CN108623585B - β-四氢咔啉类抗真菌药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑四氢咔啉类抗真菌化合物及其药学上可接受的盐，该化合物的结构如通式I所示：

其中，n为1～3；R₁为氢，或位于苯环任意位置的单取代基或多取代基；X为O或NH，R₂为取代或未取代的芳香环或脂肪环；或者X为NR₃，R₂和R₃独立地为低级烷基、取代或未取代的芳香环或脂肪环；或者X为N，R₂和X组成取代或未取代的杂环烷基。本发明还公开了该化合物的制备方法及其在制备抗真菌药物中的应用。本发明化合物表现出良好的抗真菌活性特点，部分化合物结果优于对照药氟康唑，可以用于制备抗真菌药物。实验结果还显示，本发明的部分化合物与氟康唑联用对临床分离的氟康唑白念珠菌均表现出良好的协同效果。

Description

β-四氢咔啉类抗真菌药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有抗真菌活性的β-四氢咔啉类衍生物及其药学上可接受的盐类，以及制备方法，以及化合物抗真菌活性，可用于治疗真菌感染类疾病。

背景技术

近年来，侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，尤其在HIV、肿瘤、器官移植、血液病、重症监护患者中侵袭性真菌感染的发病率和死亡率不断升高。白念珠菌(Candidaalbicans)，新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)和烟曲霉菌(Aspergillusfumigates)是目前发病率和死亡率最高的三大致病真菌。

目前，临床上只有四类药物用于治疗深部真菌感染：多烯类(两性霉素B)、核酸类(5-氟胞嘧啶)和唑类(氟康唑、伊曲康唑等)。尽管上述药物使得真菌感染从预防到治疗都取得了很大进展，但深部真菌感染的治疗，尤其是难治性真菌病(如隐球菌脑膜炎)仍然存在很大的困难。两性霉素B至今仍为中枢神经系统隐球菌病的首选药物之一，但毒副作用严重；5-氟胞嘧啶单独使用极易产生耐药，多与两性霉素B联合应用，且对肝、肾、造血系统均有损害；氟康唑虽副作用较轻，但单独使用治疗隐球菌脑膜炎疗效并不理想，且耐药性日趋严重，进一步降低了疗效；伊曲康唑药代动力学性质不佳，多与两性霉素B合用或作为维持治疗用药；而棘白菌素类抗真菌药物则对隐球菌无效。因此，研发全新结构类型、作用机制和抗耐药的抗深部真菌感染药物十分重要。

本课题组前期合成了一类γ-四氢咔啉类化合物(包括下列化合物wsz-c38)，该类化合物对7种常见致病真菌具有中等抑制活性，该结果2014年发表在ACS MedicinalChemistry Letters期刊(ACS Med.Chem.Lett.Novel Carboline Derivatives as PotentAntifungal Lead Compounds:Design,Synthesis,and Biological Evaluation,2014,5:506)。进一步结构优化得到了β-四氢咔啉类化合物(包括下列化合物hxm-b10)，该结果2015年在本课题组研究生硕士毕业论文中报道(新型抗真菌先导化合物的设计、合成和活性研究，贺潇蒙)。但以上报道的化合物(包括下列化合物wsz-c38和hxm-b10)抑菌效果有限、构效关系不明确，且无动物体内抗真菌效果。

发明内容

本发明在现有的研究结果基础上进一步优化研究，第一目的在于提供一类新的抗真菌小分子抑制剂。

该抗真菌小分子抑制剂为一种β-四氢咔啉类抗真菌化合物或其药学上可接受的盐，该化合物结构如通式I所示：

其中，n为1～3；

R₁为氢，或位于苯环任意位置的单取代基或多取代基；各取代基独立地为卤素、腈基、低级烷基、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级卤代烷基、低级羟基烷基、低级卤代烷氧基、低级卤代烷基氨基、低级环烷基氨基、低级链炔基氨基、酰胺基、低级环烷基酰胺基、低级酰胺基烷基、苄基或取代苄基；

X为O或NH，R₂为取代或未取代的芳香环或脂肪环；或者X为NR₃，R₂和R₃独立地为低级烷基、取代或未取代的芳香环或脂肪环，R₂和R₃可以相同，也可以不同；或者X为N，R₂和X组成取代或未取代的杂环烷基。

所述的“低级”是指含1至6个碳原子的直链或支链饱和脂肪烃基团；所述的环烷基是指含3至7个碳的环；所述的芳香环是指苯环或芳香杂环；所述脂肪环3～7元的环烷基或杂环烷基。

其中，当R₁为氢，X为O时，R₂不为对氯取代苯基。

本发明的一些较佳实施例中，

R₁为氢；

X为O；

R₂为邻氯取代苯基、间氯取代苯基、对溴取代苯基、邻溴取代苯基、间溴取代苯基、对氟取代苯基、邻氟取代苯基、间氟取代苯基、对甲基取代苯基、邻甲基取代苯基、间甲基取代苯基、对甲氧基取代苯基、邻甲氧基取代苯基、间甲氧基取代苯基、对乙氧基取代苯基、邻乙氧基取代苯基、间乙氧基取代苯基、对硝基取代苯基、邻硝基取代苯基、间硝基取代苯基、对异羟肟酸取代苯基、邻异羟肟酸取代苯基或间异羟肟酸取代苯基。

本发明的一些较佳实施例中，

R₁为氢；

X为NH；

R₂为对氯取代苯基、邻氯取代苯基、间氯取代苯基、对溴取代苯基、邻溴取代苯基、间溴取代苯基、对氟取代苯基、邻氟取代苯基、间氟取代苯基、对甲基取代苯基、邻甲基取代苯基、间甲基取代苯基、对甲氧基取代苯基、邻甲氧基取代苯基、间甲氧基取代苯基、对乙氧基取代苯基、邻乙氧基取代苯基、间乙氧基取代苯基、对硝基取代苯基、邻硝基取代苯基、间硝基取代苯基、对异羟肟酸取代苯基、邻异羟肟酸取代苯基或间异羟肟酸取代苯基。

本发明的一些较佳实施例中，

R₁为氢；

X为NR₃；

R₂和R₃均为甲基或乙基。

本发明的一些较佳实施例中，

R₁为氢；

X为N；

R₂和X组成取代或未取代的哌啶基、吡咯基、二氢吡咯基、四氢吡咯基、哌嗪基、邻苯二甲酰亚胺基或二甲酰亚胺基吗啉基。

本发明的另一些较佳实施例中，

R₁为位于苯环任意位置的单取代基，具体的：

当R₁是卤素时，可以是氟、氯、溴、碘，优选氯和氟；

当R₁是低级烷基时，可以选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基和正己基等，优选甲基和乙基；

当R₁是低级烷氧基时，可选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基等，优选甲氧基和乙氧基。

当R₁是低级卤代烷基时，优选三氟甲基；

当R₁是低级卤代烷氧基时，优选三氟甲氧基。

X为O或NH；

R₂为对氯取代苯基、邻氯取代苯基、间氯取代苯基、对溴取代苯基、邻溴取代苯基、间溴取代苯基、对氟取代苯基、邻氟取代苯基、间氟取代苯基、对甲基取代苯基、邻甲基取代苯基、间甲基取代苯基、对甲氧基取代苯基、邻甲氧基取代苯基、间甲氧基取代苯基、对乙氧基取代苯基、邻乙氧基取代苯基、间乙氧基取代苯基、对硝基取代苯基、邻硝基取代苯基、间硝基取代苯基、对异羟肟酸取代苯基、邻异羟肟酸取代苯基或间异羟肟酸取代苯基。进一步优选的R₂为对氯取代苯基和对异羟肟酸取代苯基。

本发明的另一些较佳实施例中，

R₁为位于苯环任意位置的单取代基，具体的：

当R₁是卤素时，可以是氟、氯、溴、碘，优选氯和氟；

当R₁是低级烷基时，可以选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基和正己基等，优选甲基和乙基；

当R₁是低级烷氧基时，可选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基等，优选甲氧基和乙氧基。

当R₁是低级卤代烷基时，优选三氟甲基；

当R₁是低级卤代烷氧基时，优选三氟甲氧基。

X为NR₃；

R₂和R₃均为甲基或乙基。

本发明的另一些较佳实施例中，

R₁为位于苯环任意位置的单取代基，具体的：

当R₁是卤素时，可以是氟、氯、溴、碘，优选氯和氟；

当R₁是低级烷基时，可以选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基和正己基等，优选甲基和乙基；

当R₁是低级烷氧基时，可选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基等，优选甲氧基和乙氧基。

当R₁是低级卤代烷基时，优选三氟甲基；

当R₁是低级卤代烷氧基时，优选三氟甲氧基。

X为N；

R₂和X组成取代或未取代的哌啶基、吡咯基、二氢吡咯基、四氢吡咯基、哌嗪基、邻苯二甲酰亚胺基或二甲酰亚胺基吗啉基。

本发明的一些较佳实施例中，所述的盐为有机酸盐或无机酸盐。

当所述的盐为有机酸盐时，所述有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸。

所述的盐为无机酸盐时，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸。

当然，所述有机酸和所述无机酸并不限于上述几种，其他任何药学上可接受的酸均可。

本发明的第二目的在于提供一种制备上述通式I的化合物的方法，所述方法使用Boc保护的β-四氢咔啉类化合物6与卤代化合物通过一步取代或两步取代反应后脱保护制得通式I化合物，包括以下反应步骤：

或者

其中，n、R₁、R₂和X如前所述；X₀为Cl、Br或I，优选Br。

上述化合物6直接进行取代反应时可使用碱催化，碱作为缚酸剂；优选条件溶剂使用DMF，碱使用NaOH。当化合物6直接进行取代反应后还需要然进一步取代时，也可使用碱催化，当活泼氢反应活性低时可使用更强的碱NaH，相反的当反应活性高时可采用碱性低的K₂CO₃，Na₂CO₃等等。

本发明所述方法的一些较佳实施例中，化合物6通过以下反应步骤制得：

其中，吲哚原料1首先和POCl₃反应得化合物2，化合物2溶于硝基甲烷后经醋酸铵催化生成化合物3，再经四氢锂铝还原得到化合物4；化合物4与多聚甲醛反应关环得到化合物5；化合物5与Boc酸酐反应得到化合物6。

本发明的第三目的在于公开所述的咔啉类抗真菌化合物及其药学上可接受的盐在制备抗真菌药物中的应用。

将本发明的通式I的化合物进行真菌生长抑制的测试，体外抗真菌活性实验结果显示，本发明的通式I的大部分化合物表现出良好的抗真菌活性特点，部分发明的化合物结果优于对照药氟康唑。因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗真菌药物。

较佳的，所述咔啉类抗真菌化合物及其药学上可接受的盐与氟康唑组合使用。所述咔啉类抗真菌化合物及其药学上可接受的盐可与氟康唑协同作用，实验结果显示，本发明的通式I的部分化合物与氟康唑联用对临床分离的氟康唑白念珠菌均表现出良好的协同效果。

本发明的积极进步效果在于：

本发明提供了一类新的抗真菌小分子抑制剂，即通式I的卡琳类化合物，体外抗真菌活性实验结果显示，本发明的通式I的大部分化合物表现出良好的抗真菌活性特点，部分发明的化合物结果优于对照药氟康唑。因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗真菌药物。实验结果还显示，本发明的通式I的部分化合物与氟康唑联用对临床分离的氟康唑白念珠菌均表现出良好的协同效果。

本发明提供的通式I的卡琳类化合物中，尤其当n＝2，X为O，R₂为取代苯基时，表现出较佳的抗新生隐球菌活性。而当n＝2，X为O，R₂为异羟肟酸取代苯基时，可与氟康唑实现较佳的协同抗菌效果。

附图说明

图1为小鼠脑部荷菌量实验结果。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，给出以下系列具体实施例，但本发明并不受这些具体实施例的限制，任何了解该领域的技术人员对本发明的些许改动将可以达到类似的结果，这些改动也包含在本发明之中。

下列实施例中所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、化合物A系列的制备

合成路线1

试剂条件:(a)POCl₃,DMF,rt,yield 81-92％；(b)NH₄OAc,CH₃NO₂,rf,yield 78-91％；(c)LiAlH₄,THF,rf,yield 37-78％；(d)AcOH:MeOH＝10:1,yield 45-90％；(e)THF,rt,1h,yield 51-89％；(f)K₂CO₃,EtOH,yield 51-66％；(g)NaH,DMF,yield 34-54％；(h)TFA,CH₂Cl₂,yield 71-85％.

上述试剂条件中“rt”表示常温反应，“yield”表示收率，“rf”表示回流，下同。

化合物A1-A29的制备过程如下：

(a1)化合物2-6的制备

吲哚和POCl₃在DMF溶剂中常温下反应，得化合物2。取化合物2溶于硝基甲烷，经醋酸铵催化生成化合物3。以无水四氢呋喃为溶剂，将化合物3溶解其中，加入四氢锂铝，在无水条件下反应得到化合物4。化合物4在AcOH:MeOH＝10:1的溶液中与多聚甲醛反应得到化合物5。化合物5与Boc酸酐在四氢呋喃溶剂中反应得到化合物6。

(a2)化合物9-10的制备

过量的1,3-二溴丙烷和苯酚在乙醇中反应得到化合物9。取化合物6溶于DMF，以NaH拔氢后，加入化合物9，常温下反应，得化合物10。

(a3)化合物A1-A29的制备

以二氯甲烷(DCM)为溶剂，将化合物10溶解其中，加入三氟乙酸(TFA)，在冰浴条件下反应得到目标产物A1-A29。

2、化合物B系列的制备

合成路线2

试剂条件:(a)NaOH,Dry DMF,1h,yield 17-21％；(b)KI/K₂CO₃,MeCN,rt 8h,yield42-86％；(c)TFA,CH₂Cl₂,yield 37-80％.

化合物B1-B9，B11-B19的制备过程如下：

(b1)化合物20-21的合成

过量的1,3-二溴丙烷和化合物6在干燥DMF反应得到化合物20。化合物20和苯胺在MeCN中在KI/K₂CO₃的作用下，得到化合物21。

(b2)化合物B1-B9以及B11-B17的制备

以DCM为溶剂，将化合物21溶解其中，加入TFA，在冰浴条件下反应得到目标产物。

3、化合物C系列的制备

合成路线3

试剂条件:(a)Dry DMF,yield 13-91％；(b)TFA,CH₂Cl₂,yield 18-71％.

化合物C1-C12的制备过程如下：

(c1)化合物23的合成

将20和杂环溶于DMF，室温反应得到化合物23。

(c2)化合物C1-C12的合成

以DCM为溶剂，将23溶解其中，加入TFA，在冰浴条件下反应得到目标产物。

合成路线4

试剂条件:(a)NaOH,Dry DMF,1h,yield 15-21％；(b)TFA,CH₂Cl₂,yield 45-76％.

化合物C13-C14的制备过程如下：

化合物6、NaOH和原料11在DMF中反应得到化合物12，将化合物12溶于DCM，加入TFA，在冰浴条件下反应得到目标产物C13和C14。

4、化合物D系列的制备

合成路线5

试剂条件:(a)POCl₃,DMF,rt,yield 81-92％；(b)NH₄OAc,CH₃NO₂,rf,yield 78-91％；(c)LiAlH₄,THF,rf,yield 37-78％；(d)AcOH:MeOH＝10:1,yield 45-90％；(e)THF,rt,1h,yield 51-89％；(f)K₂CO₃,EtOH,yield 61-74％；(g)NaH,DMF,yield 24-64％；(h)TFA,CH₂Cl₂,yield 68-87％.(i)KOH,NH₂OH,HCl,CH₃OH,yield 31-84％.

化合物D1-D13的制备过程如下：

(d1)化合物25-27的合成

过量的1,3-二溴丙烷和2-(4-羟基苯基)乙酸甲酯在乙醇中反应得到化合物25。取化合物6溶于DMF，以NaH拔氢后，加入化合物25，常温下反应得化合物26。将化合物26溶于DCM，加入TFA，在冰浴条件下反应得到化合物27。

(d2)化合物D1-D13的合成

化合物27在碱性条件下与新鲜制备的羟胺溶液反应得到目标产物D1-D13。上述制备的本发明部分优选化合物的化学结构式、NMR和MS数据详见表1。

表1：本发明部分优选化合物的NMR和MS数据

效果实施例

1、真菌生长抑制试验

使用上述制备的A系列、B系列和C系列化合物进行真菌生长抑制试验，菌株选用临床常见致病真菌白念珠菌(C.alb.SC5314)和新生隐球菌(C.neo.H99)，阳性对照药为氟康唑(FLC)，对照化合物wsz-c38和hxm-b10。

材料及仪器

移液枪，96孔板，血细胞计数板，涡旋仪，玻璃管，EP管，超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)。

培养基配制

YEPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)，后于4℃保存备用。

RPMI1640液体培养液：RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO₃ 2.0g，吗啡啉丙磺酸(MOPS)34.5g，NaOH 2.7g，三蒸水定容至1000mL，抽滤灭菌，后于4℃保存备用。

PBS缓冲溶液：NaCl 8.0g，Na₂HPO₄ 12H₂O 3.57g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)，室温保存备用。

待测药物的配制

待测药物用DMSO溶解，配制成2mg/mL的溶液，置于-20℃冰箱储存备用。

菌悬液的制备

用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取单克隆的菌株，接种至1mLYEPD培养液中，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1.5mL EP管，离心(3000g，5min，4℃)，吸弃上清液，用1mL PBS缓冲液吹打混匀，用PBS缓冲溶液吹洗2次，用1mL RPMI 1640培养液吹打混匀，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×10³cells/mL。

加药及检测

将配制好的菌悬液加入96孔板中，第1列加入200μL，2至11列加入100μL。第12列加入1640培养基做空白对照。每个待测药物(2mg/mL)都取6.4μL于第一列菌悬液中，作三复孔，倍半稀释10个浓度梯度，即终浓度为64μg/mL–0.125μg/mL，第11列不加药，作阳性对照。

放入35℃恒温培养箱中孵育48h，用酶标仪测定OD₆₃₀。以阳性对照的OD值为100％，最低抑菌浓度(MIC₈₀)为80％OD值的最低化合物浓度。实验结果如表2所示。

表2化合物的体外抗真菌活性(MIC₈₀,μg·mL^-1)

*注：对于新生隐球菌的体外抗真菌活性，化合物Hxm-b10 4在研究生论文中为0.5，本课题重复试验结果为4。

由表2可知，体外抗真菌活性实验结果显示本发明大部分化合物表现出良好的抗真菌活性特点，部分发明的化合物结果优于对照药氟康唑，其中大部分A系列化合物抗新生隐球菌活性优于对照药氟康唑。

2、体外协同抗真菌活性实验

使用D系列化合物与氟康唑进行体外协同抗真菌活性实验，测试菌株为白色念珠菌0304103(氟康唑耐药菌)。

材料及仪器

THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；SW-CT-IF型单人双面超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；XW-80A漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；UV-2802型紫外可见光分光光度计(UNIC)；96孔细胞培养板(丹麦Nunclon公司)。

氟康唑(fluconazole)注射液；RPM I1640液体培养液；沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)；YEPD培养液。

菌悬液配制

白色念珠菌0304103的活化

(1)取出两只玻璃管，编号“0”(表示空白)和“1”；

(2)分别吸取1ml的YEPD培养液加于“0”和“1”中；

(3)从-80℃冰箱中取出白色念珠菌0304103，吸取10μl，加于“1”中，吹打混匀后，于35℃摇床中培养24h；

(4)再取出两只玻璃管，编号“0”和“1”；

(5)分别吸取1ml的YEPD培养液加于“0”和“1”中；

(6)从35℃摇床中取出已经活化一次的白色念珠菌悬液，吸取10μl加于⑤中的“1”中，吹打混匀后，于35℃摇床中培养16h。

洗菌悬液(目的：洗去YEPD培养液)

(1)将活化好的菌悬液转移至1.5ml EP管中，离心，弃上清，加1ml PBS缓冲液(作用：维持真菌形态)，反复吹打混匀，震荡后离心。共计离心三次。

(2)离心后白色念珠菌的浓度为10⁸个/ml，用RPMI 1640培养液将其稀释为每毫升10³个后备用。

药液配制

将待测化合物溶于DMSO，配成2mg/ml的药物储存液，备用。

取6个5mL的EP管，分别编号1-6号。1号管中用移液枪加入2904μL的菌悬液和96μL的2mg/ml的药物储存液，震荡使其混匀，此时药液在管中的浓度为64μg/mL。2-5号管中分别加1.5mL的菌悬液。从1号管中吸取1.5mL加入2号管中进行倍比稀释，震荡混匀。依次类推，此时1-6号管中药物在菌悬液中的浓度依次为64、32、16、8、4、2μg/mL。

接种

(1)分别将配置好的1-6号管中化合物按以下方法加到96孔板中：

第一行，加1号管中的药液(即药物浓度为64μg/ml的菌悬液)(A1，200μl；A2，100μl；A3，100μl；A4，100μl；A5，100μl；A6，100μl；A7，100μl；A8，100μl；A9，100μl；A10，100μl)。

第二行(B)到第六行(G)，按同样方法分别加2-6号管中的药液。

(2)将2mg/ml的氟康唑溶液按以下方法加到96孔板中：

依次在A1-G1中加入6.4μl的浓度为2mg/ml的氟康唑溶液，使第一列中氟康唑浓度为64μg/ml。从第一列开始每次吸取100μl加入下一列，倍比稀释一直到第九列。在A11-G11加入100μl菌悬液，第H行及第12列加入RPMI 1640培养基100μl作为空白对照。

培养及检测

将接种好的96孔板放35℃烘箱中静置培养24h和48h后观察结果。设阳性对照要的光密度(OD)值为100％，用酶标仪测定OD₆₃₀。

实验结果如表3所示。

表3 D系列化合物与氟康唑联用的协同指数(FICI)

*FICI<0.5两种药表现为协同作用；使用菌株为临床分离的耐氟康唑白念珠菌(C.alb.0304103)

体外协同抗真菌活性实验结果显示，化合物D1-D13与氟康唑联用对临床分离的耐氟康唑白念珠菌均表现出良好的协同效果。

3、小鼠隐球菌脑膜炎模型荷菌量实验

使用上述制备的A4化合物进行小鼠隐球菌脑膜炎模型荷菌量实验。

材料及仪器

THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；SW-CT-IF型单人双面超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；XW-80A漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；X5Z-G电子显微镜(重庆光学仪器厂)；高通量组织研磨仪(上海万柏生物)。

氟康唑(fluconazole，FLC)注射液；化合物A4注射液；沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)；YEPD培养液；生理盐水；75％乙醇。

实验动物

ICR小鼠(20g/只，20只)

注射液配制

氟康唑注射液的配制：将购买的氟康唑注射液使用生理盐水稀释为0.2mg/mL，4℃冰箱保存备用。

A4注射液的配制：称取适量A4原料药于研钵中，加入0.5％的吐温80和1.5％的甘油，研磨均匀，加入生理盐水稀释为主药量为1mg/mL的混悬液，4℃冰箱保存备用。

菌悬液配制

新生隐球菌H99的活化

(1)取出两只玻璃管，编号“0”(表示空白)和“1”；

(2)分别吸取1ml的YEPD培养液加于“0”和“1”中；

(3)从-80℃冰箱中取出白色念珠菌H99，吸取10μl，加于“1”中，吹打混匀后，于35℃摇床中培养24h；

(4)再取出两只玻璃管，编号“0”和“1”；

(5)分别吸取1ml的YEPD培养液加于“0”和“1”中；

(6)从35℃摇床中取出已经活化一次的白色念珠菌悬液，吸取10μl加于⑤中的“1”中，吹打混匀后，于35℃摇床中培养16h；

(7)将活化好的菌悬液转移至1.5ml EP管中，离心，弃上清，加1ml PBS缓冲液(作用：维持真菌形态)，反复吹打混匀，震荡后离心。共计离心三次。

计数

将离心后的新生隐球菌稀释100倍，在电子显微镜下计数，共三次，取平均值，计算母液菌浓度。将母液使用生理盐水稀释为1*10⁶CFU/mL的菌悬液。

接种

吸取配制好的菌悬液0.2mL采用尾静脉注射对小鼠进行接种，即接种量为2*10⁵/只。

分组

小鼠分为四组，每组5只，(即氟康唑组、空白对照组、A4组、A4+氟康唑组)。

给药

接种结束后，两小时后给药，每只老鼠给药量为0.2mL(腹腔注射)，A4+氟康唑组为氟康唑注射液及A4注射液各0.2mL(即氟康唑组为2mg/kg、A4组为10mg/kg)。连续给药5天。

取脑及匀浆

于第六天将小鼠处死，将小鼠脑部完整取出置于2mL匀浆管中，加入生理盐水1mL。使用高通量组织研磨仪将其研磨均匀，匀浆液置于4℃冰箱备用。

涂板

将匀浆液稀释10000倍，吸取40μL于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)中，使用涂布棒将菌悬液涂布均匀，平行操作三次。将涂布均匀的SDA培养基放置于30℃隔水式电热恒温培养箱培养48小时。

数据处理

记录每块培养基上的菌落数，计算每只小鼠脑部荷菌量。结果如图1所示。

结果表明，化合物A4具有优秀的体内活性，单独用药可显著降低隐球菌脑膜炎小鼠脑组织荷菌量(P<0.0001)，优于对照药氟康唑(FLC，P<0.001)；而且化合物A4与氟康唑联合用药效果优于化合物A4或FLC单独用药(P<0.0001)。

综上，本发明的A、B、C系列化合物具有良好的体外抗新生隐球菌活性，部分化合物表现出优秀的体外抗新生隐球菌活性，且对于小鼠隐球菌脑膜炎模型，具有优秀的体内活性，其中尤其是优选化合物A4对隐球菌脑膜炎小鼠具有良好的治疗效果；另外试验结果也显示D系列化合物与临床一线药物氟康唑针对耐药菌有良好的协同作用。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种β-四氢咔啉类抗真菌化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，该化合物的结构如下所示：

D1 R＝H D8 R＝5-OCH₃

D2 R＝4-Cl D9 R＝6-F

D3 R＝4-Br D10 R＝6-Cl

D4 R＝5-F D11 R＝6-Br

D5 R＝5-Cl D12 R＝7-Cl

D6 R＝5-Br D13 R＝7-OCH₃

D7 R＝5-CH₃

2.如权利要求1所述的β-四氢咔啉类抗真菌化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的盐为有机酸盐或无机酸盐。

3.如权利要求2所述的β-四氢咔啉类抗真菌化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的盐为有机酸盐时，所述有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸；所述的盐为无机酸盐时，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸。

4.如权利要求1所述的β-四氢咔啉类抗真菌化合物或其药学上可接受的盐在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述真菌为新生隐球菌、白念珠菌。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述咔啉类抗真菌化合物或其药学上可接受的盐与氟康唑组合使用。

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