KR102138256B1 - 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브, 이를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 생체 외, 내에서 활성화된 케스페이즈-1 효소와 특이적으로 반응하여 분해되고, 형광을 재방출하는 것으로써, 염증반응이 야기된 세포나 조직을 특이적으로 이미징할 수 있다. 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증반응이 유발된 세포나 조직의 영상, 약물전달체, 염증반응을 억제하는 약물의 스크리닝 등의 다양한 목적으로 사용 될 수 있다
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 생체 내(in vivo), 생체 외(in vitro) 모두에 적용이 가능하며, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝(high-throughput screening) 방법 및 조기 질병 진단 등의 다양한 용도로 사용이 가능하다.

Description

케스페이즈-1 활성 측정용 프로브, 이를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물{probe for measuring the activity of caspase-1 and composition for diagnosis of inflammatory diseases comprising the same}
본 발명은 케스페이즈-1 활성을 측정할 수 있는 프로브에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 케스페이즈-1에 의해 분해되는 폴리펩타이드에 형광체 및 소광체가 결합되어, 케스페이즈-1의 존재하에서 형광을 나타내는 새로운 구조의 프로브 및 이를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
우리 체내에는 외부의 위험으로부터 우리를 보호하는 역할을 하는 여러 방어 장치들이 존재한다. 이러한 방어 장치들을 통틀어 '면역작용'이라고 한다. 구체적으로 체내에서 문제를 일으키는, 외부로부터 침투한 외부 물질 또는 체내에 존재하는 내부 물질을 '염증원'이라 하며, 이러한 염증원을 제거하기 위하여 체내의 면역세포들이 다양한 반응을 수행하게 되는데, 이를 면역작용이라고 한다. 이때 '케스페이즈-1' 또는 'caspase-1'은 염증성 단백질 분해효소로, 상기 염증원과 반응하여, 이 신호를 다른 면역세포에게 알리는 '개시자'의 역할을 수행한다.
케스페이즈-1 효소는 평소, 아주 낮은 농도로 체내에서 존재하고 있다가, 염증원이 인식될 경우, 활성화되어 우리 몸의 위험신호를 알리는 중요한 역할을 수행하게 된다. 구체적으로, 체내에 염증원이 침투할 경우, 면역세포들에 의해 특이 수용체로 인식된다. 이후 프로케스페이즈-1 등 여러 단백질로 합쳐진 거대 분자인 '인플라마좀(Inflammasome)'을 생성한다. 이 인플라마좀은 그 구체적인 기전이 정확히 알려지진 않았으나, 염증반응에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 밝혀진 바에 따르면 상기 인플라마좀은 자가 분해를 통해, 프로케스페이즈-1로부터 활성화된 케스페이즈-1을 생성한다. 상기 생성된 케스페이즈-1 효소는 염증반응 초기, 1시간에서 12시간 이내에 일어나는 조기 면역반응이다. 즉, 염증성 질환이 심각해지기 전, 초기 염증 단계에서 발생하기 때문에, 이를 이용하면 조기에 염증을 진단할 수 있을 것이라 예상된다.
그럼에도, 체내에 존재하는 케스페이즈-1 효소의 활성 및 발현 양을 정량적으로 분석화하거나 영상화하기 위해서 많은 과제들이 존재한다. 우선 상기 케스페이즈-1 효소는 세포 내 세포질에 존재하기 때문에, 혈액만으로는 검출이 어렵다는 문제가 있다. 현재까지 케스페이즈-1 효소의 검출을 위해서, 전기영동을 이용한 단백질 정량화 방법이나, 효소면역측정법(The Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 등과 같이 실험적인 방법들이 공지된 바 있다. 그러나 상술한 방법들은 검체의 해당 부위에서 단백질을 추출해야하고, 단백질 추출하기 위해 침습적인 과정이 필수적이며, 추출과정이 복잡하고, 측정을 위한 장비와 고도의 기술을 갖는 기술자가 요구될 뿐만 아니라, 결과를 얻기까지 시간이 필요하다. 따라서, 실시간 또는 직접적으로 생체 내에서 케스페이즈-1 효소를 측정할 수 없으므로, 질병을 조기에 진단하는 것이 불가능하다.
따라서 상술한 문제점을 극복하기 위해서 생체적합성을 가지며 케스페이즈-1을 정확히 실시간 검출 및 진단할 수 있는 새로운 기술 개발이 요구되고 있다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0095187호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 특이적으로 절단되어, 스스로 세포 내에서 형광을 낼 수 있는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브 및 이를 유효성분으로 포함하는 케스페이즈-1 효소를 정성 또는 정량 분석하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 케스페이즈-1 활성 측저용 프로브를 유효성분으로 함유하는 케스페이즈-1 효소의 활성화를 억제하는 약물 스크리닝용 조성물 및 이의 활용성을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 4 내지 7 개의 아미노산 잔기로 이루어지고 케스페이즈-1에 의해 특이적으로 분해되는 폴리펩티드(a);를 중심으로 양 말단에 형광체(b)와 소광체(c)가 접합되어 있는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 제공한다.
상기 폴리펩티드(a)는 서열번호 1 내기 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 폴리펩티드(a)의 N-말단에 상기 형광체(b)가 결합되고, 상기 폴리펩티드(a)의 라이신 또는 아르기닌 아미노산 잔기의 입실론 아민기에 소광체(c)가 결합되어 있는 것일 수 있다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증 반응을 통해 활성화된 케스페이즈-1에 의해 형광을 나타내는 것일 수 있다.
상기 형광체(b)는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 텍사스 레드(Texas red), Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine), 메로사이아닌(merocyanine), 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 벤족사디아졸(benzoxadiazol), 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 아크리딘 옐로우(acridine yellow), 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 소광체(c)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증 세포 내에서 특이적으로 발현하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 분해되어, 형광이 복원되는 것일 수 있다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 약물 또는 나노입자를 더 포함하고, 상기 약물 또는 나노입자는 상기 폴리펩티드(a)의 C 말단의 카르복실기에 결합하는 것일 수 있다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 치매, 뇌졸중, 골관절염 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질병을 진단하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 유효성분으로 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 케스페이즈-1 효소를 정성 또는 정량 분석하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 유효성분으로 함유하는, 상기 케스페이즈-1 효소의 활성화를 억제하는 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 1) 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 개체에 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브에 의한 이미지를 수득하는 단계;를 포함하는 상기 개체로부터 염증반응이 야기된 세포나 조직을 영상화하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증반응이 야기되어, 활성화된 케스페이즈-1 효소에 특이적으로 반응하여 활성화되기 때문에, 염증반응이 야기된 세포를 효과적으로 진단 및 영상화할 수 있다.
또한 상기 케스페이즈-1 활성 측저용 프로브는 세포 내에 효과적으로 침투되고, 세포 내에 활성화된 케스페이즈-1 효소가 존재하여야만 형광을 방출하기 때문에, 염증 반응이 야기된 세포에서만 형광이 발생하므로, 이를 정확하고 빠르게 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 종래 케스페이즈-1 분석용 물질이 가지고 있는 시료의 채취 문제(침습적)와 분석의 정확성이 낮고, 시료를 채취한 영역 외의 부분에서는 케스페이즈-1 분석이 어렵다는 문제 등을 해결할 수 있고, 생체 내에서 별도의 담체, 전달체 및 나노 캐리어를 포함하지 않아도, 단일구성만으로 활성화된 케스페이즈-1 효소가 존재하는 세포를 형상화할 수 있다는 장점이 있다. 또한 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 한번의 투여로 생체 전체에 존재하는 염증반응이 야기된 조직 또는 세포를 영상화할 수 있다는 큰 장점이 있다.
도 1a는 세포 내에서 분해되는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 화학적 구조식과 케스페이즈-1 효소에 의한 작용기작을 나타낸 도면이다. 이는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해, 잘리는 폴리펩타이드(WEHD) 기반를 기반으로 하고, 상기 폴리펩티드의 양 말단에 글리신(gly, G)이 결합되어 있으며, 아민기가 있는 펩타이드(lysine, K)에 근적외선 형광체인 Cy5.5를 도입하고, N-말단기에 위치하는 라이신 또는 아르기닌의 입실론 아민기에 소광체(BHQ-3)가 결합되도록 설계하였다. 각각의 합성과정은 DMSO 상태에서 이루어졌으며, N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine(DMAP)을 촉매 하에 합성하였다. 각각의 합성과정은 형광체 도입, 보호 그룹(protecting group) 제거 및 소광체 도입 세 가지로 이루어진다. 각각의 과정은 고성능액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)로 확인 및 정제하였다.
도 1b는 세포 내에서 케스페이즈-1 효소를 활성화하는 다양한 작용기작과, 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브와 케스페이즈-1 효소의 기작을 나타낸 도면이다.
도 2a는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 분자량을 측정한 MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 그래프이다.
도 2b는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 자외선/가시광선 분광광도계(UV-VIS spectroscopy)로 측정한 결과 그래프이다.
도 2c는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 형광기기(spectroscopy)로 측정한 그래프이다.
도 3a은 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브와 케스페이즈 효소(caspase-1,3,8,11) 또는 caspase-1 저해제를 처리하고, 이의 형광 복원효과를 시간에 따라 PL(Photoluminescence)으로 측정하여 나타낸 결과 그래프이다.
도 3b는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브와 케스페이즈-1 효소(caspase-1)를 다양한 농도(0, 2.5, 5, 7.5, 10 unit)로 처리하고, 이의 형광 복원효과를 시간에 따라 PL(Photoluminescence)으로 측정하여 나타낸 결과 그래프이다. 도 3b의 하단 사진은 각각의 반응물에 대한 형광 이미지이다.
도 4a는 THP-1 세포, BMDM 세포에 대해서, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 다양한 농도(0~50 ㎍/㎖)로 처리하였을 때, 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 4b는 THP-1 세포에 LPS 1.5 ㎍/㎖ 및 ATP 5 mM을 처리한 다음, 세시간 반이 지난 후, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 30 분 처리하였을 때, 각각의 세포를 형광 현미경으로 촬영한 것이다. control은 LPS, ATP를 처리하지 않은 것이다.
도 5a는 염증유발 동물모델의 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군을 각각 영상기기(Ivis-lumina)로 영상화한 사진이고, 도 5b의 왼쪽 그래프는 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군의 왼발의 발등으로부터 측정한 형광을 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5b의 오른쪽 그래프는 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군의 왼쪽 종아리로부터 측정한 형광을 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5c는 염증유발 동물모델의 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군으로부터 서혜부, 오금부, 림프노드를 적출하여 형광을 관찰한 사진이다.
도 6a는 대장염 동물모델의 급여시간에 따른 체중변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 6b는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)의 대장 길이(colon length, ㎝)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6c는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)에 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 각각 정맥 주사한 후 30분 간격으로 관찰한 형광 이미지이다.
도 6d는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)으로부터 대장을 적출하여 형광을 비교한 것이다.
도 6e는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)을 제조하고 6일 째, 병변 생성여부를 확인하기 위하여, 조직검사를 통하여 대장의 손상 정도를 나타낸 헤마톡실린-에오진 조직 염색 사진이다.
도 6f는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)으로부터 분리한 대장 세포를 준비하고, 각각의 세포를 인플라마좀 마커인 NLRP3 인플라마좀을 면역염색하여 형광 현미경으로 촬영한 것이다. Cy5.5는 적색이고, NLRP3은 인플라마좀을 나타내는 것으로 녹색이다.
도 7a는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월부터 6개월 알츠하이머 동물모델에 정맥주사하고, 90분 후 촬영한 형광 이미지이다.
도 7b는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월부터 6개월 알츠하이머 동물모델(3 mo, 4 mo, 5 mo, 6 mo)에 처리하고, 뇌를 적출하여 형광을 측정한 사진이다.
도 7c는 도 7b를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7d는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월부터 6개월 알츠하이머 동물모델(3 mo, 4 mo, 5 mo, 6 mo)에 처리하고, 뇌를 적출하고, 이를 4분등분하여 각각을 형광현미경으로 촬영한 사진이다.
도 7e는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월 알츠하이머 동물모델(TG)에 처리하고, 3 시간이 지난 후, 뇌조직을 적출하여 이들 각각을 케스페이즈-1 마커인 caspase-1' Ab로 면역염색한 뒤, 형광현미경으로 촬영한 사진이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현 예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K)과 같다.
본 발명의 일 측면은 4 내지 7 개의 아미노산 잔기로 이루어지고 케스페이즈-1에 의해 특이적으로 분해되는 폴리펩티드(a);를 중심으로 양 말단에 형광체(b)와 소광체(c)가 접합되어 있는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브에 관한 것이다.
본 발명자들은 상기 종래기술의 단점을 극복하기 위하여, 케스페이즈-1 효소와 특이적으로 반응하여, 분해되는 펩타이드 서열에 형광체와 소광체를 합쳐, 케스페이즈-1 효소의 활성을 측정할 수 있는 프로브를 개발하기에 이르렀다. 활성화된 케스페이즈-1 효소는 다양한 질병의 염증반응에 관여하는 중요한 효소지만, 세포 내 세포질에만 존재하기 때문에, 비침습적이고, 간단하게 이를 측정하는 것은 많은 어려움이 있다. 이에 따라 본 발명에서는 생체 내에서, 세포의 세포질 내에 존재하는 케스페이즈-1 효소의 활성화 여부를 형광으로 검출 및 분석하기 위해서, 상기 프로브에서 근적외선 형광체가 소광체와 일정거리(nm)이상 가까이 위치하도록 설계하였다. 만약 상기 프로브에서 폴리펩티드(a)의 길이가 달라질 경우(4 개 미만의 아미노산 잔기 또는 7 개 이상의 아미노산 잔기), 형광체와 소광체의 거리가 멀어져, 제대로 된 소광효과를 얻을 수 없다. 이러한 기술은 배경의 노이즈를 효과적으로 줄여 신호 대 노이즈(signal-to-noise(S/N)) 비율을 높여 해상도를 향상시킬 수 있으며, 케스페이즈-1 효소에 특이적으로 반응함으로써, 세포 또는 생체 내에서 활성화된 케스페이즈-1 효소 활성이나, 억제여부를 비침습적이고, 실시간으로 영상화할 수 있다는 장점이 있다.
나아가 종래 케스페이즈-1 효소 활성을 분석하기 위한 물질들은 침습적으로 생체로부터 시료를 채취하고, 다양한 시약 및 검출장비를 사용해야만 케스페이즈-1 효소 활성을 측정할 수 있는 데 반해, 본 발명의 프로브는 세포의 세포질 내로 효과적으로 침투하되, 세포질에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소와 특이적으로 반응하여, 분해되어 형광을 나타내도록 하는 물질을 발명하고자 노력한 바, 완성하게 되었다.
상기 폴리펩티드(a)는 세포의 세포질 내에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 특이적으로 분해되는 폴리펩티드로, 4 내지 7 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 폴리펩티드(a)는 세포 내로 침투가 용이하고, 세포 내의 세포질에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 잘리도록(분해되도록) 펩타이드(WEHD, LEHD 또는 YVAD)를 기반으로, N, C 말단에 하나 이상의 글리신이 결합되어 있고, C 말단의 글리신 잔기에 라이신 또는 아르기닌 아미노산 잔기가 결합되어 있는 폴리펩티드이다.
상기 폴리펩티드(a)의 N-말단에 상기 형광체(b)가 결합되고, 상기 폴리펩티드(a)의 라이신 또는 아르기닌 아미노산 잔기의 입실론 아민기에 소광체(c)가 결합되어 있는 형태이다. 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 평소에는 소광상태로, 매우 낮은 형광 세기를 나타내다가, 세포의 세포질에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 분해되어 형광을 나타내도록 설계되었기 때문에, 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 세포 내부로 침투될 경우, 세포 내에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 효과적으로 분해됨으로써, 형광을 발현하게 되는 것이다. 이는 후술하는 실험예를 통해 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 상기 형광체(b)의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체(c)가 결합되어 있는 것으로, 형광체(b)가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 강한 소광 효과(quenching effect)를 달성하도록 하는 것이다. 다시 말해 상기 폴리펩티드(a)가 세포 내에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 분해되지 않으면 형광이 발광되지 않으며, 이러한 소광 효과는 형광체와 소광체의 거리가 수십 ㎚ 이내에 있을 경우에 나타난다. 효소에 의해 폴리펩티드(a)가 분해되면, 여기에 결합되어 있던 형광체(b)와 소광체(c)가 서로 분리되어 떨어지면서 소광효과가 없어지고, 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 세포의 내부에서 활성화된 케스페이즈-1 효소의 존재유무를 확인할 수 있도록 이미징(영상화)할 수 있게 된다. 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 세포 내에 침투하여 활성화된 케스페이즈-1 효소만을 특이적으로 검출할 수 있기 때문에, 케스페이즈-1 활성을 정확하고, 민감하게 측정할 수 있다.
따라서, 종래 케스페이즈-1 효소의 활성을 측정하기 위해 사용되던 많은 침습적 분석방법들의 문제를 극복 및 해결하면서도, 생체 내에서 독성을 나타내지 않고, 활성화된 케스페이즈-1 효소를 정확히 검출할 수 있다. 이를 통해 활성화된 케스페이즈-1 효소와 관련된 다양한 질환들도 진단할 수 있고, 이는 후술하는 실험예를 통해 알 수 있다.
또한, 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 생리학적 용액에 쉽게 용해되므로, 흡수가 용이하여 생체 이용률이 뛰어나고, 안정성 및 활성화된 케스페이즈-1 효소 특이성이 확인되었으므로 염증 반응이 나타난 세포로의 전달체 또는, 활성화된 케스페이즈-1 효소가 존재하는 세포나 조직의 영상 이미징 및 약물 스크리닝에 매우 유용하다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 세포 내에 효과적으로 침투되고, 세포의 세포질 내에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 분해되어 형광 물질이 방출되어, 활성화된 케스페이즈-1 효소가 존재하는 세포나 조직을 영상화하는 효과를 갖는다. 이후, 상기 분해된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브들은 모두 체내 대사과정을 통해 분해되거나, 신장을 통해 체외로 배출되어, 생체 내에 잔류하지 않으며, 그 자체로도 독성을 거의 야기하지 않기 때문에 생체 적합성이 매우 우수하다. 이는 실험예를 통해 확인할 수 있다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증 반응을 통해 활성화된 케스페이즈-1에 의해 형광을 나타내는 것으로, 이와 관련된 다양한 질환을 조기에 동시에 진단할 수 있다는 장점을 갖는다. 예를 들어 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 또는 담낭암을 포함하는 암; 치매, 뇌졸증; 골관절염, 류마티스 관절염과 같은 자가 면역질환의 진단이 가능하다. 치매의 경우, 임상 증상이 발현되지 않은 치매 초기를 진단하고, 관련 세포를 영상화하는 것이 매우 어려운 실정이다. 그러나 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 임상증상이 발현되지 않더라도, 치매를 유발하는 활성화된 케스페이즈-1 효소를 측정함으로써, 진단이 가능하다는 장점이 있다. 각종 질환은 염증반응을 동반하기 때문에, 생체 내 이상 유무를 본 발명의 프로브를 통해 이미징하여 확인할 수 있고, 한번의 투여로 질환에 구애받지 않고, 동시에 진단이 가능하다는 장점을 갖는다. 일반적으로 진단용 조성물은 특정 질환에 국한되어 사용이 가능하지만, 본 발명은 염증 반응과정에 발생하는 케스페이즈-1 효소를 측정함으로써, 염증반응을 동반하는 질환에 한해서, 질환에 제한되지 않고, 생체 내 모든 부위에서 염증반응이 야기된 세포 또는 조직의 검출이 동시에 가능하다.
상기 형광체(b)는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 텍사스 레드(Texas red), Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine), 메로사이아닌(merocyanine), 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 벤족사디아졸(benzoxadiazol), 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 아크리딘 옐로우(acridine yellow), 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 형광체(b)의 발광 파장의 범위에 따라 사용되는 소광체의 종류가 달라지며, 이는 형광체의 발광파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 소광체를 사용하여야만 소광효과를 극대화할 수 있기 때문이다. 본 발명에서, 소광체는 여기된(excited) 형광체의 에너지를 흡수하지만 형광 에너지를 밖으로 방출하지 않으므로 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 물질인 dark quencher로, 상업적으로 널리 상용화되어 있는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있다. 일 예로, BHQ-1은 480 - 580 nm, BHQ-2는 550 - 650 nm, BHQ-3는 620 - 730 nm 파장대의 형광을 매우 효율적으로 흡수한다. 따라서, 형광체로 Cy5.5(675~700 nm)를 사용할 경우, 상기 형광을 흡수할 수 있도록 BHQ-3 소광체를 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기 폴리펩티드(a)의 C 말단에 근적외선 형광체인 Cy5.5를 도입하고, N 말단에 위치한 라이신(lysine, K) 또는 아르기닌의 입실론 아민기(측쇄 아민기)에 소광체(BHQ-3)가 결합되도록 설계하였다. 이는 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 폴리펩티드(a)에 소광체(c) 또는 형광체(b)를 결합시키는 방법은 DMSO 상태에서 이루어졌으며, N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine (DMAP)을 촉매 하에 합성하였다. 합성과정은 형광체 도입, 보호 그룹(protecting group) 제거 및 소광체 도입 세 가지로 이루어지며, 각각의 과정은 고성능액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC)로 확인 및 정제하였다. 상기 폴리펩티드에 아민기가 존재하고, 형광체 및 소광체에 N-하이드록시숙신이미드(NHS 형태) 작용기가 존재하는 경우, 상기 두 분자 간의 공유 결합이 가능하다. 또는 상기 폴리펩티드에 COOH 기가 존재하고, 형광체 및 소광체에 아민기가 존재하는 경우에, 상기 두 잔기가 직접적으로 결합하는 것이 불가능하므로, 크로스링커 (예컨대, 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드, 하이드로클로라이드(EDAC))를 이용하여 두 개를 화학적으로 결합시키는 것이 가능하다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 앞서 설명한 바와 같이 염증 세포 내에서 특이적으로 발현하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 분해되어, 형광이 복원되는 것일 수 있다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 필요에 따라, 약물 또는 나노입자를 더 포함할 수 있고, 상기 약물 또는 나노입자는 상기 폴리펩티드(a)의 C 말단의 카르복실기에 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 폴리펩티드(a)에 COOH 기가 존재하고, 상기 약물 또는 나노입자에 아민기가 존재하는 경우에, 상기 두 잔기가 직접적으로 결합하는 것이 불가능하므로, 상기 폴리펩티드(a)의 COOH 기를 Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)와 EDC(1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 반응시켜 N-하이드록시숙신이미드(NHS 형태) 작용기로 치환한 후, 상기 두 분자 간의 공유 결합을 형성한다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증반응이 유도된 세포의 세포질 내에서 활성화된 케스페이즈-1 효소와 반응하여, 분해되고 형광을 발광하게 된다. 이때, 상기 형광체는 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5이고, 근적외성 빛(650-900 ㎚)을 방출한다. 이에 소광체는 상기 형광체의 형광을 흡수하여 소광 효과를 극대화시킬 수 있는 BHQ3을 사용하였다. 상기 근적외성 형광체를 사용할 경우, 통상의 가시광선대 빛을 방출하는 형광분자에 비하여 더 심도가 깊은 곳의 암 세포를 영상화할 수 있기 때문에 인간과 같은 부피가 큰 동물의 생체 내 형광이미징에 적합하다.
또한, 필요에 따라, 상기 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 정제 또는 확인할 수 있는데, 이는 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다.
상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 도 1a의 구조식(구조식 1)으로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112018091310625-pat00001
본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해 본 발명의 투여량은 유효성분인 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 기준으로 성인 남성 기준 1일 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏이다. 투여는 1일 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 시간의 간격을 두어 형광 배출 후 투여하는 것이 바람직하다. 환자의 나이, 성별, 체중, 대사 작용, 현재 복용중인 다른 약물에 따라 적절히 증감하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 유효량의 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 제형화된 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감독하거나 관리하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법 및 제제법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 랫트, 마우스, 토끼, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면 경구로 또는 복강내, 비강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 뇌혈관내로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 매우 낮은 농도로 세포에 주입시키는 것만으로 세포의 세포질 내에 활성화된 케스페이즈-1 효소와 특이적으로 반응하여, 형광을 발광할 수 있다. 세포에 주입 후, 형광 현미경으로 700 내지 900 ㎚에서 형광의 세기를 측정한다. 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 생체 내 또는 생체 외에서 세포 내부에 침투하여 활성화된 케스페이즈-1 효소가 존재할 때에만 형광을 발광하므로, 비침습적으로 염증반응이 유발된 세포나 조직의 분포를 효과적으로 이미징할 수 있다. 즉, 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 개체로부터 염증반응이 유발된 세포가 존재하는지, 어디에 분포하고 있는지를 영상화하여, 염증반응에 의한 질환을 진단할 수 있도록 하는 조성물로 활용될 수 있고, 임상 증상이 발현되지 않은 초기 환자의 질환도 진단할 수 있으며, 치료 효과의 모니터링 또는 예후 확인용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태 일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 유효성분으로 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 케스페이즈-1 효소를 정성 또는 정량 분석하기 위한 조성물과 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 유효성분으로 함유하는, 상기 케스페이즈-1 효소의 활성화를 억제하는 약물 스크리닝용 조성물에 관한 것이다. 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 생체 내 조직이나 세포의 세포질 내에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소의 존재 유무, 활성, 활성 억제 등을 쉽게 판별해 낼 수 있어서, 염증반응이 유발된 세포나 조직의 영상, 약물전달체, 염증반응을 억제하는 약물의 스크리닝 등의 다양한 목적으로 사용 될 수 있다. 상기 조성물은 생체 내(in vivo), 생체 외(in vitro) 모두에 적용이 가능하며, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝(high-throughput screening) 방법 및 조기 질병 진단 등의 다양한 용도로 사용이 가능하다.
구체적으로 상기 조성물은 염증반응(또는 케스페이즈-1 효소의 활성화)과 관련된 질환이 의심되는 개체에 투여되어 염증반응이 유도된 세포나 조직의 존재 여부 및 이의 분포를 모니터링함으로써 염증반응과 관련된 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하거나, 염증반응 억제효과를 갖는 약물 효과를 확인하거나, 미리 특정 약물에 대한 반응성을 예측하거나, 염증 세포의 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 방식은 질병의 조기 진단 및 조기 치료와 관련하여 매우 중요하다.
본 발명의 단백질-형광 복합체의 적용이 가능한 질환은, 케스페이즈-1 효소와 관련된 질환이라면 이에 특별히 제한되지 않으나, 일반적인 암 질환, 자가면역질환, 또는 염증성 질환일 수 있고, 예를 들어 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 또는 담낭암을 포함하는 암; 치매, 뇌졸증; 골관절염, 류마티스 관절염과 같은 자가 면역질환일 수 있다.
상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해 본 발명의 투여량은 유효성분인 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브 기준으로 성인 남성 기준 1일 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏이다. 투여는 1일 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 시간의 간격을 두어 형광 배출 후 투여하는 것이 바람직하다. 환자의 나이, 성별, 체중, 대사 작용, 현재 복용중인 다른 약물에 따라 적절히 증감하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 유효량의 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 제형화된 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감독하거나 관리하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법 및 제제법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 랫트, 마우스, 토끼, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면 경구로 또는 복강내, 비강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 뇌혈관내로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물에서 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 세포의 세포질 내에 존재하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 분해되어 형광을 발현한다. 이로 염증반응이 야기된 세포나 조직의 영상화뿐만 아니라 약물이 염증반응이 야기된 세포 내로 잘 전달되었는지 알아볼 수 있는 지표로 작용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 1) 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 개체에 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브에 의한 이미지를 수득하는 단계;를 포함하는 상기 개체로부터 염증반응이 야기된 세포나 조직을 영상화하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체로부터 형광으로 발광하는 영역이 존재하는 이미지가 관찰되는 경우, 염증반응이 야기된 세포가 존재하는 것으로 판정할 수 있고, 염증반응이 야기된 세포의 위치를 파악할 수 있다.
염증반응을 억제할 것이라 예상되는 약물을 투여하고, 상기 방법으로 측정하였을 때, 상기 이미지 상에서 형광으로 표시되는 영역이 감소하거나 증가하지 않을 경우 상기 약물은 염증반응을 억제하는 효과가 양성인 것으로 판정하고, 형광으로 표시되는 영역이 증가할 경우 상기 약물에 의한 치료효과가 음성인 것으로 판정하여, 스크리닝할 수 있다.
상기 개체는 랫트, 마우스, 토끼, 인간 등의 포유동물일 수 있고, 경구로 또는 복강내, 비강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 뇌혈관내로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
이하에서 다양한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실시예 1 내지 3. 폴리펩타이드(a) 합성
서열번호 1 내지 3으로 표시되는 폴리펩타이드(순서대로 실시예 1 내지 3)를 설계하고, 고체상 합성법(solid-phase peptide synthesis; SSPS) 방법을 사용하여 제조하였다. 아미드가 C-말단에 고정되어 있는 형태인 링크 아미드 레진에 Fmoc으로 보호된 아미노산 단량체를 설계한 폴리펩타이드 서열에 따라 차례로 붙여나가며 제조하였다. 상기 폴리펩타이드의 아민과 sulfo-NHS 결합을 1대1로 하기 위해 라이신(lysin, k)기 또는 아르기닌 기(Arginine, R)에 tert-Butyloxycarbonyl protecting group(BOC) 보호그룹을 결합시켰다.
[서열번호 1]
GWEHDGK
[서열번호 2]
GLEHDGK
[서열번호 3]
GYVADGK
상기 합성된 폴리펩티드를 Vydac Everest C18 컬럼(250 ㎜ㅧ22 ㎜, 10 ㎛, USA)를 사용한 역상 HPLC(Shimadzu prominence HPLC, Japan)으로 정제하였다. 용리(elution)는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)를 함유하는 물-아세토니트릴 선형 구배 용리액(water-acetonitrile linear gradient)(5~95%(v/v) of acetonitrile)으로 수행하였다. 정제한 물질은 FDT12012(Operon, Korea)을 사용하여 동결건조하였다. 상기 폴리펩티드는 세포 내에서 리소좀 분해 효소들에 의해 잘리도록 설계되었고, 구체적으로 WEHD, LEHD, YVAD 서열의 펩타이드를 백본으로, N말단에 하나의 글리신과, C 말단에 하나 이상의 글리신과 라이신(lysine, K) 아미노산 잔기가 결합되어 있다.
실시예 4 내지 6. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브 제조
상기 실시예 1 내지 3으로부터 합성된 폴리펩티드(서열번호 1 내지 3) 중에서 어느 하나의 N-말단에 근적외선 형광체인 Cy5.5가 접합되고, 상기 폴리펩티드의 라이신 아미노산 잔기의 입실론 아민기에 소광체인 BHQ-3가 결합되도록, 프로브를 설계하였다. 구체적인 합성과정은 다음과 같다.
합성과정은 형광체 도입 단계, 보호 그룹(protecting group) 제거 단계 및 소광체 도입 단계 총 세가지 단계로 수행하였다. 각각의 합성과정은 DMSO 상태에서 이루어졌으며, N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine (DMAP)을 촉매 하에 합성하였다. 각각의 합성과정이 끝난 후에는 고성능액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)로 확인 및 정제한 후 동결건조하여 냉동보관하였다.
1) 형광체 도입 단계
상기 실시예 1, 2 또는 3의 폴리펩티드(서열번호 1 내지 3) 10 ㎎에 근적외선 형광체인 Cy5.5-NHS 12 ㎎, N-메틸모르폴린(N-Methylmorpholine;NMM) 10 ㎕, 4 디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine;DMAP) 0.5 ㎎ 및 200 ㎕ 디메틸포름아미드를 혼합하여, 4 시간동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료한 용액을 고성능액체크로마토그래피(High performanace liquid chromatograpy, HPLC)로 확인 후 정제하였다. HPLC에서 칵테일 용액(0.1%트리플루오르아세트산(TFA)/아세토니트릴, 0.1%트리플루오르아세트산/증류수)을 0분에서 5분까지 5%:95% 비율로, 25분까지 다양한 비율(95%,5%)로 농도 구배를 설정하여 정제하였다. 정제한 용액을 증발기(evaporator)로 용매를 제거 후, 진공상태에서 동결건조하여 분말화하여 보관하였다.
2) 보호 그룹 제거 단계
상기 1) 단계에서 합성된 Cy5.5(형광체)가 결합된 폴리펩티드의 라이신기에 존재하는 BOC 보호그룹을 제거하기 위해, 트리플루오르아세트산(Trifluoroacetic acid) 950 ㎕, 증류수 25 ㎕, 아니솔(anisol) 25 ㎕을 혼합한 용액을 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 회수된 반응액을 증발기를 사용해 용매를 모두 제거한 다음, 이를 칵테일 용액(0.1% 트리플루오르아세트산/아세토니트릴:0.1% 트리플루오르아세트산/증류수=1:1) 1 ㎖에 녹인 후, 0.2 ㎛ 필터로 정제하였다. 상기 정제한 용액을 애질런트(Agilent) ZORBAX SB-C18 컬럼(9.4 x 150 ㎜)을 이용하여, 0.1% TFA/아세토니트릴, 0.1% TFA/95% 증류수 농도구배로 30 분간 HPLC로 정제하였다. 이때, UV 파장은 220 ㎚, 형광은 ex: 675 ㎚ em: 695 ㎚에서 측정하여, 물질을 분리하였다. 분리한 물질을 분자량을 매스(mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조시켰다.
3) 소광체 도입 단계
상기 2) 단계를 통해 보호그룹이 제거된 Cy5.5(형광체)가 결합된 폴리펩티드를 얻고, 상기 폴리펩티드의 노출된 라이신(lysine, K)의 입실론 아민기에 BHQ3-NHS(Black Hole Quencher3-NHS)를 접합하였다. 이를 위해 상기 2) 단계를 통해 보호그룹이 제거된 Cy5.5(형광체)가 결합된 폴리펩티드 2 ㎎, BHQ3-NHS(Biosearch Technologies Inc.) 0.71 ㎎, N-메틸모르폴린(N-Methylmorpholine;NMM) 2 ㎕, 4 디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine;DMAP) 0.2 ㎎ 및 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide;DMSO) 30 ㎕을 혼합하여, 상온에서 4 시간동안 반응시켜, 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 제조하였다. 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 앞의 단계와 동일한 조건으로 HPLC를 사용하여 물질을 분리했으며, 분리한 물질을 분자량을 매스(mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조하여 분말화하였다.
실험예 1. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브 합성 확인
실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 합성 분석 및 성능은 이하와 같이 확인하였다.
도 2a는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 분자량을 측정한 MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 그래프이다.
도 2a에 나타난 바와 같이, MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)를 통해, 물질의 고유값을 측정하여 형광체와 소광체가 결합했음을 확인한 바, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 폴리펩타이드(a), 형광체(b)와 소광체(c)가 결합하여 합성되었음 확인하였다. 메스(mass) 분석기로 측정하였을 때, 예상한 분자량 2255이였고, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브 역시 분자량 2255로 측정된 바, 폴리펩타이드(a), 형광체(b)와 소광체(c)가 결합한 구조임을 알 수 있다.
도 2b는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 자외선/가시광선 분광광도계(UV-VIS spectroscopy)로 측정한 결과 그래프이다. UV-VIS 분광광도계는 소광체와 형광체의 고유 파장대를 분석함으로써, 물질이 서로 결합되었는지를 확인할 수 있다. 도 2b를 살펴보면, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브에 660 ㎚의 소광체, 680 ㎚의 형광체가 관찰된 바, 제대로 합성되어 프로브를 형성하고 있음을 확인하였다.
도 2c는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 형광기기(spectroscopy)로 측정한 그래프로, 소광체가 효율적으로 형광을 흡수하고 있음을 확인하였다. 즉, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 형광체의 파장대인 680-700nm의 형광이 효율적으로 흡수하고 있음을 알 수 있다.
종합하면, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 합성하고, 이를 다양한 분석기기를 통해 분석한 바, 잘 합성되었음을 확인하였다.
실험예 2. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 특이적 활성 분석
실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브가 케스페이즈-1 효소에 특이적으로 분해되어 형광을 복원하는지 확인하고자 하기 위하여, 다양한 케스페이즈 효소(caspase-1,3,8,11) 및 caspase-1 저해제를 사용한 후, 시간에 따라 형광 변화를 분석 및 평가하였다.
우선, 반응 완충액(0.5 mM HEPES, pH7.2, 50 mM 염화칼슘, 0.1% 찹스(chaps), 10 mM EDTA, 5% 글리세롤, 10 mM DTT)에 케스페이즈 효소 또는 caspase-1 저해제를 용해하여, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이때, 효소는 모두 동일한 농도인 2 unit로 사용하였다. 상술한 과정을 통해 활성화된 케스페이즈 효소를 각각 96 웰에 200 ㎕씩 분주하고, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브와 37 ℃에서 반응시켜 반응물을 제조한 다음, 시간에 따라 형광 복원 정도를 형광분광기(spectroscopy)를 통하여 관찰하였다.
도 3a은 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브와 케스페이즈 효소(caspase-1,3,8,11) 또는 caspase-1 저해제를 처리하고, 이의 형광 복원효과를 시간에 따라 PL(Photoluminescence)으로 측정하여 나타낸 결과 그래프이다. 도 3a의 하단 사진은 각각의 반응물에 대한 형광 이미지이다. (+)cas-1은 케스페이즈-1 효소를 처리한 것이고, (+)cas-1 inhibitor는 케스페이즈-1 저해제를 처리한 것이며, (+)cas-3은 케스페이즈-3 효소를 처리한 것이며, (+)cas-8은 케스페이즈-8 효소를 처리한 것이며, (+)cas-11은 케스페이즈-8 효소를 처리한 것이다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 모든 시간에서 케스페이즈-1이 존재할 때에만 특이적으로 형광이 복원되는 것을 확인하였다.
실험예 3. 효소 농도에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 분석
실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브가 케스페이즈-1 효소의 농도에 따른 형광 확인하고자 하기 위하여, 다양한 농도(0, 2.5, 5, 7.5, 10 unit)의 케스페이즈-1 효소를 사용한 후, 시간에 따라 형광 변화를 분석 및 평가하였다.
우선, 반응 완충액(0.5 mM HEPES, pH7.2, 50 mM 염화칼슘, 0.1% 찹스(chaps), 10 mM EDTA, 5% 글리세롤, 10 mM DTT)에 다양한 농도(0, 2.5, 5, 7.5, 10 unit)의 케스페이즈 효소를 용해하여, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상술한 과정을 통해 활성화된 케스페이즈 효소를 농도별로 각각 96 웰에 200 ㎕씩 분주하고, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브와 37 ℃에서 반응시켜 반응물을 제조한 다음, 시간에 따라 형광 복원 정도를 형광분광기(spectroscopy)를 통하여 관찰하였다.
도 3b는 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브와 케스페이즈-1 효소(caspase-1)를 다양한 농도(0, 2.5, 5, 7.5, 10 unit)로 처리하고, 이의 형광 복원효과를 시간에 따라 PL(Photoluminescence)으로 측정하여 나타낸 결과 그래프이다. 도 3b의 하단 사진은 각각의 반응물에 대한 형광 이미지이다.
도 3b에 나타난 바와 같이 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 존재하는 케스페이즈-1 효소의 농도에 따라 형광 세기가 증가함을 확인하였다. 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브가 최대 측정할 수 있는 케스페이즈-1 효소의 농도한계는 7.5 unit였고, 7.5 unit 이상부터는 정확한 농도 파악을 위해 희석하여 측정하는 것이 바람직하다.
실험예 4. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 세포 독성
단핵구인 THP-1, 골수 유래 대식세포(Bone Marrow-Derived Macrophage, BMDM)를 96 well plate에 분주하고, 하루가 지난 다음, 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브(실시예 4)를 다양한 농도(0-50 ㎍/㎖)로 24 시간 투여하였다. 이후, CCK-8 용액을 이용하여 케스페이즈-1 활성 측정용 프로프의 독성을 확인하기 위해, 세포의 생존율을 측정하였다.
도 4a는 THP-1 세포, BMDM 세포에 대해서, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 다양한 농도(0~50 ㎍/㎖)로 처리하였을 때, 세포 생존율을 측정한 그래프로, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 세포에 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다.
실험예 5. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 세포 내에서 형광 복원 효과 분석
단핵구인 THP-1를 96 well plate에 분주하고, 하루가 지난 다음, LPS 1.5 ㎍/㎖ 및 ATP 5 mM을 처리하였다. 세시간 반이 지난 후, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 투여하고, 24 시간 배양한 다음, 형광 현미경으로 세포 내에서 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 형광 복원 여부를 분석하였다.
도 4b는 THP-1 세포에 LPS 1.5 ㎍/㎖ 및 ATP 5 mM을 처리한 다음, 세시간 반이 지난 후, 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 30 분 처리하였을 때, 각각의 세포를 형광 현미경으로 촬영한 것이다. control은 LPS, ATP를 처리하지 않은 것이다.
도 4b에 나타난 바와 같이, 단핵구 THP-1 세포에, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)을 3 시간 동안 처리하고, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 30 분 처리하여 형광 현미경으로 관찰하였다. LPS와 ATP는 흔히 케스페이즈-1을 활성화시키는 것으로 알려진 물질로, LPS는 염증 초기에 나타나는 1차 시그널이고, ATP는 2차 시그널이다. 상기 염증 유발물질이 투여된 세포에, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 처리하였을 때, control 그룹(대조군)에 비해 Cy5.5 형광이 효과적으로 복원되어 나타남을 확인하였다. 즉 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증 반응에 의해 유도된 활성화된 케스페이즈-1을 정확히 측정할 수 있음을 확인하였다.
실험예 6. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 이용한 마우스 내 염증 검출
케스페이즈-1 효소 활성화는, 다양한 요인들에 의해 발생한다. 이 중에서도 염증초기반응을 유도하는 LPS, ATP을 투여하여, 인플라마좀을 활성화시키는 것이 가장 대표적인 방법이다. 실험예 5에서는 LPS, ATP의 투여에 의해 염증초기 반응인 인플라마좀의 활성화가 유도되었음을, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브로 확인한 바 있다. 본 실험예에서는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브가 생체 내에서도 잘 작동하는지 확인하고자, 염증 유발 동물모델을 통해 실험하였다.
염증유발 동물모델 제작을 위해, 실험동물은 생후 8주 된 C57BL/6 쥐를 ㈜나라바이오에서 제공 받아 1주일간의 적응기간을 거친 뒤, 동물 플라스틱 케이지에 4마리씩 사육하였다. 사육장은 인공조명에 의하여 아침 7시부터 저녁 7시까지 12시간으로 조절하였으며, 실내온도는 18~23℃와 40~60%의 습도를 유지하고 정수된 식수와 사료를 자유롭게 먹게 하였다. 다음 상기 실험동물의 왼쪽 발바닥에 생리식염수(control, 대조군), 20 ㎍ LPS와 50 mM ATP(Ms1 실험군) 또는 20 ㎍ LPS와 100 mM ATP(Ms2 실험군)을 주입하여 제조하였다. 실험을 위해 3 일마다 1회씩 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 정맥을 통해 주사하여 30분 간격으로 영상기기(Ivis-lumina)로 영상화하였다.
도 5a는 염증유발 동물모델의 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군을 각각 영상기기(Ivis-lumina)로 영상화한 사진이고, 도 5b의 왼쪽 그래프는 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군의 왼발의 발등으로부터 측정한 형광을 정량화하여 나타낸 것이고, 도 5b의 오른쪽 그래프는 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군의 왼쪽 종아리로부터 측정한 형광을 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 염증 유발 물질(LPS, ATP) 농도가 높아질수록, 염증 반응도 더 강해지고, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브도 이에 따라 더 강한 형광으로 복원되는 것을 확인할 수 있다. 즉 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 강한 염증반응(높은 염증 유발물질)에 따라, 강한 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
도 5b에 나타난 바와 같이, 높은 염증유발물질이 투여되어, 상대적으로 강한 염증반응이 유발된 Ms2 실험군에서 더 강한 형광을 띄고 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증농도에 따라, 형광양의 증가를 나타내며, 동물모델의 생체 내 환경에서도 비침습적으로 정확하게 확인할 수 있음을 입증하였다.
도 5c는 염증유발 동물모델의 대조군, Ms1 실험군, Ms2 실험군으로부터 서혜부, 오금부, 림프노드를 적출하여 형광을 관찰한 사진으로, 염증을 유발한 마우스(동물모델)의 발바닥과 가장 가까운 오금부 림프노드에서 가장 강한 형광이 관찰되었고, 이를 통해 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브에 의하여 염증 부위의 관찰이 가능함을 알 수 있다.
실험예 7. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 통한 대장염 동물모델 분석.
대장염 동물모델을 제작하기 위하여, 실험동물은 생후 8주 된 C57BL/6 쥐를 ㈜나라바이오에서 제공 받아 1주일간의 적응기간을 거친 뒤, 동물 플라스틱 케이지에 4마리씩 사육하였다. 사육장은 인공조명에 의하여 아침 7시부터 저녁 7시까지 12시간으로 조절하였으며, 실내온도는 18~23℃와 40~60%의 습도를 유지하고 정수된 식수와 사료를 자유롭게 먹게 하였다. 상기 실험동물에 3% 덱스트란 소디움 설페이트(Dextran Sodium sulfate, DSS)를 포함한 식수를 공급하여, 대장염을 유발하였다. 상기 대장염 동물모델은 급여 시간에 따라 대장 내 염증이 심해져, 장 길이가 짧아지고, 혈변을 보인다. 대장염 동물모델의 체중은 병의 진행도와 일치하게 점점 감퇴하므로, 이를 측정하여, 체중의 80%가 되는 6일째 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성측정용 프로브를 투여하여 영상화하였다. 이때, 대조군(normal)으로 실험동물에 일반 식수를 먹여 대장염을 유발하지 않은 군을 준비하였다.
도 6a는 대장염 동물모델의 급여시간에 따른 체중변화를 측정하여 나타낸 것으로, 이에 따르면 병이 진행되어 점차 체중이 감소하고 있음을 알 수 있고, 6일째 되는 날, 체중이 80%로 줄어듬을 확인하였다.
도 6b는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)의 대장 길이(colon length, ㎝)를 측정하여 나타낸 그래프로, 상술한 과정을 통해 실험동물로부터 대장염이 유발되었음을 확인하였다.
도 6c는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)에 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 각각 정맥 주사한 후 30분 간격으로 관찰한 형광 이미지이다. 도 6c에 나타난 바와 같이, 대장염 동물모델에서 염증이 과다 발생하여 붉은 색의 형광이 뚜렷이 관찰되고 있음을 확인하였다.
도 6d는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)으로부터 대장을 적출하여 형광을 비교한 것으로, 대장염 동물모델로부터 적출된 대장에서 적색의 강한 형광이 관찰됨을 확인하였다.
도 6e는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)을 제조하고 6일 째, 병변 생성여부를 확인하기 위하여, 조직검사를 통하여 대장의 손상 정도를 나타낸 헤마톡실린-에오진 조직 염색 사진으로, 이에 따르면 대장염 동물모델(DSS)의 대장 세포의 손상이 유발되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브로 측정한 결과와 일치한다.
도 6f는 대장염 동물모델(DSS)과 대조군(normal)으로부터 분리한 대장 세포를 준비하고, 각각의 세포를 인플라마좀 마커인 NLRP3 인플라마좀을 면역염색하여 형광 현미경으로 촬영한 것이다. Cy5.5는 적색이고, NLRP3은 인플라마좀을 나타내는 것으로 녹색이다.
이에 따르면 대장염 동물모델로부터 분리한 대장 세포에서만 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 Cy5.5 형광체가 복원되었음을 확인하였다.
실험예 8. 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 이용한 알츠하이머 동물모델 분석
알츠하이머 동물모델을 제작하기 위하여, 실험동물은 생후 3개월~6개월 된 B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax) 쥐를 jason laboratory (미국, 바 하버)에서 제공 받아 1주일간의 적응기간을 거친 뒤, 동물 플라스틱 케이지에 4마리씩 사육하였다. 사육장은 인공조명에 의하여 아침 7시부터 저녁 7시까지 12시간으로 조절하였으며, 실내온도는 18~23℃와 40~60%의 습도를 유지하고 정수된 식수와 사료를 자유롭게 먹게 하였다. 상기 실험동물은 치매의 원인이 되는 아밀로이드 베타를 유전자 APP 변형으로 저절로 축적하게 만들어, 3개월부터 아밀로이드 베타가 고루 축적이 되고, 4개월에 덩어리를 형성하게 하도록 하여 알츠하이머 동물모델이다. 상기 알츠하이머 동물모델은 5개월부터 행동에 이상이 나타나기 시작하며, 6개월 때에는 고루 행동이상이 나타난다. 대조군(pre)은 유전자 변형을 시키지 않은 것이다.
본 실험에서는 알츠하이머 임상증상이 발현되지 않은, 초기 알츠하이머인 3개월, 4개월 알츠하이머 동물모델을 사용하여, 진단 유무를 판별하였다.
도 7a는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월부터 6개월 알츠하이머 동물모델에 정맥주사하고, 90분 후 촬영한 형광 이미지이다. 이에 따르면 알츠하이머 진행이 경과할수록(개월이 증가할수록), 아밀로이드 베타 덩어리가 쌓이게 되고 이 물질이 염증원으로 작용하여 케스페이즈-1을 활성화시킴으로써, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 통해 관찰할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 대조군(pre)에서는 형광이 거의 나타나지 않는데 반해, 알츠하이머 동물모델은 임상 증상이 발현되지 않은 3개월부터 형광 분석이 가능함을 확인하였다.
도 7b는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월부터 6개월 알츠하이머 동물모델(3 mo, 4 mo, 5 mo, 6 mo)에 처리하고, 뇌를 적출하여 형광을 측정한 사진으로, 이에 따르면 4 개월 알츠하이머 동물모델의 뇌에서부터 형광이 측정되기 시작하여, 5~6 개월 알츠하이머 동물모델에서 점차 형광의 세기가 강하게 관찰되고 있음을 확인하였다.
도 7c는 도 7b를 정량화하여 나타낸 그래프로, 이를 보면 4개월 알츠하이머 동물모델부터 대조군(WT) 대비 유의한 형광 세기가 관찰되기 시작함을 확인하였다.
도 7d는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월부터 6개월 알츠하이머 동물모델(3 mo, 4 mo, 5 mo, 6 mo)에 처리하고, 뇌를 적출하고, 이를 4분등분하여 각각을 형광현미경으로 촬영한 사진으로, 이에 따르면 본 발명의 실시예 4로부터 제조된 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 동물에 투여할 경우, 알츠하이머 동물모델의 뇌에서 형광이 복원되는 것을 확인하였고, 뇌에서도 알츠하이머가 시작되는 히포캠퍼스(hippocampus) 부분을 정확히 형광으로 표지하고 있음을 확인하였다.
도 7e는 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 3개월 알츠하이머 동물모델(TG)에 처리하고, 3 시간이 지난 후, 뇌조직을 적출하여 이들 각각을 케스페이즈-1 마커인 caspase-1' Ab로 면역염색한 뒤, 형광현미경으로 촬영한 사진으로, caspase-1' Ab는 케스페이즈-1 항체로 처리한 것으로 녹색을 나타내며, Cy5.5sms 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브의 형광체(Cy5.5)이고, 적색을 나타낸다.
도 7e에 나타난 바와 같이, 실시예 4의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브에 의해 형광이 발광하는 영역과 케스페이즈-1 항체로 면역 염색하여 나타난 영역이 정확히 일치하고 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 케스페이즈-1 효소에 특이적으로 반응하여, 형광을 나타내고 있음을 의미하는 것이다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Seoul National University Academic Corporation Foundation <120> probe for measuring the activity of caspase-1 and composition for diagnosis of inflammatory diseases comprising the same <130> HPC8040 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gly Trp Glu His Asp Gly Lys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Gly Leu Glu His Asp Gly Lys 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SIRPa recombinant protein <400> 3 Gly Tyr Val Ala Asp Gly Lys 1 5

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 폴리펩티드(a);를 중심으로 양 말단에 형광체(b)와 소광체(c)가 접합되어 이루어진 것으로,
    상기 폴리펩티드(a)의 N-말단에 상기 형광체(b)가 결합되고, 상기 폴리펩티드(a)의 라이신 또는 아르기닌 아미노산 잔기의 입실론 아민기에 소광체(c)가 결합되어 있으며,
    상기 형광체(b)는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 텍사스 레드(Texas red), Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine), 메로사이아닌(merocyanine), 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 벤족사디아졸(benzoxadiazol), 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 아크리딘 옐로우(acridine yellow), 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
    상기 소광체(c)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증 반응을 통해 활성화된 케스페이즈-1에 의해 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 염증 세포 내에서 특이적으로 발현하는 활성화된 케스페이즈-1 효소에 의해 분해되어, 형광이 복원되는 것을 특징으로 하는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 치매, 뇌졸중, 골관절염 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질병을 진단하기 위한 것을 특징으로 하는 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브.
  10. 제1항에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 유효성분으로 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 케스페이즈-1 효소를 정성 또는 정량 분석하기 위한 조성물.
  11. 제1항에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 유효성분으로 함유하는, 케스페이즈-1 효소의 활성화를 억제하는 약물 스크리닝용 조성물.
  12. 1) 제1항에 따른 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브를 개체에 투여하는 단계; 및
    2) 상기 개체로부터 상기 케스페이즈-1 활성 측정용 프로브에 의한 이미지를 수득하는 단계;를 포함하는 상기 개체로부터 염증반응이 야기된 세포나 조직을 영상화하는 방법.
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