CN103889461A - 保护细胞免于alu-rna诱导的变性和用于保护细胞的抑制剂 - Google Patents

保护细胞免于alu-rna诱导的变性和用于保护细胞的抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种保护细胞的方法，包括抑制细胞的炎性体、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、胱天蛋白酶-8和/或NFκB。施用MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、胱天蛋白酶-8和/或NFκB的抑制剂可以使细胞免受Alu-RNA诱导的变性。保护细胞，例如视网膜色素上皮细胞(RPE)，在治疗方面对年龄相关性黄斑变性和地图样萎缩的背景下是有用的。

Description

保护细胞免于ALU-RNA诱导的变性和用于保护细胞的抑制剂
Jayakrishna Ambati,列克星敦(Lexington,KY)，美国公民；Valeria Tarallo, 
列克星敦(Lexington,KY)，意大利公民 
受让人：肯塔基大学研究基金会 
代理机构卷号：13177N/1790WO 
相关申请 
本申请要求于2011年7月18日提交的美国临时申请No.61/508,867和2011年10月4日提交的美国临时申请No.61/543,038的优先权,其全部内容通过引用的方式并入本文。 
政府利益 
本发明是在美国国立卫生研究院的国家眼科研究所授予的R01EY018350、R01EY018836、R01EY020672、R01EY022238、R21EY019778、RC1EY020442的政府支持下进行的。政府享有本发明中的某些权利。 
技术领域
本发明的主题涉及炎性体、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、胱天蛋白酶-8和NFκB的抑制；炎性体MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、胱天蛋白酶-8和NFκB的抑制剂、保护细胞的方法和用于鉴定抑制剂的筛选方法。 
引言 
像癌症一样在工业化国家广泛流行的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degenearation,AMD),是在世界各地引起失明的主要原因。新生血管性AMD存在许多被认可的疗法，与之相反，对于更常见的萎缩性AMD知之甚少，且没有有效的临床干预。视网膜色素上皮细胞 (retinal pigment epithelium,RPE)的大幅萎缩导致严重的视力丧失，并称为地图样萎缩(geographic atrophy)，其发病机理尚未可知。地图样萎缩导致全世界数百万人失明，并且目前还没有被认可的疗法。 
本发明者已证明，患有地图样萎缩的人眼视网膜色素上皮细胞(RPE)中的RNase DICER1会大幅降低(Kaneko et al.Nature2011，其通过引用的方式并入本文)。本发明者还证实，DICER1缺乏会导致Alu RNA转录物的累积，这在患有地图样萎缩的人眼中也观察到。这些Alu RNA转录物会诱导人RPE细胞的细胞死亡和小鼠RPE变性。尚不知Alu转录物的细胞毒性的详细机理。 
如本文所述，本发明者已发现，DICER1缺乏或Alu RNA暴露会激活NLRP3炎性体，并在小鼠和人的RPE以及小鼠RPE细胞中通过IL-18触发Toll样受体非依赖性MyD88信号传导。 
发明概述 
本发明的主题满足了上述的一些或全部需求，在对本文件中提供的信息进行研究后，这对本领域技术人员来说会是显而易见的。 
本概述描述了本发明主题的几个实施方案，并在许多情况下列出了这些实施方案的变型和变换。本概述仅仅用于许多和各种实施方案的示范的目的。给定实施方案的一个或多个代表性特征的提及同样也为了示范的目的。这种实施方案通常在具有或不具有提到的特征的情况下存在，同样，这些特征可应用于本发明主题的其他实施方案，无论其是否列举在本概述中。为避免过多重复，本概述并未列出或提供这些特征的所有可能的组合。 
本发明的主题包括用于鉴定MyD88抑制剂的方法、用于抑制MyD88的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定炎性体抑制剂的方法、用于抑制炎性体的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定炎性体组分抑制剂的方法、用于抑制炎性体组分的方法和组合物及其用途。炎性体组分包括：例如NLRP3、PYCARD和胱天蛋白酶-1。 本发明的主题包括用于鉴定IL-18抑制剂的方法、用于抑制IL-18的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定VDAC1和VDAC2抑制剂的方法、用于抑制VDAC1和VDAC2的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定胱天蛋白酶-8抑制剂的方法、用于抑制胱天蛋白酶-8的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定NFkB抑制剂的方法、用于抑制NFkB的方法和组合物及其用途。还提供了用于在个体的眼中对活化的胱天蛋白酶-1进行成像的方法和组合物。 
本发明的主题所包括的方法包括抑制细胞的炎性体、MyD88和IL-18中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的主题所包括的方法包括抑制细胞的MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-1、NLRP-3、PYCARD和炎性体中的一种或多种，所述炎性体包括炎性体组分(例如胱天蛋白酶1、NLRP-3、PYCARD)。在一些实施方案中，本发明的主题所包括的方法包括施用选自MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-1、NLRP-3、PYCARD和炎性体的抑制剂中的一种或多种抑制剂，所述炎性体包括炎性体组分(例如胱天蛋白酶1、NLRP-3、PYCARD)。 
在所述方法的一些实施方案中，所述细胞选自RPE细胞、视网膜光感受器细胞或脉络膜细胞。在一些实施方案中，所述细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，所述细胞是个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有目标病症的个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有年龄相关性黄斑变性的个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有地图样萎缩的个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有地图样萎缩的个体的细胞，且所述细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法和组合物来治疗患有年龄相关性黄斑变性的个体。在所述方法的一些实施方案中，防止细胞发生Alu-RNA诱导的变性。 
附图说明
图1：Alu RNA不通过toll样受体(TLRs)激活或起作用，(A–E)pAlu而不是pNull诱导WT(A)小鼠、Tlr3–/–(B)小鼠、Tlr7–/–(C)小鼠、Unc93b1mt小鼠的RPE变性，其在TLRs-3,7,9(D)小鼠和Tlr4–/–小鼠(E)中功能缺失。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；闭锁小带-1(ZO-1；红色)染色的扁平封片(flat mount)，下行。蓝色箭头概述了变性。比例尺：20μm。(F)用两个不同Alu RNA序列之一刺激表达各种TLR的HEK293细胞系，不引起NF-κB激活。使用TLR特异性配体的阳性(+)对照激活NF-κB。n=3。数据表示为平均值+/-SEM。也参见图8。 
图2：Alu RNA通过MyD88诱导RPE变性。(A)pAlu不诱导Myd88–/–小鼠的RPE变性。(B)pAlu诱导的WT小鼠的RPE变性被MyD88同源二聚化肽抑制剂(MyD88i)抑制，但不被对照肽抑制。(C)pAlu诱导的WT小鼠的RPE变性被胆固醇缀合的Myd88siRNA抑制，但不被对照siRNA抑制。(D和E)相比对照siRNA，靶向MyD88的siRNA(siMyD88)降低小鼠RPE细胞的靶基因(D)和蛋白(E)的丰度。通过斯氏t检验（Student t-test），n=3,*p<0.05。(F)pAlu不诱导Myd88杂合(het)小鼠的RPE变性。(G)人的RPE细胞中Alu RNA诱导的IRAK1和IRAK4磷酸化作用的蛋白质印迹。3个实验的代表性图像。(H)pAlu降低WT小鼠RPE细胞活力，而没有降低Myd88–/–小鼠RPE细胞活力。(I)pAlu诱导的人RPE细胞活力的丧失被MyD88i营救。(J)AAV1-BEST1-Cre而不是AAV1-BEST1-GFP使Myd88f/f小鼠免受pAlu诱导的RPE变性。(K)pAlu诱导IL-18从人RPE细胞分泌，其通过ELISA测量。IL-1β的分泌几乎未检出。通过斯氏t检验，n=3,*p<0.05。(L)重组IL-18诱导WT小鼠的RPE变性，而在Myd88–/–小鼠中却没有。(M和N)pAlu-诱导的WT小鼠的RPE变性被IL-18中和抗体(N)营救，而不是被IL-1β中和抗体(M)营救。示出了代表性的图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1(红色)染色的扁平封片，下行。蓝色箭头概述了变性。比例尺：20μm(A–C,F,J,L–N)。n=3。通过斯氏t检验，*p<0.05。数据表示为平均值+/-SEM(D,E,H,I,K)。 也参见图9。 
图3Alu RNA通过NLRP3炎性体诱导RPE变性。(A)人RPE细胞中Alu RNA引起的胱天蛋白酶-1激活(p20亚基)的蛋白印迹。(B)被胱天蛋白酶-1肽抑制剂损伤的野生型小鼠中的RPE细胞溶解产物的pAlu诱导的IL-18成熟的蛋白印迹。(C)胱天蛋白酶-1肽抑制剂使WT小鼠免受pAlu诱导的RPE变性。(D和E)pAlu没有诱导Casp1–/–小鼠的RPE变性和Casp1–/–小鼠RPE细胞的细胞毒性。(F)Alu RNA和LPS+ATP诱导转染GFP-PYCARD的人RPE细胞中PYCARD聚簇的形成。(G和H)pAlu没有诱导Nlrp3–/–(G)或Pycard–/–(H)小鼠中RPE变性。(I)Nlrp3–/-和Pycard–/–小鼠RPE细胞受到保护而免受pAlu诱导的细胞活力丧失。(J)相比siRNA，靶向NLRP3或PYCARD的siRNA营救RPE细胞使其免受pAlu诱导的细胞毒性。通过斯氏t检验(A,B,E,F,I,J)，n=3–4,*p<0.05。三个实验的代表性图像。归一化为粘着斑蛋白(Vinculin)的微密度值显示于括号中(A,B)。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。蓝色箭头概述变性。比例尺：20μm(C,D,G,H)。示出了代表性图像。也参见图11。 
图4：Alu RNA诱导线粒体ROS产生和NLRP3引发。(A)pAlu诱导WT和Myd88–/–小鼠RPE细胞中的NLRP3和IL18mRNA。(B)pAlu诱导人RPE细胞中活性氧类别(ROS)的产生，如用荧光探针H2DCFDA(A.U,任意单位)所监测的。(C)DPI阻断人RPE细胞中pAlu诱导的NLRP3和IL18mRNAs。(D)DPI保护WT小鼠免受pAlu诱导的RPE变性。(E)如MitoSOX红色(绿伪色)的荧光所检测的，pAlu诱导人RPE细胞中线粒体活性氧类别的产生，其与标记MitoTracker深红(红色)的呼吸线粒体共存。(F)PMA诱导吞噬体ROS的产生，而pAlu则不然，如通过人RPE细胞的荧光Fc OXYBURST绿色试验所评价的(A.U,任意单位)。(G)MitoTempo和MitoQ阻止WT小鼠中Alu诱导的RPE变性，而媒介物或dTPP对照则不然。(H)NADPH氧化酶抑制剂gp91ds-tat或乱序肽(scrambled peptide)并不阻止WT小鼠中Alu RNA诱导的RPE变性。(I)Alu  RNA诱导Cybb(其编码NADPH氧化酶gp91phox亚基)缺乏小鼠的RPE变性。(J和K)靶向VDAC1和VDAC2的siRNA阻止人RPE细胞中pAlu诱导的mROS(J)的产生和NLRP3和IL18mRNA(K)的上调，而VDAC3或乱序重排的对照则不然。mROS通过MitoSoxRed染料可视化，而细胞核通过赫斯特染色(Hoechst stain)可视化。通过斯氏t检验n=3–4,*p<0.05(A-C,K)，通过斯氏t检验后NS不显著(F)。示出了代表性图像。n=8–12。ZO-1染色(红色)的扁平封片。比例尺：20μm(D,E,G–I),n=3–4。比例尺：100μm(J)。也参见图11。 
图5：RPE变性并不通过细胞凋亡发生。(A和B)甘氨酸抑制由LPS+ATP(A)引起的人RPE细胞死亡，而不抑制由pAlu(B)引起的人RPE细胞死亡。(C)重组IL-18诱导Casp1–/–小鼠的RPE变性。通过斯氏t检验，n=3–4(A,B),*p<0.05。示出了代表性图像。n=8-12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。蓝色箭头概述变性。比例尺：20μm(C)。 
图6：DICER1丧失通过炎性体诱导细胞死亡。(A)被人RPE细胞中DICER1的超表达抑制的Alu RNA诱导的胱天蛋白酶-1切割(p20)的蛋白印迹。(B和C)DICER1超表达降低人RPE细胞中Alu RNA诱导的胱天蛋白酶的激活（由
Figure BDA0000478497860000061
荧光底物的切割(B左图，绿色)测得）。荧光定量示于右图。(C)BEST1-Cre的RPE细胞溶解产物中增强的胱天蛋白酶-1的激活(p20亚基)的蛋白印迹；Dicer1f/f小鼠相比BEST1-Cre或Dicer1f/f小鼠。(D)用AAV1-BEST1-Cre处理的Dicer1f/f小鼠的RPE细胞溶解产物中增强的胱天蛋白酶-1的激活(p20亚基)和IL-18成熟的蛋白印迹。(E和F)Dicer1f/f小鼠中AAV1-BEST1-Cre诱导的RPE变性被胱天蛋白酶-1(E)或MyD88(F)肽抑制剂营救。(G)MyD88抑制剂营救由DICER1反义(AS)处理诱导的人RPE细胞活性的丧失。(H)人RPE细胞的DICER1反义(AS)处理降低DICER1并提高IRAK1和IRAK4的磷酸化。(I)MyD88抑制剂营救编码Cre重组酶(Ad-Cre)的腺病毒载体处理的Dicer1f/f小鼠RPE细胞的细胞活力丧失。(J)相比Ad-Null，Dicer1f/f小鼠RPE细胞中 Ad-Cre诱导的总miRNA表达缺乏。MyD88抑制剂和对照肽处理的Dicer1净除细胞中miRNA丰度没有明显差异。n=3(A,B,F–H)。归一化为粘着斑蛋白的光密度值显示于括号(A,C)中。蓝色箭头概述了变性。n=8(E,F)。通过斯氏t检验(G,I)，*p<0.05。3个实验的代表性图像(A、B、C、D、H)。也参见图12。 
图7：人GA中NLRP3炎性体和MyD88的激活。(A)相比正常的年龄相仿的对照(n=12)，黄斑GA RPE(n=13)中NLRP3和IL18丰度显著提高。通过曼-惠特尼U检验，*p<0.05。各组之间IL1B的丰度没有明显差异(通过曼-惠特尼U检验，p=0.32)。(B–D)相比正常的年龄相仿的对照，黄斑GA RPE中NLRP3(B)、PYCARD(C)和胱天蛋白酶-1(D)的免疫定位增强。比例尺：20μm。(E)来自人个体供体的眼的黄斑RPE溶解产物的蛋白印迹表明，归一化为看家蛋白粘着斑蛋白的水平的NLRP3、PYCARD和磷酸化IRAK1/4的丰度相比年龄相仿的正常对照地图样萎缩(GA)减少。数据表示为平均值+/-SEM(A)。示出了代表性图片。n=6(B–E)。也参见图13。 
图8：Alu RNA没有激活几个RNA传感器。(A和B)p7SL(7SL表达载体)(A)和体外合成的7SL RNA(B)不诱导野生型小鼠的RPE变性。(C)野生型小鼠的通过视网膜下注射pAlu诱导的RPE变性没有被TLR4拮抗剂阻抑。(D–E)Mda5(D)或Prkr(E)缺陷小鼠容易发生pAlu诱导的RPE变性。(F)去磷酸化(Dep)Alu RNA诱导野生型小鼠的RPE变性，就如同Alu RNA一样。(G)Mavs缺陷小鼠容易发生pAlu诱导的RPE变性。pNull不诱导任何小鼠品系的RPE变性。蓝色箭头概述变性。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。n=8(A–G)。(H)没有被Alu RNA激活的先天免疫途径的图示。 
图9：Alu RNA通过MyD88而不是通过TRIF或IFNγ诱导RPE变性。(A)pAlu的视网膜下给药诱导Ticam1–/–小鼠的RPE变性。(B)Alu RNA不诱导Myd88–/–小鼠的RPE变性。(C)不同Alu表达质粒(pAlu(2))的视网膜下给药也诱导野生型小鼠的RPE变性，但不诱导Myd88–/–小鼠的RPE 变性。(D)Alu RNA不诱导Myd88+/–杂合(het)小鼠的RPE变性。(E)MyD88抑制肽降低Alu RNA诱导的IRAK1/4磷酸化，其归一化为粘着斑蛋白表达。(F)视网膜下注射AAV1-BEST1-Cre而不是AAV1-BEST1-GFP保护Myd88f/f小鼠免受Alu RNA诱导的RPE变性。(G)pAlu和Alu RNA诱导接受Myd88–/–骨髓的野生型小鼠(Myd88–/–→野生型)的RPE变性，而接受野生型骨髓的Myd88–/–小鼠(野生型→Myd88–/–)中没有发生RPE变性。(H–K)视网膜下施用pAlu诱导Ifng–/–(H)、Ifngr1–/–(I)和Il1r1–/–小鼠(J)的RPE变性，而不诱导Il18r1–/–小鼠的RPE变性。(K)pNull给药不诱导任何小鼠品系的RPE变性。蓝色箭头概述变性。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。n=8(A–D,F–K)。 
图10：Alu RNA通过NLRP3激活诱导RPE变性。(A)Alu RNA或LPS+ATP诱导人RPE细胞中胱天蛋白酶-1的激活，如相比模拟处理， 
Figure BDA0000478497860000081
的切割增加(绿色，左图)所评价的，
Figure BDA0000478497860000082
为荧光连接的肽底物。荧光定量显示于右图。(B)归一化为粘着斑蛋白表达的THP-1和HeLa细胞中Alu RNA诱导的胱天蛋白酶-1的激活(p20亚基)的蛋白印迹。(C)胱天蛋白酶-1抑制肽阻断人RPE细胞中Alu RNA诱导的底物切割。n=3。(D)视网膜下注射Alu RNA不诱导Casp1–/–小鼠的RPE变性。(E)Alu RNA或LPS+ATP诱导人RPE细胞的细胞质中可见的GFP-PYCARD明亮荧光聚簇的出现。较高放大率示出插图中的区域。3个实验的代表性图像。(F和G)视网膜下注射Alu RNA不诱导Nlrp3–/–(F)或Pycard–/–(G)小鼠的RPE变性。(H)相比对照(Ctrl)siRNA，转染NLRP3表达载体的HEK293细胞的NLRP3丰度和人RPE细胞中PYCARD的丰度由于靶向这些基因的siRNA的转染而降低。通过斯氏t检验，相比Ctrl siRNA，n=3,*p<0.05。(I)人RPE细胞中Alu RNA诱导的胱天蛋白酶-1的激活(p20亚基)不受MyD88抑制肽的影响，归一化为粘着斑蛋白表达。(J)MyD88抑制肽不降低人RPE细胞中Alu RNA-诱导的胱天蛋白酶-1的切割活性(上图)。荧光定量(下图)。(K)经视网膜下pAlu给药处理的野生型小鼠的RPE细胞溶解产物中胱天蛋白酶-1的激活(p20亚基)未受到 抗-IL-18中性抗体的玻璃体内给药的削弱。(L)Alu RNA-诱导的IRAK1/4的磷酸化作用由于人RPE细胞中的胱天蛋白酶-1抑制肽而降低，其归一化为粘着斑蛋白表达。媒介对照注射也不损伤RPE。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。n=8(D,F,G)。3个实验的代表性图像(A、B、I、J–L)。 
图11：NLRP3不与Alu RNA发生物理相互作用，且siRNA抑制VDAC。用pAlu和pNLRP3-FLAG RNA转染的人RPE细胞中的RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)试验。具有蛋白-RNA复合物与抗NLRP3或FLAG抗体的免疫沉淀未揭示NLRP3和Alu RNA之间的相互作用。将从等量细胞溶解产物（未经受IP）分离的RNA用作Alu PCR的输入(input)。免疫沉淀物中Alu RNA的相对丰度，使用Alu特异性引物通过实时RT-PCR评价，并归一化为对照IgG免疫沉淀获得的水平。N=3。(B)与对照siRNA(靶向Luc)相比，人RPE中VDAC1、VDAC2和VDAC3mRNAs的丰度被靶向这些基因的siRNA的转染降低。N=3。通过斯氏t检验，相比对照siRNA，*p<0.05。 
图12：DICER1是Alu RNA引起的胱天蛋白酶-1激活的负调节剂，(A)与对照AS处理相比，人RPE细胞中反义寡核苷酸(AS)抑制DICER1增加胱天蛋白酶-1的切割活性，如Caspalux所监控的，和Caspalux是底物切割的荧光（绿色覆盖）报道子。(B)通过AS处理抑制Alu RNA降低用DICER1AS处理的人RPE细胞的Caspalux荧光。Caspalux荧光的平均值示于括号中。三个实验的代表性图像。 
图13：由导致RPE变性和地图样萎缩的DICER1缺乏诱导的Alu RNA引发的NLRP3炎性体激活的拟建模型的图示。Alu RNA通过活性氧类别(ROS)的产生诱导NLRP3和IL18mRNA的引发。NLRP3炎性体的激活触发激活的胱天蛋白酶-1将pro-IL-18切割为，成熟的IL-18。通过MyD88的IL-18发出磷酸化IRAK1和IRAK4的信号，这导致RPE细胞死亡。 
图14：胱天蛋白酶-8抑制剂的玻璃体内给药保护野生型小鼠免受pAlu诱导的RPE变性。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行； ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图15：胱天蛋白酶-8抑制剂保护人RPE细胞免受Alu诱导的细胞毒性。胱天蛋白酶-8抑制肽Z-IETD-FMK(100μM)保护人RPE细胞免受Alu RNA诱导的细胞毒性，而对照肽Z-FA-FMK(100μM)则不然。 
图16：胱天蛋白酶-8抑制剂保护人RPE细胞免受pAlu诱导的细胞毒性。胱天蛋白酶-8抑制肽Z-IETD-FMK(100μM)保护人RPE细胞免受pAlu诱导的细胞毒性，而对照肽Z-FA-FMK(100μM)则不然。 
图17：IL-18诱导胱天蛋白酶-8的激活。野生型小鼠中IL-18的视网膜下注射诱导胱天蛋白酶-8的激活，如通过荧光板测定(fluorometric plate assay)所监测的。 
图18：pAlu不诱导CD95–/–小鼠的RPE变性。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图19：Alu RNA不诱导CD95–/–小鼠的RPE变性。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图20：重组Il-18不诱导CD95–/–小鼠的RPE变性。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图21：pAlu不诱导Faslg小鼠的RPE变性。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图22：Alu RNA不诱导Faslg小鼠的RPE变性。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图23:重组IL-18不诱导Faslg小鼠的RPE变性。 
示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图24：Alu RNA不诱导Nfkb1–/–小鼠的RPE变性。示出了代表性图像。n=8–12。眼底摄影，上行；ZO-1染色的（红色）扁平封片，下行。 
图25：将Alu RNA或媒介(PBS)注射到野生型小鼠对侧眼的视网膜下腔(subretinal space)。3天后，将DyeLight782-VAD-FMK3注射到两只眼的玻璃体液中。24小时后，在荧光显微镜下可视化制备的RPE扁平封 片制剂，以显现生物活性的胱天蛋白酶区域（绿色荧光），该区域对应AluRNA注射的区域。 
图26：将Alu RNA或媒介物(PBS)注射到两只野生型小鼠对侧眼的视网膜下腔（左图和右图）。3天后，将DyeLight782-VAD-FMK3注射到两只眼的玻璃体液中。从基线(0小时)到其后的8小时中，通过Topcon50IX相机的ICG过滤器拍摄眼底(视网膜)的照片。在注射Alu RNA的眼中，在Alu RNA注射区域观察到对应生物活性胱天蛋白酶产生的白色荧光区域。在注射媒介物的眼中，没有观察到大范围的这种区域。 
图27：将重组IL-18或媒介物(PBS)注射到野生型小鼠对侧眼的视网膜下腔。2天后，将DyeLight782-VAD-FMK3注射到两只眼的玻璃体液中。从基线(0小时)到其后的8小时中，通过Topcon50IX相机的ICG过滤器拍摄眼底(视网膜)的照片。在注射IL-18的眼中，在IL-18注射区域观察到对应生物活性胱天蛋白酶产生的白色荧光区域。在注射媒介物的眼中，没有观察到大范围的这种区域。 
序列表概述 
SEQ ID NO:1.IMG-2005-1肽序列：DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT，其中最后七个氨基酸是抑制MyD88同源二聚化所需的氨基酸，而前面的氨基酸序列是能够使抑制肽进入细胞的触角足蛋白(Antennopedia)细胞渗透序列，由此其能够阻断MyD88。 
SEQ ID NO:2.对照肽序列:DRQIKIWFQNRRMKWKK 
SEQ ID NO:3.MyD88siRNA#1有义:5'-GAGAAGCCUUUACAGGUdTdT-3' 
SEQ ID NO:4.MyD88siRNA#1反义:5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3' 
SEQ ID NO:5.MyD88siRNA#2有义:5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3' 
SEQ ID NO:6.MyD88siRNA#2反义:5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3' 
SEQ ID NO:7NLRP3siRNA–5’-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3’ 
SEQ ID NO:8:NLRP3siRNA–5’-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3’ 
SEQ ID NO:9:NLRP3siRNA-5’-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3’ 
SEQ ID NO:10:NLRP3siRNA-5’-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3’ 
SEQ ID NO:11:NLRP3siRNA-5’-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3’ 
SEQ ID NO:12:PYCARD siRNA-5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3' 
SEQ ID NO:13:PYCARD siRNA-5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3′ 
SEQ ID NO:14:PYCARD siRNA-5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3′ 
SEQ ID NO:15:人的热蛋白(Pyrin)编码序列的siRNA：GCTGGAGCAGGTGTACTACTTC。 
SEQ ID NO:16:人NLRP3编码序列的siRNA：CAGGTTTGACTATCTGTTCT。 
SEQ ID NO:17:人胱天蛋白酶-1的3'UTR的siRNA：GTGAAGAGATCCTTCTGTA。 
SEQ ID NO:18:人IL1B的寡核苷酸引物，正向5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3'。 
SEQ ID NO:19:人IL1B的寡核苷酸引物，反向5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3')。 
SEQ ID NO:20:人IL18的寡核苷酸引物，正向5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3'。 
SEQ ID NO:21:人IL18的寡核苷酸引物，反向5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3'。 
SEQ ID NO:22:人NLRP3的寡核苷酸引物，正向5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3'。 
SEQ ID NO:23:人NLRP3的寡核苷酸引物，反向5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3'。 
SEQ ID NO:24:人PYCARD的寡核苷酸引物，正向5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3'。 
SEQ ID NO:25:人PYCARD的寡核苷酸引物，反向5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3'. 
SEQ ID NO:26:人VDAC1的寡核苷酸引物，正向5'-actgcaaaatcccgagtgac-3'。 
SEQ ID NO:27:人VDAC1的寡核苷酸引物，反向5'-ctgtccaggcaagattgaca-3'。 
SEQ ID NO:28:人VDAC2的寡核苷酸引物，正向5'-cagtgccaaatcaaagctga-3'。 
SEQ ID NO:29:人VDAC2的寡核苷酸引物，反向5’-cctgatgtccaagcaaggtt-3')。 
SEQ ID NO:30:人VDAC3的寡核苷酸引物，正向5'-ttgacacagccaaatccaaa-3'。 
SEQ ID NO:31:人VDAC3的寡核苷酸引物，反向5'-gccaaaacgggtgttgttac-3'。 
SEQ ID NO:32:人18S rRNA的寡核苷酸引物，正向5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3'。 
SEQ ID NO:33:用于人18S rRNA的寡核苷酸引物，反向5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3'。 
SEQ ID NO:34:小鼠Myd88的寡核苷酸引物，正向5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3'。 
SEQ ID NO:35:小鼠Myd88的寡核苷酸引物，反向5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3'。 
SEQ ID NO:36:用于鼠Nlrp3的寡核苷酸引物，正向5’-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3’。 
SEQ ID NO:37:小鼠Nlrp3的寡核苷酸引物，反向5’-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3’。 
SEQ ID NO:38:小鼠Il18的寡核苷酸引物，正向5’-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3’。 
SEQ ID NO:39:小鼠Il18的寡核苷酸引物，反向5’-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3’。 
SEQ ID NO:40:小鼠18S rRNA的寡核苷酸引物，正向5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3'。 
SEQ ID NO:41:小鼠18S rRNA的寡核苷酸引物，反向5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'。 
SEQ ID NO:42:小鼠miR-184-5'-TGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3'； 
SEQ ID NO:43:小鼠miR-221/222-5'-AGCTACATCTGGCTACTGGGT-3'； 
SEQ ID NO:44:小鼠miR-320a-5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3'，和 
SEQ ID NO:45:小鼠miR-484-5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3'。 
SEQ ID NO:46:U6snRNA-5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3'。 
SEQ ID NO:47:VDAC1siRNA有义-5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'。 
SEQ ID NO:48:VDAC2siRNA反义-5'- CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'。 
SEQ ID NO:49:VDAC3siRNA反义-5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3'。 
SEQ ID NO:50:DICER1反义寡核苷酸(AS)-5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3'。 
SEQ ID NO:51:用于DICER1的对照AS-5'-TTGGTACGCATACGTGTTGACTGTGA-3'。 
SEQ ID NO:52:Alu AS-5'-CCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCACGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCGACACCACTCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTT-3'。 
SEQ ID NO:53:用于Alu的对照AS-5'-GCATGGCCAGTCCATTGATCTTGCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCTATCCTCCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-3'。 
SEQ ID NO:54:用于抑制MyD88同源二聚化的寡肽：RDVLPGT。 
SEQ ID NO:55:用于抑制MyD88同源二聚化的寡肽：RDVVPGG。 
SEQ ID NO:56.MyD88siRNA:UUAUUUCCUAAWGGGUCdTdT。 
SEQ ID NO:57.VDAC1siRNA有义(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')。 
SEQ ID NO:58.VDAC2siRNA有义(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')。 
SEQ ID NO:59.VDAC3siRNA有义(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')。 
具体实施方式
本发明的主题包括用于鉴定MyD88抑制剂的方法、用于抑制MyD88的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定炎性体抑制剂的 方法、用于抑制炎性体的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定炎性体组分抑制剂的方法以及用于抑制炎性体组分的方法和组合物及其用途。炎性体的组分包括，例如NLRP3、PYCARD和胱天蛋白酶-1。本发明的主题包括用于鉴定IL-18抑制剂的方法、用于抑制IL-18的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定VDAC1和VDAC2抑制剂的方法、用于抑制VDAC1和VDAC2的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定胱天蛋白酶-8抑制剂的方法、用于抑制胱天蛋白酶-8的方法和组合物及其用途。本发明的主题包括用于鉴定NFkB抑制剂的方法、用于抑制NFkB的方法和组合物及其用途。还提供了用于使个体的眼中活化的胱天蛋白酶-1成像的方法和组合物。 
发明的主题包括方法，其包括抑制细胞的炎性体、MyD88和IL-18中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的主题包括方法，其包括抑制细胞的MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-1、NLRP-3、PYCARD和炎性体中的一种或多种，所述炎性体包括炎性体组分(例如胱天蛋白酶1、NLRP-3、PYCARD)。 
在所述方法的一些实施方案中，所述细胞选自RPE细胞、视网膜光感受器细胞或脉络膜细胞。在一些实施方案中，所述细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，所述细胞是个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有目标病症的个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有年龄相关性黄斑变性的个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有地图样萎缩的个体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是患有、疑似患有或潜在患有地图样萎缩的个体的细胞，且所述细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法和组合物来治疗患有年龄相关性黄斑变性的个体。 
如本文所述，术语“个体”是指治疗目标。本文所述方法的个体可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物或两栖动物。因此本文所述的方法的个体可以是人类或非人类。因此，依照本发明的主 题，提供了兽用治疗用途。 
在一些实施方案中，抑制细胞的炎性体、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NLRP3、PYCARD、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-8和NFκB的一种或多种包括对细胞或个体施用抑制剂，其中所述细胞是个体的细胞。可通过例如以下方式施用这种抑制剂：眼内注射(例如局部眼间疗法)；玻璃体内注射；视网膜下注射；巩膜注射；Tenon囊下注射；眼球后注射；球周注射；经巩膜给药；局部给药，例如局部滴眼剂应用；脉络膜上给药；从缓释送递装置释放，其缝合或连接或放置在巩膜上，或注射到玻璃体液中，或注射到前房中，或者植入透镜袋或胶囊中；口服给药；或静脉内给药。 
本文所用的术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibiting)”是指抑制、减小、降低或基本上消除多肽如MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、胱天蛋白酶-8、NFκB，或炎性体(例如NLRP3、PYCARD、胱天蛋白酶-1)多肽的生物活性。关于受到抑制的多肽，本文所述的“细胞的”是指细胞内(细胞膜内)、细胞上(在细胞膜中，出现在细胞膜上，也在细胞上)或细胞外的多肽，但当多肽处于细胞外时，它是处于细胞外环境中，从而使本领域技术人员能够认识到，该多肽与细胞相关。例如，细胞的VDAC1、VDAC2、胱天蛋白酶-8、NFκB或炎性体的多肽(例如NLRP3、PYCARD、胱天蛋白酶-1)可以处于细胞中。再如，MyD88可以处于细胞中或细胞上。又如，由于IL-18是分泌的，因此其可以处于细胞外，而本领域技术人员能够认识到它与细胞相关。 
如本领域技术人员在研究本申请后所理解的，可通过多种方法抑制细胞的炎性体、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-8、和NFκB。在一些实施方案中，可通过以下方式实现该抑制：影响多肽的转录或翻译、降解多肽、清除多肽，或以其他方式影响该多肽的生物活性来。所述抑制包括施用抑制剂。抑制剂是影响抑制多肽生物活性的化合物。这种化合物可以是例如多肽(包括寡核苷酸，且包括结合目标多肽以影响抑制的多肽)、小分子(包括小的化合物)、用于RNA干 扰的化合物(包括siRNA、miRNA、shRNA)和抗体(例如抗目标多肽的中和抗体、阻断目标多肽与受体结合的抗体)、适体、显性负质粒或载体，或病毒编码的炎性体。 
在本文中可交换使用的术语“多肽”、“蛋白”和“肽”是指20个蛋白质氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，且不考虑其大小。就参考多肽所用的术语“多肽片段”或“片段”，是指相比参考多肽自身，其中有氨基酸残基缺失，而其余的氨基酸序列通常与参考多肽的相应位置相同的多肽。这种缺失可发生在参考多肽的氨基端和羧基端、从参考多肽的内部部分开始或其组合。所述片段也可以是“功能片段”，在这种情况下，所述片段保留本文所述的参考多肽的一些或全部活性。 
术语“修饰的氨基酸”、“修饰的多肽”和“变体”是指与参考多肽有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列，例如一个或多个氨基酸取代。参考多肽的变体也指参考多肽片段的变体，例如其中相对于参考多肽发生一个或多个氨基酸取代的片段。变体也可以是“功能变体”，其中变体保持本文所述的参考蛋白的一些或全部活性。术语功能变体包括参考多肽功能片段的功能变体。 
在一些实施方案中，本发明主题的方法和组合物可用于患有、疑似患有或潜在患有目标病症的个体。在一些实施方案中，本发明主题的方法和组合物可用于治疗目标病症。目标病症的实例包括但不限于：地图样萎缩(Kaneko,Dridi et al.2011)；黄斑变性(Kaneko,Dridi et al.2011)；角膜炎(Guo,Gao et al.2011)；痛风(Gout)(Chen,Shi et al.2006)；寻常性痤疮(Acne vulgaris)(Terhorst,Kalali et al.2010)；克罗恩氏病(Crohn’s disease)(Reuter and Pizarro2004;Abreu,Fukata et al.2005;Medvedev,Sabroe et al.2006)；溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis)(Reuter and Pizarro2004;Abreu,Fukata et al.2005;Medvedev,Sabroe et al.2006)；肠易激症/肠易激综合征(McKernan,Nolan et al.2009)；I型糖尿病(Devaraj,Tobias et al.2011;von Herrath,Filippi et al.2011)；2型糖尿病(Hutton,Soukhatcheva et al.2010;Nogueira-Machado,Volpe et al.2011)；胰岛素抗性(Ghanim,Mohanty et al. 2008;Tilich and Arora2011)；肥胖(Fresno,Alvarez et al.2011)；溶血性尿毒症综合征(Batsford,Duermueller et al.2011)；多瘤病毒感染(Batsford,Duermueller et al.2011)；免疫复合物肾脏疾病(Anders,Banas et al.2004;Anders and Schlondorff2007)；急性肾小管损伤(Anders,Banas et al.2004;Anders and Schlondorff2007)；狼疮性肾炎(Anders,Banas et al.2004;Anders and Schlondorff2007)；家族性冷自身炎症综合征(Familial cold autoinflammatory syndrome)(Mariathasan,Weiss et al.2006;Meng,Zhang et al.2009)；穆-韦综合征和新生儿发病多系统炎症性疾病(Mariathasan,Weiss et al.2006;Meng,Zhang et al.2009)；慢性小儿神经皮肤和关节的自身炎性疾病，肾脏缺血灌注损伤(El-Achkar and Dagher2006;Robson2009)；肾小球性肾炎(El-Achkar and Dagher2006;Robson2009)；冷沉球蛋白血症(Banas,Banas et al.2008)；系统性血管炎(Weyand,Ma-Krupa et al.2005;Hurtado,Jeffs et al.2008;Summers,Steinmetz et al.2011)；IgA肾病(Lim,Lee et al.2011)；动脉粥样硬化(Curtiss and Tobias2009)；艾滋病(HIV/AIDS)(Brichacek,Vanpouille et al.2010)；疟疾(Franklin,Ishizaka et al.2011)；蠕虫寄生虫(Babu,Blauvelt et al.2005;Venugopal,Nutman et al.2009)；败血症和败血性休克(Knuefermann,Nemoto et al.2002;Opal and Huber2002;Cristofaro and Opal2003;Chen,Koustova et al.2007)；过敏性哮喘(Slater,Paupore et al.1998;Park,Gold et al.2001)；花粉症(Slater,Paupore et al.1998;Park,Gold et al.2001)；慢性阻塞性肺疾病(Geraghty,Dabo et al.2011)；药物引起的肺部炎症(Liu,Yang et al.2010)；接触性皮炎(Martin,Dudda et al.2008;Yokoi,Niizeki et al.2009)；麻风(Krutzik,Tan et al.2005;Terhorst,Kalali et al.2010)；伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia)感染(Ventura,Balloy et al.2009)；呼吸道合胞病毒感染(Aeffner,Traylor et al.2011)；银屑病(Zuany-Amorim,Hastewell et al.2002;Barrat and Coffman2008;Li,Zhou et al.2009)；系统性红斑狼疮(Zuany-Amorim,Hastewell et al.2002;Barrat and Coffman2008;Li,Zhou et al.2009)；硬皮病(Zuany-Amorim,Hastewell et al.2002;Barrat and  Coffman2008;Li,Zhou et al.2009)；反应性关节炎(Zuany-Amorim,Hastewell et al.2002;Barrat and Coffman2008;Li,Zhou et al.2009)；囊性纤维化、梅毒、干燥综合征(
Figure BDA0000478497860000201
syndrome)(Zuany-Amorim,Hastewell et al.2002;Barrat and Coffman2008;Li,Zhou et al.2009)；类风湿性关节炎(Zuany-Amorim,Hastewell et al.2002;Barrat and Coffman2008;Li,Zhou et al.2009)；发炎性关节疾病(O'Neill2008)；非酒精性脂肪性肝病(Tan,Fiel et al.2009)；心脏手术(围手术期/术后炎症)(Cremer,Martin et al.1996;Taylor1996;Dybdahl,Wahba et al.2002)；急性和慢性器官移植排斥反应(Alegre,Leemans et al.2008;Miller,Rossini et al.2008;Taylor,Ehrhardt et al.2008;Krams,Wang et al.2010;Wang,Schmaderer et al.2010;Shin and Harris2011;Testro,Visvanathan et al.2011)；急性和慢性骨髓移植排斥反应(Alegre,Leemans et al.2008;Miller,Rossini et al.2008;Taylor,Ehrhardt et al.2008;Krams,Wang et al.2010;Wang,Schmaderer et al.2010;Shin and Harris2011;Testro,Visvanathan et al.2011)；阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)；以及肿瘤血管生成(Frantz,Vincent et al.2005;Schmid,Avraamides et al.2011)。 
本文所述术语治疗(treatment)或治疗(treating)涉及对目标病症的任何治疗，包括但不限于预防性治疗和治疗性治疗。照此，术语治疗(treatment)或治疗(treating)包括但不限于：预防目标病症或目标病症的发展；抑制目标病症的进展，阻止或预防目标病症的发展；降低目标病症的严重性；改善或缓解与目标病症相关的症状；以及引起目标病症或与目标病症的一种或多种症状的逆转。 
在一些实施方案中，本发明主题的方法和组合物有利于保护细胞免受Alu-RNA诱导的变性。照此，在一些实施方案中，方法包括施用抑制剂，其中保护细胞免受Alu-RNA诱导的变性。 
抑制炎性体
在一些实施方案中，本发明的主题包括保护细胞的方法，其包括抑制细胞的炎性体。前述权利要求中任一项所述的方法，其中炎性体选自 NLRP3炎性体、NLRP1炎性体、NLRC4炎性体、AIM2炎性体和IFI16炎性体。在一些实施方案中，炎性体是NLRP3炎性体。 
在一些实施方案中，抑制炎性体包括抑制炎性体组分。在一些实施方案中，所述炎性体组分可包括由PYCARD编码的多肽。在一些实施方案中，所述炎性体组分可包括胱天蛋白酶。在一些实施方案中，所述炎性体组分可包括PYCARD、NLRP3和胱天蛋白酶-1。 
在一些实施方案中，抑制炎性体包括施用炎性体抑制剂。所述炎性体抑制剂可以是炎性体组分的抑制剂。在一些实施方案中，炎性体 
如上所述，在一些实施方案中，抑制本发明主题的目标多肽包括施用寡核苷酸或小RNA分子。这种小RNA分子可以靶向例如NLRP3和/或PYCARD。这种核苷酸可以靶向并降解NLRP3和/或PYCARD。就这一点而言，本发明的主题包括抑制NLRP3和/或PYCAR D表达的分离的双链RNA分子，其中双链RNA的第一条链包括表A所列的序列，并包括约14-25个核苷酸。如上所述,在一些实施方案中，抑制包括施用炎性体抑制剂，其是显性负载体。在一些实施方案中，抑制炎性体包括炎性体包括施用胱天蛋白酶-1的抑制剂。在一些实施方案中，胱天蛋白酶-1抑制剂是肽抑制剂。 
可按照本发明主题使用的炎性体抑制剂的实例包括但不限于表A中列举的那些。照此，本发明主题的实施方案可包括施用表A中所列的炎性体抑制剂。 
Figure BDA0000478497860000211
Figure BDA0000478497860000221
Figure BDA0000478497860000231
Figure BDA0000478497860000241
关于胱天蛋白酶-1抑制剂和探针的其他信息见于表B。表B列出的链接中的信息到本申请的申请日为止，通过引用的方式并入本文。 
Figure BDA0000478497860000242
本发明的主题进一步包括用于抑制炎性体的组合物。这类组合物包括抑制剂。如上所述，这种抑制剂可以是例如核苷酸、多肽、小(化学)分子等。在一些实施方案中，组合物可包含分离的RNA分子。 
本发明的主题包括抑制炎性体组分例如NLRP3、胱天蛋白酶-1和/或PYCARD表达的分离的RNA分子。在一些实施方案中，双链RNA 的第一条链包含选自以下的序列：5’-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3’(SEQ ID NO:7)；5’-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3’(SEQ ID NO:8)；5’-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3’(SEQ ID NO:9)；5’-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3’(SEQ ID NO:10)；5’-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3’(SEQ ID NO:11)；5’-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3’(SEQ ID NO:12)；5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3’(SEQ ID NO:13)；和5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3’(SEQ ID NO:14)，并包括约14-25个核苷酸。 
本发明的主题包括抑制炎性体组分表达的分离的RNA分子。在一些实施方案中，RNA分子包含选自下列序列的序列：GCTGGAGCAGGTGTACTACTTC(SEQ ID NO:15)、CAGGTTTGACTATCTGTTCT(SEQ ID NO:16)和GTGAAGAGATCCTTCTGTA(SEQ ID NO:17)。 
本发明的主题进一步包括筛选候选抑制剂，以鉴定炎性体抑制剂的方法。在一些实施方案中，鉴定炎性体抑制剂的方法使用培养的细胞，其中提供了细胞的体系，其响应炎性体激活剂(例如Alu RNA、脂多糖+ATP)，测量PYCARD的聚集、胱天蛋白酶-1的切割或者IL-1β或IL-18的切割/分泌。 
在一些实施方案中，炎性体抑制剂的筛选方法包括：用Alu RNA或LPS+ATP刺激已用编码荧光标记的PYCARD的质粒转染的细胞(例如RPE细胞)或细胞系(例如THP-1或RAW巨噬细胞)；使用荧光显微镜监控荧光PYCARD聚集成“斑点(speck)”–聚集体(aggregosome)焦点；以及测试候选分子抑制PYCARD“斑点”形成的程度。 
在一些实施方案中，用于炎性体抑制剂筛选方法包括：用Alu RNA或LPS+ATP刺激细胞(例如RPE细胞)或细胞系(例如THP-1或RAW巨噬细胞；使用
Figure BDA0000478497860000261
-E2D2试验(OncoImmunin,Inc.)监控胱天蛋白酶 -1的活性；以及测试候选分子抑制Caspaslux荧光反应程度。 
在一些实施方案中，炎性体抑制剂筛选方法包括：用Alu RNA或LPS+ATP刺激细胞(例如RPE细胞)或细胞系(例如THP-1或RAW巨噬细胞；通过使用抗-胱天蛋白酶-1抗体的免疫印迹法测量切割的胱天蛋白酶-1(p10或p20亚型)的丰度来监控胱天蛋白酶-1的活性；以及测试候选分子抑制胱天蛋白酶-1的切割片段(p10或p20)的程度。 
在一些实施方案中，炎性体抑制剂筛选方法包括：用Alu RNA或LPS+ARP刺激HEK-BlueTMIL-1β细胞(Invivogen)以使用QUANTI-BlueTM(Invivogen)检测生物活性IL-1β的形成；以及测试候选分子抑制比色信号的程度。 
抑制MyD88
在一些实施方案中，本发明的主题包括保护细胞的方法，包括：抑制细胞的MyD88。在一些实施方案中，抑制MyD88包括施用MyD88抑制剂。 
如上所述,在一些实施方案中，抑制本发明主题的目标多肽包括施用寡核苷酸或小RNA分子。这种小RNA分子可以靶向MyD88。这类核苷酸可以靶向并降解MyD88。就这一点而言，本发明的主题包括抑制MyD88表达的分离的双链RNA分子，其中双链RNA的第一条链包含表C中列出的且包括约14至25个核苷酸的序列。可根据本发明的主题使用的MyD88抑制剂的实例包括但不限于表C中列举的那些。照此，本发明的主题的实施方案可包括施用表C中列出的MyD88抑制剂。 
Figure BDA0000478497860000271
Figure BDA0000478497860000281
如上所述，在一些实施方案中，抑制MyD88包括施用MyD88抑制剂，其是针对MyD88的显性负载体，例如MyD88的显性负抑制形式(pMyD88-dn)，其包含缺少MyD88死亡结构域的截短的ΔMyD88(氨基酸152-296)(Muzio et al.IRAK(Pelle)Family Member IRAK-2and MyD88as Proximal Mediators of IL-1Signaling(IRAK(Pelle)).Science1997;278:1612-1615)。 
如上所述，在一些实施方案中，抑制MyD88包括施用MyD88抑制剂，其是小分子(例如(1)氢化肉桂酰-L-缬氨酰吡咯烷，在Bartfai et al.“A low molecular weight mimic of the Toll/IL-1receptor/resistance domain inhibits IL-1receptor-mediated responses(Toll/IL-1受体/耐受性结构域的低分子量变种抑制IL-1受体介导反应)”.PNAS2003;100:7971-7976中称为化合物4a；或(2)ST2825，其描述于Carminati,P.,Gallo,G.,Ruggiero,V.,Sassano,M.,Mastroianni,D.MyD88homodimerization inhibitors(MyD88同源二聚化抑制剂)”专利号WO2006067091并表征于Loiarro et al.“Inhibition of MyD88dimerization and recruitment of IRAK1and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound(通过新的肽模拟化合物抑制MyD88和补充IRAK1和IRAK4).”Journal of Leukocyte Biology.2007;82:801-810；或(3)4-[(E)-2-(1-己基吡啶-1-鎓-2-基)次乙基]-N,N-二甲基苯胺碘化物，也称为4-[(E)-2-(1-己基吡啶-6-yl)乙烯基]-N,N-二甲基-苯胺碘化物，在PubChem中又称为化学结构CID5716367，其阻断MyD88的相互作用，或(4)Lee et al.“Application ofβ-Lactamase Enzyme Complementation to the High-Throughput Screening of Toll-Like Receptor Signaling Inhibitors(β-内酰胺酶的酶互补对于Toll样受体信号抑制剂的高通量筛选的应用).”Molecular Pharmacology2007;72:868-875中称为50-F12和26-J10的化合物，或天然产物(Villa et al.“Selective MyD88-dependent pathway inhibition by the cyanobacterial natural product malyngamide F acetate(通过蓝藻天然产物鞘丝藻酰胺F醋酸盐的选择性MyD88-依赖途径抑制).” European Journal of Pharmacology2010;629:140-146中描述的鞘丝藻酰胺F醋酸盐)，或通过SELEX或其他结合或阻断MyD88的筛选技术产生的DNA或RNA适体。 
本发明的主题还包括用于抑制MyD88的组合物。这种组合物包含抑制剂。如上所述，这种抑制剂可以是例如核苷酸、多肽、小(化学)分子等。在一些实施方案中，组合物可包含分离的RNA分子。 
本发明的主题包括抑制MyD88表达的分离的RNA分子。在一些实施方案中，双链RNA的第一条链包含选自以下序列且包括约14-25个核苷酸的序列：5'-GAGAAGCCUUUACAGGUdTdT-3'(SEQ ID NO:3)；5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3'(SEQ ID NO:4)；5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3'(SEQ ID NO:5)；和5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3'(SEQ ID NO:6)。 
本发明的主题包括抑制MyD88表达的分离的多肽分子。在一些实施方案中，所述多肽分子包含选自以下并包括约29-100个氨基酸的序列：DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，所述多肽分子包含选自以下的序列：RDVLPGT(SEQ ID NO:54)和 RDVVPGG(SEQ ID NO:55)。 
在一些实施方案中，鉴定MyD88抑制剂的方法使用培养的细胞，其中上调MyD88。可使用培养的细胞筛选候选化合物以确定调节MyD88的效力。候选分子包括例如小分子、生物制剂及其组合，例如包括多种化合物的组合物。术语小分子包括传统药物化合物。术语生物制剂包括多肽与核苷酸，并包括siRNAs、抗体、适配子和显性负质粒或载体。 
在一些实施方案中，所述筛选方法包括：提供培养的细胞，其中上调MyD88；并使候选化合物与细胞接触。该方法可进一步包括鉴定MyD88的变化。例如，MyD88水平的可测量的变化可以表示候选化合物相关的效力。在一些实施方案中，其中MyD88的变化为MyD88的可测量的降低，该变化代表所述候选化合物是MyD88抑制剂。这类MyD88抑制剂如本文所述可对于治疗应用具有实用性。 
在一些实施方案中，可以使用Alu RNA或脂多糖(LPS)上调MyD88，例如通过用Alu RNA或LPS刺激细胞(巨噬细胞或RPE细胞)。在一些实施方案中，可以使用CpG核苷酸上调MyD88，例如通过用合成的寡核苷酸刺激细胞(巨噬细胞或RPE细胞)，所述合成的寡核苷酸包含未甲基化的CpG二核苷酸，例如5’-tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gtt-3’或5’-ggG GGACGA TCG TCg ggg gg-3’。在一些实施方案中，可以使用白介素-1β或白介素18上调MyD88，例如通过用白介素-1β或白介素18的重组形式刺激细胞(巨噬细胞或RPE细胞)。 
在用于鉴定MyD88抑制剂的方法的一些实施方案中，可通过测量细胞活力、测量已知由MyD88信号传导诱导的基因(例如Cox-2、Socs3,TNF-α)的表达或使用本领域技术人员认可的其他标准、使用本领域技术人员已知的方法监测MyD88的变化。在一些实施方案中，培养的细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，所述细胞是视网膜光感受器细胞。在一些实施方案中，所述细胞是脉络膜细胞。 
在一些实施方案中，鉴定MyD88抑制剂的方法包括：提供培养的细胞，其中MyD88被上调或发生寡聚化或诱导IRAK1或IRAK4的磷酸化； 并使细胞与候选化合物接触；以及确定候选化合物是否导致MyD88水平的变化，或是否导致二聚化或寡聚化的MyD88的丰度变化，或是否导致磷酸化的IRAK1或磷酸化的IRAK4的丰度变化。在一些实施方案中，通过Alu RNA、脂多糖、CpG核苷酸、单链RNA、白介素-1β或白介素18上调MyD88。在一些实施方案中，通过测量细胞活力或测量已知由MyD88信号传导诱导的基因的表达来监测MyD88。在一些实施方案中，已知由MyD88信号传导诱导的所述基因选自Cox-2、Socs3和TNF-α。 
在用于MyD88抑制剂的筛选方法的一些实施方案中，可以用已知的MyD88激活剂如Alu RNA或LPS刺激细胞或细胞系。基因如Cox2、Socs3或TNF-α的RNA水平可使用实时定量RT-PCR来测定。可以测试候选分子对这些基因转录物的抑制程度。 
在用于MyD88抑制剂的筛选方法的一些实施方案中，可以用已知的MyD88激活剂如Alu RNA或LPS刺激细胞或细胞系。二聚化或寡聚化的MyD88的丰度可通过蛋白质印迹法在非还原条件下使用抗-MyD88抗体来测定。可测试所述候选分子抑制MyD88的二聚化和寡聚化的程度。 
在用于MyD88抑制剂的筛选方法的一些实施方案中，可以用已知的MyD88激活剂如Alu RNA或LPS刺激细胞或细胞系，所述细胞或细胞系已经用编码标记到YFP(黄色荧光蛋白)的片段的融合MyD88蛋白的质粒转染。可使用双分子荧光互补技术测量荧光信号。可测试所述候选分子抑制荧光信号的程度。 
在用于MyD88抑制剂的筛选方法的一些实施方案中，可以用已知的MyD88激活剂如Alu RNA或LPS刺激细胞或细胞系。磷酸化形式的IRAK1或IRAK4的丰度可以通过蛋白质印迹法在还原条件下使用抗-phosphoIRAK1或抗-phosphoIRAK4抗体来测定。可以测试所述候选分子抑制IRAK1或IRAK4磷酸化的程度。 
抑制IL-18
在一些实施方案中，本发明的主题包括保护细胞的方法，包括：抑制细胞的IL-18。在一些实施方案中，所述抑制IL-18包括施用IL-18抑 制剂。 
如上所述，在一些实施方案中，所述抑制本发明主题的目标多肽包括施用结合蛋白或抗体。这类抗体可包括抗IL-18的中和抗体，或阻断IL-18结合至IL-18受体的抗体。在一些实施方案中，所述IL-18抑制剂可以是IL-18结合蛋白(Novick,et al.,1999)。 
可根据本发明主题使用的IL-18抑制剂的实例包括但不限于表D所列举的那些。照此，本发明主题的实施方案可包括施用表D所列举的IL-18抑制剂。 
Figure BDA0000478497860000321
本发明的主题还包括用于抑制IL-18的组合物。这类组合物包括抑制剂。如上所述，这类抑制剂可以是例如核苷酸、多肽、小(化学)分子等。在一些实施方案中，组合物可包含分离的RNA分子。在一些实施方案中，组合物可包含抗体或结合蛋白。 
本发明的主题还包括筛选候选抑制剂，以鉴定IL-18抑制剂的方法。在一些实施方案中，鉴定IL-18抑制剂的方法包括：将重组IL-18R1涂布于适合表面等离子体共振(SPR)的固态表面上；将所涂布的重组IL-18R1暴露于荧光标记的重组IL-18；将该体系进一步暴露于推定的IL-18抑制剂，其会替代IL-18:IL-18R1的结合；以及测量荧光值以确定抑制程度。 
在一些实施方案中，鉴定IL-18抑制剂的方法包括：用重组IL-18刺激细胞(例如RPE细胞)或细胞系(例如THP-1或RAW巨噬细胞)；测定MyD88的激活，例如通过测定MyD88二聚化的增加(通过蛋白质印迹法) 或通过测量IRAK1或IRAK4磷酸化的增加。 
抑制VDAC1和/或VDAC2
在一些实施方案中，本发明的主题包括保护细胞的方法，包括：抑制细胞的VDAC1和/或VDAC2。在一些实施方案中，所述抑制VDAC1和/或VDAC2包括施用VDAC1和/或VDAC2抑制剂。 
如上所述，在一些实施方案中，所述抑制本发明主题的目标多肽包括施用寡核苷酸或小RNA分子。这类小RNA分子可以靶向VDAC1和/或VDAC2。这类核苷酸可以靶向并降解VDAC1和/或VDAC2。就这一点而言，本发明的主题包括抑制VDAC1和/或VDAC2表达的双链RNA分子，其中双链RNA的第一条链包含表E所列出的序列，并包括约14-25个核苷酸。可根据本发明主题使用的VDAC1和/或VDAC2抑制剂的实例包括但不限于列在表E中的那些。照此，本发明的主题的实施方案可包括施用表E中所列的VDAC1和/或VDAC2抑制剂。 
Figure BDA0000478497860000331
本发明的主题还包括用于抑制VDAC1和/或VDAC2的组合物。这类组合物包含抑制剂。如上所述，这类抑制剂可以是例如核苷酸、多肽、 小(化学)分子等。在一些实施方案中，组合物可包括分离的RNA分子。 
本发明的主题包括抑制VDAC1和/或VDAC2表达的分离的RNA分子。在一些实施方案中，双链RNA的第一条链包含选自以下且包括约14-25个核苷酸的序列：5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'(SEQ ID NO:47)和5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'(SEQ ID NO:48)。 
本发明的主题还包括筛选候选抑制剂，以鉴定VDAC1和/或VDAC2抑制剂的方法。在一些实施方案中，使用基于细胞或细胞系的方法。 
抑制胱天蛋白酶-8
在一些实施方案中，本发明的主题包括保护细胞的方法，包括：抑制细胞的胱天蛋白酶-8。在一些实施方案中，所述抑制胱天蛋白酶-8包括施用胱天蛋白酶-8抑制剂。 
可根据本发明主题使用的胱天蛋白酶-8抑制剂的实例包括但不限于表F中所列的那些。照此，本发明主题的实施方案可包括施用表F中所列的胱天蛋白酶-8抑制剂。 
Figure BDA0000478497860000341
本发明的主题还包括用于抑制胱天蛋白酶-8的组合物。这类组合物包括抑制剂。如上所述，这类抑制剂可以是例如核苷酸、多肽、小(化学)分子等。在一些实施方案中，所述组合物可包括分离的RNA分子。 
本发明的主题还包括筛选候选抑制剂，以鉴定胱天蛋白酶-8抑制剂的方法。在一些实施方案中，使用基于细胞或细胞株的方法。 
抑制NFκB
在一些实施方案中，本发明的主题包括保护细胞的方法，包括抑制 细胞的NFκB。在一些实施方案中，所述抑制NFκB包括施用胱天蛋白酶-8抑制剂。 
可根据本发明的主题使用的NFκB抑制剂的实例包括但不限于表G中列举的那些。照此，本发明的主题的实施方案可包括施用表G中列举的NFκB抑制剂。 
本发明的主题还包括用于抑制NFκB组合物。这类组合物包含抑制剂。如上所述，这种抑制剂可以是例如核苷酸、多肽、小(化学)分子等。在一些实施方案中，组合物可包括分离的RNA分子。 
本发明的主题还包括筛选候选抑制剂，以鉴定NFκB抑制剂的方法。在一些实施方案中，使用基于细胞或细胞株的方法。 
对个体眼中的胱天蛋白酶成像
在一些实施方案中，提供了诊断性组合物,用于对个体眼中激活的胱天蛋白酶成像，其包含与胱天蛋白酶-1的底物缀合的荧光分子，或被胱天蛋白酶-1切割后发出荧光的分子。在一些实施方案中，提供了用于对个体眼内对激活的胱天蛋白酶-1成像的方法,包括对个体的RPE细胞(眼内或静脉内)施用所述诊断性组合物,并在光学上监控荧光的空间聚簇。 
本文件陈述了本发明的主题的一个或多个实施方案的详细内容。在对本文件所提供的信息进行研究后，对本文件中描述的实施方案和其他实施方案进行修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文件中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方案的具体细节主要提供用于清 晰地理解本发明，不应将其理解成非必要的限制。如有冲突，以本说明书,包括定义为准。 
本文所公开的一些多核苷酸和多肽序列交叉引用于 登录号。数据库中交叉引用的序列通过引用的方式清楚地并入，如同存在于
Figure BDA0000478497860000363
或其他公共数据库的等同和相关序列。还通过引用的方式清楚地并入数据库中存在的与本文所述序列相关的所有注解。除非另有说明或显而易见，对
Figure BDA0000478497860000366
数据库的引用是指对到本申请的申请日为止最近版本的引用。 
虽然认为本领域技术人员已完全理解本文所使用的术语，但仍然将定义列出以有助于解释本发明主题。 
除非另有说明，本文使用的技术和科学术语的含义与本发明所属领域技术人员通常所理解的含义相同。尽管在本发明主题的实践或测试中可以使用任何与本文所公开的那些相似或相同的任何方法、装置和材料，但还是在此描述代表性的方法、装置和材料。 
根据存在已久的专利法的规则，术语“一种/个(a,an)”和“该/所述”使用在本申请包括权利要求中时，是指“一种/个或多种/个”。因此，例如指代“一种/个细胞(a cell)”包括多个这种细胞，诸如此类。 
除非另有说明，本说明书和权利要求中使用的表达成分的量、性质如反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另有相反的说明，列举在本说明书和权利要求中的数字参数是近似值，其可以根据本发明主题待获得的所需性质而变化。 
本文所述的术语“约”在指数值或质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着在一些实施方案中包括指定数量的±20%的变化，在一些实施方案中包括指定数量的±10%的变化，在一些实施方案中包括指定数量的±5%的变化，在一些实施方案中包括指定数量的±1%的变化，在一些实施方案中包括指定数量的±0.5%的变化，以及在一些实施方案中包括指定数量的±0.1%的变化，因为这些变化适用于进行所公 开的方法。 
如本文所述，范围可以表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一具体值。也可理解为除所述数值之外，存在本文所述的若干数值，且每个数值在本文中记载为“约”那个具体值。例如，如果记载的数值为“0”,则也记载了“约为0”。还可以理解为也记载了两个具体单元之间的每个单元。例如，如果记载了10和15,则也记载了11、12、13、和14。 
通过以下具体且非限制性的实施例对本发明的主题进行详细描述。以下实施例可包括数据汇编，其是本发明相关的研发和实验过程中不同时间收集的代表性数据。 
实施例 
实施例1 
由于DICER1缺乏导致的Alu RNA在视网膜色素上皮细胞(RPE)中的累积与地图样萎缩(GA)有关，其是导致成千山万个个体失明的年龄相关性黄斑变性的高级形式。Alu RNA引发的细胞毒性的机理是未知的。这里证明，DICER1缺失或Alu RNA暴露会激活NLRP3炎性体并通过RPE中的IL-18触发TLR非依赖性信号传导。炎性体组分(NLRP3、Pycard、胱天蛋白酶-1)、MyD88或IL-18的遗传或药物抑制会阻止DICER1丧失或Alu RNA暴露引起的RPE变性。这些发现，结合人GA RPE含有提高量的NLRP3、PYCARD和IL-18这一观察结果以及胱天蛋白酶-1和激活MyD88增加的证据，提供了针对GA中的这个途径的基本原理。该发现也显示出炎性体在免疫系统之外的新功能以及移动元件(mobile element)的免疫调节作用。 
年龄相关性黄斑变性(AMD)影响了成千上万个体的视力(Smith et al.,2001)。AMD的特征为位于视网膜光感受器和脉络膜的毛细血管之间的视网膜色素上皮细胞的变性(Ambati et al.,2003)。RPE的功能异常会破坏光感受器和脉络膜的脉管系统(Blaauwgeers et al.,1999;Lopez et al.,1996;McLeod et al.,2009;Vogt et al.,2011)。这些组织的破坏导致萎缩性或新生 血管性疾病表型。尽管有用于新生血管AMD的疗法，却没有用于更常见萎缩性形式的有效治疗方法。GA是萎缩性AMD的晚期，其特征是RPE的变性，它是无法医治的视力丧失的根本原因。 
近期已经证明，RNase DICER1的显著且特定的降低导致患有GA的人眼RPE中Alu RNA转录物的累积(Kaneko et al.,2011)。这些重复性要素转录物，是被高丰度Alu逆转录转座子表达的非编码RNA，且诱导人RPE细胞死亡和小鼠的RPE变性。GA RPE中DICER1缺乏不是一般的细胞死亡反应，因为在其他视网膜的疾病中对DICER1表达没有进行异常调节。同样，Alu RNA累积不代表由于对垂死细胞的应激反应导致的一般的逆转录转座子的激活，因为在GA RPE中其他逆转录转座子没有提高。 
DICER1对成熟的微小RNA生物起源非常重要(Bernstein et al.,2001)。然而DICER1缺乏后，Alu RNA的累积，非成熟微小RNA的缺乏，是RPE细胞活性的关键决定因素(Kaneko et al.,2011)。此外，7SLRNA、转移RNA和初级微小RNA并不诱导RPE的变性(Kaneko et al.,2011)，从而排除非特异性的毒性过剩、高度结构化RNA。尽管如此，Alu RNA细胞毒性的详细机理还是未知的。 
虽然视网膜由于其免疫赦免是反常的(Streilein,2003)，但由先天免疫传感器介导的损伤可能导致深度炎症。先天性免疫受体的三个蛀牙类别包括TLR、RIG-I-样解旋酶和NLR蛋白(Akira et al.,2006)。许多先天性免疫受体在RPE中表达(Kumar et al.,2004)，且几种外源物质可以引发视网膜炎症(Allensworth et al.,2011;Kleinman et al.,2012)。然而，这种监控机制是否识别或响应宿主内源RNA尚未可知。探讨出的设想是，先天性免疫机构的典型功能是病原体相关分子模式和来自外来生物体的其他部分的检测，它也可能识别Alu RNA。 
事实上，已证明，Alu转录物可以劫持先天性免疫机制来诱导RPE细胞死亡。令人惊讶的是，资料显示，DICER1缺乏或Alu RNA以MyD88依赖性方式而不是TLR非依赖性方式激活NLRP3炎性体。如角化细胞 的细胞培养研究(Feldmeyer et al.,2007;Keller et al.,2008)中的实施例所反映出的，尽管NLRP3的激活可以更为普遍，但体内的NLRP3炎性体激活已很大程度上限于免疫细胞。该资料也扩宽DICER1功能的范围，使其超越微小RNA的生源论，并将其确定为对抗包含约50%的人类基因组的毒性逆转录转座子成分的异常累积的守护者(Lander et al.,2001)。综上所述，这些发现显示了新的自我识别免疫反应，由此，非免疫细胞中的DICER1缺乏导致内源性非编码RNA诱导型NLRP3炎性体的激活。 
结果 
Alu RNA不激活多种TLR和RNA传感器 
Alu RNA具有单链(ss)RNA和双链(ds)RNA基序(Sinnett et al.,1991)。因此检测了Alu RNA是否诱导dsRNA传感器toll样受体-3(TLR3)(Alexopoulou et al.,2001)或者ssRNA传感器TLR7(Diebold et al.,2004;Heil et al.,2004)缺陷小鼠的RPE变性。编码Alu RNA(pAlu)的质粒的视网膜下的送递诱导Tlr3–/–和Tlr7–/–小鼠的RPE变性，就如同野生型(WT)小鼠(图1A-图C)中一样。以前已经证明，≥21-核苷酸的完全互补的siRNA激活RPE细胞上的TLR3(Kleinman et al.,2011)。由Alu RNA导致的丧失TLR3的激活很可能是由于其含有可能妨碍TLR3结合的多个发夹和凸起的复合结构。Alu RNA的进化前体7SL RNA和p7SL都不诱导野生型小鼠的RPE变性(图8A和8B)，这表明Alu RNA细胞毒性可能是由于尚未清楚的结构特征所致。pAlu诱导缺乏TLR3、TLR7和TLR9信号传导的Unc93b1小鼠的RPE变性(图1D)(Tabeta et al.,2006)，这表明这些核酸传感器并不被Alu RNA过多地激活。pAlu诱导Tlr4–/–小鼠的RPE变性(图1E)，并且TLR4拮抗剂类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)LPS(Qureshi et al.,1991)不抑制WT小鼠的pAlu诱导RPE变性(图8C)。因此观察到的RPE细胞死亡并不是由于脂多糖杂质所致。此外，两种不同的体外转录Alu RNA(Kaneko et al.,2011)并未激活多个TLR(图1F)。 
接下来检测了其它dsRNA传感器如MDA5(Kato et al.,2006)或PKR(由Prkr编码,(Yang et al.,1995))是否可以介导Alu RNA毒性。然而，pAlu 诱导Mda5–/–和Prkr–/–小鼠的RPE变性(图8D和8E)。检测了能够激活有义这部分的RIG-I或IFIT-1的体外转录的Alu RNA的5′-三聚磷酸酯是否是RPE变性的原因。去磷酸化的Alu RNA诱导WY小鼠的RPE变性，就如同Alu RNA没有进行去磷酸化(图8F)一样，这表明该化学基团并不是所观察到的细胞死亡的原因。事实上，激活RIG-I的5′-三聚磷酸酯ssRNA并不诱导小鼠的RPE变性(Kleinman et al.,2011)。此外，pAlu诱导MAVS缺陷小鼠的RPE变性(图8G)，RIG-I和MDA-5通过MAVS发出信号(Kumar et al.,2006;Sun et al.,2006)。这些资料共同指出了Alu RNA诱导的PRE变性并没有被大范围的典型RNA传感器所介导的新机理。 
通过MyD88和IL-18介导Alu RNA细胞毒性 
然后检测了TLR3和TLR4的适体TRIF(由Ticam1编码)(Hoebe et al.,2003;Yamamoto et al.,2003)和除TLR3以外的所有TLR的适体MyD88(Akira et al.,2006;Alexopoulou et al.,2001;Suzuki et al.,2003)的参与。Alu RNA诱导Ticam1–/–小鼠的RPE变性(图9A)，这与在Tlr3–/–和lr4–/–小鼠中的发现一致。出乎意料的是，Alu RNA和两种不同pAlu质粒都没有诱导Myd88–/–小鼠的RPE变性(图2A、9B和9C)。MyD88同源二聚化的肽抑制剂的玻璃体内送递(Loiarro et al.,2005)阻止由Alu RNA诱导的WT小鼠的RPE变性，而对照多肽却不是如此(图2B)。MyD88靶向短干扰RNA(siRNA)在长度上比21个核苷酸短以阻止TLR3的激活，并且缀合至胆固醇上以允许细胞渗透(Kleinman et al.,2008)，MyD88靶向短干扰RNA(siRNA)抑制由pAlu诱导的WT小鼠的RPE变性(图2C-2E)，而对照的siRNA却不是如此。Myd88+/–杂合小鼠免于受到保护而免于Alu RNA诱导的RPE变性(图2F和9D)，这印证了siRNA的研究，即MyD88的部分抑制是有足够疗效的。 
由白介素诱导的MyD88介导的细胞转导引起IRAK1和IRAK4的补充和磷酸化作用(Cao et al.,1996;Kanakaraj et al.,1999;Suzuki et al.,2003;Suzuki et al.,2002)。Alu RNA增加人RPE细胞的IRAK1/4的磷酸化(图2G)，这支持了Alu RNA触发MyD88信号传导的设想。MyD88抑制肽 降低人RPE细胞的Alu RNA诱导的IRAK1/4的磷酸化(图9E)，这证实了其作用方式。 
接下来评价MyD88的激活是否介导人和小鼠RPE细胞培养系统中的Alu RNA诱导的细胞死亡。与活内数据一致，pAlu降低WT的细胞活力，而对于Myd88–/–小鼠RPE细胞却不是如此(图2H)。MyD88-抑制肽抑制转染pAlu的人RPE细胞的细胞死亡(图2I)，而对照肽则不然。总之，这些数据表明，MyD88Alu RNA诱导的PRE变性的关键介体(mediator)。 
通常认为MyD88是免疫细胞的适体(O'Neill and Bowie,2007)。然而，Alu RNA通过MyD88诱导RPE单一培养物中细胞的死亡。因此，检测了Alu RNA诱导的小鼠的PRE变性是否仅仅依赖于RPE细胞中的MyD88的激活。通过对Myd88f/f小鼠膜下注射AAV1-BEST1-Cre的MyD88条件性消融使其免于Alu RNA诱导的PRE变性(图2J和9F)。与该发现一致，Alu RNA诱导接受Myd88–/–骨髓的WT小鼠的RPE变性，而对于接受WT骨髓的Myd88–/–小鼠却不是如此(图9G)。这些结果共同表明，RPE中而不是循环免疫细胞中的MyD88表达，对Alu RNA诱导的PRE变性是关键的。这些发现与病理学领域中未显示出免疫细胞渗透物的人GA组织的病理学研究一致(个人通信,C.A.Curcio,H.E.Grossniklaus,G.S.Hageman,L.V.Johnson)。 
虽然MyD88在TLR信号传导中是关键性的(O'Neill and Bowie,2007)，但通过Alu RNA激活MyD88独立于TLR的激活。因此检测了其他的MyD88参与机理。MyD88可以通过与IFN-γ受体1(由Ifngr1编码)相互作用而调节IFN-γ细胞传导(Sun and Ding,2006)。然而，pAlu诱导Ifng –/–和Ifngr1–/–小鼠的RPE变性(图9H和9I)。MyD88在细胞白介素-1信号传导中也是关键的(Muzio et al.,1997)。因此检测了IL-1β和相关细胞因子IL-18(两者均激活MyD88)(Adachi et al.,1998)是否介导Alu RNA细胞毒性。有意思的是，人RPE细胞中Alu RNA的超表达增强IL-18的分泌，而IL-1β的分泌几乎检测不到。 
重组IL-18诱导WT中的RPE变性而不诱导Myd88–/–小鼠的RPE变 性(图2L)。IL-18的中和作用保护WT小鼠免于pAlu诱导的RPE变性，而IL-1β却没有(图2M和2N)。并且，pAlu诱导Il1r1–/–小鼠的RPE变性，而不诱导Il18r1–/–小鼠的RPE变性(图9J和9K)。这些数据表明IL-18是Alu RNA诱导的细胞毒性的效应子。 
Alu RNA激活NLRP3炎性体 
探讨了胱天蛋白酶-1(由Casp1编码)是否参与Alu RNA诱导的PRE变性，胱天蛋白酶-1是诱导细胞白介素向生物活性形式成熟化的蛋白酶(Ghayur et al.,1997;Gu et al.,1997;Thornberry et al.,1992)。如蛋白质印迹法和底物切割的荧光报道子所测定的，对人RPE细胞的Alu RNA处理引起胱天蛋白酶-1的激活(图3A和图10A)。事实上，Alu RNA诱导其他细胞类型如HeLa和THP-1单核细胞中的胱天蛋白酶-1的激活(图10B)，这表明Alu RNA细胞毒性在很多系统中具有潜在的广泛影响。胱天蛋白酶-1抑制肽Z-WEHD-FMK的玻璃体内的送递阻抑IL-18的成熟和WT小鼠的pAlu诱导的RPE变性，而对照肽Z-FA-FMK则不然(图3B和3C)。胱天蛋白酶-1抑制肽阻抑人RPE细胞中Alu RNA诱导的底物切割(图10C)，这证实了其作用方式。同样，用Alu RNA或pAlu处理的Casp1–/–小鼠没有表现出RPE变性(图3D和10D)。并且，pAlu没有诱导Casp1–/–小鼠RPE细胞的细胞死亡(图3E)。 
胱天蛋白酶-1可以在称为炎性体的多蛋白先天性免疫复合物中激活(Tschopp et al.,2003)。具有最有特征性的炎性体途径是通过NLRP3与胱天蛋白酶-1适体ASC(由PYCAR编码D)结合而激活的途径。炎性体组装体的一个特征是PYCARD的空间聚簇(Fernandes-Alnemri et al.,2007)。在用荧光标记的PYCARD(GFP-PYCARD)转染的人RPE细胞中，Alu RNA诱导亮荧光的胞质集群的出现，这相似于用LPS和ATP进行的处理，其激活NLRP3炎性体(图3F和10E)(Mariathasan et al.,2006)。 
接下来检测了NLRP3和PYCARD与Alu RNA细胞毒性的功能相关性。pAlu和Alu RNA都不诱导Nlrp3–/–或Pycard–/–小鼠的RPE变性(图3G、3H、10F和10G)，这证明炎性体在Alu RNA细胞活性中的关键重要 性。并且，pAlu不诱导Nlrp3–/–或Pycard–/–小鼠RPE细胞的细胞死亡(图3I)。此外，通过siRNA抑制NLRP3或PYCARD营救了pAlu诱导的人RPE的细胞死亡(图3J和10H)。这些发现提供了直接的证据，即响应于Alu RNA的NLRP3的激活在RPE细胞中发生，并且不需要其他免疫细胞的存在。 
通过证明(1)虽然MyD88的抑制降低人RPE细胞中Alu RNA诱导的IRAK1/4去磷酸化(图9E)，但它没有降低Alu RNA诱导的胱天蛋白酶-1的切割或荧光底物切割(图10I和10J)；(2)IL-18中和并未抑制Alu RNA诱导的胱天蛋白酶-1的切割(图10K)；和(3)胱天蛋白酶-1的抑制降低Alu RNA诱导的IRAK1/4去磷酸化(图10L)，证明了IL-18和MyD88的激活确实是胱天蛋白酶-1激活的结果。 
Alu RNA诱导线粒体的ROS和NLRP3的引发 
NLRP3炎性体的功能需要两种信号，第一种称之为引发。当pAlu同时上调NLRP3和IL18mRNA时，其诱导炎性体的引发。这种引发在WT和Myd88–/–小鼠RPE细胞中等同地发生，这进一步印证了MyD88在该系统中在NLRP3的下游起作用。类似于不与NLRP3直接作用的其他炎性体激动剂(Tschopp and Schroder,2010)，没有观察到Alu RNA和NLRP3之间的物理相互作用(图11A)。为确定Alu RNA如何引发炎性体，研究了其是否诱导用于引发的信号的活性氧类别(ROS)的产生(Bauernfeind et al.,2011;Nakahira et al.,2011)。人RPE细胞中pAlu诱导的ROS的产生(图4B)，且ROS抑制剂二苯基碘(DPI)阻抑pAlu诱导的NLRP3和IL18mRNA的上调和Alu RNA诱导的WT小鼠的PRE变性(图4C和4D)。当DPI阻抑线粒体的ROS和吞噬体ROS(Li and Trush,1998)时，由于围绕贡献于NLRP3的响应的ROS的来源存在争议(Latz,2010)，因此检测了哪条途经被触发。 
将标记产生ROS的线粒体的MitoSOX Red和标记呼吸的线粒体的MitoTracker Deep Red组合使用。为了监控吞噬体ROS的产生，使用了Fc OxyBURST Green，其测定吞噬体中NADPH氧化酶的激活。在转染了 pAlu的人RPE细胞中观察到产生ROS的线粒体的明显增加(图4E)。相反，如预期的，十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯(phorbol myristate acetate,PMA)诱导吞噬体ROS(Savina et al.,2006)，而pAlu却不然(图4F)。这些数据与NLRP3响应受到线粒体ROS抑制剂的削弱(Nakahira et al.,2011;Zhou et al.,2011),但却保留在携带减少NADPH-氧化酶依赖性ROS产生的基因突变的细胞中(Meissner et al.,2010;van Bruggen et al.,2010)这一发现一致。 
与这些报道和细胞的ROS的基本来源是线粒体的观察结果(Murphy,2009)一致，已发现线粒体靶向的抗氧化剂Mito-TEMPO和MitoQ(Murphy and Smith,2007;Nakahira et al.,2011)两者均阻抑Alu RNA诱导的WT小鼠的PRE变性，而不清除线粒体ROS的MitoQ的结构类似物dTPP却不是如此(图4)。相反，抑制两种基本的NADPH氧化酶亚基(gp91phox和p47phox)结合的穿膜肽gp91ds-tat(Rey et al.,2001)不阻抑Alu RNA诱导的WT小鼠的PRE变性(图4H)。通过印证这些资料，Alu RNA诱导Cybb(其编码gp91phox)缺陷小鼠的RPE变性，就如同WT小鼠中一样(图4I)。接下来研究了电压依赖性阴离子通道(VDAC)，因为VDAC1和VDAC2但非VDAC3，对巨噬细胞中通过NLRP3激活剂产生的线粒体ROS很重要(Zhou et al.,2011)。与这些观察结果一致，VDAC1和VDAC2(但非VDAC3)的siRNA抑制减少pAlu诱导的线粒体ROS(图4J和11B)并消弱人RPE细胞中NLRP3和IL18mRNA的诱导(图4K)。总体来说，这些数据暗示，Alu RNA诱导型NLRP3炎性体介导的RPE变性中的线粒体ROS。 
Alu RNA不通过细胞凋亡诱导RPE变性 
Alu RNA激活胱天蛋白酶-1，其可以触发细胞凋亡，细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，其特征在于膜孔的形成和细胞溶菌作用(Fink and Cookson,2006)。细胞保护剂甘氨酸使细胞凋亡衰减(Fink et al.,2008;Fink and Cookson,2006;Verhoef et al.,2005)，其抑制由LPS+ATP而不是Alu RNA诱导的人RPE细胞的死亡(图5A和5B)。细胞凋亡需要胱天蛋白酶-1，但其可以不依赖IL-18而进行(Miao et al.,2010)。因此，IL-18诱导Casp1–/–小鼠的RPE变性(图5C)这一发现，加上缺少甘氨酸的营救助， 证明Alu RNA诱导的PRE变性不通过细胞凋亡发生。 
DICER1丧失通过炎性体诱导细胞死亡 
前面证明了DICER1在保持RPE细胞健康中的关键作用(Kaneko et al.,2011)：DICER1切割的Alu RNA没有在体内诱导RPE变性；DICER1的超表达保护细胞免于Alu RNA诱导的PRE变性；并且通过拮抗Alu RNA阻抑DICER1丧失诱导的RPE变性(Kaneko et al.,2011)。并且，通过抑制Alu RNA对DICER1抑制诱导的RPE变性的营救不会伴随微小RNA不足的恢复(Kaneko et al.,2011)。因此，检测了DICER1是否也阻止Alu RNA激活NLRP3炎性体。通过DICER1超表达抑制人RPE细胞中Alu RNA诱导的胱天蛋白酶-1的激活(图6A和6B)。相反，同时反义抑制Alu RNA，抑制了人RPE细胞中由DICER1抑制诱导的胱天蛋白酶-1切割(图12A和12B)。 
接下来在DICER1丧失的背景下在体内检测这些途径的相关性。胱天蛋白酶-1的切割在BEST1Cre;Dicer1f/f小鼠的RPE中增加(图6C)，在发育过程中所述小鼠失去DICER1的表达并表现出RPE变性(Kaneko et al.,2011)。Dicer1f/f小鼠中AAV1-BEST1-Cre的视网膜送递诱导RPE中胱天蛋白酶-1的激活和IL-18的成熟(图6D)。这种处理也诱导RPE变性，其被胱天蛋白酶-1-抑制肽而不是对照肽的玻璃体内送递阻抑(图6E)。MyD88-抑制肽而非对照肽的玻璃体内送递也阻抑了Dicer1f/f小鼠中AAV1-BEST1-Cre诱导的RPE变性(图6F)。另外，MyD88的抑制阻止靶向DICER1的用反义寡核苷酸处理的人RPE细胞中的细胞死亡(图6G)。人RPE细胞中的DICER1抑制增加IRAK1/4的磷酸化作用，从而进一步提供了DICER1丧失后MyD88激活的证据(图6H)。MyD88的抑制也阻止用编码Cre重组酶的腺病毒载体处理的Dicer1f/f小鼠的RPE细胞中的细胞死亡(图6I)。MyD88抑制阻抑RPE细胞死亡，而不会恢复由Dicer1抑制引起的微小RNA表达缺乏(图6J)。这些发现表明，DICER1是NLRP3炎性体激活的主要内源性负调节物，并且DICER1缺乏导致Alu RNA介导的、MyD88依赖性、微小RNA非依赖性的RPE变性。 
人GA的炎性体和MyD88的激活 
接下来检测了患有GA的人眼是否也显示出炎性体激活的证据，患有GA的人眼表现为在其RPE中的DICER1的丧失和Alu RNA的累积。患有GA的人眼的RPE中NLRP3mRNA的丰度，与对照眼相比显著增加(图7A)。在GA RPE中IL18和IL1B mRNA的丰度也增加；然而只有IL18水平的差异达到统计学显著性(图7A)。免疫定位研究表明，GA RPE中NLRP3、PYCARD和胱天蛋白酶-1蛋白的表达也增加(图7B-D)。蛋白质印迹分析印证了GA RPE中NLRP3和PYCARD的丰度增加，并揭示出GA RPE中，酶活性的切割的胱天蛋白酶-1p20亚基的水平大幅增加(图7E)。GA RPE中磷酸化的IRAK1和IRAK4的丰度也增加，这表明MyD88信号转导提高(图7E)。总得来说，这些数据提供了人GA中NLRP3炎性体和MyD88的原位激活的证据，映射出人RPE细胞培养和小鼠体内的函数型数据。 
讨论 
所述数据建立了GA发病机理中Alu RNA破坏先天免疫传感通路的功能作用。总体来说，所述发现表明，NLRP3炎性体感受GA相关的Alu RNA危险信号，对RPE变性有贡献，并潜在地贡献于AMD中的视力丧失(图13)。迄今为止，NLRP3炎性体的功能已很大程度上限于体内免疫细胞。它在RPE细胞存活中起到关键作用，这一发现扩宽了该炎性体的细胞范围，并提升了其他非免疫细胞可以使用该平台的可能性。 
NLRP3炎性体最初被认为是外部危险信号如微生物毒素的传感器(Kanneganti et al.,2006;Mariathasan et al.,2006;Muruve et al.,2008)。后来，报道了在疾病如痛风、动脉粥硬化、阿兹海默症和2型糖尿病中内源性晶体、多肽和脂质激活了它(Halle et al.,2008;Masters et al.,2010;Muruve et al.,2008;Wen et al.,2011)。据发明人所知，Alu RNA是已知激活此免疫平台的第一个内源核酸。该发现扩大了人慢性类疾病的内源性危险信号的多样性，并符合该炎性体是代谢危险的传感器的设想(Schroder et al.,2010)。 
抑制炎性体的激活对于限制炎性反应非常关键。病原体已发展了很多策略以抑制炎性体的激活(Martinon et al.,2009)。同样，宿主自噬蛋白(Nakahira et al.,2011)、I型干扰素(Guarda et al.,2011)和与巨噬细胞接触的T细胞可以抑制此过程(Guarda et al.,2009)。DICER1通过切割Alu RNA阻止了NLRP3的激活这一发现加入到宿主炎性体调节能力的指令系统中，并且揭示了一个新的方面，即稳态抗炎机制的调节异常是如何促进AMD的(Ambati et al.,2003;Takeda et al.,2009)。 
加上近期所述的抗凋亡和肿瘤相关的功能，DICER1成为多方面的蛋白。这种功能多样性是如何在各种状态下引导的还有待确定。由于在几种人类疾病中DICER1的调节异常被越来越多地认可，因此可以合理地假设Alu RNA也可能是在那些条件下激活危险信号的炎性体。还值得注意的是，至少在成年小鼠和多种鼠类以及人类细胞中，DICER1的微小RNA生物源功能对于细胞存活并不是关键的，至少在MyD88缺陷环境中(数据未示出)。 
线粒体ROS的产生参与Alu RNA诱导的PRE变性，这一数据与患有AMD的人眼的RPE中线粒体DNA损伤(Lin et al.,2011)、参与线粒体能量产生和运输的蛋白质的下调(Nordgaard et al.,2008)以及线粒体的数量和尺寸的降低(Feher et al.,2006)的观察结果一致。这些发现共同证明了对干扰线粒体ROS生成的潜在治疗性益处。 
当前针对炎性体的项目很大程度上关注于IL-1β；目前在注册的临床试验中没有IL-18抑制剂。然而，资料表明，在GA中介导RPE细胞死亡方面，IL-18比IL-1β更重要(相似于结肠炎模型中选择性IL-18的参与(Zaki et al.,2010))，这指出调节机制的存在，炎性体激活在细胞白介素效应子的水平或仅其在之前通过该调节机制进行分支。尽管胱天蛋白酶-1的抑制可能是具有吸引力的局部治疗策略，但胱天蛋白酶抑制剂可能促进替代的细胞死亡途径，这可能会限制其应用(Vandenabeele et al.,2006)。 
MyD88由于病原相关的分子模式引发的转导TLR信号而被熟知(O'Neill and Bowie,2007)，尽管近期它已在人的癌症中涉及(Ngo et al., 2011;Puente et al.,2011)。这些发现提出了MyD88的意料不到的新功能，即MyD88影响来自可以导致视网膜退化和失明的移动元件转录物的死亡信号，并且提高了MyD88可能是来自也使用胱天蛋白酶-1的其他非NLRP3炎性体的信号的中央集成器的可能性(Schroder and Tschopp,2010)。由于MyD88的非典型激活是GA中RPE变性的关键关卡(图13)，因此它代表了吸引人的治疗目标。潜在的担忧是，其在小鼠中的重要的抗微生物功能(O'Neill and Bowie,2007)。然而，与Myd88–/–小鼠相反，MyD88缺陷成年人被描述为是普通健康的，并且耐受大范围的微生物病原体(von Bernuth et al.,2008)。MyD88缺陷的人对于化脓性细菌感染具有窄的敏感性范围，并且只是在幼儿时期而不在成年时期(Picard et al.,2010)。此外，从siRNA和Myd88+/–的研究中明显证明，MyD88的部分抑制足以抵御Alu RNA。局部的眼内治疗是大部分视网膜疾病目前的标准治疗，会进一步限制不利感染的结果的可能性。可以合理地预见到MyD88抑制剂用于预防或治疗GA的发展。 
实验程序 
视网膜下注射与成像。使用微型注射器(Pico-Injector,PLI-100,Harvard Apparatus)进行视网膜下注射(1μL)。在体内用10%Neuroporter(Genlantis)转染质粒。在与数字成像系统(Sony)连接的TRC-50IX相机(Topcon)上进行眼底成像。使用抗闭锁小带-1(zonula occludens-1)的抗体(Invitrogen)对RPE的扁平封片进行免疫标记。 
mRNA丰度。使用Applied Biosystems7900HT快速实时PCR系统通过2–ΔΔCt方法对转录物的丰度进行实时RT-PCR定量。 
蛋白质丰度和活性。使用抗胱天蛋白酶-1的抗体(1:500;Invitrogen)、pIRAK1(1:500;Thermo Scientific)、pIRAK4(1:500,Abbomax)、PYCARD(1:200,Santa Cruz Biotechnology)、NLRP3(1:500,Enzo Life Sciences)和Vinculin(1:1,000;Sigma-Aldrich)，通过蛋白质印迹发对蛋白质丰度进行评价。使用CaspAlux1E1D2(OncoImmunin)根据制造商的使用说明对胱天蛋白酶-1活性进行可视化。 
小鼠。所有动物实验均得到机构审查委员会的批准并符合视力研究协会和用于眼科和实例研究的动物的用途的眼科学声明。野生型C57BL/6J、Cybb–/–、Tlr3–/–、Tlr4–/–(C57BL/10ScNJ)、Trif–/–(Ticam1Lps2)、Ifng–/–、Ifngr1–/–、Il1r1–/–、Il18r1–/–、Myd88f/f和Dicer1f/f小鼠购自Jackson Laboratory。Casp1–/–、Nlrp3–/–和Pycard–/–小鼠以前曾描述过(Kanneganti et al.,2006)。Unc93b1突变体小鼠由B.A.Beutler通过K.Fitzgerald慷慨提供。Myd88–/–和Tlr7–/–小鼠由S.Akira通过T.Hawn和D.T.Golenbock慷慨提供。Mda5–/–小鼠由M.Colonna慷慨提供。Prkr–/–小鼠由B.R.Williams和R.L.Silverman慷慨提供。Mavs–/–小鼠由Z.Chen通过K.Fitzgerald慷慨提供。通过腹腔内注射100mg/kg盐酸氯胺酮(Ft.Dodge Animal Health)和10mg/kg甲苯噻嗪(Phoenix Scientific)来实现用于所有步骤的麻醉，并用外用1%托品酰胺(Alcon Laboratories)扩散瞳孔。 
眼底摄影。用与数码成像系统(Sony)连接的TRC-50IX相机(Topcon)对散瞳的小鼠眼视网膜进行拍摄。 
人的组织。来自患有由于AMD引起的地图样萎缩的患者或没有AMD的年龄相仿的患者供体眼或眼组织获自各个眼库。在获得组织或眼之前或解剖后的眼球的检查之后，通过散瞳眼科检查确认这些诊断。该研究遵照赫尔辛基宣言的指导方针。机构审查委员会对样本的安置和组织学分析授予批准。 
免疫标记。将固定在2-4％多聚甲醛中的人眼制备成眼杯，在30％的蔗糖中冷冻保护，包埋于最佳切削温度化合物(组织-Tek OCT;Sakura Finetek)，并冰冻切层为10μm的切片。使用0.25%高锰酸钾和0.1%草酸实现脱色。用抗NLRP3的兔抗体(1:100,Sigma Aldrich)或抗胱天蛋白酶-1的兔抗体(预稀释的，AbCam)进行免疫组织化学着色。用第一抗体替代同种型IgG，以评价染色的特异性。用生物素缀合的二抗检测结合的抗体，随后用ABC试剂孵育，并通过Vector Blue(Vector Laboratories)可视化。使用左旋咪唑(Vector Laboratories)阻断内源性碱性磷酸酶活性。在PBS中清洗载片，用中性红(Fisher Scientific)复染色，用去离子水漂洗，风干， 然后在Vectamount(Vector Laboratories)中封片。用抗PYCARD的兔抗体(1:50,Clone N-15,Santa Cruz Biotechnology)进行人组织的荧光标记。免疫标记通过荧光缀合的抗-兔二抗(Invitrogen)进行可视化。通过将切片在0.3%苏丹黑(Fisher Scientific)中孵育来熄灭组织自体荧光。将载片在带有DAPI的Vectashield(Vector Laboratories)中封片。将小鼠RPE/脉络膜扁平封片用4%多聚甲醛或100%甲醇固定，用抗人闭锁小带-1的兔抗体(1:100,Invitrogen)染色，并用Alexa594(Invitrogen)进行可视化。使用Leica SP-5或Zeiss Axio Observer Z1显微镜获得所有图像。 
视网膜下注射。使用微型注射器(PLI-100,Harvard Apparatus)对小鼠进行视网膜下注射(1μL)。使用10%Neuroporter(Genlantis)实现编码两种不同Alu序列(pAlu)或空白对照载体(pNull)(Bennett et al.,2008;Kaneko et al.,2011;Shaikh et al.,1997)的质粒的体内转染。以1.0×1011pfu/mL注射AAV1-BEST1-Cre(Alexander and Hauswirth,2008)或AAV1-BEST1-GFP，并以0.3mg/mL注射体外转染的Alu RNA。 
药物治疗。将配制于si RNA缓冲液(20mM KCL,0.2mM MgCl2于pH7.5的HEPES缓冲液中；Dharmacon)或磷酸盐缓冲盐水(PBS;Sigma-Aldrich)中的siRNA、TLR4拮抗剂超纯类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)LPS(LPS-RS,InvivoGen)、MyD88同源二聚化的肽抑制剂IMG-2005(IMGENEX)、对照抑制剂(IMGENEX)、重组IL-18(Medical&Biological Laboratories)、抗小鼠IL-1β的中和鼠抗体(IMGENEX)、抗小鼠IL-18的中和鼠抗体(Medical&Biological Laboratories)、同种型对照IgG(R&D Systems或eBioscience，视情况而定)、胱天蛋白酶-1抑制剂Z-WEHD-FMK(R&D Systems)、胱天蛋白酶对照抑制剂Z-FA-FMK(R&D Systems)、DPI(Enzo Life Sciences)、Mito-TEMPO(Enzo Life Sciences)、MitoQ和dTPP(两种均吸收到环糊精中，并且由M.P.Murphy,MRC Mitochondrial Biology Unit提供)，以及gp91ds-tat和乱序gp91ds-tat(两者均来自Anaspec)，溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS;Sigma-Aldrich)或二甲基亚砜(DMSO;Sigma-Aldrich)中，并使用33-量规Exmire微量注射器(Ito  Corporation)将其以1μL的总量注射到玻璃体液中。为了评价MyD88阻抑pAlu诱导的RPE变性的效果，在注射pAlu一天后，在玻璃体内注入射1μL胆固醇(chol)缀合的MyD88siRNA(17+2nt;2μg/μL)。作为对照，以等同的剂量使用Luc siRNA-chol(17+2nt)。 
骨髓嵌合体。使用骨髓移植产生Myd88–/–嵌合体小鼠，其中将Myd88的基因缺陷限制于循环细胞(Myd88–/–→WT)或非造血组织(WT→Myd88–/–)。简言之，通过用RPMI1640冲洗，从同类系WT或Myd88–/–供体小鼠的股骨和胫骨中采集骨髓。在两次洗涤步骤后，将细胞重悬浮于RPMI1640中。将150μL的RPMI1640中的1×107个细胞注射到已辐照的供体小鼠的尾部静脉。产生两个嵌合体组：WT→Myd88–/–(WT细胞嵌入Myd88–/–小鼠)和Myd88–/–→WT(Myd88–/–细胞嵌入WT小鼠)。骨髓转移2个月后，对小鼠视网膜下注射Alu RNA、媒介、pAlu或pNull，并监控7日后的RPE变性。 
实时PCR。根据制造商的建议使用Trizol试剂(Invitrogen)，从组织或细胞中提取总RNA，进行Dnase(DAN酶)处理和反向转录(QuantiTect,Qiagen)。用Power SYBR green Master Mix、通过实时定量PCR(Applied Biosystems7900HT快速实时PCR系统)扩增RT产物(cDNA)。使用了对人IL1B(正向5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3'和反向5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3')、人IL18(正向5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3'和反向5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3')、人NLRP3(正向5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3'和反向5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3')、人PYCARD(正向5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3'和反向5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3'),人VDAC1(正向5'-actgcaaaatcccgagtgac-3'和反向5'-ctgtccaggcaagattgaca-3')、人VDAC2(正向5'-cagtgccaaatcaaagctga-3'和反向5’-cctgatgtccaagcaaggtt-3')、人VDAC3(正向5'-ttgacacagccaaatccaaa-3'和反向5'-gccaaaacgggtgttgttac-3')、 人18S rRNA(正向5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3'和反向5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3'), 
小鼠Myd88(正向5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3'和方向5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3')、小鼠Nlrp3(正向5’-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3’和反向5’-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3’)、小鼠Il18(正向5’-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3’和反向5’-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3’)和小鼠18S rRNA(正向5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3'和反向5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3')有特异性的寡核苷酸引物。QPCR的循环条件为50℃下2min(分钟)，95℃下10min，随后进40个循环的两步扩增程序(95℃下15s和58℃下1min)。扩增结束时，使用来自序列检测系统的分离方法(dissociation protocol)进行熔解曲线分析，以排除带有非特异性PCR产物的杂质。还通过琼脂糖凝胶确认PCR产物，并仅显示出一条特定的预测尺寸的带。对于阴性对照，QPCR中RT产物没有用作模板，并通过凝胶检测带的缺少得到验证。靶基因的相对表达通过2 –ΔΔCt方法得以确定。. 
miRNA的定量。使含miRNA的总RNA聚腺苷酸化并使用通用引物，根据制造商的说明书利用All-In-One miRNA q-RT-PCR检测试剂盒(GeneCopoeia)使用通用反向引物与以下正向引物结合进行逆转录:小鼠miR-184(5'-TGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3')；小鼠miR-221/222(5'-AGCTACATCTGGCTACTGGGT-3')；小鼠miR-320a(5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3')，和小鼠miR-484(5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3')。使用2–ΔΔCt方法将miRNA水平归一化为U6snRNA(5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3')的水平。通过SYBR green qPCR在以下条件下进行检测：95℃下10min，随后进行40个95℃下10s(秒)、60℃下20s和72℃下20s的循环。通过熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳产生独特条带来评价扩增子的特异性。 
蛋白质印迹。使组织或细胞在细胞溶解缓冲液(10mM Tris碱、pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%Triton X-100、0.5%NP-40、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Roche))中均匀化。使用Bradford试验试剂盒(Bio-Rad)以牛血清白蛋白作为标准物测定蛋白浓度。使蛋白(40-100μg)在NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上跑胶，并转印至Immun-Blot PVDF膜(Bio-Rad)上。将细胞刮落在热Laemmli缓冲液(62.5mM Tris碱、pH6.8、2%SDS、5%2-巯基乙醇、10%甘油、0.01%溴酚蓝)中。煮沸样品，并在4–20%NuPAGE Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上跑胶。转印的膜在室温下封闭1h，并用抗人胱天蛋白酶-1(1:500;Invitrogen)、小鼠胱天蛋白酶1(1:500;MBL)、NLRP3(1:1000;Enzo Life Sciences)、PYCARD(1:1000,RayBiotech)、磷酸-IRAK1(S376)(1:500,Thermo Scientific)、磷酸-IRAK4(T345)(1:500,AbboMax)、DICER1(1:2000;Bethyl)、MyD88(1:1000;Cell Signaling)和小鼠IL-18(1:200;MBL)的抗体在4℃下过夜培养。使用抗-粘着斑蛋白抗体(1:1000;Sigma-Aldrich)通过蛋白质印迹评价蛋白质的装载。在室温下使用二抗(1:5000)1h(小时)。通过增强化学发光(ECL plus)使信号可视化，并通过VisionWorksLS图像采集和分析软件(Version6.7.2,UVP,LLC)获取信号。 
细胞培养。所有细胞培养物维持在37℃和5%CO2的条件下。如前所述将原代小鼠RPE细胞分离(Yang et al.,2009)，并在补充有20%FBS和标准抗生素浓缩物的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco Modified Eagle Medium,DMEM)中生长。如前所述分离原代人RPE细胞(Yang et al.,2008)，并维持在补充有10%FBS和抗生素的DMEM中。将HeLa细胞维持在补充有20%FBS和标准抗生素浓缩物的DMEM中。将THP-1细胞培养于补充有10%FBS和抗生素的RPMI1640培养基中。 
Alu RNA的体外转录。合成了两种Alu RNA：源自cDNA克隆TS103(Shaikh et al.,1997)的281nt Alu序列和从患有地图样萎缩的人眼的RPE中分离的302nt Alu序列。根据制造商的说明，使含有这些有相邻的5'T7启动子的Alu序列的线性质粒与相邻的5'T7启动子经受 AmpliScribeTMT7-FlashTM转录试剂盒(Epicentre)的处理。使用MEGAclearTM(Ambion)对Dnase处理的RNA纯化，并且通过凝胶电泳来监控完整性。这产生了单链RNA，其折叠成等同于Pol III衍生的转录物的限定的二级结构。特别注明，用小牛肠碱性磷酸酶(Invitrogen公司)将转录的RNA脱磷酸化，并用苯酚：氯仿：异戊醇沉淀再纯化。 
瞬时转染。根据制造商的说明，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，利用pUC19、pAlu、pCDNA3.1/Dicer-FLAG、pCDNA3.1、Alu RNA、NLRP3siRNA有义(5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3')、PYCARD siRNA有义(5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3')、MyD88siRNA有义(有义:5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3')、VDAC1siRNA有义(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')、VDAC2siRNA有义(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')、VDAC3siRNA有义(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')、DICER1反义寡核苷酸(AS)(5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3')、对照(用于DICER1)AS(5'-TTGGTACGCATACGTGTTGACTGTGA-3')、Alu AS(5'-CCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCACGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCGACACCACTCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTT-3')、对照(用于Alu)AS(5'-GCATGGCCAGTCCATTGATCTTGCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCTATCCTCCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-3')转染人或小鼠的RPE细胞。 
腺病毒感染。以15×103/cm2的密度进行细胞涂布，并在16小时后，在大约50％的汇合时，用AdCre或AdNull(Vector Laboratories)感染，感染复数为1000。 
细胞活力。使用CellTiter96水性单溶液细胞增殖测定(Promega)根据制造商的说明进行MTS试验。为了检验甘氨酸在Alu RNA诱导的细胞死亡中的细胞保护作用，用pNull/pAlu转染人RPE细胞。在转染后6小时用含甘氨酸(5mM)的完全培养基或者媒介孵育细胞，并在24小时后评价 细胞活力。类似地，在含有甘氨酸(5mM)的培养基的存在下，用ATP(25μM)处理由LPS(5μg/ml进行6h)引发的人RPE细胞。30min后，如上所述，，对ATP的细胞活力进行评价。 
胱天蛋白酶-1的活性。根据制造商的说明，通过用CaspAlux1E1D2试剂(OncoImmunin)孵育细胞来可视化胱天蛋白酶-1的活性。使用Synergy4读数器(Biotek)读取荧光值(激发552nm,发射580nm)，量化CaspAlux1E1D2信号。通过在Adobe Photoshop CS5中将图像转化为灰度图，对来自图像的荧光进行量化，并使用ImageJ软件(NIH)(Bogdanovich et al.,2008)测量黑白图像的累积密度。 
ROS的产生。使用ROS特异性探针2’7’-二氯二氢荧光蛋白二醋酸盐(H2DCFDA,BioChemica,Fluka)评价细胞ROS的产生。使用MitoSOXTMRed(Invitrogen)评价线粒体ROS的产生。用pNull或pAlu转染亚汇合(sub-confluent)的人RPE细胞。24h(小时)后，在37℃下用10μM H2DCFDA或用于活体细胞成像的MitoSOXTMRed(Invitrogen)线粒体超氧化物指示剂装载细胞10min，并用PBS冲洗两次。对于H2DCFDA，使用Synergy4图数器(Biotek)、利用FITC过滤器(激发485nm,发射538nm)记录96孔板中的荧光值。为了可视化与线粒体ROS信号共存的呼吸线粒体，在用PBS洗涤后，在37℃下用MitoTracker Deep RedTM(Invitrogen)孵育细胞30min，然后用PBS洗涤两次。使用Leica SP-5或Zeiss Axio Observer Z1显微镜检测荧光信号。用Fc-OXYBURST GreenTM测定(Invitrogen)评价吞噬体ROS的产生。用pNull或pAlu转染或用PMA(0.5μg/ml;Sigma-Aldrich)处理亚汇合的人RPE细胞。在添加Fc-OXYBURST GreenTM前，在37℃下用Krebs-Ringer’s PBS(KRP)孵育细胞20min。在添加Fc-OXYBURST GreenTM后，使用FITC过滤器(激发485nm，发射538nm)，通过Synergy4读数器(Biotek)立即测量来自细胞的总荧光值。 
RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP):根据制造商的使用说明(Active Motif)，使用RNA ChIP-IT试剂盒检测NLRP3和Alu RNA之间的物理相互作用。简而言之，用pAlu和pNLRP3-FLAG(由G.
Figure BDA0000478497860000551
提供)转染人 RPE细胞，用抗NLRP3(Enzo Life Sciences)、FLAG(Sigma-Aldrich)或对照IgG(Sigma-Aldrich)的抗体免疫沉淀蛋白-RNA复合物。使用Alu-特异性引物用实时RT-PCR分析从这些免疫沉淀物分离的RNA。 
ELISA。根据制造商的说明，使用人IL-1β和IL-18ELISA试剂盒(R&D)对条件细胞培养基中分泌的细胞因子含量进行分析。 
TLR筛选。使用超表达各个TLR家族成员的细胞并结合AP-1/NF-κB报告基因系统通过InvivoGen进行常规TLR配体筛选。用通过体外转录合成的两种Alu RNA中的每一种或者TLR-特异性阳性对照配体刺激细胞。 
统计。结果表示为平均值±SEM，p<0.05认为是统计学显著的。视情况，使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)和斯氏t检测(Student t-test)比较组之间的差异，并报道了双尾p值(2-tailed p vAlue)。 
实施例2 
据证明，体外转录的Alu RNA和质粒编码的Alu(pAlu)都通过诱导IL-18分泌诱导RPE细胞死亡,IL-18分泌触发MyD88依赖性信号传导,其导致胱天蛋白酶-3的激活。寻求决定该细胞死亡途径中干预机械性步骤。 
已知胱天蛋白酶-8激活胱天蛋白酶-3(Stennicke et al.1998)。因此，检测了胱天蛋白酶-8抑制是否会抑制由Alu RNA或pAlu RPE诱导的细胞死亡或变性。已发现胱天蛋白酶-8抑制肽Z-IETD-FMK阻抑野生型小鼠中由pAlu诱导的RPE变性(图14)，而对照肽Z-FA-FMK却不会。Z-IETD-FMK也抑制由Alu RNA(图15)或pAlu(图16)诱导的人RPE细胞死亡。还发现，重组IL-18的视网膜下注射诱导野生型小鼠的RPE(图17)的胱天蛋白酶-8的激活，如荧光试验所监控的。这些数据表明Alu RNA或pAlu诱导的IL-18导致胱天蛋白酶-3激活上游的胱天蛋白酶-8的激活。 
已知MyD88结合Fas相关的死亡结构域蛋白(FADD)，并通过胱天蛋白酶8诱导细胞凋亡(Aliprantis et al.2000)。因此，检测了Fas(由CD95编码)或FasL(由Faslg编码)的消融是否会抑制由Alu RNA、pAlu或IL-18诱导的RPE细胞死亡或变性。发现pAlu(图18)和Alu RNA(图19)都不 诱导CD95-/-(Faslpr)小鼠的RPE变性。另外，重组IL-18也不诱导CD95-/-(Faslpr)小鼠的RPE变性(图20)。同样地，pAlu(图21)、Alu RNA(图22)和IL-18(图23)都不诱导Faslg-/-(Faslgld)小鼠的RPE变性。 
已证明，Alu RNA通过NLRP3炎性体诱导RPE变性。因为NF-κB的激活需要NLRP3的激活(Bauernfeind et al.2009;Qiao et al.2012)，因此检测了Alu RNA是否需要NF-κB来诱导RPE变性。事实上发现，Alu RNA并不诱导Nfkb1-/-小鼠的RPE变性，这证明NF-κB激活是该细胞死亡途径中的关键步骤。 
实验步骤 
小鼠。所有动物实验均得到机构审查委员会的批准并符合视力研究协会和用于眼科和视力研究的动物的用途的眼科学声明。野生型C57BL/6J、Fas–/–(a.k.a CD95or Faslpr)Faslg–/–(a.k.a.Fasgld)和Nfkb1–/–小鼠购自Jackson Laboratory。通过腹腔内注射100mg/kg盐酸氯胺酮(Ft.Dodge Animal Health)和10mg/kg甲苯噻嗪(Phoenix Scientific)来实现用于所有步骤的麻醉，并用外用1%托品酰胺(Alcon Laboratories)扩散瞳孔。 
眼底摄影。用与数码成像系统(Sony)连接的TRC-50IX相机(Topcon)对散瞳的小鼠眼视网膜照片进行拍摄。 
视网膜下注射。使用微型注射器(PLI-100,Harvard Apparatus)对小鼠进行视网膜下注射(1μL)。使用10%Neuroporter(Genlantis)实现编码两种不同Alu序列(pAlu)或空白对照载体(pNull)(Bennett et al.,2008;Kaneko et al.,2011;Shaikh et al.,1997)的质粒的体内转染。以0.3mg/mL注射体外转染的Alu RNA。 
药物治疗。将重组IL-18(Medical&Biological Laboratories)、胱天蛋白酶-8抑制剂Z-IETD-FMK(R&D Systems)、胱天蛋白酶对照抑制剂Z-FA-FMK(R&D Systems)、IRAK1/4抑制剂(Calbiochem)溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS;Sigma-Aldrich)或二甲基亚砜(DMSO;Sigma-Aldrich)中,并使用33-量规Exmire微量注射器(Ito Corporation)将其以1μL的总量注射到玻璃体液中。 
细胞培养。将所有细胞培养物维持在37℃和5%CO2的条件下。如前所述将原代小鼠RPE细胞分离(Yang et al.,2009)，并在补充有20%FBS和标准抗生素浓缩物的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco Modified Eagle Medium,DMEM)中生长。如前所述分离原代人RPE细胞(Yang et al.,2008)，并维持在补充有10%FBS和抗生素的DMEM中。将HeLa细胞维持在补充有20%FBS和标准抗生素浓缩物的DMEM中。在补充有10%FBS和抗生素的RPMI1640培养基中培养THP-1细胞。 
Alu RNA的体外转录。我们合成了从患有地图样萎缩的人眼的RPE中分离的302nt Alu序列。根据制造商的说明，使含有这些具有相邻的5'T7启动子的Alu序列的线性质粒经受AmpliScribeTM T7-Flash TM转录试剂盒(Epicentre)的处理。使用MEGAclear TM(Ambion)对Dnase处理的RNA纯化，并且通过凝胶电泳来监控完整性。这产生了单链RNA，其折叠成等同于Pol III衍生的转录物的限定的二级结构。特别注明，用小牛肠碱性磷酸酶(Invitrogen)将转录的RNA脱磷酸化，并用苯酚：氯仿：异戊醇沉淀再纯化。 
瞬时转染。根据制造商的说明，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，使pUC19、pAlu、Alu RNA、VDAC1siRNA有义(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')、VDAC2siRNA有义(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')、VDAC3siRNA有义(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')转染人或小鼠的RPE细胞。 
细胞活力。使用CellTiter96水性单溶液细胞增殖测定(Promega)根据制造商的说明进行MTS试验。 
胱天蛋白酶-8活性。使RPE组织在细胞溶解缓冲液(10mM Tris碱、pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%Triton X-100、0.5%NP-40、蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(Roche))中均匀化。使用Bradford试验试剂盒(Bio-Rad)以牛血清白蛋白作为标准物测定蛋白浓度。根据制造商的说明，使用胱天蛋白酶-8荧光测定(R&D)测量胱天蛋白酶-3的活性。 
统计。结果表示为平均值±SEM，p<0.05视为统计学上显著的。视情况，使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)和斯氏t检测(Student t-test)比较组之间的差异，并报道了双尾p值(2-tailed p vAlue)。 
用于胱天蛋白酶成像的方法 
在第0天，将Alu RNA或重组IL-18注射到野生型小鼠的视网膜下腔。在注射后的第2天或第3天，将在生物活性胱天蛋白酶的存在下发出荧光的探针DyeLight782-VAD-FMK3(ThermoScientific)注射到野生型小鼠的玻璃体液内。 
扁平封片成像。在注射DyeLight782-VAD-FMK3后24小时，将眼杯从小鼠中解剖出来，除去神经视网膜，制备RPE的扁平封片，在荧光显微镜下观察。 
活体眼内的体内生物成像。以注射DyeLight782-VAD-FMK3后的0-24小时的间隔，使用ICG过滤器与Topcon50IX相机拍摄眼底照片。 
在本文件中，提及了各种参考文献。所有的这类参考文献通过引用的方式并入本文，就如同每一单个文献被明确和单独地说明被引用作为参考一样，包括以下列出的参考文献： 
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应理解的是，在不背离本文公开的主题的范围的情况下，可以对现在公开的主题的各种细节作出改变。此外，前面的描述仅作为说明的用途，不作为限制用途。 

Claims (62)

1.保护细胞的方法，包括：抑制所述细胞的炎性体、所述细胞的MyD88、所述细胞的IL-18、所述细胞的VDAC1、所述细胞的VDAC2、所述细胞的胱天蛋白酶-8和所述细胞的NFκB中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是RPE细胞、视网膜光感受器或脉络膜细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞是RPE细胞。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，保护所述细胞免受Alu-RNA诱导的变性。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抑制MyD88包括施用MyD88抑制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述抑制剂包含选自序列SEQID NO:1、54和55的多肽序列。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述抑制剂是抑制MyD88表达的双链RNA分子，其至少一条链包括选自SEQ ID NOS:3、4、5、6和56的序列。
8.如权利要求5所述的方法，其中，所述MyD88抑制剂是MyD88同源二聚化抑制剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述MyD88抑制剂是Pepinh-MYD(Invitrogen)。
10.如权利要求5所述的方法，其中，所述MyD88抑制剂是MyD88的显性负性变体或剪接变体。
11.如权利要求11所述的方法，其中，所述MyD88抑制剂是缺少外显子2的MyD88剪接变体。
12.如权利要求5所述的方法，其中，所述MyD88抑制剂选自表C所列举的那些。
13.如权利要求5-12中任一项所述的方法，其中所述抑制剂通过以下方式来施用：玻璃体内注射；视网膜下注射；巩膜注射；Tenon囊下注射；眼球后注射；球周注射；局部滴眼剂应用；从缓释植入装置释放，所述装置缝合或连接或放置在巩膜上，或注射到玻璃体液中，或注射到前房中，或者植入透镜袋或胶囊中；口服给药；或静脉内给药。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述炎性体包括PYCARD编码的蛋白。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述炎性体选自NLRP3炎性体、NLRP1炎性体、NLRC4炎性体、AIM2炎性体和IFI16炎性体。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述炎性体是NLRP3炎性体。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，抑制所述炎性体包括施用炎性体抑制剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述炎性体抑制剂选自表A所列举的那些。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述炎性体抑制剂是NLRP3抑制剂和/或PYCARD抑制剂。
20.如权利要求17所述的方法，其中，所述炎性体抑制剂包含选自序列SEQ ID NOS:7-16的序列。
21.如权利要求17所述的方法，其中，所述炎性体抑制剂是胱天蛋白酶-1抑制剂。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述炎性体抑制剂是胱天蛋白酶-1的肽抑制剂。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中，所述胱天蛋白酶-1抑制剂包含序列SEQ ID NO:17。
24.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂通过以下方式来施用：玻璃体内注射；视网膜下注射；巩膜注射；Tenon囊下注射；眼球后注射；球周注射；局部滴眼剂应用；从缓释植入装置释放，所述装置缝合或连接或放置在巩膜上，或注射到玻璃体液中，或注射到前房中，或者植入透镜袋或胶囊中；口服给药；或静脉内给药。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抑制IL-18包括施用IL-18抑制剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述IL-18抑制剂是抗IL-18的中和抗体。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述IL-18抑制剂是阻抑IL-18结合到IL-18受体的抗体。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述IL-18抑制剂是IL-18结合蛋白。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述IL-18抑制剂选自表D所列举的那些。
30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂通过以下方式来施用：玻璃体内注射；视网膜下注射；巩膜注射；Tenon囊下注射；眼球后注射；球周注射；局部滴眼剂应用；从缓释植入装置释放，所述装置缝合或连接或放置在巩膜上，或注射到玻璃体液中，或注射到前房中，或者植入透镜袋或胶囊中；口服给药；或静脉内给药。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抑制VDAC1包括施用VDAC1抑制剂。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述VDAC1抑制剂包含序列SEQ ID NO:47。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抑制VDAC2包括施用VDAC2抑制剂。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述VDAC2抑制剂包含序列SEQ ID NO:48。
35.如权利要求31或33所述的方法，其中所述VDAC1或VDAC2抑制剂选自表E所列举的那些。
36.如权利要求31-35中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂通过以下方式来施用：玻璃体内注射；视网膜下注射；巩膜注射；Tenon囊下注射；眼球后注射；球周注射；局部滴眼剂应用；从缓释植入装置释放，所述装置缝合或连接或放置在巩膜上，或注射到玻璃体液中，或注射到前房中，或者植入透镜袋或胶囊中；口服给药；或静脉内给药。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抑制胱天蛋白酶-8包括施用胱天蛋白酶-8抑制剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述胱天蛋白酶-8抑制剂选自表F所列举的那些。
39.如权利要求37-38中任一项所述的方法，其中所述抑制剂通过以下方式来施用：玻璃体内注射；视网膜下注射；巩膜注射；Tenon囊下注射；眼球后注射；球周注射；局部滴眼剂应用；从缓释植入装置释放，所述装置缝合或连接或放置在巩膜上，或注射到玻璃体液中，或注射到前房中，或者植入透镜袋或胶囊中；口服给药；或静脉内给药。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抑制NFκB包括施用NFκB抑制剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述NFκB抑制剂选自表G所列举的那些。
42.如权利要求40-41中任一项所述的方法，其中所述抑制剂通过以下方式来施用：玻璃体内注射；视网膜下注射；巩膜注射；Tenon囊下注射；眼球后注射；球周注射；局部滴眼剂应用；从缓释植入装置释放，所述装置缝合或连接或放置在巩膜上，或注射到玻璃体液中，或注射到前房中，或者植入透镜袋或胶囊中；口服给药；或静脉内给药。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞在个体中。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述个体患有或潜在患有目标病症。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述个体需要治疗地图样萎缩。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述个体患有年龄相关性黄斑变性。
47.抑制MyD88表达的分离的双链RNA分子，其中，所述双链RNA的第一条链包含选自SEQ ID NO:3、4、5、6和56并包括约11-27个核苷酸。
48.抑制NLRP3和/或PYCARD表达的分离的双链RNA分子，其中，所述双链RNA的第一条链包含选自SEQ ID NO:7-14并包括约11-27个核苷酸。
49.抑制Pyrin表达的分离的双链RNA分子，包含序列SEQ IDNO:15，并包括约11-27个核苷酸。
50.抑制NALP3表达的分离的双链RNA分子，包含序列SEQ IDNO:16，并包括约11-27个核苷酸。
51.抑制胱天蛋白酶-1表达的分离的双链RNA分子，包含序列SEQID NO:17，并包括约11-27个核苷酸。
52.抑制VDAC1和/或VDAC2表达的分离的双链RNA分子，其中，所述双链RNA的第一条链包含选自SEQ ID NO:47和48并包括约11-27个核苷酸。
53.鉴定MyD88抑制剂的方法，包括：
提供培养的细胞，其中MyD88被上调或发生寡聚化或诱导IRAK1或IRAK4的磷酸化；并
使所述细胞与候选化合物接触；以及
确定所述候选化合物是否导致MyD88水平的变化，或是否导致二聚化或寡聚化MyD88的丰度变化，或是否导致磷酸化IRAK1或磷酸化IRAK4的丰度变化。
54.如权利要求53所述的方法，其中，通过Alu RNA、脂多糖、CpG核苷酸、单链RNA、白介素-1β或白介素18上调MyD88。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中，通过测量细胞活力或测量已知由MyD88信号传导诱导的基因的表达来监控MyD88。
56.如权利要求55所述的方法，其中，所述已知由MyD88信号传导诱导的基因选自Cox-2、Socs3和TNF-α。
57.鉴定MyD88抑制剂的方法，包括：
提供培养的细胞，其中MyD88被上调或发生寡聚化或诱导IRAK1或IRAK4的磷酸化；并
使所述细胞与候选化合物接触；以及
确定二聚化或寡聚化MyD88的丰度。
58.鉴定MyD88抑制剂的方法，包括：
提供用编码融合MyD88蛋白的质粒转染的培养的细胞已知的MyD88激活剂，所述融合MyD88蛋白被标记到荧光蛋白片段；以及
测量荧光信号，以确定所述受试化合物抑制荧光信号的程度。
59.鉴定炎性体抑制剂的方法，包括：
提供编码荧光标记的PYCARD的质粒转染的培养的细胞；
用Alu-RNA或LPS+ATP刺激所述细胞；
监控荧光PYCARD的聚集；以及
确定受试化合物对PYCARD聚集的影响。
60.鉴定IL-18抑制剂的方法，包括：
提供IL-18转染的细胞；
用Alu-RNA或LPS+ATP刺激所述细胞；以及
确定受试化合物对MyD88水平的影响。
61.用于对个体的眼中激活的胱天蛋白酶-1成像的诊断性组合物，包含与胱天蛋白酶-1的底物缀合的荧光分子，或被胱天蛋白酶-1切割后发荧光的分子。
62.用于对个体的眼中激活的胱天蛋白酶-1成像的方法，包括：
对所述个体的RPE细胞通过眼内或静脉内施用权利要求35所述的组合物；并且
光学监控荧光的空间聚簇。
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