CN101084240A

CN101084240A - MyD88同型二聚体化抑制剂

Info

Publication number: CN101084240A
Application number: CNA2005800437629A
Authority: CN
Inventors: P·卡米纳蒂; G·加洛; N·范托; V·鲁格吉洛; M·萨斯萨诺; D·马斯特罗雅尼
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2004-12-20
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2007-12-05
Also published as: KR20070094802A; WO2006067091A1; JP2008524167A; CA2590750A1; EP1828246A1; BRPI0519148A2; AU2005318226A1; MX2007007259A; US20080064643A1

Abstract

本发明涉及具有结构式(X－)AA₁－AA₂－AA₃－AA₄－AA₅－AA₆－AA₇的拟肽化合物，其中，在本文下文中定义了多个基团，所述化合物模拟MyD88的特定蛋白部分，阻止其同型二聚体化，干扰其与TIR结构域之间的相互作用。本发明还提供了用于制备所述化合物的方法、含有它们的药物组合物以及它们作为药剂的用途，特别是用于治疗炎性疾病和自身免疫疾病的。

Description

MyD88同型二聚体化抑制剂

技术领域

本发明涉及肽(peptidic)和拟肽化合物，所述化合物模拟MyD88的特定蛋白部分，阻止其同型二聚体化，以及干扰其与TIR结构域之间的相互作用。

本发明提供了制备所述化合物的方法、含有它们的药物组合物以及它们作为药剂的用途，特别是用于治疗炎性疾病和自身免疫疾病的。

发明背景

炎性反应通常是防御天性的反应，其由活的生物体激活，以区分以及随后清除物理化学伤害导致的损伤以及感染性攻击。但是，在一些情况下，由于持续刺激导致的急性炎性事件进化为炎性过激活的状态，其趋向于变成慢性，通常导致正常的周围组织的自身毁灭。该过程是由下述这些导致的：对粘附分子(adhesive molecule)的增加的诱导，炎性细胞成分在病理伤害位点的迁移以及随后炎性介体能量的释放(Shanley，T.P.，et al.；Mol.Med.Today，40-45，1995)。

各种介体的转录序列和可能的生产处于已知作为转录因子或TFs的特定蛋白因子的控制之下(Müller， C.W.；Curr.Opin.Struct.Biol.，11：26-32，2001)。这些因子一旦被激活，会与DNA中存在的特定共有区域结合，作为分子开关，用于对炎性试剂的基因表达进行诱导或过调节。

最经常被研究的转录因子(由于其参与多种炎性状况)，毋庸置疑是NF-κB，其识别针对编码前炎性细胞因子(TNF、IL-1、IL-2、IL-6、IL-11、IL-17、GM-CSF)、趋化因子(IL-8、RANTES、MIP-1α、MCP-2)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-选择蛋白)和生产炎性介体的酶(iNOS和COX2)的多种基因的增强子的共有序列(Ghosh，S.，et al.；Annu.Rev.Immunol，16：225-260，1998)。

应答于各种类型的损伤刺激，在免疫应答涉及的几乎所有细胞中都观察到NF-κB激活：嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞以及内皮、上皮及间质细胞。对NF-κB的即时短暂激活由此构成了对病原性损伤的正常生理应答功能中最为重要的特征。但是，已发现，对该精细机制的调节不良(使其自身处于过量的、永久的激活形式)与慢性炎性疾病紧密相关(Barnes，P.J.和Karin，M.；New Engl.J.Med.，336：1066-1071，1997)。

NF-κB在导致慢性炎性疾病中的重要作用使得该因子成为定向治疗干涉方法的治疗靶标。

在考虑到“抗NF-κB”疗法的安全性的那些情况下，必须在非特异性副作用和直接由对NF-κB的内在抑制导致的副作用加以区分。因为后者在关于正常细胞生理应答的方面构成多种信号汇合的关键点，预测对NF-κB的延伸广泛的、全身性的抑制是否导致不想要的损伤作用是模棱两可的。就将此类拮抗剂用于治疗应用的目的而言，明显出现了下述需要：确定允许有效治疗同时又尽可能地使得不想要的影响最小化的物质。对设计可能的NF-κB拮抗剂的首要重要的参数因此由对活性的选择性构成。

此外，人们预期，能通过干扰接近的炎性信号系统来抑制NF-κB的药理试剂可能比作用于关系更远的生物化学事件的那些试剂要安全。

导致IL-1的结合以及导致对转录因子(例如NF-κB和AP-1)的激活的分子事件通过基于对多种蛋白因子的顺序激活的放大级联发生。

具体而言，IL-1的结合诱导了受体异源复合物IL-1R/1L-1RacP的形成，其随后吸引进衔接(adaptor)蛋白MyD88。通过置于各自的TIR结构域之间的嗜同型相互作用，IL-1R e IL-1RAcP的细胞内原生质体结构域与MyD88发生的相互作用值得强调。由于MyD88的羧基末端部分(TIR结构域)对于使MyD88结合到受体异源复合物上有作用，而氨基末端部分(死亡结构域)则通过与激酶IRAK的死亡结构域之间的相互作用(在本情况下，也是通过嗜同型相互作用)，允许将后者吸引到异源复合体上，这是其磷酸化发生的位置。磷酸化发生之后，IRAK据信会从复合物上自己脱离下来，在于蛋白体中被降解之前与衔接蛋白TRAF6发生相互作用。TRAF6进而导致对激酶TAK1的激活，该激酶自身磷酸化，随后激活激酶MAP2K和NIK(NF-κB诱导激酶)。最终结果是MAP2K和NIK导致了对参与编码重要炎性介体的基因的转录的转录因子AP1和NF-κB分别的激活。

近些年来进行的研究已支持了关于在IL-1R/TLR超家族中存在共有转导机制的假设。有力地说，已证实(O′Neill，LAJ andDinarello，CA；Immunology Today，21(5)：206-209，2000)：IL-1激活的信号的转导机制还在IL-18 ed LPS的信号传递中生效。

具体而言，其显示：衔接蛋白MyD88在IL-1、IL-18和LPS诱发的转导事件中扮演重要角色。事实上已有报道：MyD88 KO小鼠虽被证明可完美存活，但其缺乏应答LPS的刺激的正常能力(Kawai，T，etal.；Immunity，11：115-122，1999)。

这些结果在不同的实验设置中得到证实，其中，MyD88的点突变，F56N(其阻止MyD88的功能活性二聚体的形成)不会诱导对NF-κB转录因子的激活(Burns K et al.，J Biol Chem 273(20)：12203-12209，1998)。

此外，还建立了进一步的研究(Adachi，O.，et al.；Immunity，9：143-150，1998)，MyD88 KO小鼠对用IL-1或IL-18的刺激没有应答。事实上，已观察到：如果用IL-1进行刺激，这些KO小鼠的胸腺细胞和脾细胞不能激活正常的增殖应答。此外，IFN-γ和NK细胞活性的产生并不作为用IL-18刺激的结果而增加，这与在野生型小鼠中发生的不同。

基于上面列出的发现，明显地，MyD88在多种不同炎性刺激(例如IL-1，IL-8，IL-1R家族的激动剂和TLR家族的激动剂，例如，LPS)诱发的对NF-κB的激活中扮演关键角色(Takeuchi，O.and Akira，S.；Curr.Top.Microbiol.Immunol.，270：155-67，2002)。

目前用于拮抗炎性细胞因子的信号传递的手段的目的目前是特异性地中和它们中每种的活性，这通过使用特定的单克隆抗体、受体拮抗剂或可溶性受体来实现。明显的目的是从外界选择性阻止细胞因子与相关膜受体的结合。

然而，最近来的文献暗示，基于对细胞原生质衔接蛋白介导的细胞内信号传递的抑制来使用实验手段，可能是一种有效的创新策略(L.A.J. O′Neill and CA.Dinarello；Immunol.Today，21：206-209，2000；M.Muzio，et al.；J.Leukoc.Biol，67：450-456，2000；J.M. Schuster and P.S.Nelson；J.Leukoc.Biol.，67：767.773，2000)。

因此，原理上证明，对衔接蛋白(例如MyD88)的抑制比对各个配体活性的抑制更有效，所述衔接蛋白参与对NF-κB的激活，这一激活是来自细胞膜外表面存在的受体的信号诱发的，所述受体识别不同的配体但共享相同的转导途径。

对受体IL-1R/TLR和MyD88的TIR结构域的初级序列比对时，保守的区域之一构成第二beta链和第二alpha螺旋之间的环(BB环)，其共有序列是RDXΦ₁Φ₂GX，其中X是任何氨基酸，Φ₁Φ₂是两个疏水氨基酸；具体而言，Φ₂是脯氨酸，除了在IL-1RI中其是缬氨酸。已知，TLR4中R677->E、P681->H和G682->V的突变消除了信号的传送；此外，对受体TLR2和突变为P681->H的受体TLR2的细胞内原生质TIR结构域的结晶图坐标进行比较时，没有发现影响环或其邻近区域的结构变化(Nature，2000，Vol.408，111)。该区域因此可能与衔接蛋白/受体相互作用界面有关。因此假设，该区域对于MyD88的同型二聚体化也是重要的。

这一联系中还已知了Rebek et al..(Bartfai，T.，et al.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：7971，2003)进行的研究，他证实了能以细胞内TIR结构域的水平干扰MyD88/IL1-RI相互作用的拟肽化合物的可能可应用性；BB环的中央部分的模拟物，具有(F/Y)-(V/L/I)-(P/G)作为其在不同toll受体以及MyD88同源体中的共有序列，能在体外抑制蛋白激酶p38在用IL-1β刺激的EL4细胞系中的磷酸化，其还能在体内显著减轻用鼠重组IL-1β注射的小鼠中的发热应答。但是，该化合物不能抑制MyD88/TLR4相互作用。

该领域的专家将欢迎能不抑制单一的MyD88/受体相互作用，但抑制衔接蛋白的同型二聚体化的化合物，其因此导致对更大量的前炎性信号的抑制，并且因此证明更具治疗效果。

此外，Yale University，CT，USA(WO02/090520A2)的近来的发明要求保护TIRAP多肽用于拮抗应答于TLR4连接(ligation)的不依赖MyD88的信号传递。

TIRAP是新颖的蛋白，其含有Toll/IL-1受体(TIR)结构域，其是Medzhitov(Horng，T.，Barton，G.M.，and Medzhitov，R.；Nat.Immunol.2：835-841，2001)和O′Neill(Fitzgerald，K.A.，Palsson-McDermott，EM.et al.；Na ture 413：78-83，2001)分别鉴定的。尽管最初预期TIRAP可能参与不依赖MyD88的NF-κB激活，但后续研究已揭示，TARAP并不参与不依赖MyD88的途径，而是作为衔接蛋白在由TLR2和TLR4初始化的依赖MyD88的信号传递途径中发挥作用(Yamamo to，M.，Sato，S.，Hemmi，H.；Nature 420：324-329，2002)。实际上，同样是这些研究者发现，名为Trif的另一种衔接蛋白，是实际上参与不依赖于MyD88的对NF-κB的激活(Yamamoto，M.，Sato，S.，Hemmi，H.et al.；Science 301，640-643)。目前可获得的证据表明，所有TLRs都利用MyD88，TLR3是唯一例外(Takeda，K.and Akira，S.；Int Immunol.17：1-14，2005)。Dunne et al.对TIRAP和MyD88与TLR2和TLR4之间的相互作用进行了深度研究，显示，TIRAP和MyD88实际与TLR2和TLR4的不同区域结合(Dunne，A.，Ejdeback，M.，Ludidi，P.L.et al.；J Biol Chem 278：41443-41451，2003)。

再一次地，本领域技术人员将欢迎既非单一抑制的MyD88/受体相互作用也非单独抑制参与TLR2和TLR4信号传递的衔接蛋白(TIRAP)的化合物。事实上，对参与所有已知TLRs(除TLR3之外)的信号传递的转导的单个瓶颈衔接蛋白(MyD88)的抑制被预计能拮抗更大量的前炎性信号，由此证明在治疗上更有效果。

基于文献中目前可获得的信息，我们相信，对TLR/IL-1R受体系统的信号传递的调节不良导致的大量疾病包括但不限于：

-炎性和自身免疫疾病，例如，关节炎、痛风性关节炎、慢性炎性肠疾(IBD)、牛皮癣、1型糖尿病、多发性硬化、哮喘和系统性红斑狼疮(见，例如Sabroe，I.，et al.；J.Immunol；171：1630-5，2003；Liu-Bryan R et al.Arthritis Rheum.52：2936-46，2005；Joosten，LA，et al.；J Immunol.，171：6145-53，2003；Sabroe，L.，et al.；Clin.Exp.Allergy，32：984-9，2002；Lehnardt，S.；Proc.Natl.Acad.Sci USA，100：8514-9，2003；Cboe，JY，et al.，J.Exp.Med.，197：537-42，2003；Sabroe，I.；Thorax，59：81，2004；Bellou，A.；Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol，3：487-94，2003；O′Neill，LA；Curr.Opin.Pharmacol，3：396-403，2003；Schon，M.，et al.；Clin.Exp.Immunol，123：505-10，2001；Leadbetter，EA et al.；Nature，416：603-7，2002；Rifkin，IR etal.；Immunol Rev.204：27-42，2005.)。

-心血管和致动脉粥样硬化性疾病，例如，心肌梗塞、病毒性心肌炎、动脉粥样硬化、静脉移植物动脉粥样硬化(vein graftatherosclerosis)、血栓、再狭窄、由于支架造成的再狭窄以及由于血管成形术(angioplasty)造成的再狭窄(见，例如de Kleijn，D.，and Pasterkamp G.；Cardiovasc Res.，60：58-67，2003；Oyama，J.-I.，et al.；Circulation，109：784-789，2004；Satoh，M.，et al.；Lab.Invest，84：173-81，2004； Thomas，JA，et al.；Am.I.Physiol.Heart Circ.Physiol.，285：H597-606，2003)；Fairweather，D.，et al.；J.Immunol.，170：4731-7，2003；Kiechl，S.，et al.；Ann.Med.，35：164-71，2003；Edfeldt，K.，et al.；Circulation，105：1158-1161，2002；Arditi et al，US20030148986)。

-脓毒症和休克(见，例如Read，RC，and Wyllie，DH；Curr.Opin.Crit.Care；7：371-5，2001；Carrillo-Esper，R.；Cir.Cir.，71：252-8，2003；Knuefermann，P.；Chest，121：1329-1336，2002；Knuefermann，P.，et al.；Circulation，106：2608-2615，2002)。

-移植排斥(见，例如Goldstein，DR.，et al.；J.Clin.Invest.，111：1571-1578，2003；Belperio，J.A.；Am.J.Respir.Crit.Care Med.，168：623-624，2003)。

-癌症(见，例如，Huang，B，et al.；Cancer Res.65：5009-14，2005)。

-病毒感染(见，例如Bafica，A.et al.；J Immunol.172：7229-34，2004；Equils，O.，et al.；J Immunol 170：5159-5164，2003；Scheller，C.et al.；J Biol Chem 279：21897-21902，2004；Sund strom，J.B.et al.；J Immunol 172：4391-4401，2004)。

以Cedars-Sinai Medical Center的名义提交的专利申请US20030148986描述了抑制蛋白质MyD88的表达或生物活性的多种方法。这些还包括阻止蛋白质信号传递的拟肽剂的使用。该抑制用与TLR-4受体结合的小的肽(10-20个氨基酸)来完成，由此其阻止与MyD88的结合。MyD88的小的重叠片断(大约10-20个氨基酸)可被分离开，以检测看看其中的哪些能通过与TLR-4受体结合来阻止MyD88细胞信号的转导。分离之后，片断被复制，对其进行检测，以确定该片断是否包含MyD88的能与TLR-4受体结合的至少一部分，其将组织MyD88的结合以及细胞信号的转导。该参考文献中没有给出具体例子。

本发明的发明人已进行了关于对MyD88的同型二聚体化的抑制的初步研究，对包含BB环的共有序列的一系列天然肽(在N末端合成为乙酰胺，在羧基末端合成为一级酰胺)进行了共免疫沉淀试验。表1显示了被证明有活性的肽，以及MyD88同型二聚体中发现的残余相互作用，以未经处理的蛋白质的百分比显示。蛋白质myc-MyD88在HEK293细胞中暂时表达，通过用抗myc抗体进行免疫沉淀将其从细胞提取物分离出来。在存在或不存在合成肽(终浓度200μm)的情况下，将免疫沉淀的蛋白与经纯化的蛋白GST-MyD88TIR一起在4℃孵育60分钟。合适的洗涤之后，用SDS溶解吸附在用于免疫沉淀的树脂上的蛋白质，通过Western杂交印迹试验针对myc-MyD88和GST-MyD88TIR的存在进行分析。针对两种肽还给出了对NF-κB激活的百分比抑制。

表1

名称	肽(序列)	％残余相互作用	％NF-κB抑制
名称	肽(序列)	％残余相互作用	％NF-κB抑制	ST2348	MyD88(Ac-RDVLPGT-NH₂)	29	37
ST2350	IL-18R(Ac-RDVVPGG-NH₂)	18	20	ST2348	MyD88(Ac-RDVLPGT-NH₂)	29	37

此外，与果蝇(Drosophila)的Antennapaedia(Ap)蛋白片段接合的(Ap-MyD88＝ST2345)肽ST2348具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(穿膜肽)(Gari，J.，and Kawamura，K.；TRENDS in Biotechnology，19；21-28，2001)被证明能在用IL-1α刺激的HeLa细胞中抑制NF-κB激活，而相应的杂乱的(scrambled)肽(ST2403 Ap-PTDLVRG-NH₂)是没有活性的。

本发明的目的是鉴定出MyD88的特定蛋白部分的模拟物，所述模拟物能通过干扰该蛋白与TIR结构域的相互作用来阻止的其同型二聚体的形成。该手段使得避免将MyD88吸引到每个IL-1R/TLR受体处作为衔接蛋白发挥作用成为可能。

本发明的分子可用作为药剂，用于治疗慢性炎性疾病，并能调节IL-1R/TLR受体介导的NF-κB激活。

用于构建MyD88的TIR结构域共有肽的模拟物的策略将在下文中描述：

MyD88的TIR结构域的共有肽的H-Arg-Asp-Val-Leu-Pro-Gly-Thr-OH结构被进一步分为三个不同的部分，其由

a)由氨基酸Arg-Asp构成的带电荷部分，

b)由氨基酸Val-Leu构成的疏水部分，

c)由氨基酸Leu-Pro-Gly-Thr构成的β-转角部分构成。

对于这些部分的每一个来说，选择某种类型的类似物，在共有肽序列中交替地或同时被取代，同时保留酰胺键作为三个基团之间的功能性接头基团：

a)更考虑Arg基团，其被拟精氨酸基团取代，其中，拟精氨酸表示下述化学结构，当精氨酸被其取代时，调节该功能性基团的碱度为从精氨酸的碱度到零碱度。

b)考虑精氨酸和脯氨酸之间的距离，用间隔基(spacer)对其进行填充，间隔基表示下述疏水化学结构，其具有有限数量的旋转自由度，其含有被各种取代的、官能团化的芳香族接头环、仅一个羧酸基团和仅一个一级胺，参与酰胺键。

c)考虑Pro-Gly的β-转角的中央部分，其被β-转角模拟物取代，其中，β-转角模拟物表示下述化学结构，通过模拟Pro-Gly β-转角的中央部分，其允许该分子采用有利于与蛋白质MyD88形成键的构象。

发明内容

现在已经发现，下文所述的肽和/或拟肽化合物能模拟MyD88的特定蛋白部分，阻止其同型二聚体化，以及干扰其与TIR结构域之间的相互作用。

本发明的主题是结构式(I)的肽和/或拟肽化合物

(X-)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-AA₇

(I)

其中：

X是可药用的阴离子，或者不存在；

基团AA₁-AA₇中的每一个(可以是相同的或不同的)，是具有下述含义的氨基酸或氨基酸模拟物：

AA₁＝L-精氨酸(Arg)、D-精氨酸(arg)、L-组氨酸(His)、D-组氨酸(his)或拟精氨酸基团的残基，或不存在，其中，所谓拟精氨酸表示下述化学结构，其取代精氨酸，并调节该功能性基团的碱度从精氨酸的碱度到零碱度，其具有结构式(II)、(III)和(IV)

AA₂＝L-天冬氨酸(Asp)、D-天冬氨酸(asp)、L-天冬酰胺(Asn)、D-天冬酰胺(asn)、甘氨酸(gly或Gly)，或不存在；

AA₃＝L-缬氨酸(Val)、D-缬氨酸(val)、氮杂缬氨酸(AzaVal)、氮杂甘氨酸(Azagly)、氮杂亮氨酸(AzaLeu)；

AA₄＝L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸(Val)、D-缬氨酸(val)、L-半胱氨酸(Cys)、D-半胱氨酸(cys)、氮杂亮氨酸(AzaLeu)、氮杂缬氨酸(AzaVal)、氮杂甘氨酸(Azagly)；

AA₂-AA₃-AA₄可共同被间隔基取代，其中，间隔基表示下述疏水化学结构，其具有有限数量的旋转自由度，其含有被多样取代的、官能化的芳香族接头环、仅一个羧酸基团和仅一个一级胺基团，参与酰胺键，其具有结构式(V)：

AA₅＝L-脯氨酸(Pro)、D-脯氨酸(pro)、顺-4，5-(亚甲基)-L-脯氨酸(cMe-Pro)、顺-(4，5)-(亚甲基)-D-脯氨酸(cMe-pro)、反-4，5-(亚甲基)-L-脯氨酸(tMe-Pro)、反-(4，5)-(亚甲基)-D-脯氨酸(tMe-pro)；

AA₆＝甘氨酸(gly或Gly)、肌氨酸(Sar)、氮杂甘氨酸(Azagly)；

AA₅-AA₆可共同被β-转角模拟物取代，其中，β-转角模拟物表示下述化学结构，通过模拟Pro-Gly β-转角的中央部分，其允许该分子采用有用于与蛋白质MyD88形成键的构象，其具有结构式(VI)和(VII)

n＝0，1，2

m＝0，1，2

p＝0，1

*＝外消旋物以及纯的对映异构体

X＝CO，SO₂

Y＝H，OH

*＝外消旋物以及纯的对映异构体

(VII)

AA₇＝甘氨酸(gly或Gly)、氮杂甘氨酸(Azagly)、L-苏氨酸(Thr)、D-苏氨酸(thr)、L-半胱氨酸(Cys)、D-半胱氨酸(cys)的残基，或不存在；

当AA₄＝AA₇＝Cys或cys时，两个半胱氨酸之间存在二硫桥；

当AA₁、AA₂、AA₃、AA₄、AA₅、AA₆和AA₇中的一些或全部是氨基酸时，它们可以是L或D，序列可以是反向的或不是反向的；

AA₁-AA₇之间的键总是酰胺类型的；

末端氨基可以是游离的，或用有用于转运该分子的可药用基，例如乙酰基、甲酰基、苯甲酰基、丙酰基、环己基、肉豆蔻酰基酰化的；末端羧基可以是羧酸或一级酰胺的形式。

各自的对映异构体、非对映异构体、其混合物以及它们的可药用盐；

当如下条件时：

AA₁-AA₇中的至少一个不是上面指出的天然氨基酸，或者

如果AA₁-AA₇全部都是上面指出的天然氨基酸，所述AA₁-AA₇是反向的。

结构式(I)的化合物可用作药剂，特别是用于制备用于治疗疾病的药剂，所述疾病源自对TLR/IL-R1受体系统的信号传递的调节不良，以及特别地，炎性和自身免疫疾病；心血管和致动脉粥样硬化性疾病；脓毒症和休克；以及移植排斥。

因此，本发明的主题是结构式(I)的化合物、含有它们的药物组合物以及它们作为药剂的用途。

发明详述

可药用酸的阴离子的例子是Cl^-、Br^-、I^-、CH₃COO^-和CF3COO^-。其它可药用阴离子可由本领域的专家按照用于本领域的通常标准加以选择，所述标准例如无毒或者实质上无毒或者任何可接受的毒性，或者制剂优点，例如溶解度或晶型。可药用的盐表示下述任何盐，它们不产生毒性或不想要的影响，或者从临床角度来看此类影响使得它们仍以可接受的形式存在。除了他或她的普通知识之外，具有平均经验的技术人员可容易地参考文献，例如，European Pharmacopoeia(欧洲药典)或United States Pharmacopeia(美国药典)。

假设对拟精氨酸基团的定义如上文所述，优选例子是下面这些

其中，A是直链或带支链的C₁-C₄烷基；AL是选自F、Cl、Br和I的卤素基团。

假设对间隔基团的定义如上文所述，该基团的优选例子具有结构式(SPX)_n，其中n＝0-3，其如下表中所定义

其中，A是直链或支链的C₁-C₄烷基；AL是选自F、Cl、Br和I的卤素基团。

假设对间隔基团的定义如上文所述，该基团的优选例子是如下这些：

对化合物进行实验部分描述的三种生物初级筛选试验：a)双杂交试验，b)NF-κB抑制试验和c)RGA试验。在三种生物试验中的任何一种中提供活性的化合物被认为是活性化合物。

结构式(I)代表的化合物可被分入下述的类：

1.按照流程9制备的直到结构式I^V或结构式I^VI的肽化合物。

优选的化合物是：

ST2565 Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂

2.按照流程9制备的直到结构式I^II或结构式I^III的拟肽化合物

优选的化合物是：

ST2793：PAM8-SP20-Beta3-NH₂

ST2806：AM8-SP38-Beta6

ST2825：PAM4-SP19-Beta8-NH₂

ST2826：PAM6-SP20-Beta8-NH2

ST2828：SP32-Beta3-NH₂

ST3324：PAM11-SP19-Beta8-NH₂

ST3374：PAM10-SP6-Beta8-NH₂

ST3375：PAM3-SP30-Beta8-NH₂

3.按照流程9制备的直到结构式I^II、I^III、I^IV和I^V的部分肽化合物，其被分入下述亚类：

-其中AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代的部分肽化合物，其是按照流程9制备的直到结构式I^IV和I^V。

优选的化合物是：

ST2799：Ac-arg-asp-val-leu-Beta1-NH₂

-其中AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代并且AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代的部分肽化合物，其是按照流程9制备的直到结构式I^II和I^III。

优选的化合物是：

ST2804：Ac-Arg-SP02-Beta2-Gly-NH₂

ST2801：Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH₂

ST2805：NH₂-arg-SP02-Beta5

-其中AA₁是拟精氨酸并且AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代的部分肽化合物，其是按照流程9制备的直到结构式I^IV和I^V。

优选的化合物是：

ST2794：PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH₂.

-其中AA₁是拟精氨酸并且AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代的部分肽化合物，其是按照流程9制备的直到结构式I^III和I^IV。

优选的化合物是：

ST2807：PAM9-(SP31)₃-Pro-Gly-NH₂

ST2796：AM9-SP02-Pro-Gly-NH₂

ST2797：PAM8-SP15-Pro-Gly-NH₂

ST2798：PAM9-SP38-Pro-Gly-NH₂.

ST2863：AM9-SP17-Pro-Gly-NH2

其中chiral表示“手性”

-其中AA₁是拟精氨酸，AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代，AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代并且AA7是氨基酸的部分肽化合物，其是按照流程9制备的直到结构式I^III。

优选的化合物是：

ST2792：PAM9-SP02-Beta2-Thr-NH₂.

-其中AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代的部分肽化合物，其是按照流程9直到结构式I^III制备的。

优选的化合物是：

ST2864：Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH2，

其中chiral表示“手性”

其中一个或多个氨基酸被一个或多个氮杂-氨基酸取代的部分肽化合物，其是按照流程9制备的直到结构式I^V和I^VI。

优选的化合物是：

ST2926 H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH₂

ST3032 Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂

ST2927 Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH₂

ST2930 Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂

ST2920 Ac-Arg-Asp-Val-Aza Val-Pro-Gly-NH₂

ST2928 Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH₂

根据本发明的化合物可通过本领域专家熟悉的传统合成方法来制备。一般性的肽合成技术能很好地适用于本发明的目的。指导性的参考文献例如：Norbert Sewald，Hans-Dieter Jakubke，Peptides：Chemistry and Biology，Wiley VCH(2002)；Miklos Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis(Sec.Ed.)，Springer-Verlag(1993)；John Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis(OxfordChemistry Primers)，Oxford Science Publications(2000)。

下文示出的流程9中描述了一般性的合成流程，读者应将其看作一般性的描述。

当根据本发明的化合物含有非肽部分时，对它们的合成需要先构建合成块(building block)，然后在其上完成对肽分子的构造。

在下文描述的流程中，对合成块举例了若干的优选实施方式，应当理解，它们在其完全的上下文中只是关于本发明实施方式的对本领域专家的指导。事实上，关于没有被阐释性示例出来的那些，本领域专家也能通过他们自己的一般性知识来获得，例如，通过在市场上可获得的那些中寻找起始化合物，或者通过与例子中列出的那些的类似性来制备它们。

对合成块的合成

使用按照下文实施例所述的合成方法合成的合成块，来合成被称为β-转角模拟物的拟肽化合物的部分。

(以下流程中，“silica gel”表示“硅胶”，“chiral”表示“手性”)

按照流程1合成合成块ST2364(11)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta2的拟肽化合物，其中使用R.L.Johnson及其同事(Genin，M.J.；et al.；J.Org.Chem.；1993，58，2334-2337)描述的经R.DLong and K.D.Moeller(Long，R.D.；et al.；J.Am.Chem.Soc；1997，119，12394-1239)改进的方法，至中间体8，再使用下文实施例1描述的方法来进行。

流程1

ST2364的合成

试剂：(a)t-Bu-CHO，cat.CF₃COOH，(b)1.LDA，2.CH₂＝CH-CH₂-Br，(c)Silica gel，MeOH/H₂O(d)(Boc)₂O，

(e)Gly-OMe.HCl，DCC，HOBt，NEt₃，(f)OsO₄，NalO₄，MeOH/H₂O，(g)NaBH₃CN，(h)K₂CO₃，(i)TFA，

(l)1.NaHCO₃，2.Fmoc-OSu，3.HCl

实施例1

{(5R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮杂螺 [4，4]壬-7-基}-乙酸ST2364(11)的制备

中间体[(5R)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧代-1，7-二氮杂螺[4，4]壬-7- 基]-乙酸(9)的制备

将8.5g(0.027mol)(5R)-7-(2-甲氧基-2-氧基-乙基)-6-氧基-1，7-二氮杂螺[4，4]壬-1-羧酸叔丁基酯(8)溶解于140ml H₂O和140ml di MeOH中。向溶液中加入7.48g(0.054mol)K₂CO₃，在室温下搅拌混合物过夜。然后用2N HCl将其酸化至pH 5，在减压下蒸发。获得的残余物溶解于H₂O中，pH被降低至2-3，用CH₂Cl₂进行萃取。用无水Na₂SO₄对有机相脱水，在减压下使其至干，获得6.5g玻璃状固体(收率：81％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH2/AcOH 0.1；RF：0.54。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.30-1.60(2s，9H)，1.80-2.20(m，4H)，2.20-2.40(m，2H)，2.40-2.60(m，2H)，3.30-3.70(m，4H)，3.85(d，1H)，3.20-4.20(sa，1H)，4.50(d，1H)。

中间体(5R)-7-(羧甲基)-6-氧代-7-氮杂-1-氮-螺[4，4]壬烷-三氟乙酸盐(10)的制备

将6g(0.02mol)[(5R)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧代-1，7-二氮杂螺[4，4]壬-7-基]-乙酸(9)溶解于100ml CH₂Cl₂和100ml三氟乙酸中。在室温下对溶液搅拌1小时，之后在减压下使其干燥，向残余物中加入水，再在减压下蒸发，以除去任何痕量的三氟乙酸。用油泵干燥获得的油，产生6.2g油状产物(收率：100％)。

TLC：CHCl₃ 60/MeOH 40/H₂O 15/iPrOH 10/AcOH 15；RF：0.33。

¹HNMR(300MHz，DMSOd₆)：δ2.10(m，4H)，2.30(m，2H)，3.35(m，2H)，3.50(m，2H)，4.05(2d，2H)，9.25(sa，1H)，9.35(sa，1H)。

{(5R)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧-1，7-二氮杂螺 [4，4]壬-7-基}-乙酸ST2364(11)的制备

将6.2g(0.02mol)(5R)-7-(羧甲基)-6-氧-7-氮杂-1-氮-螺[4，4]壬烷-三氟乙酸盐(10)和4g(0.047mol)NaHCO₃溶解于200ml H₂O中。然后向溶液中加入溶解于300ml丙酮中的7.0g(0.021mol)Fmoc-N-OSu，在室温下将溶液搅拌20小时。向反应混合物中加入H₂O，然后用Et₂O洗三次。用HCl 2N令水相至pH2-3，用CHCl₃进行萃取。用无水Na₂SO₄对有机相脱水，在减压下使其蒸发。用CHCl₃使获得的沥青状固体结晶，产生了6.1g白色固体(收率：73％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2/AcOH 0.1；RF：0.55。

MP：144°-146℃。

[α]D：-12.6；浓度：0.5％MeOH溶液。

HPLC：柱：μBondapack C18 3.9×150mm；

流动相：KH₂PO₄ 50mM./CH₃CN 75/25；

流速：1.0ml/min.室温；

R.T.：10.9min。

¹HNMR(300MHz，DMSOd₆)：δ1.50(m，1H)，1.60-2.00(m，4H)，2.40(q，1H)，2.60，3.02(2m，1H)，3.30(m，2H)，3.40(m，2H)，3.70，4.10(2d，2H)，4.15，4.20(2m，1H)，4.35，4.75(2dd，1H)，7.25-7.45(m，4H)，7.55-7.70(m，2H)，7.83(d，2H)12.70(sa，1H)。

按照流程1来合成可用于合成含β-转角模拟物Beta1的拟肽化合物的合成块ST2201，这通过使用与用于合成ST 2364相同的方法(实施例1)，从作为起始物的D-脯氨酸(而不是L-脯氨酸)开始。对ST2201的分析数据被描述于下文的实施例2中。

实施例2

{(5S)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮杂螺 [4，4]壬-7-基}-乙酸ST2201的制备

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2；RF：0.33。

MP：138°-141℃。

[α]D：+15.1；浓度：0.5％MeOH溶液。

HPLC：柱：μBondapack C18 3.9×150mm；

流动相：KH₂PO₄ 50mM/CH₃CN 65/35；

流速：1.0ml/min.室温；

R.T.：8.2min.

¹HNMR(300MHz，DMSOd₆)：δ1.50(m，1H)，1.60-2.00(m，4H)，2.40 q，1H)，2.60，3.02(2m，1H)，3.30(m，2H)，3.40(m，2H)，3.70，4.10(2d，2H)，4.15，4.20(2m，1H)，4.35，4.75(2dd，1H)，7.25-7.45(m，4H)，7.55-7.70(m，2H)，7.83(d，2H)12.70(sa，1H)。

按照流程2合成合成块ST2451(22)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta3的拟肽化合物，其中使用R.L.Johnson及其同事(Genin，M.J.；et al.；J.Med.Chem.；1999，42，628-637)描述的方法至中间体16，再使用下文实施例3描述的方法来进行。

流程2

ST2451的合成

试剂：(a)t-Bu-CHO，cat.CF₃COOH，(b)1.LDA，2.CH₂＝CH-CH₂-CH₂-Br，(c)Silica gel，MeOH/H₂O，(d)(Boc)₂O.

(CH₃)NOH.5H₂O(e)Gly-OMe.HCl，DCC，HOBt，NEt₃(f)OsO₄，NalO₄，MeOH/H₂O(g)NaBH₃CN，

(h)K₂CO₃(i)TFA，(l)1.NaHCO₃，2.Fmoc-OSu，3.HCl

实施例3

{(5S)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮杂螺 [4，5]癸-7-基}-乙酸ST2451(22)的制备

中间体2-丁-3-烯-1-基-1-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酰甘氨酸甲酯 (17)的制备

将8.0g(0.297mol)2-丁-3-烯-1-基-1-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酸(16)、3.7g(0.0297mol)盐酸甘氨酸甲酯和4.0g(0.0297mol)羟基苯并三唑溶解于100ml无水CHCl₃中。向溶液中加入4.1ml(0.0297mol)TEA，然后加入溶解于100ml pf无水CHCl₃中的6.1g(0.0297mol)DCC。在N₂气氛下，室温下搅拌反应混合物过夜。过滤形成的二环己脲(DCU)，将滤液在减压下处理至干。用Et₂O振荡由此获得的残余物，对其进行过滤以除去任何DCU，用NaHCO₃ 1M、盐水以及10％柠檬酸洗液相，然后再用盐水洗。用无水Na₂SO₄对有机相脱水，在减压下使其至干，获得13g黄色的油，使用硅胶层析柱对其进行纯化，用正己烷/AcOEt 2∶1洗脱。纯化产生了9.4g的白色固体(收率：93％)。

TLC：己烷2/AcOEt 1；RF：0.27。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)：δ1.54，1.60(2s，9H)，1.75(m，3H)，2.10(m，4H)，2.75(m，1H)，3.35(m，1H)，3.58(m，1H)，3.75(s，3H)，4.05(m，2H)，5.00(m，2H)，5.82(m，1H)，6.50，8.32(2sa，1H)。

中间体(5S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧代-1，7-二氮杂螺 [4，5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(19)的制备

将9.15g(0.027mol)2-丁-3-烯-1-基-1-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酰甘氨酸甲酯(17)溶解于300ml di MeOH/H₂O 2∶1中。向溶液中加入0.33g(0.0013mol)OsO₄，然后在鼓入N₂气泡后搅拌10分钟，同时将17.1g(0.08mol)NaIO₄分部分加入。从黑色溶液中形成白色沉淀，在室温下搅拌24小时。向反应混合物中加入H₂O，直到获得溶液，用AcOEt对该溶液萃取若干次。用H₂O洗收集合并的有机相，用无水Na₂SO₄对其进行脱水，在减压下至干，获得9.2g的深色油状(5R)-8-羟基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧代-1，7-二氮杂螺[4，5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(18)，其未经进一步纯化直接进行反应。

TLC：AcOEt；RF：0.39和0.52(非对映异构体)。

将9.0g(0.026mol)(5R)-8-羟基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧-1，7-二氮杂螺[4.5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(18)溶解于180ml无水THF中。向溶液中加入18ml三氟乙酸，用冰浴冷却溶液，加入4.68g(0.074mol)的NaBH₃CN。在氮气氛围下，在室温下对反应混合物搅拌20小时，然后用K₂CO₃碱化。通过过滤将溶液与残余物分开，减压下令滤液至干。将获得的无定形物质溶解于H₂O中，用CH₂Cl₂萃取若干次。用无水Na₂SO₄对有机相脱水，在减压下使其至干。获得9g黑色的油，使用硅胶柱层析对其进行纯化，用AcOEt/正己烷3∶1洗脱。获得了4.5g的浅色油(收率：53％)。

TLC：AcOEt；RF：0.5。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.40，1.60(2s，9H)，1.60-2.15(m，6H)，2.15-3.80(m，2H)，3.30(m，1H)，3.30-3.80(m，4H)，3.75，3.76(2s，3H)，4.70，4.78(2d，1H)。

中间体[(5S)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧-1，7-二氮杂螺[4.5]癸-7- 基]-乙酸(20)的制备

将4g(0.012mol)(5S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-6-氧代-1，7-二氮杂螺[4.5]癸烷-1-羧酸叔丁酯(19)溶解于60ml MeOH和60mlH₂O中；然后加入3.32g(0.024mol)的K₂CO₃。反应混合物在室温下搅拌20小时，然后用HCl 2N令其pH为5，在减压下令其至干。将获得的残余物溶解于H₂O中，令其至pH 2-3，并用CH₂Cl₂萃取若干次。在无水Na₂SO₄上对有机相脱水，在减压下使其至干，获得3.2g白色固体(收率：86％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2/CH3COOH 0.1；RF：0.59。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.43(s，9H)，1.60-2.15(m，6H)，2.15-2.50(m，2H)，3.25(m，1H)，3.30-3.80(m，4H)，4.43，4.98(2d，1H)。

中间体(5R)-7-(羧甲基)-6-氧代-7-氮杂-1-氮螺[4，5]癸烷-三氟乙酸盐(21)的制备

将3.1g(0.01mol)[(5S)-1-(叔丁氧羰基)-6-氧代-1，7-二氮杂螺[4，5]癸-7-基]-乙酸(20)溶解于60ml CH₂Cl₂以及60ml三氟乙酸中；在室温下对反应混合物搅拌1小时。然后在30℃在减压下令其至干，残留物中加入水，再次在减压下至干，用油泵彻底干燥。由此获得3.1g浅色的油(收率：95％)。

TLC：CHCl₃ 60/MeOH 40/H₂O 15/isoPrOH/10/AcOH 15；RF：0.4。

¹H-NMR(200MHz，D₂O)：δ1.85-2.30(m，8H)，3.20-3.60(m，4H)，4.05(d，2H)。

{(5S)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)-羰基]-6-氧代-1，7-二氮杂螺 [4，5]癸-7-基}-乙酸ST2451(22)的制备

将3.2g(0.01mol)(5R)-7-(羧甲基)-6-氧代-7-氮杂-1-氮螺[4.5]癸烷-三氟乙酸(21)溶解于100ml H₂O中；向溶液中加入1.7g(0.02mol)NaHCO₃，然后加入溶解于150ml丙酮中的3.7g(0.011mol)Fmoc-N-OSu。在室温下对反应混合物搅拌24小时，在减压下蒸发丙酮，接着用H₂O稀释，用Et₂O洗。用HCl 2N令水相至pH2-3，用CHCl₃进行萃取；用无水Na₂SO₄对有机相脱水，在减压下使其蒸发。用CH₂Cl₂和Et₂O使产物结晶，获得1.4g白色固体(收率：32％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2/CH₃COOH 0.1；RF：0.62。

MP：122℃。

[α]D：-26.4(MeOH中的0.5％)。

E.A.：

理论值：C69.10；H6.03；N6.44；

实测值：C67.81；H5.90；N6.31。

HPLC：柱：Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；

流动相：KH₂PO₄ 50mM pH 3/CH₃CN 65/35；

流速：1,0ml/min.室温；

R.T.：5.2min。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.20，1.38，1.62(3m，1H)，1.78-2.20(m，5H)，2.22-2.50(m，2H)，2.80，3.45(2m，1H)，3.25(m，1H)，3.60(dd，1H)，3.65(m，1H)，3.80，3.85(2d，1H)，4.15，5.2(2m，1H)，4.2-4.35(m，1H)4.40(m，1H)，4.60(m，1H)，7.20-7.45(m，8H)，7.58(m，2H)，7.75(d，2H)。

按照流程3合成合成块ST2535(34)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta4的拟肽化合物，其中使用R.L.Johnson及其同事(Genin，M.J.；et al.；J.Med.Chem.；1999，42，628-637)描述的方法至中间体31，再使用下文实施例4描述的方法来进行。

流程3

ST2535的合成

试剂：(a)t-Bu-CHO，cat，CF₃COOH，(b)1.LDA，2.CH₂＝CH-CH₂-Br，(c)Silica gel，MeOH/H₂O

(d)(Boc)₂O，(CH₃)NOH·5H₂O(e)K₂CO₃，(f)OsO₄，NalO₄，MeC，-1/H₂O(g)D-Cys-OH.HCl，NaOH，

H₂O/EtOH，(h)1.NEt₃，DMF，2.CH₃l，KHCO₃，(i)K₂CO₃(l)TFA，(m)Fmoc-OSu，NaHCO₃.

实施例4

(2R，3’S，7a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)-羰基]-5’-氧代四氢螺- [吡咯烷-2，6’-吡咯并-[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸ST2535(34)的制备

中间体(2R，3’S，7a’R)-1-(叔丁氧羰基)-5’-氧代四氢螺-[吡咯烷-

2，6’-吡咯并-[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸(32)的制备

将5g(0.014mol)(2R，3’S，7a’R)-5’-氧代四氢-1H-螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并-[2，1-b][1，3]噻唑-1，3’-二羧酸1-叔丁酯-3’-甲酯(31)溶解于65ml H₂O以及65ml MeOH中。向溶液中加入3.87g(0.028mol)K₂CO₃。在室温下对悬浮液搅拌20小时，用HCl 2N令混合物pH为5，在减压下令混合物至干。获得的残余物放置于H₂O，pH被降低至2-3，用CHCl₃进行萃取。用水洗有机相，用无水Na₂SO₄干燥，在减压下使其至干，用Et₂O对玻璃状残余物进行结晶，得到3g的白色固体(收率：64％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2/CH₃COOH 0，1；RF：0.56。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)：δ1.45(s，9H)1.75-2.45(m，5H)，2.85(dd，1H)3.50(m，4H)4.98(m，1H)，5.20，5.30(d和dd，1H)，5.00-6.00(sa，1H)。

中间体(2R，3’S，7a’R)-3’-羧基-5’-氧代四氢螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑]三氟乙酸盐(33)的制备

将3.0g(0.0087mol)(2R，3’S，7a’R)-1-(叔丁氧羰基)-5’-氧代四氢螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸(32)溶解于60ml CH₂Cl₂以及60ml三氟乙酸中。在室温下对整体搅拌2小时，在30℃蒸发；用油泵干燥获得的油，直到获得沥青状物质，用CHCl₃对其进行结晶，得到了2.4g白色固体(收率：80％)。

TLC：CHCl₃ 60/MeOH 40/H₂O 15/isoPrOH 10/AcOH 15；RF：0.57。

¹H-NMR(200MHz，D₂O)：δ1.95-2.40(m，4H)，2.45(dd，1H)，2.90(dd，1H)，3.25-3.35(m，3H)3.45(dd，1H)，4.93(dd，1H)，5.22(t，1H)。

(2R，3’S，7a’R)-1-[(9H-芴基-9-基-甲氧基)-羰基]-5’-氧代四氢螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑-3’-羧酸ST2535(34)的制备

将2.3g(0.0064mol)(2R，3’S ，7a’R)-羧基-5’-氧代四氢螺-[吡咯烷-2，6’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻唑]三氟乙酸盐(33)溶解于100mlH₂O中；向溶液中加入1.1g(0.013mol)NaHCO₃，然后加入溶解于150ml丙酮中的4.4g(0.013mol)Fmoc-N-OSu。在室温下对整体进行20小时的搅拌，在减压下蒸发丙酮。加入更多的水，用Et₂O洗水相，再使pH至2-3，用CHCl₃进行萃取。分离出有机相，用无水Na₂SO₄脱水，在减压下至干。用乙酸乙酯对由此获得的玻璃状固体进行结晶，获得2.3g可过滤白色固体(收率：80％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2/CH₃COOH 0.1；RF：0.67。

MP：110℃.分解。

E.A.：理论值：+8.4％H₂O＝C59.21；H5.71；N5.52 S6.32；

实测值：＝C57.11；H4.87；N5.21：S5.43。

[α]D：+121.9。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.60-2.20(m，4H)，2.30(m，1H)，2.80(m，1H)，3.30，3.35-3.60(3m，4H)，4.05，4.20(2m，1H)，4.40(m，2H)，4.60，4.98(2m，1H)，5.05，5.15(2m，1H)，6.00-7.20(s a，1H)，7.20-7.45(m，8H)，7.58(m，2H)，7.75(d，2H)。

HPLC：柱：Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；

流动相：KH₂PO₄ 50mM/CH₃CN 65/35；

流速：1.0ml/min.室温；

R.T.：12.1min。

按照流程4合成合成块ST2304(40)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta6的拟肽化合物，其中使用M.R.Pena和J.K.Stille(J.Am.Chem.Soc；1989，111，5417-5424)描述的方法至中间体37，再使用下文实施例5描述的方法来进行。

流程4

ST2304的合成

试剂：(a)DMSO-120℃，5h，(b)TBDPSCl，lm，DMF，(c)NaH，BCH₂COO-tBu，(d)TFA.

实施例5

(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-5，11-二氧代- 2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-10(5H)-基)- 乙酸ST2304(40)的制备

中间体(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-2，3-二氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5，11(10H，11a H)-二酮 (38)的制备

将2.3g(0.01mol)(2R，11aS)-2-羟基2，3-二氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5，11(10H，11aH)-二酮(37)溶解于30mlDMF中；加入3.4g(0.05mol)咪唑，在搅拌下向该溶液中逐滴加入5.6ml(0.022mol)叔丁基-二苯基-甲硅烷基氯。在室温下搅拌该溶液3.5小时，然后加入100ml H₂O，用100ml CH₂Cl₂进行萃取，用H₂O洗有机相。用无水Na₂SO₄对有机相脱水，在减压下使其至干，还是用机械泵，获得浓稠的油，其被热溶解于正己烷/AcOEt中，重复沉淀若干次。用机械泵干燥之后，获得3.9g无定形固体(收率：83％)。

TLC：正己烷1/AcOEt1；RF：0.5。

E.A.：理论值：C：71.45；H：6.42；N：5.95；

实测值：C：70.47；H：6.67；N：5.53。

¹H-NMR：(200MHz，CDCl₃)：δ1.03(s，9H)，2.20(m，1H)，2.78(m，1H)，3.55，3.60(2d，1H)，3.85，3.90(2d，1H)，4.25(m，1H)，4.55(m，1H)，7.00(d，1H)，7.25-7.55(m，8H)，7.60-7.80(m，4H)，8.02(d，1H)，8.65(s，1H)。

中间体(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂- 10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(39)的制备

用THF洗若干次后，将330mg(0.008mol)的60％NaH悬浮于6ml无水THF中。将悬浮液冷却至-40℃，逐滴加入溶解于18ml THF中的3.45g(0.0073mol)(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-2，3-二氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5，11(10H，11aH)-二酮(38)，保持溶液处于搅拌下。45分钟后，还逐滴加入1.2ml(0.008mol)的溴乙酸叔丁基酯，让混合物在搅拌下反应2小时，令温度升高至室温。然后将悬浮液倾倒入50ml H₂O，用30ml CH₂Cl₂萃取两次，用H₂O和盐对收集汇合的有机相洗若干次，用无水Na₂SO₄脱水。在减压下令溶液至干，获得油，用石油醚洗以及用机械泵干燥之后，得到3.6g的无定形固体(收率：84％)。

TLC：正己烷7/AcOE t：3；R.F.0.5。

E.A.：理论值：C：69.83；H：6.89；N：4.79；

实测值：C：68.87；H：7.37；N：4.01.

¹H-NMR：(200MHz，CDCl₃)：δ1.03(s，9H)，1.45(s，9H)，2.15(m，1H)，2.80(m，1H)， 3.55，3.60(2d，1H)，3.75，3.82(2d，1H)，4.30(m，1H)，4.05-4.60(dd，2H)，4.62(m，1H)，7.20(d，1H)，7.30-7.60(m，8H)，7.60-7.80(m，4H)，8.00(d，1H)。

(2R，11a S)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧}-5，11-二氧- 2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯-二氮杂-10(5H)-基)- 乙酸ST2304(40)的制备

将3.6g(0.0061mo1)(2R，11aS)-2-{[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]-氧基}-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(39)悬浮于30ml CH₂Cl₂中，15℃时搅拌下逐滴加入25ml三氟乙酸。令温度升高至室温，然后搅拌溶液45分钟。在用机械泵减压下令反应溶液至干；将残余物溶解于乙醚中，通过冷却沉淀，形成2.6g的白色固体(收率：81％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH2/CH₃COOH0.1；RF：0.51。

M.P.：191-193℃。

E.A.：理论值：+0.6％H₂O(TG)：C：67.74；H：6.13；N：5.26；

实测值：C：67.12；H：6.09；N：5.28。

[α]²⁰D+246.2；浓度1％CHCl₃。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.03(s，9H)，2.05(m，1H)，2.75(m，1H)，3.50，3.55(2d，1H)，3.75，3.78(2d，1H)，4.25(m，1H)，4.20-4.57(dd，2H)，4.60(m，1H)，7.10(d，1H)，7.20-7.50(m，8H)，7.60(m，4H)，7.90(d，1H)。

HPLC：柱：Inertsil ODS 3(5μ)4.6×250mm；

流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30；pH 3(H₂PO₄85％)；

流速：1.0ml/min，t＝30℃；

R.T.：10.79min。

按照流程5合成合成块ST2393(45)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta5的拟肽化合物，其中使用M.R.Pena和J.K.Stille(J.Am.Chem.Soc；1989，111，5417-5424)描述的方法，使用靛红酸酐(41)和L-脯氨酸(42)作为起始产物来进行。在下文实施例6中对合成进行了描述。

流程5

ST2393的合成

试剂：(a)DMSO-120℃，5h，(b)NaH，BrCH₂COO-tBu，(d)TFA，

实施例6

[(11a S)-5，11-二氧-2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-10(5H)-基)-乙酸ST2393(45)的制备

中间体(11a S)-2，3-二氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂- 5，11(10H，11aH)-二酮(43)的制备

在N₂气氛下，将2.67g(0.0164mol)靛红酸酐(41)溶解于20ml无水DMSO中，在搅拌下加入1.72g L-脯氨酸(0.0149mol)(42)。然后在搅拌下将溶液加热至120℃，持续2.5小时，然后冷却，搅拌下倾倒进130ml冷水中。对水溶液形成的沉淀进行过滤，再用冷水洗，真空烘干3小时。获得了2.6g(收率：80％)。

TLC：AcOEt；RF：0.5。

[α]²⁰D：+528(0.5％CH₃OH)。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)：δ2.05(m，3H)，2.80(m，1H)，3.65(m，1H)3.82(m，1H)4.12(d，1H)，7.00(d，1H)，7.30(t，1H)，7.52(t，1H)，8.03(d，1H)，8.25(sa，1H)。

中间体[(11a S)-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1- c][1，4]苯并二氮杂-10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(44)的制备

用THF洗若干次后，将518mg(0.0127mol)的60％NaH悬浮于5ml无水THF中。将悬浮液冷却至-40℃，逐滴加入溶解于25ml无水THF中的2.5g(0.0115mol)(11a S)-2，3-二氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5，11(10H，11aH)-二酮(43)，保持溶液处于搅拌下。45分钟后，逐滴加入1.87ml(0.0127mol)的溴乙酸叔丁基酯，让混合物在搅拌下反应2小时，令温度升高至室温。然后将悬浮液倾倒入150ml H₂O，用100ml CH₂Cl₂萃取两次，用H₂O和盐对收集汇合的有机相洗若干次，用无水Na₂SO₄脱水。在减压下令溶液至干，获得油，用石油醚洗以及用机械泵干燥之后，得到3.7g的无定形固体(收率：97％)。

TLC：正己烷1/AcOEt1；RF：0.4。

¹H-NMR：(200MHz，CDCl₃)：δ1.50(s，9H)，2.05(m，3H)，2.68(m，1H)，3.60(m，1H)， 3.83(m，1H)， 4.15(m，1H)， 4.15(d，1H)，4.59(d，1H)，7.18-7.40(m，2H)，7.55(dt，1H)，7.97(dd，1H)。

[(11a S)-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-10(5H)-基)-乙酸ST2393(45)的制备

将3.5g(0.01mol)[(11a S)-5，11-二氧代-2，3，11，11a-四氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-10(5H)-基)-乙酸叔丁基酯(44)溶于30ml CH₂Cl₂中，10℃时搅拌下逐滴加入25ml三氟乙酸。令温度升高至室温，然后搅拌溶液1.5小时。在用机械泵减压下令反应溶液至干；用乙醚处理残余物，其由此固化，在真空烘干2小时后得到2.65g的白色固体(收率：96％)。

TLC：CHCl₃ 60/MeOH 40/H₂O 15/IprOH 10/CH₃COOH15；RF：0.8。

M.P.：267-269℃。

E.A.：理论值：+1.9％H₂O(TG)：C：60.14；H：5.26；N：10.02；

实测值：C：60.31；H：5.36；N：9.70。

[α]²⁰D：+408(0.7％CHCl₃)。

¹H-NMR(300MHz，MeOD)：δ2.07(m，3H)，2.61(m，1H)3.55(m，1H)，3.77(m，1H)，4.25(m，IH)，4.48(d，1H)，4.60(d，1H)，7.38(m，2H)，7.60(m，1H)，7.83(m，1H)。

HPLC：柱：Symmetry C18(3.5μ)；

流动相：KH₂PO₄ 50mM/CH₃CN；

梯度：从100％至30％KH₂PO₄ 50Mm；

流速：1.0mL/min.，室温；

R.T.：10.85min

按照流程6合成合成块ST2590(52)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta7的拟肽化合物，这从商业产品(46)和(47)开始。在下文实施例7中对合成进行了描述。

流程6

ST2590的合成

试剂：(a)TFA，CH₂Cl₂，(b)Nl-Raney，(c)HCl，Toluene/Riflusso，(d)1.NaH，2.BrCH₂COOC(CH₃)₃，

(θ)TFA.

实施例7

[(11a S)-5，5-二氧化-11-氧-2，3，11，11a-四氢-吡咯[1，2- b][1，2，5]苯并噻二氮杂-10(1H)-基)-乙酸ST2590(52)的制备中间体1-[(2-硝基苯基)磺酰基]-L-脯氨酸甲酯(48)的制备

将5.0g(30mmol)L-脯氨酸甲酯(47)悬浮于30ml CH₂Cl₂中，在搅拌下加入8.5ml(60mmol)三乙胺。在N₂下，5℃时，将30ml di CH₂Cl₂中的6.75g(30mmol)2-硝基-苯磺酰氯(46)逐滴加入，N₂气氛下，令混合物在搅拌下反应1.5小时。用冷水对反应溶液洗两次，分离有机相，在无水Na₂SO₄上脱水，令其在真空下至干，获得油状粗产物，用正己烷/乙酸乙酯6∶4作为洗脱剂在硅胶上进行层析之后，得到3.5g的产物(收率：37％)。

TLC：正己烷1/AcOEt：1；R.F.0.56。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)：δ1.90-2.20(m，3H)，2.20-2.45(m，1H)，3.45-3.85(m，1H)，3.70(s，3H)，4.65(dd，1H)，7.70(m，3H)，8.17(m，1H)。

中间体1-[(2-氨基苯基)-磺酰基]-L-脯氨酸甲酯(49)的制备

将3.95g(12.5mmol)1-[(2-硝基苯基)磺酰基]-L-脯氨酸甲酯(48)溶解于55ml甲醇中，在甲醇中活化之后以50％水分散液加入过量的Ni-Raney，对溶液搅拌2.5小时。加入更多的活化的Ni-Raney，然后再对溶液进行45分钟的搅拌，用硅藻土过滤，用乙酸乙酯和甲醇的混合物洗，不使Ni-Raney残余物干。在无水Na₂SO₄上对甲醇过滤溶液进行脱水，令其在真空下至干，得到3.1g足够纯净的产物(收率：87％)。

TLC：正己烷1/AcOEt 1；R.F.0.45。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)：δ1.80-2.35(m，4H)，3.40(t，2H)，4.55(dd，1H)，5.05-5.40(sa，1H)，6.74(t，2H)，7.30(t，1H)，7.72(d，1H)。

中间体[(11a S)-2，3，11，11a-四氢吡咯并[1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮杂-11(10H)-基)-酮5，5-二氧化物(50)的制备

将3.1g(10.9mmol)1-[(2-氨基苯基)-磺酰基]-L-脯氨酸甲酯(49)与50mg对甲苯磺酸(0.268mmol)一起溶解于250ml甲苯中，在回流温度下加热三天，通过Dean-Stark 脱水器除去水。然后用NaHCO₃的饱和溶液以及用水在中性pH下对溶液洗两次，用无水Na₂SO₄脱水，过滤，在减压下至干。用己烷和乙酸乙酯对褐色粗制固体结晶，获得1-1g产物。使用正己烷/AcOEt 55∶45作为洗脱剂，

通过

快速色谱来处理在减压下至干的母液，由此获得另外的550mg。由此获得总共1.65g产物(收率：60％)。

TLC：正己烷/AcOEt 1；R.F.0.25。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)：δ1.75-2.15(m，2H)，2.15-2.38(m，1H)，2.38-2.63(m，1H)，3.05(q，1H)，3.55(q，1H)，4.65(t，1H)，7.00-7.40(m，2H)，7.55(t，1H)，7.95(d，1H)，8.80(sa，1H)。

中间体[(11aS)-5，5-二氧化-11-氧代-2，3，11，11a-四氢吡咯并 [1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮杂-11(10H)-基)-乙酸叔丁基酯(51)的制备

在氮气气流下，向-40℃的15ml无水THF中的200mg NaH(0.0087mol)中加入25ml无水THF中的2.0g[(11aS)-2，3，11，11a-四氢吡咯并[1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮杂-11(10H)-基)-酮5，5-二氧化物(50)。-40℃下45分钟后，加入1.17ml(0.0087mol)

溴乙酸叔丁基酯，令温度升高至20℃(室温)，对溶液搅拌2小时。用冷水稀释溶液，收集汇合用水和盐洗过的有机相。用无水Na₂SO₄对有机溶液脱水，过滤，在减压下令其至干。然后用己烷和乙酸乙酯对产物进行结晶，获得1.76g的产物(收率：61％)。

TLC：正己烷/AcOEt 1∶1；R.F.0.55。

¹H-NMR(200 MHz，CDCl₃)：δ2.52 和2.58(2s，9H)，2.80-2.22(m，3H)，2.45(m，1H)，3.45(m，2H)，3.88(t，1H)，4.05(d，1H)，4.70(d，1H)，7.45 (t，2H)，7.68(t，1H)，8.03(d，1H)。

[(11aS)-5，5-二氧化-11-氧代-2，3，11，11a-四氢二吡咯并[1，2- b][1，2，5]苯并噻二氮杂-10(1H)-基)-乙酸ST2590(52)的制备

向0℃的20ml CH₂Cl₂中的1.75g(0.00478mol)[(11aS)-5，5-二氧化-11-氧代-2，3，11，11a-四氢吡咯并[1，2-b][1，2，5]苯并噻二氮杂-11(10H)-基)-乙酸叔丁基酯(51)溶液中逐滴加入13mlTFA，在室温下对溶液搅拌2小时。

TLC

监控(硅胶，CHCl₃ 9/MeOH)之后，蒸发溶液，残余物加入CH₂Cl₂中，用Na₂CO₃的饱和溶液处理有机相，其被分离出来。

然后用乙酸乙酯洗两次，用浓缩的HCl溶液处理。从溶液中沉淀出产物，用CH₂Cl₂对其进行萃取，用无水Na₂SO₄脱水，令其在旋转蒸发仪上至干，得到1-1g 98％纯的终产物(收率：74％)。

M.P.：149-152℃.

[α]D20：+210.1；浓度0.47％Me-OH.

HPLC：柱：Symmetry C18(3.5μ)4.6×150mm；

流动相：KH₂PO₄ 50mM pH3/CH₃CN 80/20；流速：1.0ml/min；室温；R.T.：10.51min。

¹H-NMR(300 MHz，CDCl₃)：δ1.8-2.2(3H，m，C H ₂C H ₂)；2.4-2.6(1H，m，C H ₂C H ₂)；3.4-3.6(2H，m，C H ₂N)；3.8-3.9(1H，m，CHN)；4.25和4.75(2H，2d，C H ₂COOH)；5.6-6.6(1H，bs，COO H)；7.45(2H，t，Ar)；7.7(1H，t，Ar)；8.0(1H，d，Ar)。

E.A.(C₁₄H₁₄N₂O₄)：

理论值：C：50.31；H：4.54；N：9.02；S：10.33；

实测值：C：50.03 H：4.45；N：8.78；S：10.13。

按照下面的流程7合成合成块ST2610(64)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta8的拟肽化合物，其中使用Ehab M.Khalil及其同事，J.Med.Chem.；1999，42，628-637描述的方法进行至中间体61，再使用下文实施例8描述的方法来进行。

流程7

ST2610的合成

试剂：(a)t-Bu-CHO，cat，CF₃COOH，(b)1.LDA，2.CH₂＝CH-CH，-Br，(c)Silica gel，MeOH/H₂O，

(d)(Boc)₂O，(e)K₂CO₃，(f)O8O₄，NalO₄ ，MeOH/H₂O，(g)D-Homocys-OH，HCl，NaOH，H₂O/EtOH，

(h)1.NEt₃，DMF，2.CH₃l，KHCO₃，(i)1.K₂CO₃，(l)TFA，(m)Fmoc-OSu，NaHCO₃

实施例8

(2R，4’R，8a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)羰基]-6’-氧代四氢-2’H- 螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][[1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(64)的制备

中间体(2R，4’R，8a’R)-1-(叔丁氧-羰基]-6’-氧代四氧-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(62)的制备

将2.55g(0.0069mol)(2R，4’R，8a’R)-6’-氧代四氢-1H，2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-1，4’-二羧酸1-叔丁基4’-甲酯(61)溶解于45ml MeOH和45ml H₂O中；向溶液中加入1.9g(0.0138mol)K₂CO₃。搅拌下将溶液在室温下保持20小时，然后通过将pH降至5以及在减压下使其至干来对进行处理。将获得的残余物加入H₂O中，令其至pH 2-3，用CHCl₃萃取。在无水Na₂SO₄上对有机相脱水，接着蒸发至干。用乙酸乙酯对沥青状物质进行结晶，获得2.4g可过滤白色固体(收率：97％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2/CH₃COOH 0.1；RF：0.65；

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.40，1.45(2d，9H)，2.70-2.05(m，4H)，2.00-2.30(m，1H)，2.25-2.55(m，1H)，2.55-2.80(m，1H)，2.75-3.15(m，1H)，3.50(m，2H)，3.70(t，2H)，4.98(dd，1H)，5.10(d，1H)。

中间体(2R，4’R，8a’R)-4’-羧基-6’-氧代四氢-2’H-螺[吡咯烷- 2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]三氟乙酸酯(63)的制备

将2.1g(0.0058mol)(2R，4’R，8a’R)-1-(叔丁氧羰基]-6’-氧代四氢-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(62)溶解于45ml三氟乙酸中。在室温下对混合物搅拌3小时，在30℃减压下蒸发至干。获得的残余物溶解于少量CHCl₃中，用二乙醚沉淀，迅速过滤形成的固体。该操作进行两次，获得1.55g非常吸湿的白色固体(收率；74％)。

TLC：(CHCl₃ 60/MeOH 40/H₂O 15/IsoPrOH 10/AcOH 15)；RF：0.68。

¹H-NMR(300MHz，D₂O)：δ1.75-2.00(m，1H)，2.00-2.38(m，5H)，2.45(dd，1H)，2.70(dt，1H)，2.77-3.05(m，2H)，3.25-3.55(m，2H)，3.96(d，1H)，5.18(d，1H)。

(2R，4’R，8a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)羰基]-6’-氧代四氢-2’H- 螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]-4’-羧酸ST2610(64)的制备

将1.48g(0.004mol)(2R，4’R，8a’R)-4’-羧基-6’-氧代四氢-2’H-螺[吡咯烷-2，7’-吡咯并[2，1-b][1，3]噻嗪]三氟乙酸酯(63)溶解于50ml H₂O中。向溶液中加入0.67g(0.008mol)NaHCO₃，再加入溶解于75ml丙酮中的1.42g(0.0042mol)Fmoc-N-OSu。在室温下搅拌反应溶液20小时，然后在减压下除去丙酮，加入H₂O，用Et₂O洗溶液。用HCl 2N使水溶液pH为3，用CHCl₃进行萃取。在无水Na₂SO₄上干燥有机相，进行蒸发，获得1.9g玻璃状白色固体(收率：98％)。

M.P.：108°-115℃。

[α]D20：+70.1。

E.A.：(C₂₆H₂₆N₂O₅S).

理论值，7.47％H₂O：C：60.38；H：5.90；N 5.41；S：6.20；

实测值，C：56.77；H：4.85；N：5.06；S：5.26。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.85(m，1H)，1.94(dd，1H)，2.05(m，1H)，2.15(m，1H)，2.42(m，1H)，2.67(d，1H)，2.82(m，2H)，3.00(m，1H)，3.58(dd，2H)，4.20(t，1H)。

HPLC：柱：Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；

流动相：KH₂PO₄ 50mM/CH₃CN 65/35；

流速：1.0ml/min；室温；

R.T.：12.19min。

按照流程8合成合成块ST2775(78)，其可用于合成含有β-转角模拟物Beta9的拟肽化合物，其中使用Ehab M.Khalil及其同事，J.Med.Chem.；1999，42，628-637描述的方法进行至中间体75，再使用下文实施例9描述的方法来进行。

流程8

ST2775的合成

试剂：(a)t-Bu-CHO，cat.CF₃COOH，(b)1.LDA，2.CH₂＝CH-CH₂-CH₂-Br，(c)Silica gel，MeOH/H₂O，

(d)(Boc)₂O，(e)BnBr，DBU，Benzene，(f)OsO₄，NalO₄，MeOH/H₂O，

(g)10％Pd/C，H₂，Benzene，(h)Dcys-OMe.HCl，NaHCO₃，H₂O/EtOH，(i)

NEt₃，CH₂Cl₂，

(l)K₂CO₃，MeOH/H₂O，(m)1.TFA，CH₂Cl₂，(n)Fmoc-OSu，NaHCO₃

实施例9

(2R，3’S，8a’R)-1-[(9H-芴-9-基-甲氧基)羰基]-5’-氧代四氢-7’H- 螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-3’-羧酸ST2775(78)的制备

中间体(2R，3’S，8a’R)-1-(叔丁氧羰基]-5’-氧代四氢-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-3’-羧酸(76)的制备

将1.5g(0.004mol)(2R，3’S，8a’S)-5’-氧代四氢-1H，7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-1，3’二羧酸1-叔丁基3’-甲酯(75)溶解于80ml MeOH和50ml H₂O中；向溶液中加入1.1g(0.008mol)K₂CO₃，在室温下对反应混合物搅拌20小时。

通过用HCl将pH降至5以及在减压下使其至干来对溶液进行处理。将获得的残余物加入H₂O中，令其至pH 2-3，用CHCl₃萃取。在无水Na₂SO₄上对有机相脱水，接着蒸发至干，获得1.4g玻璃状白色固体(收率：100％)。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2/CH₃COOH 0.1；RF：0.7。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.45，1.50(2s，9H)，1.60-2.18(m，6H)，2.20-2.50(m，2H)，3.20-3.80(m，4H)，4.95(dd，1H)，4.38(dd，1H)，7.35(sa，1H)。

中间体(2R，3’S，8a’R)-3-羧酸-5’-氧代-四氢-7’H-螺[吡咯烷- 2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-三氟乙酸盐(77)的制备

将1.4g(0.004mol)(2R，3’S，8a’R)-1-(叔丁氧羰基]-5’-氧代四氢-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-3’-羧酸(76)溶解于25ml CH₂Cl₂和25ml三氟乙酸中。在室温下对混合物进行搅拌；2小时后在30℃下蒸发。获得的残余物溶解于少量CHCl₃中，用Et₂O沉淀，迅速过滤形成的沉淀。该操作重复两次，获得1.07g非常吸湿的白色固体(收率；70％)。

TLC：CHCl₃ 60/MeOH 40/H₂O 15/IPrOH 10/AcOH 15；RF：0.5。

¹H-NMR(300MHz，D₂O)：δ1.70-2.50(m，8H)，3.15(dd，IH)，3.22-3.60(m，3H)，4.60-5.00(m，2H)。

将1.00g(0.0027mol)(2R，3’S，8a’R)-3-羧酸-5’-氧代四氢-7’H-螺[吡咯烷-2，6’-[1，3]-噻唑并[3，2-a]吡啶]-三氟乙酸盐(77)溶解于50ml水中。向获得的溶液中加入0.45g(0.0054mol)NaHCO₃，5分钟后加入溶解于75ml丙酮中的0.94g(0.0028mol)Fmoc-N-OSu。向形成的悬浮液中加入更多丙酮，直到获得溶液，在室温下搅拌溶液。24小时后，蒸发丙酮，重新加入水，用Et₂O洗。再用HCl 2N使水溶液pH为3，用CHCl₃萃取水相。有机相在无水Na₂SO₄上脱水，在减压下使其至干，获得1.2g玻璃状白色固体(收率：90％)。

M.P.：95°-100℃.

E.A.：(C₂₆H₂₆N₂O₅S).

理论值(含3.76％H₂O)：C：62.80；H：5.69；N：5.63；S：6.44。

实测值：C：57.27；H：4.89；N：4.97；S：5.25。

[α]²⁰D：+108.6；浓度在MeOH中0.5％。

TLC：CHCl₃ 8/MeOH 2；RF：0.64。

¹H-NMR(CDCl₃ 300MHz)：δ1.60-2.20(m，5H)，2.25-2.45(m，2H)，2.80，3.05(2dd，1H)，3.30-3.50(m，2H)，3.50-3.70(m，2H)，4.07，4.17-4.35(s，m，2H)，4.37-4.50(m，1H)，4.73，4.92(t，dd，1H)，5.35，5.65(2dd，1H)，5.00-6.40(sa，IH)，7.22-7.45(m，4H)，7.50-7.65(m，2H)，7.65-7.80(m，2H)。

HPLC：柱：Symmetry C18(5μ)3.9×150mm；

流动相：KH₂PO₄ 50mM/CH₃CN 60/40；

流速：1.0ml/min.室温；

R.T.：7.38min；

合成最终化合物

流程9

(以下流程中“ammide”为“酰胺”)

R₁＝AA₁或AA₆或AA₇或AA₅-AA₆(beta)

如果R₁＝AA₁，R₂＝AA₂或AA₂-AA₃-AA₄(SP)

如果R₁＝AA₅-AA₆(beta)，R₂＝AA₄或AA₂-AA₃-AA₄(SP)

如果R₁＝AA₆，R₂＝AA₅

如果R₁＝AA₇，R₂＝AA₆

如果R₂＝AA₂，R₃＝AA₃

如果R₂＝AA₆，R₃＝AA₅

如果R₂＝AA₅，R₃＝AA₄或AA₂-AA₃-AA₄(SP)

如果R₂＝AA₄，R₃＝AA₃

如果R₂＝AA₂-AA₃-AA₄(SP)，R₃＝AA₁或AA₅-AA₆(beta)

如果R₃＝AA₃，R4＝AA₄或AA₂

如果R₃＝AA₅，R4＝AA₄

如果R₃＝AA₄，R4＝AA₃

如果R₃＝AA₂-AA₃-AA₄(SP)，R4＝AA₁

如果R₄＝AA₄，R₅＝AA₅或AA₃

如果R₄＝AA₃，R₅＝AA₂

如果R₄＝AA₂，R₅＝AA₁

如果R₅＝AA₅，R₆＝AA₆

如果R₅＝AA₃，R₆＝AA₂

如果R₅＝AA₂，R₆＝AA₁

如果R₆＝AA₆，R₇＝AA₇

如果R₆＝AA₂，R₇＝AA₁

A.典型的脱保护程序。

B.用于将第一种氨基酸或β-转角模拟物(AA₅-AA₆)与胺偶联的典型程序。

C.用于将随后的氨基酸或间隔基(AA₂-AA₃-AA₄)或β-转角模拟物(AA₅-AA₆)与羧基偶联的典型程序。

D.用于将拟精氨酸基团与羧基偶联的典型程序。

E.典型的乙酰化程序。

F.典型的切割程序

G.用于形成氮杂丙氨酸的典型程序。

H.用于形成氮杂缬氨酸或氮杂亮氨酸的典型程序。

I.用于将拟精氨酸与胍基形成的典型程序。

J.对末端胺基进行胍基化的典型程序。

所有分子都在由氨基甲基NovaGel^TM构成的聚合物支持体上合成，其具有经修饰的Rink接头(0.74mmol/g)，拟肽序列按照基于Fmoc化学的方案合成。反应通常在DMF中进行，用HOBt-TBTU作为酰化反应中的活化剂，DIPEA作为质子清除剂(scavenger)。当必须要对羧基官能团进行更猛烈的活化时，例如，在对芳香族胺进行酰化时，反应在70℃进行，或者通过用二氯亚砜(SOCl₂)将受Fmoc保护的酰化剂的羧基官能团转化为相应的酰基氯^[1]来进行。在这种情况下，反应在70℃于四氢呋喃中进行，其中使用DIPEA或三甲基吡啶作为质子清除剂。

用于合成的保护天然氨基酸、溶剂和试剂购自Chem-Impex；被取代的氨基苯甲酸(间隔基)购自Sigma-Aldrich，按照文献所述，用芴甲基氧羰基氯(Fmoc-Cl)对其进行保护。

在Thermofinnigan LCQ-Duo质谱系统上进行对合成中间体和反应产物的LC/MS和MS信息分析，其中使用H₂O-乙腈梯度系统(溶剂B)，其具有0.1％TFA缓冲过的pH，用于运行HPLC-RP，

梯度1

时间	0	2	13	15	18	20
时间	0	2	13	15	18	20	％B梯度2时间％B	505	555	604560	954895	955095	5525

在Luna(Phenomenex)C18柱；50×2mm；3μm中，流速为0.5mL/min(梯度1)或在Jupiter(Phenomenex)C18柱；250×4.6mm；5μm中，流速为1.0mL/min(梯度2)，所有都应当被理解为：是在通过用由TFA/H2O/Tis/(95∶2.5∶2.5)(300μL)构成的切割混合物对干燥树脂样品(5-10mg)进行3小时处理获得的材料上开发的。

在Jupiter-Proteo(Phenomenex)C柱；250×21.2mm；10μm；90埃上，使用H₂O-MeCN-TFA(97∶3∶0.1)梯度系统[溶剂A]和MeCN∶H₂O∶TFA(80∶20∶0,1)[溶剂B]来进行半制备性HPLC纯化

时间 3 20 10 10 10 5 3

％B 8 30 40 60 98 98 8

缩写

AAA 氨基酸(普通指代)

Ac20 乙酸酐

DMF 二甲基甲酰胺

DIPEA 二异丙基乙胺

DIPEA_abs 纯二异丙基乙胺

Fmoc 9-芴甲基氧羰基

HOBt 1-羟基-1-H-苯并三唑

MeCN 乙腈

min 分钟

TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲四氟硼酸盐

THF 四氢呋喃

TFA 三氟乙酸

Tis 三异丙基硅烷

典型反应程序(见流程9)

典型程序A 从Rink酰胺MBHA树脂的接头的胺官能团，或从锚定到树脂上的拟肽序列除去Fmoc

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板(porous frit)的聚丙烯反应器中，用亚甲基氯(15mL/g树脂)和二甲基甲酰胺(15mL/g树脂)进行树脂膨胀。然后用二甲基甲酰胺中的25％哌啶溶液(15mL/g树脂)对树脂进行处理，以从接头的胺官能团或从锚定到树脂上的拟肽序列除去Fmoc保护基团，以及生长(growing)。对混合物搅拌20分钟。指定的时间过后，排出脱保护混合物，用二甲基甲酰胺(15mL/g树脂，重复5次，每次5分钟)洗树脂。

典型程序B-在Rink酰胺MBHA上加载第一个氨基酸或β-转角模拟物

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，使用标准程序，用酰化剂(相对树脂而言5当量的)对按照A节所述获得的树脂接头的游离胺官能团进行处理，以加载第一个氨基酸或β-转角模拟物，以形成典型程序C所述的肽键。针对未反应的胺，用Kaiser测试来监测反应趋势。阳性的Kaiser测试的情况下，将树脂从反应混合物排出，用二甲基甲酰胺洗(15mL/g树脂，重复5次，每次洗5分钟)。

典型程序C-在肽-氨基酰基-树脂或β-转角模拟物-树脂上加载氨基酸或疏水间隔基

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，使用标准程序，用酰化种类(相对树脂而言5当量的)对按照典型程序B所述的锚定到树脂的Fmoc-脱保护拟肽序列进行处理，将其溶解于溶液HOBt以及二甲基甲酰胺中的TBTU 0.5M(相对树脂而言5当量的)和二甲基甲酰胺中的DIPEA 1.0M(相对树脂而言10当量的)中。对混合物进行搅拌，只要可以，就通过Kaiser测试对偶联趋势加以监测。不超过120分钟的时间内，将树脂从反应混合物排出，用二甲基甲酰胺洗(15mL/g树脂，重复5次，每次5分钟)。

典型程序D-氨基酸或拟精氨酸与疏水间隔基芳香胺官能团的偶联

在具有螺帽的玻璃反应器中，向锚定到树脂上的拟肽序列加入来源于Fmoc-氨基酸或拟精氨酸的酰基氯(相对树脂而言5当量的，用于下文描述的典型制备)以及溶解于四氢呋喃中的质子清除剂DIPEA(或三甲基吡啶)(500μL)。在70℃对混合物搅拌2小时，阳性的Kaiser测试的情况下，将树脂从反应混合物排出，用二甲基甲酰胺洗(15mL/g树脂，重复5次，每次5分钟)。

拟精氨酸酰基氯的制备。典型程序：在玻璃反应器中，在磁力搅拌下，将二氯亚砜(5mL)加入到二乙醚中的拟精氨酸或受Fmoc保护的拟精氨酸(20mL中16mmol)中。将获得的悬浮液加热至回流条件(75-80℃)，2小时。期间混合物变得清澈。当转化完成(甲醇分解作用产物的，IPC：TLC在硅胶60F₂₅₄ Merck板上，洗脱剂为正己烷-AcOEt 70∶30)，将反应混合物冷却至环境温度，蒸发溶液。油状残余物与正己烷(4×50mL)共蒸发，在高真空下干燥，最终产生了预期的产物。

典型程序E-对锚定到树脂的拟肽的N-末端胺官能团进行乙酰化

完成对拟肽的合成以及按照典型程序A去除Fmoc保护基团后，在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，用Ac₂O/DIPEA/DMF[15∶45∶40](10mL/g树脂，重复两次，每次30分钟)的混合物对锚定到树脂的序列加以处理，用于对拟肽序列的N-末端氨基酸的α-胺官能团进行乙酰化。用Kaiser测试来监测乙酰化趋势。阳性的Kaiser测试结果的情况下，将树脂从反应混合物排出，用二甲基甲酰胺(15mL/g树脂，重复5次，每次洗5分钟)、二氯甲烷(15mL/g树脂，重复3次，每次洗5分钟)、二乙醚(15mL/g树脂)洗，通过经历氮气流来干燥。

典型程序F-从Rink酰胺MBHA树脂解离拟肽序列

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，用二乙醚和氮气流洗过树脂之后，用TFA-TiS-H₂O[95∶2,5∶2.5]的混合物(10mL/g树脂)对树脂进行处理，用于解离拟肽。对混合物搅拌2小时。指定的时间过后，从树脂过滤出混合物，向滤液中加入二乙醚(15mL)。获得的溶液在-20℃冷却12小时。沉淀与溶液分离时，对混合物进行离心，以回收固体。后者不存在时，在减压下蒸发溶液以回收残余物。

典型程序G-在树脂上形成氮杂甘氨酸

对该程序而言，使用的方案是Kessler在文章J.Org.Chem.；1999，64，7388-7394中描述过的，其中，在按照典型程序A中所述处理之后，使用受Fmoc保护的Rink酰胺MBHA，代替文章中描述的树脂：

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，用无水CH₂Cl₂(3×1mL)去洗Fmoc脱保护的Rink酰胺MBHA树脂或Fmoc脱保护的拟肽序列(锚定到树脂的，按照典型程序B制备的)，加入无水CH₂Cl₂(1mL)中的5-(9H-芴基-9-基甲氧)-1，3，4-氧二氮杂茂-2(3H)-酮(相对树脂而言5当量的)溶液。反应混合物在室温下振荡90分钟，将树脂从反应混合物排出，用无水CH₂Cl₂(3×1mL)和二甲基甲酰胺(3×1mL)洗。

典型程序H-在树脂上形成氮杂缬氨酸和氮杂亮氨酸

对该程序而言，使用的方案是Kessler在文章J.Org.Chem.；1999，64，7388-7394中描述过的用于在树脂2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-异丙基-肼或2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-异丁基-肼(代替2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-甲基-肼)上形成氮杂丙氨酸的，其中，在按照典型程序A中所述处理之后，使用受Fmoc保护的Rink酰胺MBHA，代替文章中描述的树脂：

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，用无水二甲基甲酰胺(3×1mL)去洗Fmoc脱保护的Rink酰胺MBHA树脂或Fmoc脱保护的拟肽序列(锚定到树脂的，按照典型程序B制备的)，加入1mL无水二甲基甲酰胺中的2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-异丙基-肼或2-(氯羰基)-1-Fmoc-2-异丁基-肼(相对树脂而言5当量的)和47μL DIPEA。反应混合物在室温下振荡15小时，将树脂从反应混合物排出，用无水二甲基甲酰胺(3×1mL)洗。

典型程序I-制备拟精氨酸AM8。在Rink酰胺MBHA树脂上通过 Fmoc-异硫氰酸盐合成胍基(guanidylic group)

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，将溶解于二甲基甲酰胺(4.0mL/g)中的Fmoc-异硫氰酸盐(相对树脂而言10当量的)加入按照典型程序A所述处理过的Rink酰胺MBHA树脂。对混合物搅拌12小时。这段时间过后，排出树脂，用二甲基甲酰胺(5mL×5)去洗，用二甲基甲酰胺(10mL)中的CH₃I(相对树脂而言10当量的)和DIPEA(相对树脂而言30当量的)溶液进行处理。在室温下对混合物搅拌2小时，然后排出，用二甲基甲酰胺(5×5mL)洗。向该材料中加入1，4-二氨基丁烷(相对树脂而言10当量的)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液。在室温下对混合物搅拌12小时。这段时间过后，排出树脂，用二甲基甲酰胺(5×5mL)洗。

典型程序J-对锚定到Rink酰胺MBHA树脂的拟肽序列的末端胺官能团进行胍基化

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，用二氯甲烷(15mL/g)中的1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰基)胍(3.0当量)的溶液，通过对N-末端胺官能团的胍基化，对锚定有不含Fmoc的拟肽序列的树脂进行处理。对混合物搅拌24小时。正的测试结果的情况下，将树脂从反应混合物排出，用二氯甲烷(15mL/g树脂，重复5次，每次洗5分钟)和二乙醚(15mL/g树脂)洗，通过氮气流来干燥。

实施例10

ST2565[Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂，MW＝797.41]的制备

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，向按照典型程序A所述处理过的Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)中加入Fmoc-(D)Arg(pbf)-OH(250μmol)，用于按照上文所述加载第一个氨基酸。对混合物搅拌45分钟。指定的时间过后，用二甲基甲酰胺(2mL×5)洗树脂，对其进行处理以去除Fmoc(典型程序A)。重复所述合成循环，以加载第一个之后的氨基酸。向生长中的拟肽依次加入Fmoc-(D)Asp(Ot-Bu)-OH(250μmol)、Fmoc-(D)Val-OH(250μmol)、Fmoc-(D)Leu-OH(250μmol)、Fmoc-(D)Pro-OH(250μmol)、Fmoc-Gly-OH(250μmol)和Fmoc-(D)Thr(OtBu)-OH(250μmol)。通过Kaiser测试监控偶联。完成序列并且按上文所述去除Fmoc之后，按上文所述，用Ac₂O/DIPEA/DMF[15∶45∶40](2mL×2×30分钟)的混合物对拟肽加以处理，用于最后一个氨基酸的α-胺官能团进行乙酰化。用Kaiser测试来监控乙酰化趋势。阳性的测试结果的情况下，将树脂从反应混合物排出，用二甲基甲酰胺(2mL×5)、二氯甲烷(2mL×3)和二乙醚(2mL)洗，通过氮气流来干燥。

按照上文所述，通过用TFA-TiS-H₂O[95∶2.5∶2.5]的混合物(1mL，2小时)对肽进行切割来处理干的树脂。指定时间过后，过滤混合物，向滤液加入二乙醚(15mL)。作为该操作的结果，沉淀与溶液分离。将悬浮液在-20℃保持12小时，然后离心。将获得的固体溶解于H₂O/乙腈/TFA[50∶50∶0.1](5mL)中，冻干，产生预期的肽[13.5mg；LC(梯度1)：保留时间＝5.70分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例11

ST2792[PAM9-SP02-Beta2-Thr-NH₂，MW＝552.11]的制备

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，向按照典型程序A所述处理过的Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)中加入Fmoc-Thr(OtBu)-OH(250μmol)，用于按照典型程序B和C所述加载第一个氨基酸。对混合物搅拌45分钟。该时间过后，从反应混合物排出树脂，用二甲基甲酰胺(2mL×5)洗，对其进行处理以去除Fmoc(典型程序A)。

重复所述合成循环，以加载Fmoc-[Beta2]-OH(250μmol)和Fmoc-SP02-OH(250μmol)。除去Fmoc后，按照典型程序D所述，向获得的拟肽序列中加PAM9-C1(250μmol)，其中在PAM9-C1和SP02的胺官能团的偶联反应中使用DIPEA作为清除剂。在70℃对混合物搅拌2小时。正的测试结果的情况下，将树脂从反应混合物排出，用二甲基甲酰胺(2mL×5)、二氯甲烷(2mL×3)和二乙醚(2mL×3)洗，通过氮气流来干燥。最后，按照典型程序F所述，通过对肽进行切割来处理干的树脂。对来自树脂的切割产物进行HPLC-RP纯化，并冻干，最终产生预期的分子[9.1mg；LC(梯度1)：保留时间＝5.55分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例12

ST2864[Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH₂，MW＝502.61]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[19.0mg；LC(梯度2)：保留时间＝17.31分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例13

ST2794[PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH₂，MW 615.21]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[19.0mg；LC(梯度1)：保留时间＝6.20分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例14

ST2796[AM9-SP02-Pro-Gly-NH₂，MW＝433.21]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。完成序列以及除去Fmoc之后，通过按照典型程序J所述对β-丙氨酸的末端胺官能团进行胍基化，对仍在树脂上的拟肽进行处理。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[10.0mg；LC(梯度2)：保留时间＝19.12分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例15

ST2863[AM9-SP17-Pro-Gly-NH₂，MW＝460.51]的制备

按照实施例13所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[12.5mg；LC(梯度2)：保留时间＝18.12分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例16

ST2797[PAM8-SP15-Pro-Gly-NH₂，MW 492.11]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[8.3mg；LC(梯度2)：保留时间＝29.03分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例17

ST2807[PAM9-(SP31)₃-Pro-Gly-NH₂，MW＝675.51]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列，重复三次典型程序C。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[4.4mg；LC(梯度2)：保留时间＝22.54分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例18

ST2798[PAM9-SP38-Pro-Gly-NH₂，MW＝445.31]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[11.8mg；LC(梯度2)：保留时间＝18.83分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例19

ST2799[Ac-arg-asp-val-leu-Betal-NH₂，MW 722.31]的制备

按照实施例10所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[11.9mg；LC(梯度2)：保留时间＝6.3分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例20

ST2801[Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH₂，MW＝629.31]的制备

按照典型程序A、B、C和D所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列(在这种情况下，在Fmoc-Arg(pbf)-C1与间隔基12胺官能团的偶联反应以及典型程序E和F中，三甲基吡啶用作为清除剂)。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[2.9mg；LC(梯度2)：保留时间＝18.16分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例21

ST2804[Ac-Arg-SP02-Beta2-Gly-NH₂，MW601.01]的制备

按照实施例21所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[2.7mg；LC(梯度2)：保留时间＝18.22分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例22

ST2806[AM8-SP38-Beta6-NH₂，MW＝571.31]的制备

在装备有盖和位于底部的排水旋塞和多孔玻璃板的聚丙烯反应器中，按照典型程序I所述，对Rink酰胺MBHA(135mg，约100μmol)进行处理。按照典型程序B、C和F所述，在树脂上构建的G8上完成对拟肽序列的合成。从对树脂切割获得的物质经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的产物[0.9mg；LC(梯度1)：保留时间＝6.78分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例23

ST2805[NH₂-arg-SP02-Beta5，MW＝578.31]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[0.3mg；LC(梯度2)：保留时间＝20.70分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例24

ST2825[PAM4-SP19-Beta8-NH₂，MW＝591.01]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[9.3mg；LC(梯度1)：保留时间＝12.28分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例25

ST2828[H-SP32-Beta3-NH₂，MW＝384.11]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[33.3mg；LC(梯度1)：保留时间＝7.62分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例26

ST3324[PAM11-SP19-Beta8-NH₂，MW＝572.71]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[9.4mg；LC(梯度1)：保留时间＝17.30分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例27

ST3374[PAM10-SP6-Beta8-NH₂，MW＝514.991]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[1.6mg；LC(梯度1)：保留时间＝10.15分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例28

ST3375[PAM3-SP30-Beta8-NH₂，MW＝557.071]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[0.6mg；LC(梯度1)：保留时间＝11.23分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例29

ST2793[PAM8-SP20-Beta3-NH₂，MW＝569.21]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[3.5mg；LC(梯度1)：保留时间＝10.02分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例30

ST2941[PAM3-SP33-beta8-NH₂，MW＝533.01]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[1.3mg；LC(梯度1)：保留时间＝10.08分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例31

ST2826[PAM6-SP20-Beta8-NH₂，MW＝565.21]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[5.5mg；LC(梯度1)：保留时间＝8.87分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例32

ST2926[H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH₂，MW＝583.71]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列，例外之处在于，按照典型程序H所述来形成氮杂缬氨酸。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[4.9mg；LC(梯度1)：保留时间＝4.98分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例33

ST3032[Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂，MW＝755.81]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列，例外之处在于，按照典型程序G所述来形成氮杂甘氨酸。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[10.0mg；LC(梯度1)：保留时间＝8.25分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例34

ST2927[Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH₂，MW＝641.71]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列，例外之处在于，按照典型程序G所述来形成氮杂甘氨酸。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[18.2mg；LC(梯度1)：保留时间＝5.17分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例35

ST2930[Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂，MW＝798.91]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列，例外之处在于，按照典型程序G所述来形成氮杂甘氨酸。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[19.1mg；LC(梯度1)：保留时间＝6.20分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例36

ST2920[Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH₂，MW＝681.81]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列，例外之处在于，按照典型程序H所述来形成氮杂甘氨酸。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[11.7mg；LC(梯度1)：保留时间＝5.88分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

实施例37

ST2928[Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH₂，MW＝697.81]的制备

按照实施例11所述，在Rink酰胺MBHA(66mg，约50μmol)上合成指出的拟肽序列，例外之处在于，按照典型程序H所述来形成氮杂甘氨酸。来自树脂的切割产物经HPLC-RP纯化，并被冻干，最终产生预期的分子[12.00mg；LC(梯度1)：保留时间＝5.18分钟；Ms：(m+1)＝在给定范围内]。

根据本发明的化合物可用作为药物以及作为工具(means)用于生物试验。

它们的活性由对蛋白质MyD88同型二聚体化的抑制构成，由此能抑制更大量的前炎性信号，组成更有效的治疗剂。

在其普通应用中，本发明提供了结构式(I)的化合物用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗源自对TLR/IL-R1受体系统的信号传递系统调节不良的疾病。

本领域知识能使专家基于上面提到的分子生物学机制确定可被治疗的疾病。

根据本发明可治疗的疾病选自炎性和自身免疫疾病；心血管和致动脉粥样硬化性疾病；脓毒症和休克；以及移植排斥构成的组。

炎性和自身免疫疾病的例子是关节炎、痛风性关节炎、慢性炎性肠疾(IBD)、牛皮癣、1型糖尿病、多发性硬化、哮喘和系统性红斑狼疮。

心血管和致动脉粥样硬化性疾病的例子是心肌梗塞、病毒性心肌炎、动脉硬化、移植静脉硬化、血栓、再狭窄、由于支架造成的再狭窄以及由于血管成形术造成的再狭窄。

非炎性疾病的例子包括癌症和AIDS。

根据本发明的药物将含有有效量的结构式(I)的化合物，这根据正常临床试验确定。然后，初级保健医师将根据待治疗疾病种类、患者状况以及任何伴随的疗法来确定剂量。

生物试验

对作为本发明主题的化合物进行生物性质的测试，以鉴定它们部分或完全抑制MyD88的同型二聚体化以及由此调节对NF-κB的激活的能力。为达到此目的，使用三种类型的试验：a)双杂交试验，在酵母中进行，下文提供了对其的简单描述，b)NF-κB抑制试验，在下文中描述，以及c)荧光素酶活性的报告基因试验，在下文中描述。被认为有活性的化合物是在三种生物试验中任意一种中被发现有活性的。

a)双杂交试验

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的双杂交系统基于体外重构(reconstitute)转录因子GAL4的能力，GAL4可被分为两个功能性结构域：激活结构域(AD)和结合结构域(BD)(Field，S.；Song，O.；Naturee，1989，340：245-247；Chien，CT.；et al.；Proc.Nat.Acad.ScL USA；1991，88：9578-9582)。如果，通过分子生物学技术这两个结构域可以和能相互作用的两个蛋白融合的话，结果将是GAL4的功能性重构，这将激活处于其自身上游激活序列(UAS)控制下的大量报告基因。处于GAL4的UAS控制下的报告基因的转录将允许对对于在选择性培养基中的生长来说重要的酶进行合成。该试验用384孔板来进行，其底部存在加入了荧光底物的硅氧烷基质，该荧光底物的发射光对氧的水平敏感(Wodnicka，M.；et al.；J.Biomol.Screen；1995，5：141-152)。在双杂交系统中，当与GAL4的BD和AD结构域分别融合的两个蛋白之间发生相互作用时，酵母将能在选择性培养基中生长，并且将消耗氧，发射出荧光，这将随着时间进程增加，可用合适的荧光测读计(Fusion，Perkin Elmer)探测到。如果酵母被放置于存在能抑制该相互作用的分子的地方，报告基因的转录将减少，因此，在最小限度培养基中生长的能力将降低并伴随荧光信号的减少。

用于表达与结构域AD和BD融合的MyD88的载体(pGBKT7和pGADT7)由Clontech提供，用于共转化的酵母菌株AH109(MATa，trp1-901 leu2-3 112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal80Δ和最小限度培养基SGd/-Leu/-Trp e SGd/-Ade/-His/-Leu/-Trp也一样。用于该试验的384孔板由BD Biosciences(Oxygen BioSensor Plates)提供，用于测量荧光的仪器是Perkin Elmer Fusion设备。经两种基因融合体(AD-MyD88和BD-MyD88)共转化过的菌株AH109被预接种于2mL SGd/-Leu/-Trp中，在30℃于200rpm搅拌下培养过夜；然后，在存在待试分子(终浓度100mM)的情况下，针对384孔板的每个孔，在100mL SGd/-Ade/-His/-Leu/-Trp中对预接种物加以稀释(1/20)。在30℃于Fusion中温育平板，使用485nm的荧光团激发波长来测定各个孔发射的荧光，每90分钟，从平板底物读取630nm的发射，总共25个读数。荧光强度是任意单位(arbitrary unit)，因此必须进行归一化：一个孔在时间n的荧光强度必须除以同一个孔的初始荧光强度。

对荧光增加曲线的分析

通过针对这种类型的研究特别制作的系统(Chrysallis s.a.s.software-house精心制作的软件，无限使用许可授予TecnogenS.C.p.A.)，对通过双杂交试验产生的荧光增加曲线加以分析。

曲线分析能直接涉及数据获取仪器产生的文件，而无须对数据进行预先处理，由此能立即进行定量类型的分析。

举例而言，图1/4展示了从含有大多数第2类化合物的一块平板获得的曲线。关于荧光增加的曲线表示为NRF(相对于时间0的归一化相对荧光)，其是时间的函数。

软件提供了定量参数，其能描述各曲线的特征，如图所示，其展示了非常不同的方面。具体而言，使用了七种不同的描述符：斜率(平台的斜率)、水平(平台的高度)、范围(平台的范围)、ΔT(生长时间)、t1/2(生长至平台高度的50％的时间)、因子(“驼峰(hump)”因子)和Tau(sigmoidalτ)。通过这些定量参数，可能获得对实验曲线组的多维示意图。由此开始，使用用于主要组分的提取技术，构建对数据的二维示意图，以尽可能清楚地强调出曲线之间的差别。后面的阶乘平面(factorial plane)“解释了”在从研究的平板获得的曲线(由不同符号代表)间鉴定出的变异性，将它们归因于多种参数或其组合(图2/4)。

前两个阶乘轴(axes)解释的变异性为77.6％+13.7％＝91.3％，因此，第一个阶乘平面上的二维图完全足以以良好程度来展示曲线空间分散近似值。第一个阶乘轴趋向于将具有高平台水平的曲线(我们发现处于该轴右边的)与具有较低平台水平的那些(相反地，其将在轴的左边)分开。后者还展示出下述特征：较之位于右边的曲线而言，具有更高ΔT、Tau、VA、范围和斜率。这些描述符的值越高，它们就离两轴交点越远。

这种类型的示意图允许鉴定出具有相似情况的曲线的“组”(具有相同符号的曲线对应于具有相似特征的曲线)，以及清楚鉴定出哪些曲线是影响氧消耗进而影响酵母生长的化合物产生的。

因此从该平板(其提供了该示意图(图3/4))选出的是图2/4中以符号x表示的曲线，其较之该平板上存在的化合物产生的曲线的平均值，展示出较低的平台水平以及较高的生长时间(ΔT)和tau值，如下述统计数据所报告的：

ΔT＝36.001±0.0(14.615±10.252)

水平＝2.884±0.667(4.763±1.131)

斜率＝0.263±0.077(0.125±0.096)

范围＝0.801±0.279(0.364±0.294)

Tau＝30.005±0.0(8.805±12.146)

t1/2＝33.006±0.012(25.142±4.738)

因子＝0.006±0.002(0.402±0.258)

括号中的值是针对在分析的平板中该参数获得的平均值。

此外，图2/4中以符号·表示的曲线组选自该平板，尽管它们展示出比平均值高的因子，低于平均值的ΔT值，但它们展示出高于从平板上存在的化合物产生的曲线的平均值的t1/2、范围和斜率，如下述统计数据所报告的(图4/4)：

ΔT＝22.687±1.577(14.615±10.252)

水平＝4.044±0.377(4.763±1.131)

斜率＝0.261±0.071(0.125±0.096)

范围＝0.746±0.201(0.364±0.294)

Tau＝30.005±0.003(8.805±12.146)

t1/2＝33.004±0.0(25.142±4.738)

因子＝0.619±0.056(0.402±0.258)

上述分析系统以同样的方式用于所使用的所有平板，以选出根据本发明的化合物，产生了下述结果：

第1类

名称序列

ST2402 Ac-arg-asp-val-leu-pro-gly-NH₂

ST2565 Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂

ST2842 Arg-Asn-Val-Cys-Pro-Gly-Cys-NH₂

|-------------|

ST2946 Ac-arg-asn-val-leu-pro-gly-NH₂

ST2947 Ac-arg-asp-val-val-pro-gly-NH₂

第2类

名称序列

ST2793 PAM8-SP20-Beta3-NH₂

ST2806 AM8-SP38-Beta6

ST2825 PAM4-SP19-Beta8-NH₂

ST2826 PAM6-SP20-Beta8-NH₂

ST2827 PAM6-(SP39)₂-Beta3-NH₂

ST2828 SP32-Beta3-NH₂

ST2848 AM8-SP12-Beta7

ST2849 PAM8-SP33-Beta4-NH₂

ST2851 PAM3-SP39-Beta3-NH₂

ST2852 PAM6-(SP39)₄-BETA3-NH₂

ST2935 PAM8-SP12-Beta3-NH₂

ST2936 PAM10-SP19-Beta3-NH₂

ST2937 AM8-SP33-Beta5

ST2938 PAM3-SP39-Beta4-NH₂

ST2940 AM4-SP33-Beta3-NH₂

ST2941 PAM3-SP33-Beta8-NH₂

ST3374 PAM10-SP6-Beta8-NH₂

第3类

名称序列

ST2791 PAM8-SP2-Beta1-Thr-NH₂

ST2795 PAM6-SP18-Pro-Gly-NH₂

ST2796 AM9-SP2-Pro-Gly-NH₂

ST2797 PAM8-SP15-Pro-Gly-NH₂

ST2853 AM1-GLY-SP30-Pro-Gly-NH₂

ST2854 Beta7-SP2-arg-NH₂

ST2855 Ac-AKG-SP12-Beta1-THK-NH₂

ST2856 PAM8-ASP-VAL-VAL-Pro-Gly-Gly-NH₂

ST2857 PAM10-SP18-Pro-Gly-NH₂

ST2858 PAM3-SP18-Pro-Gly-NH₂

ST2859 PAM6-SP12-Pro-Gly-NH₂

ST2862 AM9-SP15-Pro-Gly-NH₂

ST2863 AM9-SP17-Pro-Gly-NH₂

ST2864 Ac-Gly-PK07-SP30-Arg-NH₂

ST2867 Beta6-val-val-asp-arg-NH₂

ST2868 Ac-Gly-Pro-SP2-Arg-NH₂

ST2869 Ac-Pro-Gly-SP2-ARG-NH₂

ST2870 PAM8-(SP31)₄-Pro-Gly-NH₂

ST2942 Beta5-SP38-His-OH

ST2943 PAM10-SP2-Pro-Gly-NH₂

ST2944 PAM6-SP14-Pro-Gly-NH₂

ST2945 PAM9-(SP17)₂-Pro-Gly-NH₂

b)NF-κB抑制试验

对NF-κB的激活是发生于MyD88同型二聚体化以及其与大量受体复合物的胞质内部分结合下游的事件。因此，对本发明的主题的化合物抑制对NF-κB的激活的能力加以评估，对NF-κB的激活是IL1α诱发的信号放大级联下游的。

用MTT细胞存活力测试对所有分子进行了检验，验证了：用于NF-κB抑制试验中的化合物的剂量低于毒性剂量。

将HeLa*细胞培养于EMEM(EBSS)培养集中，其中补充有2mM谷氨酰胺+1％非必要氨基酸+7.5％FBS(胎牛血清)+10ml/1青霉素-链霉素溶液(10,000单位/ml青霉素和10mg/ml链霉素)。

(所有细胞培养基和多种组分都购自Sigma-Aldrich。*HeLa细胞系，尼格罗人宫颈上皮癌Human，来自SIGMA ALDRICH ECACC，编号93021013。IL1α*＝SIGMA 12778白细胞介素-1-alpha IL1a Human，其是E.coli中重组表达的)。

所有细胞都在经历了次数在14至35范围内的细胞传代之后使用。

以300,000细胞/孔的密度，将细胞接种于6孔板，完全培养基中，在37℃，5％CO₂培养过夜。

大约18小时后，除去完全培养基，用PBS 1x洗细胞两次，向每个孔中加入1ml不含PBS的培养基。

随后将待测试分子以100μM的浓度加入到培养基中。然后在37℃ ，5％CO₂对细胞培养6小时。

试验的所有分子都溶解于DMSO中。

将等体积的DMSO加入到阴性对照中，即，没有用分子处理过的细胞中。

在用分子处理的末尾，用5ng/ml的IL1α*对细胞进行30分钟的刺激，在37℃，5％CO₂培养。

将等体积的PBS/BSA 0.4％(用于溶解IL1α的溶液)加入到阴性对照中，即，未受刺激的细胞。

用IL1α刺激之后，用PBS 1x对细胞洗两次，通过刮取来收集细胞。

然后在800rpm，4℃对细胞离心10分钟。

除去上清液。将沉淀重新悬浮于裂解缓冲液**中，在4℃培养10分钟，以最大速度在4℃离心。除去沉淀，上清液冷冻于-80℃。

随后通过Bradford试验来测量总蛋白含量，其中以已知浓度的BSA作为标准，其用于下文所述的ELISA试验中。

使用Trans AM#(Active Motif)试剂盒来评估对NF-κB的激活/抑制。

I1 Trans AM试剂盒允许对IL1α诱导的对NF-κB的激活进行探测，这通过在常规ELISA试验最后获得的比色反应来实现。

该试剂盒提供了96孔板，其被含有NF-κB的共有位点(5，-GGGACTTT-CC-3’)的寡核苷酸进行过衍生化。该寡核苷酸仅特异结合NF-κB的活性形式，这是用IL1α刺激后释放的。提供来探测NF-κB的第一抗体识别p65抗原决定簇(这仅在转录因子具有活性时才可利用)，并且结合其靶DBNA序列。

提供的次级抗体与马辣根过氧化物酶桥联，加入发色底物时，该酶使得人们可以获得比色反应，这可在450nm的波长处通过分光光度方法来评估。

对样品进行一式两份的重复试验，每种提取物取10μg上样到每个孔中。

在试验末尾，通过对分光光度读数获得的值进行加工来计算％抑制，如下所述：

IL*-C*/IL-C＝对NF-κB的％激活

IL*＝经过刺激，并且用研究分子处理过的细胞的A₄₅₀。

C*＝没有经过刺激，但用研究分子处理过的细胞的A₄₅₀。

IL＝用ILlα刺激过但是没有用分子处理过的细胞的A₄₅₀。

C＝没有经过刺激和处理的细胞的A₄₅₀。

NF-κB激活越高，所测试的分子的活性就越低。

用于进行细胞裂解和ELISA试验的所有试剂都由所使用的试剂盒提供。

在NF-κB抑制试验中被认为是阳性的化合物是给出了≥15％的百分比抑制的那些。

第1类

名称序列 NF-κB％抑制

ST2565 Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂ 30

第2类

名称序列 NF-κB％抑制

ST3375 PAM3-SP30-Beta8-NH₂ 33

ST2828 SP32-Beta3-NH₂ 27

ST2825 PAM4-SP19-Beta8-NH₂ 26

ST2806 AM8-SP38-Beta6 24

ST2826 PAM6-SP20-Beta8-NH₂ 23

ST2793 PAM8-SP20-Beta3-NH₂ 18

ST2863 AM9-SP17-Pro-Gly-NH₂ 17

ST2941 PAM3-SP33-BETA8-NH₂ 17

第3类

名称序列 NF-κB％抑制

ST2804 Ac-Arg-SP2-Beta2-Gly-NH₂ 34

ST2807 PAM9-(SP31)₃-Pro-Gly-NH₂ 33

ST2794 PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH₂ 25

ST2799 Ac-arg-asp-val-leu-Beta1-NH₂ 23

ST2792 PAM9-SP2-Beta2-Thr-NH₂ 22

ST2797 PAM8-SP15-Pro-Gly-NH₂ 20

ST2798 PAM9-SP38-Pro-Gly-NH₂ 18

ST2796 AM9-SP2-Pro-Gly-NH₂ 17

ST2801 Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH₂ 17

ST2864 Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH₂ 16

ST2805 NH₂-arg-SP2-Beta5 15

c)在用IL-1刺激过的人类肠CaCo2上皮细胞中对荧光素酶活性进行的报告基因试验

这基于用报告基因质粒对CaCo2人类肠上皮细胞的瞬时共转染，该质粒的荧光素酶报告基因表达处于IL-1-应答性人IL-8启动子基因区域的控制下。共转染中的第二种质粒是编码对照Renilla荧光素酶报告基因的载体，其组成性表达用于估计测试的化合物的非特异性细胞毒性。该试验结果被定义为针对萤火虫和Renilla荧光素酶的相对应答比例(Relative Response Ratio，RRR)，如下所述：

其中，实验样品是以实验报告基因荧光的每秒浓度(cps)表示的值，其是针对任何未知样品定义的。阳性对照是以报告基因荧光的cps表示的值，其是针对下述样品定义的，所述样品鉴定了在不存在参照抑制化合物时IL-1的最大诱导。阴性对照是以报告基因荧光的cps表示的值，其是针对下述样品定义的，所述样品鉴定了IL-1诱导的不存在。对于非诱导型的Renilla荧光素酶，RRR按照如下来定义：

RGA是上述实验的结果，其按照下文所述来进行：

将6×10⁶个粘附CaCo2细胞涂布到10cm平板上。18-24小时之后，更换培养基，使用9mL D-MEM+谷氨酰胺580mg/L，不加FBS和抗生素。对于每块平板，然后将26μgIL-1-应答性报告基因载体DNA(pGL2-NA-INT)和4μg对照报告基因载体DNA溶解于500μLOptimem(Invitrogen)中；在室温下对该后一种反应混合物进行5分钟温育。然后将DNA混合物逐滴加入到Lipofectamine 2000混合物中。在室温下对得到的DNA/Lipofectamine混合物温育20分钟，通过轻柔摇晃平板，将其逐滴加到培养平板上。然后在37℃和5％CO₂对培养平板进行6小时温育。然后按照实验设计的要求，对细胞进行胰蛋白酶处理，将其以5×10⁴个细胞/孔转移进96孔板的100μL培养基(D-MEM，具有FBS1％+谷氨酰胺580mg/L)中。之后，在37℃ 和5％CO₂对细胞温育16-18小时，按照下文所述进行处理：

从每个孔取出培养基。

向对照细胞孔中加入60μL新鲜的培养基。

向IL-1处理孔中加入40μL新鲜的培养基。

向抑制剂物质的孔中加入40μL新鲜的培养基以及20μL以100μM的浓度存在的物质和0.4％DMSO。

在IL-1处理孔和对照细胞孔中加入20μL新鲜的培养基，其中补充有0.4％DMSO。

在37℃和5％CO₂温育4小时。

2小时后，在37℃和5％CO₂用20μL IL-1(500pg/mL)刺激额外的两小时。

在另外一些试验孔中加入合适的量的荧光素酶标准蛋白。

每个孔中加入80μL萤火虫荧光素酶底物(Dual-GIoLuciferase Assay System试剂)。

在室温温育10分钟。

在Veritas lumenometer(Turner BioSystems)上读取萤火虫荧光素酶的结果。

向每个孔中立即加入80μL Renilla荧光素酶底物(Dual-GIoLuciferase Assay System试剂)。

在室温温育10分钟。

在Veritas lumenometer(Turner BioSystems)上读取Renilla荧光素酶的结果。

在RGA试验中被认为是阳性的化合物是给出了≥20％的百分比抑制的那些。

第2类

名称序列％抑制

ST2828 SP32-Beta3-NH₂ 24

ST2825 PAM4-SP19-Beta8-NH₂ 71

ST2793 PAM8-SP20-Beta3-NH₂ 20

ST3324 PAM11-SP19-Beta8-NH₂ 51(80μM)

第3类

名称序列％抑制

ST2926 H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH₂ 20

ST3032 Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂ 21

ST2927 Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH₂ 22

ST2930 Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂ 24

ST2920 Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH₂ 25

ST2928 Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH₂ 29

ST2797 PAM8-SP15-Pro-Gly-NH₂ 31

根据本发明，药物组合物含有至少一种活性成分，其含量为能产生显著疗效的量。本发明包括的组合物是传统的，通过属于制药工业的常规实践的方法来获得，例如通过Remington′s PharmaceuticalScience Handbook，Mack Pub.N.Y.——最新版本中阐述的那些。根据选择的施予途径，组合物将是固体或液体形式的，它们适合用于口服、肠胃外或静脉内施予。根据本发明的组合物含有活性成分以及至少一种可药用载体或赋形剂。配方佐剂可能是特别有用的，例如，增溶剂、分散剂、悬浮剂或乳化剂。

考虑到根据本发明的化合物的肽性本质，具有本领域平均经验的技术人员将能确定对药物组合物中的化合物加以配制，用于以胃保护或受控释放形式口服施予的适用性(advisability)。

序列表

<110>希格马托制药有限公司

<120>MYD88同型二聚体化抑制剂

<130>EPI-8803

<140>EP04425929.9

<141>2005-01-14

<160>14

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>1

Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr

1 5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>2

Arg Asp Val Val Pro Gly Gly

1 5

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>果蝇Drosophila melanogaster

<400>3

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Ash Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>4

Pro Thr Asp Leu Val Arg Gly

1 5

<210>5

<211>4

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>5

Leu Pro Gly Thr

1

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>6

Thr Gly Pro Leu Val Asp Arg

1 5

<210>7

<211>4

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>7

Arg Asp Val Leu

1

<210>8

<211>6

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>8

Arg Asp Val Leu Pro Gly

1 5

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>9

Arg Asn Val Cys Pro Gly Cys

1 5

<210>10

<211>6

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>10

Arg Asn Val Leu Pro Gly

1 5

<210>11

<211>6

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>11

Arg Asp Val Val Pro Gly

1 5

<210>12

<211>6

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>12

Asp Val Val Pro Gly Gly

1 5

<210>13

<211>4

<212>PRT

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成肽

<400>13

Val Val Asp Arg

1

<210>14

<211>10

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工合成序列的描述：合成寡核苷酸

<400>14

gggactttcc 10

Claims

1.结构式(I)的肽和/或拟肽化合物

(X-)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-AA₇

(I)

其中：

X是可药用的阴离子，或者不存在；

AA₁＝L-精氨酸(Arg)、D-精氨酸(arg)、L-组氨酸(His)、D-组氨酸(his)或拟精氨酸基团的残基，或不存在，其中，拟精氨酸表示下述化学结构，其取代精氨酸，并调节功能性基团的碱度，从精氨酸的碱度至零碱度，其具有结构式(II)、(III)和(IV)

Y＝Cl，F，Br，l

Z＝Alk C₁-C₄

(III)

AA₃＝L-缬氨酸(Va )、D-缬氨酸(val)、氮杂缬氨酸(AzaVal)、氮杂甘氨酸(Azagly)、氮杂亮氨酸(AzaLeu)；

AA₂-AA₃-AA₄可共同被间隔基取代，其中，间隔基表示下述疏水化学结构，其具有有限数量的旋转自由度，其含有被各种取代的、官能化的芳香族接头环、仅一个羧酸基团和仅一个一级胺基，参与酰胺键，其具有结构式(V)：

Y＝O-AlkC₁-C₄，COO-Alk C₁-C₄，Cl，F，Br，l

(V)

AA₆＝甘氨酸(gly或Gly)、肌氨酸(Sar)、氮杂甘氨酸(Azagly)；

AA₅-AA₆可共同被β-转角模拟物取代，其中，β-转角模拟物表示下述化学结构，通过模拟Pro-Gly β-转角的中央部分，其允许该分子采用有利于与蛋白质MyD88形成键的构象，其具有结构式(vI)和(VII)

n＝0，1，2

m＝0，1，2

p＝0，1

*＝外消旋物以及纯的对映异构体

(VI)

X＝CO，SO₂

Y＝H，OH

*＝外消旋物以及纯的对映异构体

(VII)

当AA₄＝AA₇＝Cys或cys时，两个半胱氨酸之间存在二硫桥；

AA₁-AA₇之间的键总是酰胺类型的；

满足如下条件：

AA₁-AA₇中的至少一个不是上面指出的天然氨基酸，或者

如果AA₁-AA₇全部都是上面指出的天然氨基酸时，所述AA₁-AA₇是反向的。

2.权利要求1所述的化合物，其中，所述拟精氨酸是下述化学结构，其取代精氨酸，并调节功能性基团的碱度，从精氨酸的碱度至零碱度。

3.权利要求1所述的化合物，其中，所述间隔基表示下述疏水化学结构，其具有有限数量的旋转自由度，其含有被各种取代的、官能化的芳香族接头环、仅一个羧酸基团和仅一个一级胺基，参与酰胺键。

4.权利要求1所述的化合物，其中，所述β-转角模拟物表示下述化学结构，通过模拟Pro-Gly β-转角的中央部分，其允许该分子采用有用于与蛋白质MyD88形成键的构象。

5.权利要求1或2所述的化合物，其中，在AA₁中，拟精氨酸选自下述结构构成的组：

其中，A是直链或支链的C₁-C₄烷基；Al是选自F、Cl、Br和I的卤素原子。

6.权利要求1至3中任意一项所述的化合物，其中，当AA₂-AA₃-AA₄被其中n＝0-3的间隔基(SPX)_n取代，其选自如下结构构成的组

7.权利要求1至4中任意一项所述的化合物，其中，所述β-转角模拟物选自由下述结构构成的组。

8.权利要求1的化合物，其具有结构式Ac-thr-gly-pro-leu-Val-asp-arg-NH₂。

9.权利要求1的化合物，其选自下述结构构成的组：

10.权利要求1的化合物，其中AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代。

11.权利要求10的化合物，其具有结构式。

12.权利要求1的化合物，其中AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代并且AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代。

13.权利要求12的化合物，其选自如下结构构成的组：

14.权利要求1的化合物，其中AA₁是拟精氨酸并且AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代。

15.权利要求14的化合物，其具有结构式。

16.权利要求1的化合物，其中AA₁是拟精氨酸并且AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代。

17.权利要求16的化合物，其选自如下结构构成的组：

其中chiral表示手性。

18.权利要求1的化合物，其中AA₁是拟精氨酸，AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代，AA₅-AA₆被β-转角模拟物取代并且AA7是氨基酸。

19.权利要求18的化合物，其具有结构式：

20.权利要求1的化合物，其中AA₂-AA₃-AA₄被间隔基取代。

21.权利要求20的化合物，其具有结构式：

22.权利要求1的化合物，其中一个或多个氨基酸被一个或多个氮杂氨基酸取代。

23.权利要求16的化合物，其选自如下结构构成的组：

H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH₂

Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH₂

Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH₂

Ac-thr-Azagly-pro-leu-V8l-asp-arg-NH₂

Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH₂

Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH₂

24.权利要求1-23的化合物作为MyD88的特定蛋白部分模拟物的用途，其阻止所述蛋白的同型二聚体化，通过干扰其与TlR结构域的相互作用来实现。

25.作为药物的根据权利要求1-23的化合物。

26.权利要求1-23的化合物用于制备可用于治疗下述疾病的药剂的用途，所述疾病源自对TLR/IL-R1受体系统的信号传递系统的调节不良。

27.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病选自炎性疾病和自身免疫疾病、心血管和致动脉粥样硬化性疾病、脓毒症和休克、移植排斥、癌症和病毒感染构成的组。

28.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病选自关节炎、痛风性关节炎、慢性炎性肠疾(IBD)、牛皮癣、1型糖尿病、多发性硬化、哮喘和系统性红斑狼疮构成的组。

29.如权利要求26所述的用途，其中所述心血管和动脉粥样硬化疾病选自心肌梗塞、病毒性心肌炎、动脉硬化、移植静脉硬化、血栓、再狭窄、由于支架造成的再狭窄以及由于血管成形术造成的再狭窄构成的组。

30.药物组合物，其含有根据权利要求1-23的至少一种化合物，所述化合物处于与至少一种可药用载体和/或赋形剂的混合物中。