CN108627588A - 一种正气片指纹图谱的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种正气片指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：1）供试品溶液的制备；2）对照品溶液的制备；3）测定。本发明还进一步提供了上述正气片指纹图谱在正气片中成分的质量检测中的应用及其质量检测方法。本发明更进一步提供了一种正气片中多味药材指纹图谱的筛选方法。本发明提供的一种正气片指纹图谱的检测方法及其应用，建立了正气片的高效液相指纹图谱，并对正气片中各单味药材色谱峰进行了归属确证，能够从原料源头进行有效监测，严格控制原药材的质量，保证正气片成分中有效成分的量相对稳定，从而保证临床用药的安全有效。
Description
技术领域
本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种正气片指纹图谱的检测方法及其应用，具体涉及一种正气片指纹图谱的检测方法及其在质量检测中应用。
背景技术
正气，也称藿香正气，是传统中成药，主要用于治疗伤风感冒、头痛胸闷、吐泻腹胀等，其可以解暑祛湿，多用于外感暑湿引起的发热、胸闷、腹胀、吐泻。亦可和胃止呕，多用于湿浊过盛引起的恶心呕吐，同时可芳香化浊，常用于脾湿胃浊引起的食欲不振、舌苔厚腻、腹泻等症。
虽然正气片揭示了其中药材组成，但其所含化学成分极其复杂，仅靠同时对几个化学成分进行含量测定，无法全面反映中药制剂的物质基础和化学成分群的整体性和复杂性，难以全面控制正气片的内在质量。
中药指纹图谱具有整体、宏观、模糊分析等特点，可通过对中药整体特征的描述，采用适当模糊处理方式，达到整体质量控制的目的，因此成为中药质量控制的有效手段。其中色谱指纹图谱分析可以使中药所含多种化学组分的整体特征可视化，从而披露出常规检验难以发现的质量问题。指纹图谱是根据中药多组分、多靶点的整体综合作用的特点，从“全成分”的角度出发的一种现代中药质量控制方法，对非单一成分药物的质量控制更加全面。目前缺乏对正气片系统的定性研究。因此，有必要建立正气片的指纹图谱，能够完成对正气片中成分的定性分析，以便对正气片进行有效的质量控制。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种正气片指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化条件的前处理及高效液相色谱方法，建立了正气片的高效液相指纹图谱，从不同侧面突出反映不同类别化学成分对正气片指纹图谱系统的贡献，从而实现对正气片全方化学成分的检测，较全面的反映正气片中各成分的现状，为整体控制和评价正气片质量提供参考依据。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种正气片指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：将正气片样品，加入乙醇水溶液，超声提取、离心后，过滤，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：将木香烃内酯、去氢木香内酯、苍术素、甘草苷、橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入乙醇水溶液溶解，配成对照品溶液；
3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得正气片指纹图谱。
优选地，步骤1)中，所述正气片样品为将正气片粉碎后获得的粉末样品。
优选地，步骤1)中，所述正气片样品加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为2：15-25。更优选地，所述正气片样品加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为1：10。所述正气片样品和乙醇水溶液称取时，应当精密称取。
优选地，步骤1)中，所述超声提取时间为20-40min。更优选地，所述超声提取时间为30min。
优选地，步骤1)中，所述正气片样品加入乙醇水溶液后，需精密称重。
优选地，步骤1)中，所述超声提取后需再称重，并用乙醇水溶液补足失重。
优选地，步骤1)中，所述离心条件为：离心时间：15-25min；离心转速：2000-4000r/min。更优选地，所述离心条件为：离心时间：20min；离心转速：3000r/min。
优选地，步骤1)中，所述过滤的方式为滤膜过滤方式。更优选地，所述滤膜的孔径为0.22μm。
优选地，步骤1)或2)中，所述乙醇水溶液为体积百分比浓度为≥50％的乙醇水溶液。
更优选地，步骤1)中，所述乙醇水溶液为体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液。
优选地，步骤2)中，所述木香烃内酯的CAS号为553-21-9，去氢木香内酯的CAS号为74299-48-2，苍术素的CAS号为55290-63-6，甘草苷的CAS号为551-15-5，橙皮苷的CAS号为520-26-3，厚朴酚的CAS号为528-43-8，和厚朴酚的CAS号为35354-74-6。
优选地，步骤2)中，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：木香烃内酯为50-200μg/mL、去氢木香内酯为50-200μg/mL、苍术素为50-200μg/mL、甘草苷为50-200μg/mL、橙皮苷为50-200μg/mL、厚朴酚为50-200μg/mL、和厚朴酚为50-200μg/mL。
更优选地，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：木香烃内酯为100μg/mL、去氢木香内酯为100μg/mL、苍术素为100μg/mL、甘草苷为100μg/mL、橙皮苷为100μg/mL、厚朴酚为100μg/mL、和厚朴酚为100μg/mL。
优选地，步骤2)中，所述对照品溶液采用逐级稀释制得。
更优选地，所述对照品溶液的逐级稀释包括以下步骤：
A1)将木香烃内酯、去氢木香内酯、苍术素、甘草苷、橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入乙醇水溶液稀释并定容，配成对照品储备溶液；
A2)将对照品储备溶液，加入乙醇水溶液稀释并定容，配成所需对照品溶液。
进一步优选地，步骤A1)中，所述对照品储备溶液中各成分的浓度均为0.5mg/mL。
进一步优选地，步骤A1)中，所述对照品储备溶液的储存温度为0-5℃。
进一步优选地，步骤A1)中，所述乙醇水溶液为体积百分比浓度为100％的无水乙醇。
进一步优选地，步骤A2)中，所述乙醇水溶液为体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液。
优选地，步骤3)中，所述供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，是根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为Waters Atlantis T3色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的柱温为25-35℃。更优选地，所述高效液相色谱法中的柱温为30℃。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的流速为0.8-1.2mL/min。更优选地，所述高效液相色谱法中的流速为1.0mL/min。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的进样量为1-10μL。更优选地，所述高效液相色谱法中的进样量为5μL。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，流动相为甲醇-0.05-0.2％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05-0.2％磷酸水溶液；分析时间为115min；梯度洗脱。
更优选地，所述0.05-0.2％磷酸水溶液为体积百分数为0.05-0.2％的磷酸水溶液。
更优选地，所述流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1％磷酸水溶液。
更优选地，所述梯度洗脱以流动相A相：B相体积比为15：85-15：85梯度变化洗脱。
进一步优选地，如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-5min，A相：B相体积比为15：85-15：85；
5-10min，A相：B相体积比为15：85-25：75；
10-20min，A相：B相体积比为25：75-35：65；
20-35min，A相：B相体积比为35：65-45：55；
35-50min，A相：B相体积比为45：55-65：35；
50-65min，A相：B相体积比为65：35-70：30；
65-75min，A相：B相体积比为70：30-78：22；
75-90min，A相：B相体积比为78：22-92：8；
90-100min，A相：B相体积比为92：8-92：8；
100-105min，A相：B相体积比为92：8-15：85；
105-115min，A相：B相体积比为15：85-15：85。
表1梯度洗脱程序
| 时间/min | A甲醇/％ | B 0.1％磷酸/％ |
| 0 | 15 | 85 |
| 5 | 15 | 85 |
| 10 | 25 | 75 |
| 20 | 35 | 65 |
| 35 | 45 | 55 |
| 50 | 65 | 35 |
| 65 | 70 | 30 |
| 75 | 78 | 22 |
| 90 | 92 | 8 |
| 100 | 92 | 8 |
| 105 | 15 | 85 |
| 115 | 15 | 85 |
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的扫描波长为190-400nm。更优选地，所述高效液相色谱法中的扫描波长为225-340nm。
进一步优选地，如表2所示，所述扫描波长随保留时间变化的具体程序为：
0-19min，扫描波长为280nm；
19-19.01min，扫描波长由280nm变为225nm；
19.01-50min，扫描波长为225nm；
50-50.01min，扫描波长由225nm变为240nm；
50.01-55min，扫描波长为240nm；
55-55.01min，扫描波长由240nm变为225nm；
55.01-60min，扫描波长为225nm；
60-60.01min，扫描波长由225nm变为340nm；
60.01-64min，扫描波长为340nm；
64-64.01min，扫描波长由340nm变为225nm；
64.01-80min，扫描波长为225nm；
80-80.01min，扫描波长由225nm变为340nm；
80.01-90min，扫描波长为340nm；
90-90.01min，扫描波长由340nm变为225nm；
90.01-115min，扫描波长为225nm。
表2扫描波长随保留时间变化的具体程序
| 保留时间/min | 波长nm |
| 0 | 280 |
| 19 | 280 |
| 19.01 | 225 |
| 50 | 225 |
| 50.01 | 240 |
| 55 | 240 |
| 55.01 | 225 |
| 60 | 225 |
| 60.01 | 340 |
| 64 | 340 |
| 64.01 | 225 |
| 80 | 225 |
| 80.01 | 340 |
| 90 | 340 |
| 90.01 | 225 |
| 115 | 225 |
本发明第二方面提供一种正气片指纹图谱的检测方法在正气片中成分的质量检测中的用途。
本发明第三方面提供一种正气片的质量检测方法，包括采用前述正气片指纹图谱的检测方法获得正气片指纹图谱，将得到的正气片指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的正气片的标准指纹图谱进行相似度比较。
优选地，本发明将测得的正气片指纹图谱与正气片的标准指纹图谱进行相似度的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件进行比较。更优选地，本发明测得的正气片指纹图谱与正气片标准指纹图谱的相似度≥0.90。
优选地，采用与前述正气片指纹图谱的检测方法相同的条件得到正气片的标准指纹图谱，所述正气片的标准指纹图谱包括17个共有指纹峰，以16号峰为定位峰(S峰，保留时间为1.000)，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.103±0.003)、2号峰(0.218±0.006)、3号峰(0.254±0.007)、4号峰(0.289±0.008)、5号峰(0.298±0.009)、6号峰(0.367±0.011)、7号峰(0.389±0.011)、8号峰(0.449±0.013)、9号峰(0.755±0.022)、10号峰(0.761±0.022)、11号峰(0.802±0.024)、12号峰(0.833±0.025)、13号峰(0.860±0.025)、14号峰(0.936±0.028)、15号峰(0.949±0.028)、17号峰(1.134±0.034)。
更优选地，所述正气片的标准指纹图谱包括17个共有指纹峰，以16号峰为定位峰(S峰，保留时间为1.000)，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.103±0.002)、2号峰(0.218±0.004)、3号峰(0.254±0.005)、4号峰(0.289±0.005)、5号峰(0.298±0.005)、6号峰(0.367±0.007)、7号峰(0.389±0.007)、8号峰(0.449±0.008)、9号峰(0.755±0.015)、10号峰(0.761±0.015)、11号峰(0.802±0.016)、12号峰(0.833±0.016)、13号峰(0.860±0.017)、14号峰(0.936±0.018)、15号峰(0.949±0.018)、17号峰(1.134±0.022)。
最优选地，所述正气片的标准指纹图谱包括17个共有指纹峰，以16号峰为定位峰(S峰，保留时间为1.000)，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.103)、2号峰(0.218)、3号峰(0.254)、4号峰(0.289)、5号峰(0.298)、6号峰(0.367±0.001)、7号峰(0.389±0.001)、8号峰(0.449±0.001)、9号峰(0.755)、10号峰(0.761±0.001)、11号峰(0.802±0.001)、12号峰(0.833±0.001)、13号峰(0.860±0.001)、14号峰(0.936)、15号峰(0.949)、17号峰(1.134)。所述正气片的标准指纹图谱的具体数据见图1。
更优选地，如图3所示，所述正气片的标准指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，定位确定所述6号峰为甘草苷的指纹峰，所述8号峰为橙皮苷的指纹峰，所述11号峰为木香烃内酯的指纹峰，所述12号峰为去氢木香内酯的指纹峰，所述13号峰为和厚朴酚的指纹峰，所述14号峰为厚朴酚的指纹峰，所述16号峰为苍术素的指纹峰。
本发明第四方面提供一种正气片中多味药材指纹图谱的筛选方法，包括下列步骤：
A)药材样品溶液的制备：将正气片中广藿香油、紫苏油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜10味药材样品中任一种或多种，按正气片指纹图谱的检测方法的步骤1)进行制备，分别获得至少一种单味药材样品溶液；
B)缺样阴性样品混合溶液的制备：将广藿香油、紫苏油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜10味药材样品去除其中任一1味药材，加入对应质量的辅料填补，按正气片指纹图谱的检测方法的步骤1)进行制备，分别获得10种缺样阴性样品混合溶液；
C)测定：采用与正气片指纹图谱的检测方法的步骤3)中相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液，分别获得单味药材样品溶液和10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱；
D)标准指纹图谱的取得：采用与正气片指纹图谱的检测方法相同的步骤，得到正气片的标准指纹图谱；
E)质量检测：将单味药材样品溶液的指纹图谱、10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱，分别与正气片的标准指纹图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出单味药材样品溶液在正气片的标准指纹图谱中的相应特征峰，从而对单味药材样品溶液的指纹图谱中的特征峰进行归属定位。
优选地，步骤A)中，所述广藿香油(Patchouli oil)、紫苏叶油(Perilla oil)应当精密称取。
优选地，步骤A)中，所述木香(Aucklandiae Radix)、苍术(AtractylodisRhizoma)、甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)、茯苓(Poria)、陈皮(CitriReticulatae Pericarpium)、半夏(Pinelliae Rhizoma)、厚朴(Magnoliae officinalisCortex)、生姜(Zingiberis Rhizoma Recens)，应当粉碎成粉后精密称取。所述半夏为制半夏，厚朴为姜厚朴。
优选地，步骤A)中，所述广藿香油与所述乙醇水溶液加入的体积之比为1：750-1250。更优选地，所述广藿香油与所述乙醇水溶液加入的体积之比为1：1000。
优选地，步骤A)中，所述紫苏油与所述乙醇水溶液加入的体积之比为1：1500-2500。更优选地，所述广藿香油与所述乙醇水溶液加入的体积之比为1：2000。
优选地，步骤A)中，所述木香加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.45：15-25。更优选地，所述木香加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.45：20。
优选地，步骤A)中，所述茯苓加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.45：15-25。更优选地，所述茯苓加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.45：20。
优选地，步骤A)中，所述苍术加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：15-25。更优选地，所述苍术加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：20。
优选地，步骤A)中，所述陈皮加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：15-25。更优选地，所述陈皮加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：20。
优选地，步骤A)中，所述半夏加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：15-25。更优选地，所述半夏加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：20。
优选地，步骤A)中，所述厚朴加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：15-25。更优选地，所述厚朴加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：20。
优选地，步骤A)中，所述生姜加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：15-25。更优选地，所述生姜加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.3：20。
优选地，步骤A)中，所述甘草加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.15：15-25。更优选地，所述甘草加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为0.15：20。
优选地，步骤B)中，所述辅料选自硬脂酸镁或滑石粉中的一种或两种混合。
优选地，步骤E)中，本发明将测得的单味药材样品溶液的指纹图谱、10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱与正气片的标准指纹图谱进行特征峰的归属定位，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件进行分析处理，并通过正气片的标准指纹图谱上各特征峰的相对保留时间对正气片各单味药材的特征峰进行归属确证。
优选地，步骤E)中，所述木香样品溶液的指纹图谱包括2个共有指纹峰，所述2个共有指纹峰为11号峰、12号峰。具体结果见表3。
优选地，步骤E)中，所述苍术样品溶液的指纹图谱包括4个共有指纹峰，所述4个共有指纹峰为9号峰、15号峰、16号峰、17号峰。具体结果见表3。
优选地，步骤E)中，所述甘草样品溶液的指纹图谱包括1个共有指纹峰，所述1个共有指纹峰为6号峰。具体结果见表3。
优选地，步骤E)中，所述陈皮样品溶液的指纹图谱包括3个共有指纹峰，所述3个共有指纹峰为5号峰、8号峰、10号峰。具体结果见表3。
优选地，步骤E)中，所述制半夏样品溶液的指纹图谱包括1个共有指纹峰，所述1个共有指纹峰为1号峰。具体结果见表3。
优选地，步骤E)中，所述姜厚朴样品溶液的指纹图谱包括7个共有指纹峰，所述7个共有指纹峰为2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、7号峰、13号峰、14号峰。具体结果见表3。
优选地，步骤E)中，所述广藿香油样品溶液、紫苏油样品溶液、茯苓样品溶液、生姜样品溶液的指纹图谱不包括共有指纹峰。具体结果见表3。
表3正气片中各单味药材的共有指纹峰归属
| 药材 | 峰数(个) | 共有指纹峰峰号 |
| 广藿香油 | 0 | — |
| 紫苏油 | 0 | — |
| 木香 | 2 | 11、12 |
| 苍术 | 4 | 9、15、16、17 |
| 甘草 | 1 | 6 |
| 茯苓 | 0 | — |
| 陈皮 | 3 | 5、8、10 |
| 半夏 | 1 | 1 |
| 厚朴 | 7 | 2、3、4、5、7、13、14 |
| 生姜 | 0 | — |
本发明中的用水均为纯净水。
如上所述，本发明提供的一种正气片指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化反应条件的前处理及高效液相色谱方法，建立了正气片的高效液相指纹图谱，从不同侧面突出反映不同类别化学成分对正气片指纹图谱系统的贡献，从而实现对正气片全方化学成分的检测，为正气片的质量标准提供参考依据。本发明首次建立的正气片指纹图谱的检测方法，其精密度和重复性良好，确定了17个共有峰，各共有峰的相对保留时间的RSD≤0.3％，多批次正气片样品的相似度评价结果均大于0.95，并能保持供试品溶液在24h内稳定性良好。该方法对正气片中各单味药材色谱峰进行了归属确证，指纹图谱体现了广藿香油、紫苏油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜的特征峰。该方法可实现从原料源头进行有效监测，严格控制原药材的质量，保证正气片中有效成分量的相对稳定，从而保证临床用药的安全有效性。本发明建立的高效液相指纹图谱方法首次实现了对正气片全方的质量控制，不是对单一化合物或药材进行鉴别，且方法操作简单，重复性强，便于质量控制。本发明建立的正气片指纹图谱方法基于药材的药效物质基础，分波段检测，实现一张图谱涵盖多个药材的药效物质。
附图说明
图1显示为本发明中的正气片的指纹图谱。
图2显示为本发明中的10批次正气片样品的指纹图谱。
图3显示为本发明中的对照品溶液的液相色谱图，其中，6为甘草苷，8为橙皮苷，11为木香烃内酯，12为去氢木香内酯，13为和厚朴酚，14为厚朴酚，16为苍术素。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA Co.ltd)；磷酸(色谱纯，美国TEDIA Co.ltd)；木香烃内酯(纯度﹥98％)、去氢木香内酯(纯度﹥98％)、苍术素(纯度﹥98％)，均购自成都曼思特生物科技有限公司；甘草苷(纯度﹥98％)、橙皮苷(纯度﹥98％)、厚朴酚(纯度﹥98％)、和厚朴酚(纯度﹥98％)，均购自中国食品药品检定研究院；超纯水(Milli-Q纯水仪自制)。
正气片，由上海和黄药业有限公司提供，共10批次正气片，批号见下表4。
表4正气片批号
| 编号 | 批号 | 编号 | 批号 |
| S1 | 170810 | S6 | 171027 |
| S2 | 170815 | S7 | 171110 |
| S3 | 170908 | S8 | 171117 |
| S4 | 170922 | S9 | 171201 |
| S5 | 171013 | S10 | 171215 |
单味药材：广藿香油、紫苏油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜由上海和黄药业有限公司提供，均为常规使用的中药材，可从市场上购买获得
2、仪器
Milli-Q纯水仪(美国Millipore Co.ltd)；1260-HPLC色谱仪(配有DAD检测器，USAAgilent Co.ltd)；AL204型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo Co.ltd)；SB-5200-DTD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
实施例1
1、样品前处理
供试品溶液的制备：精密称取正气片粉末2g，置于50mL的EP管中，精密加入体积百分比浓度为50-100％的乙醇水溶液15-25ml，称定重量，密塞封闭后用超声波仪超声提取20-40min，再次称重，用50-100％的乙醇水溶液减失的重量，在2000-4000r/min下离心15-25min，取上清液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯、苍术素、甘草苷、橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品，置于容量瓶中进行逐级稀释。即先加入50-100％的乙醇水溶液溶解并在容量瓶中定容摇匀，得到对照品储备溶液，对照品储备溶液中各成分的浓度均为0.5mg/mL，对照品储备溶液的储存温度为0-5℃。再将对照品储备溶液加入50-100％的乙醇水溶液稀释并定容，配成所需对照品溶液，对照品溶液中各成分的浓度均为50-200μg/mL。
2、色谱条件
所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为Waters Atlantis T3色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；柱温：25-35℃；流速：0.8-1.2mL/min；进样量：1-10μL；流动相：甲醇-0.05-0.2％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05-0.2v/v％的磷酸水溶液；分析时间：115min；梯度洗脱。所述高效液相色谱法中的扫描波长为190-400nm。
如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-5min，A相：B相体积比为15：85-15：85；
5-10min，A相：B相体积比为15：85-25：75；
10-20min，A相：B相体积比为25：75-35：65；
20-35min，A相：B相体积比为35：65-45：55；
35-50min，A相：B相体积比为45：55-65：35；
50-65min，A相：B相体积比为65：35-70：30；
65-75min，A相：B相体积比为70：30-78：22；
75-90min，A相：B相体积比为78：22-92：8；
90-100min，A相：B相体积比为92：8-92：8；
100-105min，A相：B相体积比为92：8-15：85；
105-115min，A相：B相体积比为15：85-15：85。
3、测定
采用上述2中的色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述1中供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱。其中，所述供试品溶液的指纹图谱，要与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得正气片指纹图谱。
实施例2
1、样品前处理
供试品溶液的制备：精密称取正气片粉末2g，置于50mL的EP管中，精密加入体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液20ml，称定重量，密塞封闭后用超声波仪超声提取30min，再次称重，用体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液减失的重量，在3000r/min下离心20min，取上清液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯、苍术素、甘草苷、橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚，进行逐级稀释。即先将对照品各5mg置于10mL容量瓶中，加入体积百分比浓度为100％的无水乙醇溶解并在容量瓶中定容摇匀，得到对照品储备溶液，对照品储备溶液中各成分的浓度均为0.5mg/mL，对照品储备溶液的储存温度为4℃。再将对照品储备溶液加入体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液稀释并定容，配成所需对照品溶液，对照品溶液中各成分的浓度均为100μg/mL。
2、色谱条件
所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为Waters Atlantis T3色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：5μL；流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1v/v％的磷酸水溶液；分析时间：115min；梯度洗脱。
如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-5min，A相：B相体积比为15：85-15：85；
5-10min，A相：B相体积比为15：85-25：75；
10-20min，A相：B相体积比为25：75-35：65；
20-35min，A相：B相体积比为35：65-45：55；
35-50min，A相：B相体积比为45：55-65：35；
50-65min，A相：B相体积比为65：35-70：30；
65-75min，A相：B相体积比为70：30-78：22；
75-90min，A相：B相体积比为78：22-92：8；
90-100min，A相：B相体积比为92：8-92：8；
100-105min，A相：B相体积比为92：8-15：85；
105-115min，A相：B相体积比为15：85-15：85。
所述高效液相色谱法中的扫描波长为225-340nm。如表2所示，所述扫描波长随保留时间变化的具体程序为：
0-19min，扫描波长为280nm；
19-19.01min，扫描波长由280nm变为225nm；
19.01-50min，扫描波长为225nm；
50-50.01min，扫描波长由225nm变为240nm；
50.01-55min，扫描波长为240nm；
55-55.01min，扫描波长由240nm变为225nm；
55.01-60min，扫描波长为225nm；
60-60.01min，扫描波长由225nm变为340nm；
60.01-64min，扫描波长为340nm；
64-64.01min，扫描波长由340nm变为225nm；
64.01-80min，扫描波长为225nm；
80-80.01min，扫描波长由225nm变为340nm；
80.01-90min，扫描波长为340nm；
90-90.01min，扫描波长由340nm变为225nm；
90.01-115min，扫描波长为225nm。
3、测定
采用上述2中的色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述1中供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱。其中，所述供试品溶液的指纹图谱，要与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得正气片指纹图谱。
实施例3
采用上述实施例2中建立的正气片指纹图谱的检测方法对10批次正气片进行检测，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，10批次正气片的批号见表4。得到的供试品的指纹图谱数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中，与相同指纹图谱检测条件下获得的正气片的标准指纹图谱进行相似度比较，以正气片的指纹图谱与正气片标准指纹图谱的相似度≥0.90为标准，并以表4中S1样品为参照图谱，确定正气片的标准指纹图谱包括17个共有指纹峰，以16号峰为定位峰(S峰，保留时间为1.000)，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.100-0.106)、2号峰(0.212-0.224)、3号峰(0.247-0.261)、4号峰(0.281-0.297)、5号峰(0.289-0.307)、6号峰(0.356-0.378)、7号峰(0.378-0.400)、8号峰(0.436-0.462)、9号峰(0.733-0.777)、10号峰(0.739-0.783)、11号峰(0.778-0.826)、12号峰(0.808-0.858)、13号峰(0.835-0.885)、14号峰(0.908-0.964)、15号峰(0.921-0.977)、17号峰(1.100-1.168)。
其中，优选方案的正气片的标准指纹图谱包括17个共有指纹峰，以16号峰为定位峰(S峰，保留时间为1.000)，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为(0.101-0.105)、2号峰(0.214-0.222)、3号峰(0.249-0.259)、4号峰(0.284-0.294)、5号峰(0.293-0.303)、6号峰(0.360-0.374)、7号峰(0.382-0.396)、8号峰(0.441-0.457)、9号峰(0.740-0.770)、10号峰(0.746-0.776)、11号峰(0.786-0.818)、12号峰(0.817-0.849)、13号峰(0.843-0.877)、14号峰(0.918-0.954)、15号峰(0.931-0.967)、17号峰(1.112-1.156)。
将上述的正气片的标准指纹图谱，与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据图1中的对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出正气片的标准指纹图谱中的相应特征峰，定位确定所述6号峰为甘草苷的指纹峰，所述8号峰为橙皮苷的指纹峰，所述11号峰为木香烃内酯的指纹峰，所述12号峰为去氢木香内酯的指纹峰，所述13号峰为和厚朴酚的指纹峰，所述14号峰为厚朴酚的指纹峰，所述16号峰为苍术素的指纹峰。
实施例4
采用上述实施例2中建立的正气片指纹图谱的检测方法对10批次正气片进行检测，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，10批次正气片的批号见表4。得到的供试品的指纹图谱数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中，与相同指纹图谱检测条件下获得的正气片的标准指纹图谱进行相似度比较，以正气片的指纹图谱与正气片标准指纹图谱的相似度≥0.90为标准，并以表4中S1样品为参照图谱，平均数法生成对照图谱见图1，叠加图谱见图2，确定指纹图谱中17个共有指纹峰。其中16号峰出峰时间较为稳定适中，故选取16号为定位峰(S峰)。
通过10批次正气片获得的指纹图谱，计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积的比值，得到的相对保留时间和相对峰面积见表5。由表5可知，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.3％，相对峰面积的RSD在4％-25％之间，说明10批次正气片样品的成分比较稳定。
表5共有峰的相对保留时间和相对峰面积
具体的正气片的标准指纹图谱见图1，由图1可知，正气片的标准指纹图谱包括17个共有指纹峰，以16号峰为定位峰(S峰，保留时间为1.000)，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.103)、2号峰(0.218)、3号峰(0.254)、4号峰(0.289)、5号峰(0.298)、6号峰(0.366-0.368)、7号峰(0.388-0.390)、8号峰(0.448-0.450)、9号峰(0.755)、10号峰(0.760-0.762)、11号峰(0.801-0.803)、12号峰(0.832-0.834)、13号峰(0.859-0.861)、14号峰(0.936)、15号峰(0.949)、17号峰(1.134)。
将具体的正气片的标准指纹图谱，与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据图1中的对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出正气片的标准指纹图谱中的相应特征峰，定位确定所述6号峰为甘草苷的指纹峰，所述8号峰为橙皮苷的指纹峰，所述11号峰为木香烃内酯的指纹峰，所述12号峰为去氢木香内酯的指纹峰，所述13号峰为和厚朴酚的指纹峰，所述14号峰为厚朴酚的指纹峰，所述16号峰为苍术素的指纹峰。
实施例5
对本发明中的正气片指纹图谱的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。
1、精密度
取编号S1(批号：170810)的正气片样品1份，按上述实施例2中正气片指纹图谱的检测方法进行检测，连续进样6次，考察指纹图谱中各主要色谱峰保留时间及其峰面积的一致性，其中规定的共有峰的相对保留时间RSD≤0.3％，相对峰面积RSD≤3.0％。结果表明，仪器精密度良好。
2、重复性
取编号S1(批号：170810)的正气片样品6份，按上述实施例2中正气片指纹图谱的检测方法进行检测，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，其中规定的共有峰相对保留时间的RSD≤0.2％，相对峰面积的RSD≤3.0％。表明本发明中方法的重复性良好，准确度较高。
3、稳定性
取编号S1(批号：170810)的正气片样品1份，按上述实施例2中正气片指纹图谱的检测方法，制备供试品溶液后分别放置0h、4h、8h、12h、16h、24h进行检测，计算得出各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果各共有峰相对保留时间的RSD≤0.3％，相对峰面积的RSD％≤3.0％。表明本发明中样品在24h内检测稳定性良好。
实施例6
采用上述实施例2中正气片指纹图谱的检测方法，对10批次正气片进行指纹图谱分析，10批次正气片的批号见表4，检测结果见图2。同时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件，进行10批次正气片样品的整体相似度评价，整体相似度可以体现不同批次样品间各成分在种类及其相对含量上的相似程度，结果见表6。由表6结果显示，10批次正气片的相似度均≥0.95，表明10批次正气片的相似度良好，批间差异较小，此指纹图谱适用于正气片质量控制。
表6 10批次正气片相似度评价结果
实施例7
采用上述实施例2中样品前处理步骤，制备获得供试品溶液。
分别取广藿香油20μL、紫苏油10μL、木香0.45g、茯苓0.45g、苍术0.3g、陈皮0.3g、半夏0.3g、厚朴0.3g、鲜生姜0.3g、甘草0.15g，采用上述实施例2中样品前处理步骤，分别制备获得10种单味药材样品溶液。
根据正气片处方和工艺制备缺样阴性样品，缺样阴性样品即将10味药材样品去除1味药材，各缺样阴性样品中缺少的药材由对应量的辅料如硬脂酸镁或滑石粉填补，最后重量满足正气片要求重量，从而配制10种缺样阴性样品。取10种缺样阴性样品粉末各2.0g，采用上述实施例2中样品前处理步骤，分别制备获得10种缺样阴性样品混合溶液。
采用实施例2的正气片指纹图谱的检测方法中第2、3项，分别测定供试品溶液、10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液，分别获得供试品溶液、10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱。将得到的供试品溶液、10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中进行分析处理，同时采用实施例2的正气片指纹图谱的检测方法得到正气片的标准指纹图谱。将供试品溶液、10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱，分别与正气片的标准指纹图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出10种单味药材样品溶液在正气片的标准指纹图谱中的相应特征峰，从而对10种单味药材样品溶液的指纹图谱中的特征峰进行归属定位，具体结果见图3，表3。所述10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱能够用于对比，确认特征峰来源。
由图3、表3可知，峰1等1个共有峰来源于半夏；峰2-5、峰7、峰13-14等7个共有峰来源于厚朴；峰5、峰8，峰10等3个共有峰来源于陈皮；峰6等1个共有峰来源于甘草；峰9、峰15-17等4个共有峰来源于苍术；峰11、峰12等2个共有峰来源于木香。正气片中10味药材，广藿香油、紫苏油、茯苓、生姜不包括共有峰，其它6味药材的化学特征峰在该指纹图谱中均有较好的体现，并得到归属确证。
综上所述，本发明提供的一种正气片指纹图谱的检测方法及其应用，建立了正气片的高效液相指纹图谱，并对正气片中各单味药材色谱峰进行了归属确证，能够实现从原料源头进行有效监测，严格控制原药材的质量，保证正气片成分中有效成分量的相对稳定，从而保证临床用药的安全有效性。所以，本发明克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种正气片指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：将正气片样品，加入乙醇水溶液，超声提取、离心后，过滤，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：将木香烃内酯、去氢木香内酯、苍术素、甘草苷、橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入乙醇水溶液溶解，配成对照品溶液；
3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得正气片指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种正气片指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1)和2)中，包括以下条件中任一项或多项：
A1)所述正气片样品加入的重量(g)与所述乙醇水溶液加入的体积(mL)之比为2：15-25；
A2)所述超声提取时间为20-40min；
A3)所述正气片样品加入乙醇水溶液后，需精密称重；
A4)所述超声提取后需再称重，并用乙醇水溶液补足失重；
A5)所述离心条件为：离心时间：15-25min；离心转速：2000-4000r/min；
A6)所述过滤的方式为滤膜过滤方式；
A7)所述乙醇水溶液为体积百分比浓度为≥50％的乙醇水溶液；
A8)所述对照品溶液中各成分的含量范围为：木香烃内酯为50-200μg/mL、去氢木香内酯为50-200μg/mL、苍术素为50-200μg/mL、甘草苷为50-200μg/mL、橙皮苷为50-200μg/mL、厚朴酚为50-200μg/mL、和厚朴酚为50-200μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种正气片指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为Waters Atlantis T3色谱柱；扫描波长为190-400nm；流动相为甲醇-0.05-0.2％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05-0.2％磷酸水溶液；分析时间为115min；梯度洗脱。
4.根据权利要求3所述的一种正气片指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0-5min，A相：B相体积比为15：85-15：85；5-10min，A相：B相体积比为15：85-25：75；10-20min，A相：B相体积比为25：75-35：65；20-35min，A相：B相体积比为35：65-45：55；35-50min，A相：B相体积比为45：55-65：35；50-65min，A相：B相体积比为65：35-70：30；65-75min，A相：B相体积比为70：30-78：22；75-90min，A相：B相体积比为78：22-92：8；90-100min，A相：B相体积比为92：8-92：8；100-105min，A相：B相体积比为92：8-15：85；105-115min，A相：B相体积比为15：85-15：85。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种正气片指纹图谱的检测方法在正气片中成分的质量检测中的用途。
6.一种正气片的质量检测方法，包括采用权利要求1-4任一所述的正气片指纹图谱的检测方法获得正气片指纹图谱，将得到的正气片指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的正气片的标准指纹图谱进行相似度比较。
7.根据权利要求6所述的一种正气片的质量检测方法，其特征在于，采用与权利要求1-4任一所述的正气片指纹图谱的检测方法相同的条件得到正气片的标准指纹图谱，所述正气片的标准指纹图谱包括17个共有指纹峰，以16号峰为定位峰S峰，保留时间为1.000，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.100-0.106、2号峰0.212-0.224、3号峰0.247-0.261、4号峰0.281-0.297、5号峰0.289-0.307、6号峰0.356-0.378、7号峰0.378-0.400、8号峰0.436-0.462、9号峰0.733-0.777、10号峰0.739-0.783、11号峰0.778-0.826、12号峰0.808-0.858、13号峰0.835-0.885、14号峰0.908-0.964、15号峰0.921-0.977、17号峰1.100-1.168。
8.一种正气片中多味药材指纹图谱的筛选方法，包括下列步骤：
A)药材样品溶液的制备：将正气片中广藿香油、紫苏油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜10味药材样品中任一种或多种，按权利要求1-4任一所述的正气片指纹图谱的检测方法的步骤1)进行制备，分别获得至少一种单味药材样品溶液；
B)缺样阴性样品混合溶液的制备：将广藿香油、紫苏油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜10味药材样品去除其中任一1味药材，加入对应质量的辅料填补，按权利要求1-4任一所述的正气片指纹图谱的检测方法的步骤1)进行制备，分别获得10种缺样阴性样品混合溶液；
C)测定：采用与权利要求1-4任一所述的正气片指纹图谱的检测方法的步骤3)中相同色谱条件的高效液相色谱法分别测定单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液，分别获得单味药材样品溶液和10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱；
D)标准指纹图谱的取得：采用与权利要求1-4任一所述的正气片指纹图谱的检测方法相同的步骤，得到正气片的标准指纹图谱；
E)质量检测：将单味药材样品溶液的指纹图谱、10种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱，分别与正气片的标准指纹图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出单味药材样品溶液在正气片的标准指纹图谱中的相应特征峰，从而对单味药材样品溶液的指纹图谱中的特征峰进行归属定位。
9.根据权利要求8所述的一种正气片中多味药材指纹图谱的筛选方法，其特征在于，步骤A)或B)中，包括以下条件中任一项或多项：
B1)所述广藿香油与所述乙醇水溶液加入的体积之比为1：750-1250；
B2)所述紫苏油与所述乙醇水溶液加入的体积之比为1：1500-2500；
B3)所述木香加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.45：15-25；
B4)所述茯苓加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.45：15-25；
B5)所述苍术加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.3：15-25；
B6)所述陈皮加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.3：15-25；
B7)所述半夏加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.3：15-25；
B8)所述厚朴加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.3：15-25；
B9)所述生姜加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.3：15-25；
B10)所述甘草加入的重量g与所述乙醇水溶液加入的体积mL之比为0.15：15-25；
B11)所述辅料选自硬脂酸镁或滑石粉中的一种或两种混合。
10.根据权利要求8所述的一种正气片中多味药材指纹图谱的筛选方法，其特征在于，步骤E)中，包括以下条件中任一项或多项：
C1)所述木香样品溶液的指纹图谱包括2个共有指纹峰，所述2个共有指纹峰为11号峰、12号峰；
C2)所述苍术样品溶液的指纹图谱包括4个共有指纹峰，所述4个共有指纹峰为9号峰、15号峰、16号峰、17号峰；
C3)所述甘草样品溶液的指纹图谱包括1个共有指纹峰，所述1个共有指纹峰为6号峰；
C4)所述陈皮样品溶液的指纹图谱包括3个共有指纹峰，所述3个共有指纹峰为5号峰、8号峰、10号峰；
C5)所述制半夏样品溶液的指纹图谱包括1个共有指纹峰，所述1个共有指纹峰为1号峰；
C6)所述姜厚朴样品溶液的指纹图谱包括7个共有指纹峰，所述7个共有指纹峰为2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、7号峰、13号峰、14号峰；
C7)所述广藿香油样品溶液、紫苏油样品溶液、茯苓样品溶液、生姜样品溶液的指纹图谱不包括共有指纹峰。
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