RNA复合物不是细胞毒的。
39.一种抑制细胞MyD88或TLR3表达的方法,所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至38中任一项所述的RNA复合物接触。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述细胞存在于人受试者的眼中。
41.如权利要求39所述的方法,其中所述受试者患有AMD。
42.如权利要求41所述的方法,其中所述AMD是湿性AMD。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述AMD是干性AMD。
44.如权利要求40至43中任一项所述的方法,所述方法包括向所述受试者的所述眼施用所述RNA复合物。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述RNA复合物通过玻璃体内注射被施用。
46.一种在受试者中治疗AMD的方法,所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至38中任一项所述的RNA复合物。
47.如权利要求46所述的方法,其中所述AMD是湿性AMD。
48.如权利要求46所述的方法,其中所述AMD是干性AMD。
49.如权利要求46至48中任一项所述的方法,所述方法包括向所述受试者的眼施用所述RNA复合物。
50.如权利要求49所述的方法,其中所述RNA复合物通过玻璃体内注射被施用。
51.一种药物组合物,所述药物组合物包括如权利要求1至38中任一项所述的RNA复合物和药学上可接受的载体。
52.如权利要求51所述的药物组合物,其中所述组合物是玻璃体内递送。
53.如权利要求51所述的药物组合物,其中所述药物组合物是滴眼剂。
54.一种在受试者中治疗AMD的方法,所述方法包括向所述受试者施用如权利要求51至53中任一项所述的药物组合物。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述AMD是湿性AMD。
56.如权利要求54所述的方法,其中所述AMD是干性AMD。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法,所述方法包括向所述受试者的眼施用所述药物组合物。
58.如权利要求57所述的方法,其中所述药物组合物通过玻璃体内注射被施用。
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ES2716818T3 (es) | 2012-05-22 | 2019-06-17 | Olix Pharmaceuticals Inc | Molécula de ácido nucleico inductora de interferencias de arn capaz de penetrar en las células y uso de la misma |
KR20180071362A (ko) | 2015-11-16 | 2018-06-27 | 올릭스 주식회사 | MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료 |
KR20180104692A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-21 | 올릭스 주식회사 | Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 |
KR20180104075A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-19 | 올릭스 주식회사 | IL4Rα, TRPA1, 또는 F2RL1을 표적화하는 RNA 복합체를 사용한 아토피 피부염 및 천식의 치료 |
US10301628B2 (en) | 2016-04-11 | 2019-05-28 | Olix Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor |
KR101916652B1 (ko) | 2016-06-29 | 2018-11-08 | 올릭스 주식회사 | 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도 |
CN110770343A (zh) | 2017-02-10 | 2020-02-07 | 成均馆大学校产学协力团 | 用于rna干扰的长双链rna |
EP4159858A1 (en) * | 2020-05-26 | 2023-04-05 | Olix Pharmaceuticals, Inc. | Rnai agent targeting myd88 and use thereof |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1852979A (zh) * | 2003-09-18 | 2006-10-25 | Isis药物公司 | eIF4E表达的调节 |
WO2009105260A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | University Of Kentucky | Ultra-small rnas as toll-like receptor-3 antagonists |
CN101688206A (zh) * | 2007-07-05 | 2010-03-31 | 诺瓦提斯公司 | 用于靶向病毒感染的dsRNA |
CN102245187A (zh) * | 2008-08-04 | 2011-11-16 | 艾德拉药物股份有限公司 | 通过反义寡核苷酸来调制toll样受体3表达 |
CN103562387A (zh) * | 2011-03-03 | 2014-02-05 | 夸克医药公司 | Toll样受体途径的寡核苷酸调剂 |
WO2014043291A1 (en) * | 2012-09-12 | 2014-03-20 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double-stranded nucleic acid compounds |
CN103889461A (zh) * | 2011-07-18 | 2014-06-25 | 肯塔基大学研究基金会 | 保护细胞免于alu-rna诱导的变性和用于保护细胞的抑制剂 |
CN104755620A (zh) * | 2012-05-22 | 2015-07-01 | 奥利克斯医药有限公司 | 具有细胞内穿透能力的诱导rna干扰的核酸分子及其用途 |
CN105748782A (zh) * | 2016-02-25 | 2016-07-13 | 太和县中医院 | 一种用于治疗颈椎病的中药口服液 |
Family Cites Families (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5837258A (en) | 1991-08-30 | 1998-11-17 | University Of South Florida | Induction of tissue, bone or cartilage formation using connective tissue growth factor |
DE10160151A1 (de) | 2001-01-09 | 2003-06-26 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens |
EP1873259B1 (en) | 2000-12-01 | 2012-01-25 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | RNA interference mediated by 21 and 22nt RNAs |
US20080188430A1 (en) | 2001-05-18 | 2008-08-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20050282188A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-12-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20050119202A1 (en) | 2001-10-26 | 2005-06-02 | Roland Kreutzer | Medicament to treat a fibrotic disease |
US20040138163A1 (en) | 2002-05-29 | 2004-07-15 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of vascular edothelial growth factor and vascular edothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
EP1527176B2 (en) | 2002-08-05 | 2017-03-22 | Silence Therapeutics GmbH | Further novel forms of interfering rna molecules |
WO2006006948A2 (en) | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
PT2284266E (pt) | 2002-11-14 | 2013-12-17 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | Siarn contra tp53 |
EP3450559A1 (en) | 2003-03-07 | 2019-03-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic compositions |
US20040198640A1 (en) | 2003-04-02 | 2004-10-07 | Dharmacon, Inc. | Stabilized polynucleotides for use in RNA interference |
US20050136437A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-06-23 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Nanoparticles for delivery of nucleic acids and stable double-stranded RNA |
US20060134787A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-22 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA |
WO2005062937A2 (en) | 2003-12-22 | 2005-07-14 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna |
US20060069050A1 (en) | 2004-02-17 | 2006-03-30 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for mediating gene silencing |
AU2005222902B2 (en) | 2004-03-12 | 2010-06-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | iRNA agents targeting VEGF |
KR101147147B1 (ko) | 2004-04-01 | 2012-05-25 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | Rna 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드 |
JP2008512500A (ja) | 2004-09-10 | 2008-04-24 | ソマジェニックス インコーポレーティッド | ウィルス遺伝子発現を効率的に阻害する低分子干渉rnaおよびその使用方法 |
EP2982754A1 (en) | 2004-09-24 | 2016-02-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Rnai modulation of apob and uses thereof |
US20060142228A1 (en) | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Ambion, Inc. | Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference |
TWI386225B (zh) | 2004-12-23 | 2013-02-21 | Alcon Inc | 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子(CTGF)RNA干擾(RNAi)抑制技術 |
US20100254945A1 (en) | 2005-04-08 | 2010-10-07 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Rnai Therapeutic for Respiratory Virus Infection |
US8067572B2 (en) | 2005-05-25 | 2011-11-29 | The University Of York | Hybrid interfering RNA |
AU2006261943B2 (en) | 2005-06-24 | 2010-12-02 | Intervet International B.V. | Inactivated chimeric vaccines and related methods of use |
FR2890859B1 (fr) | 2005-09-21 | 2012-12-21 | Oreal | Oligonucleotide d'arn double brin inhibant l'expression de la tyrosinase |
US7825099B2 (en) * | 2006-01-20 | 2010-11-02 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes |
US7951784B2 (en) | 2006-01-26 | 2011-05-31 | University Of Massachusetts | RNA interference agents for therapeutic use |
ES2550099T3 (es) | 2006-01-27 | 2015-11-04 | Biogen Ma Inc. | Antagonistas del receptor Nogo |
US20070218495A1 (en) | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Dharmacon, Inc. | Methods, libraries and computer program products for gene silencing with reduced off-target effects |
US7700541B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-04-20 | Nitto Denko Corporation | Biodegradable cationic polymers |
GB0608838D0 (en) | 2006-05-04 | 2006-06-14 | Novartis Ag | Organic compounds |
JP2010519907A (ja) | 2007-03-02 | 2010-06-10 | エムディーアールエヌエー,インコーポレイテッド | Vegfファミリー遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用 |
US20100105134A1 (en) | 2007-03-02 | 2010-04-29 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof |
PT2164967E (pt) | 2007-05-31 | 2015-10-27 | Univ Iowa Res Found | Redução da toxicidade não dirigida do arn de interferência |
WO2009002462A1 (en) | 2007-06-22 | 2008-12-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Pre-mirna loop-modulated target regulation |
WO2009020344A2 (en) | 2007-08-06 | 2009-02-12 | Postech Acad Ind Found | Small interfering rnas (sirnas) controlling multiple target genes and method for preparing the same |
US20100286378A1 (en) | 2007-08-27 | 2010-11-11 | Boston Biomedical, Inc. | Composition of Asymmetric RNA Duplex As MicroRNA Mimetic or Inhibitor |
DK2548962T3 (en) | 2007-09-19 | 2016-04-11 | Applied Biosystems Llc | Sirna sequence-independent modification formats to reduce off-target phenotype effects in RNAI and stabilized forms thereof |
BRPI0817605A2 (pt) | 2007-10-03 | 2017-05-09 | Quark Pharmaceuticals Inc | novas estruturas de sirna |
US8614311B2 (en) | 2007-12-12 | 2013-12-24 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | RTP801L siRNA compounds and methods of use thereof |
KR100949791B1 (ko) | 2007-12-18 | 2010-03-30 | 이동기 | 오프-타겟 효과를 최소화하고 RNAi 기구를 포화시키지않는 신규한 siRNA 구조 및 그 용도 |
CA2731779A1 (en) | 2008-07-24 | 2010-01-28 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rnai constructs and uses therof |
MX2011001422A (es) * | 2008-08-08 | 2011-03-15 | Idera Pharmaceuticals Inc | Modulacion de expresion de gen de respuesta primaria de diferenciacion mieloide 88 por oligonucleotidos antisentido. |
WO2010026660A1 (ja) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 学校法人福岡大学 | Zfat遺伝子発現抑制rna |
EP3336188B1 (en) | 2008-09-22 | 2020-05-06 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Reduced size self-delivering rnai compounds |
US20100227920A1 (en) | 2008-09-29 | 2010-09-09 | The Regents Of The University Of California | Aldehyde dehydrogenase inhibitors as novel depigmenting agents |
US9745574B2 (en) | 2009-02-04 | 2017-08-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality |
US8829179B2 (en) | 2009-02-18 | 2014-09-09 | Silence Therapeutics Gmbh | Means for inhibiting the expression of ANG2 |
US20120016011A1 (en) | 2009-03-19 | 2012-01-19 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA Interference Mediated Inhibition of Connective Tissue Growth Factor (CTGF) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) |
EP2414374A4 (en) | 2009-04-03 | 2013-09-25 | Dicerna Pharmaceuticals Inc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR SPECIFIC KRAS INHIBITION WITH ASYMMETRIC DOUBLE STRAND RNA |
US8472766B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Waveguide coupler having continuous three-dimensional tapering |
KR101207561B1 (ko) | 2009-12-15 | 2012-12-04 | 주식회사 코리아나화장품 | 티로시나제의 발현을 저해하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물 |
WO2011084193A1 (en) | 2010-01-07 | 2011-07-14 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs |
EP2550001B1 (en) | 2010-03-24 | 2019-05-22 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Rna interference in ocular indications |
EP2569445B1 (en) | 2010-05-12 | 2017-01-04 | Val-Chum, Limited Partnership | Screening assays based on abhd6 for selecting insulin secretion promoting agents |
AU2011302152B2 (en) | 2010-09-15 | 2015-06-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Modified iRNA agents |
ES2732929T3 (es) | 2010-10-22 | 2019-11-26 | Olix Pharmaceuticals Inc | Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas |
AU2011338682B2 (en) | 2010-12-06 | 2017-04-27 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications |
CN102719432B (zh) | 2011-03-29 | 2013-10-23 | 南京大学 | 特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用 |
KR101590586B1 (ko) | 2011-05-30 | 2016-02-01 | 성균관대학교산학협력단 | 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 rna |
US9707235B1 (en) | 2012-01-13 | 2017-07-18 | University Of Kentucky Research Foundation | Protection of cells from degeneration and treatment of geographic atrophy |
RU2656154C2 (ru) | 2013-07-05 | 2018-05-31 | Байонир Корпорейшн | СВЯЗАННАЯ С РЕСПИРАТОРНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЕМ ГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ миРНК, ДВУСПИРАЛЬНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ОЛИГО-РНК, СОДЕРЖАЩАЯ миРНК, И СОДЕРЖАЩАЯ ЕЕ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ |
EP3027223A1 (en) * | 2013-07-31 | 2016-06-08 | QBI Enterprises Ltd. | Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds |
US9790506B2 (en) | 2013-10-02 | 2017-10-17 | The Regents Of The University Of California | Diagnostic and screening methods for atopic dermatitis |
US8980273B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-03-17 | Kymab Limited | Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA |
US20170226507A1 (en) | 2014-05-05 | 2017-08-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Coordinate control of pathogenic signaling by the mir-130/301 family in pulmonary hypertension and fibroproliferative diseases |
US9139648B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-09-22 | Kymab Limited | Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain |
EP3277811B1 (en) | 2015-04-03 | 2020-12-23 | University of Massachusetts | Fully stabilized asymmetric sirna |
CN108138181B (zh) | 2015-07-27 | 2022-05-24 | 奥利克斯医药有限公司 | 抑制黑色素生成的rna复合物 |
KR20180071362A (ko) | 2015-11-16 | 2018-06-27 | 올릭스 주식회사 | MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료 |
KR20180104075A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-19 | 올릭스 주식회사 | IL4Rα, TRPA1, 또는 F2RL1을 표적화하는 RNA 복합체를 사용한 아토피 피부염 및 천식의 치료 |
KR20180104692A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-21 | 올릭스 주식회사 | Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 |
US10301628B2 (en) | 2016-04-11 | 2019-05-28 | Olix Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor |
KR101916652B1 (ko) | 2016-06-29 | 2018-11-08 | 올릭스 주식회사 | 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도 |
CN110770343A (zh) | 2017-02-10 | 2020-02-07 | 成均馆大学校产学协力团 | 用于rna干扰的长双链rna |
-
2016
- 2016-11-15 KR KR1020187015145A patent/KR20180071362A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-11-15 US US15/352,322 patent/US10059949B2/en active Active
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- 2016-11-15 JP JP2018524721A patent/JP7027311B2/ja active Active
- 2016-11-15 CN CN201680078793.6A patent/CN108699556B/zh active Active
- 2016-11-15 CA CA3005411A patent/CA3005411C/en active Active
-
2018
- 2018-07-23 US US16/042,833 patent/US10590423B2/en active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1852979A (zh) * | 2003-09-18 | 2006-10-25 | Isis药物公司 | eIF4E表达的调节 |
CN101688206A (zh) * | 2007-07-05 | 2010-03-31 | 诺瓦提斯公司 | 用于靶向病毒感染的dsRNA |
WO2009105260A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | University Of Kentucky | Ultra-small rnas as toll-like receptor-3 antagonists |
CN102245187A (zh) * | 2008-08-04 | 2011-11-16 | 艾德拉药物股份有限公司 | 通过反义寡核苷酸来调制toll样受体3表达 |
CN103562387A (zh) * | 2011-03-03 | 2014-02-05 | 夸克医药公司 | Toll样受体途径的寡核苷酸调剂 |
CN103889461A (zh) * | 2011-07-18 | 2014-06-25 | 肯塔基大学研究基金会 | 保护细胞免于alu-rna诱导的变性和用于保护细胞的抑制剂 |
CN104755620A (zh) * | 2012-05-22 | 2015-07-01 | 奥利克斯医药有限公司 | 具有细胞内穿透能力的诱导rna干扰的核酸分子及其用途 |
WO2014043291A1 (en) * | 2012-09-12 | 2014-03-20 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double-stranded nucleic acid compounds |
CN105748782A (zh) * | 2016-02-25 | 2016-07-13 | 太和县中医院 | 一种用于治疗颈椎病的中药口服液 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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