CN113121505B - 一种具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物，结构通式如下所示：

各取代基定义详见说明书。本发明的三唑酮类化合物具有抗真菌与抗肿瘤双重作用，可以作为三唑酮类Hsp90抑制剂和Hsp90‑HDAC双靶点抑制剂，可以用作抗真菌与抗肿瘤的药物使用。

Description

一种具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物及应用。

背景技术

近年来，伴随着艾滋病患者、肿瘤患者、器官移植患者的增加以及免疫抑制剂、糖皮质激素、广谱抗生素的广泛应用，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率不断上升。然而，当前临床上治疗侵袭性真菌感染(IFIs)的药物种类有限，仅包括多烯类(如两性霉素B)，唑类(如氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑等)，棘白菌素类(如卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净等)以及核酸类(5-氟胞嘧啶)。尽管上述药物的使用，使得侵袭性真菌感染从预防和治疗均获得了很大进展。但是随着临床上广泛使用，它们耐药现象日益严重，进一步降低了现有药物的疗效。因此，研发全新作用机制以及对耐药真菌有效的抗侵袭性真菌感染药物十分重要。

恶性肿瘤患者由于接受化疗、放疗，常导致免疫功能低下，使之成为病原微生物的易感人群。特别是血液肿瘤患者，IFIs是导致其死亡的重要原因。因此，寻找和发现具有抗耐药真菌和抗肿瘤双重作用的药物对于肿瘤患者的治疗和预后具有重要意义。

Hsp90抑制剂和HDAC抑制剂是抗肿瘤热门靶点，目前已有多种类型的Hsp90抑制剂和HDAC抑制剂进入抗肿瘤临床试验阶段和上市，同时已报道一些Hsp90抑制剂和HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同抗耐药真菌活性。因此获得新型Hsp90抑制剂和Hsp90-HDAC双靶点抑制剂是发现具有抗耐药真菌和抗肿瘤作用药物的一个很好思路。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物，可以作为Hsp90抑制剂和Hsp90-HDAC双靶点抑制剂。

本发明的第二个目的是提供一种所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物在制备抗真菌和/或抗肿瘤的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面提供了一种具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物，结构通式如下所示：

R₁选自氢、C1～C12支链或直链的烷基；

R₂选自氢、羟基、C1～C12支链或直链的烷基；

R₃选自氢、羟基、C1～C12支链或直链的烷基；

R₄选自氢、羟基、C1～C12支链或直链的烷基；

R₅选自氢或C1～C12支链或直链的烷基；

R₆选自氢或C1～C12支链或直链的烷基；

R₇选自氢、C1～C12支链或直链的烷基、C1～C12支链或直链的烷氧基、卤素(氟、氯、溴、碘)、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、

n₁为0～12的正整数，n₂为1～12的正整数，m为1～12的正整数；

R₈选自氢、C1～C12支链或直链的烷基、C1～C12支链或直链的烷氧基、卤素(氟、氯、溴、碘)、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、

n₁为0～12的正整数，n₂为1～12的正整数，m为1～12的正整数；

R₉选自氢、C1～C12支链或直链的烷基、C1～C12支链或直链的烷氧基、卤素(氟、氯、溴、碘)、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)；

或，R₇与R₈与C或杂原子N、O、S中的至少一个组成C3～C16的环。

较优选的，所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物结构通式中：

R₁选自氢、甲基、乙基、正丁基、正己基、正辛基、正丙基、异丙基；

R₂选自氢、羟基、甲基、乙基、正丁基、正己基、正辛基、正丙基、异丙基；

R₃选自氢、羟基、甲基、乙基、正丁基、正己基、正辛基、正丙基、异丙基；

R₄选自氢、羟基、甲基、乙基、正丁基、正己基、正辛基、正丙基、异丙基；

R₅为氢；

R₆为氢；

R₇选自氢、甲氧基、甲基、乙基、乙氧基、氟、氯、溴、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、

n₁为0、2、3、4、5、6、7、8，n₂为1、2、3、4、5、6、7、8，m为1、2、3、4、5、6、7、8；

R₈选自氢、甲氧基、甲基、乙基、乙氧基、氟、氯、溴、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、

n₁为0、2、3、4、5、6、7、8，n₂为1、2、3、4、5、6、7、8，m为1、2、3、4、5、6、7、8；

R₉选自氢、甲基、甲氧基、乙基、乙氧基、氟、氯、溴、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)；

或，R₇与R₈与C和N组成C4～C6的环。

更优选的，所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物结构通式如下所示：

R₁选自氢、甲基、乙基、正丁基、正己基、正辛基、正丙基、异丙基；

R₇选自氢、甲氧基、甲基、乙基、乙氧基、氟、氯、溴、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、

n₁为0、2、3、4、5、6、7、8，n₂为1、2、3、4、5、6、7、8，m为1、2、3、4、5、6、7、8；

R₈选自氢、甲氧基、甲基、乙基、乙氧基、氟、氯、溴、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、

n₁为0、2、3、4、5、6、7、8，n₂为1、2、3、4、5、6、7、8，m为1、2、3、4、5、6、7、8；

R₉选自氢、甲基、甲氧基、乙基、乙氧基、氟、氯、溴、三氟甲基、氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)；

R₁₀选自氢、C1～C12支链或直链的烷基(优选为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基)。

最优选的，所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物的结构为以下结构中的一种：

本发明的第二方面提供了一种所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物在制备抗真菌和/或抗肿瘤的药物中的应用。

所述真菌为白念珠菌。

所述肿瘤为白血病或肺癌。

本发明的第三方面提供了一种所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物在制备Hsp90抑制剂或Hsp90-HDAC双靶点抑制剂中的应用。

本发明的第四方面提供了一种所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物与氟康唑联用在制备抗真菌和/或抗肿瘤的药物中的应用。

所述真菌为白念珠菌。

所述肿瘤为白血病或肺癌。

所述三唑酮类化合物为化合物F5或化合物F9。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明的三唑酮类化合物具有抗真菌与抗肿瘤双重作用，可以作为三唑酮类Hsp90抑制剂和Hsp90-HDAC双靶点抑制剂，可以用作抗真菌与抗肿瘤的药物使用。

本发明的三唑酮类化合物结构新颖，单独使用具有较强的抗肿瘤活性，与唑类药物联用具有优秀的协同抗真菌活性。

附图说明

图1是小鼠肾脏荷菌量的示意图；左图是三唑酮类化合物F5小鼠肾脏荷菌量的示意图，右图是三唑酮类化合物F9小鼠肾脏荷菌量的示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

化合物A1-A4的制备：

Reagents and conditions：(a)BnCl,K₂CO₃,EtOH,80℃,12h；(b)Ph₃CH₃P·I,t-BuOK,THF,rt,12h；(c)H₂,Pd/C,CH₃OH,rt,48h；(d)POCl₃,DMF,rt,12h；(e)BnCl,K₂CO₃,EtOH,80℃,12h.

化合物A1的制备方法：

第一步，取化合物1(5.00g)溶解于无水DMF(50mL)中，向其中加入含量为60％的氢化钠(2.47g)和CH₃I(6.57g)，待室温下搅拌反应2h后，加入20mL水淬灭反应，加入200mL乙酸乙酯稀释反应溶液，以饱和NaCl水溶液洗涤稀释液，分取有机层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物即为化合物2。

第二步，取化合物2(4.60g)分散于70％的乙醇水溶液中(50mL)，向其中依次加入NH₄Cl(2.79g)和还原Fe粉(7.31g)，回流搅拌反应1h，过滤，滤液以100mL水稀释，以乙酸乙酯(80mL×2)萃取稀释液，分取乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物即为化合物3。

第三步，取化合物3(2.70g)溶解于二氯甲烷(50mL)中，向其中依次加入三乙胺(5.61g)和氯甲酸苯酯(3.47g)，在室温下搅拌反应30min，后减压除去反应溶剂，得残余物以乙酸乙酯(50mL)溶解，并以水洗涤，分取有机层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物为化合物4。

第四步，取化合物4(4.6g)溶于无水乙醇(50mL)中，向其中加入85％的水合肼(3.05g)，回流搅拌反应3h，待反应液降至室温后，加入乙酸乙酯(200mL)稀释，以水洗涤稀释液，收集乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物经硅胶柱层析纯化得化合物5。

第五步，取化合物5(3.00g)溶解于无水乙醇/1,4-二氧六环(1/1，v/v，100mL)中，向其中加入化合物6(5.29g)，回流搅拌反应2h，后依次加入NaOH(3.53g)和K₃Fe(CN)₆(14.5g)，继续回流搅拌反应12h，待反应液降至室温后，过滤，滤液加入150mL的乙酸乙酯稀释，以水洗涤稀释液，收集乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物在硅胶柱层析中纯化得化合物7。

第六步，取化合物7(1.00g)以及CH₃CH₂Br(0.240g)溶解于无水乙醇(20mL)中，向其中加入K₂CO₃(0.761g)，回流搅拌反应1h，过滤，滤液加入100mL的乙酸乙酯稀释，以饱和NaCl水溶液洗涤稀释液，收集乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物在硅胶柱层析中纯化得化合物8。

第七步，取化合物8(0.650g)溶解于无水甲醇(20mL)中，向其中加入10％的Pd/C(0.060g)，在H₂氛围下室温搅拌反应12h，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物在硅胶柱层析中纯化得化合物A1。

化合物A2的制备方法：制备方法同化合物A1的制备方法类似，不同之处在于第六步中使用CH₃(CH₂)₃Br作为A1制备方法中CH₃CH₂Br的替换。

化合物A3的制备方法：制备方法同化合物A1的制备方法类似，不同之处在于第六步中使用CH₃(CH₂)₅Br作为A1制备方法中CH₃CH₂Br的替换。

化合物A4的制备方法：制备方法同化合物A1的制备方法类似，不同之处在于第六步中使用CH₃(CH₂)₇Br作为A1制备方法中CH₃CH₂Br的替换。

化合物B1的制备方法：

第一步，以化合物1为原料按照化合物A1的制备方法中第二步至第六步的方法制备化合物12。

第二步，取化合物12(0.400g)溶解于无水甲醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.040g)，在H₂氛围下室温搅拌反应12h，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物以在硅胶柱层析中纯化得化合物B1。

Reagents and conditions：(a)Fe,NH₄Cl,EtOH,H₂O,reflux,1h；(b)PhOCOCl,CH₂Cl₂,Et₃N,rt,30min；(c)NH₂NH₂·H₂O,EtOH,reflux,3h；(d)(i)EtOH,1,4-dioxane,reflux,2h；(ii)K₃Fe(CN)₆,NaOH,reflux,12h；(e)H₂,Pd/C,CH₃OH,rt,12h.

化合物B2的制备方法：

第一步，以化合物1为原料按照化合物A1的制备方法中第一至第六步的方法制备化合物17a，不同之处在于第一步反应中使用CH₃CH₂Br代替化合物A1的制备方法中第一步的CH₃I。

第二步，取化合物17a(0.400g)溶解于无水甲醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.040g)，在H₂氛围下室温搅拌反应12h，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物以在硅胶柱层析中纯化得化合物B1。

化合物B3的制备方法：制备方法同化合物B2的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用CH₃(CH₂)₃Br作为B2制备方法中CH₃CH₂Br的替换。

Reagents and conditions：(a)Alkyl-Br,NaH,DMF,rt,2h；(b)Fe,NH₄Cl,EtOH,H₂O,reflux,1h；(c)PhOCOCl,CH₂Cl₂,Et₃N,rt；(d)NH₂NH₂·H₂O,EtOH,reflux,3h；(e)(i)EtOH,1,4-dioxane,reflux,2h；(ii)K₃Fe(CN)₆,NaOH,reflux,12h；(f)H₂,Pd/C,CH₃OH,rt,12h.

化合物C1的制备方法：

第一步，以化合物18a为原料按照化合物A1的制备方法中第三至第六步的方法制备化合物21a。

第二步，取化合物21a(0.400g)溶解于无水甲醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.043g)，在H₂氛围下室温搅拌反应12h，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物以在硅胶柱层析中纯化得化合物C1。

化合物C2的制备方法：以化合物18b为原料按照化合物C1的制备方法制备C2。

化合物C3的制备方法：以化合物18c为原料按照化合物C1的制备方法制备C3。

化合物C4的制备方法：以化合物18d为原料按照化合物C1的制备方法制备C4。

化合物C5的制备方法：以化合物18e为原料按照化合物C1的制备方法制备C5。

化合物C6的制备方法：以化合物18f为原料按照化合物C1的制备方法制备C6。

化合物C7的制备方法：以化合物18g为原料按照化合物C1的制备方法制备C7。

化合物C8的制备方法：以化合物18h为原料按照化合物C1的制备方法制备C8。

化合物C9的制备方法：以化合物18i为原料按照化合物C1的制备方法制备C9。

化合物C10的制备方法：以化合物18j为原料按照化合物C1的制备方法制备C10。

化合物C11的制备方法：以化合物18k为原料按照化合物C1的制备方法制备C11。

化合物C12的制备方法：以化合物18l为原料按照化合物C1的制备方法制备C12。

化合物C13的制备方法：以化合物18m为原料按照化合物C1的制备方法制备C13。

化合物C14的制备方法：以化合物18n为原料按照化合物C1的制备方法制备C14。

化合物C15的制备方法：以化合物18o为原料按照化合物C1的制备方法制备C15。

化合物C16的制备方法：以化合物18p为原料按照化合物C1的制备方法制备C16。

化合物C17的制备方法：以化合物18q为原料按照化合物C1的制备方法制备C17。

化合物C18的制备方法：以化合物18r为原料按照化合物C1的制备方法制备C18。

化合物C19的制备方法：以化合物18s为原料按照化合物C1的制备方法制备C19。

Reagents and conditions：(a)PhOCOCl,CH₂Cl₂,Et₃N,rt,30min；(b)NH₂NH₂·H₂O,EtOH,reflux,3h；(c)(i)EtOH,1,4-dioxane,reflux,2h；(ii)K₃Fe(CN)₆,NaOH,reflux,12h；(iii)(for the preparation of 32o-s)NaOH,H₂O,reflux,12h,yield 35-49％；(d)H₂,Pd/C,CH₃OH,rt,12h.

化合物D1的制备方法：

第一步，取化合物21o(0.400g)溶解于二氯甲烷(20mL)中，加入三乙胺(0.240g)和CH₃COCl(0.136g)，室温搅拌反应1h，减压除去反应溶剂，得残余物分散于75％的乙醇水溶液(50mL)中，向其中加入NaOH(0.095g)，回流搅拌反应1h，待反应液降至室温后，以水(100mL)稀释，并以1M的HCl水溶液调节pH至7左右，加入乙酸乙酯(200mL)萃取，收集乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物以流动相(CH₂Cl₂/CH₃OH,100/1-100/4,v/v)经硅胶柱层析纯化得化合物22a。

第二步，取化合物22a(0.226g)溶解于无水甲醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.022g)，在H₂氛围下室温搅拌反应12h，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物以在硅胶柱层析中纯化得化合物D1。

化合物D2的制备方法：制备方法同化合物D1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用CH₃(CH₂)₂COCl作为D1制备方法中CH₃COCl的替换。

化合物D3的制备方法：制备方法同化合物D1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用CH₃(CH₂)₄COCl作为D1制备方法中CH₃COCl的替换。

化合物D4的制备方法：制备方法同化合物D1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用CH₃(CH₂)₆COCl作为D1制备方法中CH₃COCl的替换。

Reagents and conditions：(a)(i)Alkyl-COCl,CH₂Cl₂,Et₃N,rt,1h；(ii)NaOH,EtOH,H₂O,reflux,1h；(b)H₂,Pd/C,CH₃OH,rt,12h.

化合物E1的制备方法：

第一步，取化合物21o(0.500g)溶解于二氯甲烷(40mL)中，向其中加入HBTU(0.823g)、三乙胺(0.399g)和HOOC(CH₂)₃CO₂Me(0.288g)，室温搅拌反应36h，减压除去反应溶剂，得残余物分散于乙酸乙酯(100mL)中，依次以NH₄Cl水溶液(60mL)和NaCl水溶液(60mL)洗涤分散液，收集乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物在硅胶柱层析中纯化得化合物23a。

第二步，取化合物23a(0.450g)溶解于无水甲醇中，加入盐酸羟胺(2.30g)、KOH(2.80g)，室温搅拌反应5h，减压除去反应溶剂。加水(50mL)稀释残余物，并以1M HCl水溶液调节pH至5左右，所得混合物以EtOAc(50mL×3)萃取，合并有机层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，得残余物在硅胶柱层析中纯化得化合物24a。

第三步，取化合物24a(0.24g)溶解于无水甲醇(20mL)中，向其中加入10％的Pd/C(20.0mg)，在H₂氛围下室温搅拌反应12h，过滤，滤液经减压除去溶剂，残余物以流动相在C18柱层析中纯化得化合物E1。

化合物E2的制备方法：制备方法同化合物E1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用HOOC(CH₂)₄CO₂Me作为E1制备方法中HOOC(CH₂)₃CO₂Me的替换。

化合物E3的制备方法：制备方法同化合物E1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用HOOC(CH₂)₅CO₂Me作为E1制备方法中HOOC(CH₂)₃CO₂Me的替换。

化合物E4的制备方法：制备方法同化合物E1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用HOOC(CH₂)₆CO₂Me作为E1制备方法中HOOC(CH₂)₃CO₂Me的替换。

化合物E5的制备方法：制备方法同化合物E1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用HOOC(CH₂)₄CO₂Me作为E1制备方法中HOOC(CH₂)₃CO₂Me的替换以及使用21p为原料。

化合物E6的制备方法：制备方法同化合物E1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用HOOC(CH₂)₅CO₂Me作为E1制备方法中HOOC(CH₂)₃CO₂Me的替换以及使用21p为原料。

化合物E7的制备方法：制备方法同化合物E1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用HOOC(CH₂)₆CO₂Me作为E1制备方法中HOOC(CH₂)₃CO₂Me的替换以及使用21p为原料。

Reagents and conditions：(a)HOOC(CH₂)_nCO₂Me,HBTU,Et₃N,CH₂Cl₂,rt,36h,；(b)NH₂OH·HCl,KOH,CH₃OH,rt,5h；(c)H₂,Pd/C,CH₃OH,rt,12h.

化合物F1的制备方法：

第一步，取化合物21r(0.500g)溶解于二氯甲烷(40mL)中，向其中加入HBTU(0.449g)、三乙胺(0.300g)和4-氨基丁酸甲酯(0.139g)，室温下搅拌反应12h，减压除去反应溶剂，得残余物分散于乙酸乙酯(100mL)中，依次以NH₄Cl水溶液(60mL)、NaCl水溶液(60mL)洗涤分散液，收集乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液经减压除去溶剂，得残余物在硅胶柱层析中纯化得化合物25a。

第二步，取化合物25a(0.400g)溶解于无水甲醇中，加入盐酸羟胺(2.30g)、KOH(2.80g)，室温搅拌反应5h，减压除去反应溶剂。加水(50mL)稀释残余物，并以1M HCl水溶液调节pH至5左右，所得混合物以EtOAc(50mL×3)萃取，合并有机层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，得残余物在硅胶柱层析中纯化得化合物26a。

第三步，取化合物26a(0.250g)溶解于无水甲醇(20mL)中，向其中加入10％的Pd/C(20.8mg)，在H₂氛围下室温搅拌反应12h，过滤，滤液经减压除去溶剂，残余物以流动相在C18柱层析中纯化得化合物F1。

化合物F2的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₄CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换。

化合物F3的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₅CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换。

化合物F4的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₆CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换。

化合物F5的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₇CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换。

化合物F6的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用21s为原料。

化合物F7的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₄CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换以及使用21s为原料。

化合物F8的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₅CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换以及使用21s为原料。

化合物F9的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₆CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换以及使用21s为原料。

化合物F10的制备方法：制备方法同化合物F1的制备方法类似，不同之处在于第一步中使用NH₂(CH₂)₇CO₂Me作为F1制备方法中NH₂(CH₂)₃CO₂Me的替换以及使用21s为原料。

Reagents and conditions：(a)NH₂(CH₂)_nCO₂Me,HBTU,Et₃N,CH₂Cl₂,rt,12h；(b)NH₂OH·HCl,KOH,CH₃OH,rt,5h；(c)H₂,Pd/C,CH₃OH,rt,12h.

上述制备的本发明部分优选化合物的结构式、NMR和MS数据详见表1：

表1本发明优选化合物的结构式和NMR和MS数据

上述化合物中，A、B、C、D系列均为Hsp90抑制剂，E、F系列为Hsp90-HDAC双靶点抑制剂。

效果实施例

1、Hsp90α抑制实验

使用上述制备的三唑酮类化合物A1-A4、B1-B3、C1-C19、D1-D4、E1-E7、F1-F10进行Hsp90α抑制实验，阳性对照药物为Ganetespib。

材料及仪器：移液枪，黑色96孔板，涡旋仪，EP管，恒温培养箱，多动能酶标仪。

实验用Buffer：以配制20mM的HEPES(pH＝8)、50mM的KCl、5mM的MgCl₂、0.1mg/mL的BSA、20mM的NaMoO₄、0.01％NP40以及2mM的DTT的混合溶液，后置于4℃条件下保存和备用。

待测化合物的配制：待测三唑酮类化合物用DMSO溶解，配制成4mg/mL的溶液，置于-20℃冰箱储存备用。

实验步骤：向黑色96孔板的每孔中加入Hsp90α(3.4μg/mL)、FITC-Geldanamycin(5nM)和系列稀释的三唑酮类化合物的实验用Buffer溶液100μL(阳性对照孔不加入三唑酮类化合物，阴性对照孔既不加入Hsp90α也不加入三唑酮类化合物)，后在室温条件下孵育3h。测定每孔在激发波长485nm和发射波长530nm下的荧光偏振值Fb。利用公式：抑制率％＝(Fb_{阳性对照孔}-Fb_化合物孔)/(Fb_{阳性对照孔}-Fb_{阴性对照孔})×100％，计算各浓度下三唑酮类化合物的抑制率，并以Graphpad软件计算化合物的IC₅₀值。实验结果如表2所示。

表2化合物的Hsp90α抑制活性(IC₅₀，μM)

从以上表2中的数据可以得知，化合物A1-A4对Hsp90α的IC₅₀大于1μM，B1-B3、C1-C19、D1-D4、E1-E7和F1-F10对Hsp90α的均具有较强的抑制活性。表明化合物B1-B3、C1-C19、D1-D4、E1-E7和F1-F10可作为Hsp90抑制剂应用。

2、体外协同抗真菌活性实验

使用上述制备的三唑酮类化合物A1-A4、B1-B3、C1-C19、D1-D4、E1-E7、F1-F10进行体外协同抗真菌活性实验，阳性对照药物为Ganetespib和SAHA。测试菌株为白念珠菌0304103(氟康唑耐药菌)。

材料及仪器：恒温培养箱；SW-CT-IF型单人双面超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；XW-80A漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；UV-2802型紫外可见光分光光度计(UNIC)；透明96孔板(丹麦Nunclon公司)。

培养基配制：

YEPD培养基：取10g酵母浸膏、20g葡萄糖、20g蛋白胨溶解于1000mL三蒸水中，经高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后，置于4℃条件下保存和备用。真菌用RPMI 1640培养基：取10gRPMI 1640(Gibco)粉末、34.5g吗啡啉丙磺酸、2g NaHCO₃、2.7g NaOH溶解于1000mL三蒸水中，经0.22μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：取8.0gNaCl、0.2g KCl、3.57g Na₂HPO₄·12H₂O、0.24g KH₂PO₄溶解于1000mL三蒸水中，经高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后，置于4℃条件下保存和备用。

待测三唑酮类化合物的配制：待测三唑酮类化合物用DMSO溶解，配制成4mg/mL的溶液，置于-20℃冰箱储存备用。

实验步骤：三唑酮类化合物体外协同抗耐药真菌活性测试采用CLSI推荐的棋盘式微量液基稀释法。首先收集在YEPD培养基中处于指数生长末期的真菌细胞，PBS缓冲液清洗2次，以真菌用RPMI 1640培养基稀释至1×10³CFU/mL。按照每孔100μL接种真菌稀释液至透明96孔板中，其中1-11列加入系列稀释的三唑酮类化合物，A-H行加入系列稀释的氟康唑(第12列作为阳性对照孔中仅加入真菌稀释液不加入药物，第G行作为阴性对照孔中不加入药物也以RPMI 1640培养基代替真菌稀释液，11列仅加入三唑酮类化合物不加入氟康唑，H行仅加入氟康唑不加入三唑酮类化合物)，后在35℃条件下孵育48h。测定每孔在630nm处的吸光度A，依据公式：抑制率％＝(A_{阳性对照孔}-A_化合物孔)/(A_{阳性对照孔}-A_{阴性对照孔})×100％，计算各孔对应的抑制率。在96孔板中A1-F10区域内，如果某一孔对应的所有左上方孔和该孔的抑制率均大于80％，则该孔对应的三唑酮类化合物和氟康唑浓度分别作为FIC_compd.和FIC_氟康唑，利用公式：FICI＝(FIC_compd./MIC_{80 compd}.)+(FIC_氟康唑/MIC_80氟康唑)(MIC₈₀>64μg/mL的三唑酮类化合物，MIC₈₀以64μg/mL计算)，计算各三唑酮类化合物对应的FICI。实验结果如表3所示。

表3化合物的协同抗真菌活性

注:FICI值≤0.5代表协同，FICI值>4代表拮抗；0.5＜FICI＜4表示不相关

从以上表3中的数据可知，化合物B1-B2、C1-C11、C13、C15-C17、D1-D2、E1、E3、E4、E7、F1、F4、F5、F9、F10具有协同抗真菌活性，其中以化合物C7活性最强(FICI＝0.023)，与对照药物Ganetespib相当。

3、体外抗肿瘤活性实验

使用上述制备的三唑酮类化合物A1-A4、B1-B3、C1-C19、D1-D4、E1-E7、F1-F10进行体外抗肿瘤活性实验，阳性对照药物为Ganetespib和SAHA。测试肿瘤细胞株为HEL细胞、HL60细胞和A549细胞。

材料及仪器：透明96孔板、恒温培养箱、CCK-8(碧云天，上海)。

培养基配制：细胞用RPMI 1640完全培养基：按照89％RPMI 1640基础培养基(Gibco)+10％胎牛血清+1％双抗(含100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素)混匀制得，混匀后置于4℃条件下保存和备用

待测三唑酮类化合物的配制：待测三唑酮类化合物用DMSO溶解，配制成4mg/mL的溶液，置于-20℃冰箱储存备用

实验步骤：

HEL细胞和HL60细胞：以每孔50μL接种细胞RPMI 1640培养基悬液于透明96孔板中，在37℃和5％CO₂的条件下培养24h。向每孔加入含有系列浓度的三唑酮类化合物培养基溶液50μL，继续在37℃和5％CO₂的条件下培养48h(阳性对照孔接种细胞不加入三唑酮类化合物，阴性对照孔不接种细胞也不加入三唑酮类化合物并均以纯培养基代替)。向每孔中加入含有10μL的CCK-8，在37℃和5％CO₂的条件下培养30min。测定每孔在450nm处的吸光度A，依据公式：抑制率％＝(A_{阳性对照孔}-A_化合物孔)/(A_{阳性对照孔}-A_{阴性对照孔})×100％，计算各浓度下三唑酮类化合物的抑制率，并以Graphpad软件计算三唑酮类化合物的IC₅₀值。实验结果如表4所示。

A549细胞：按照100μL接种细胞培养基悬液100μL于透明96孔板中，在37℃和5％CO₂的条件下培养24h。吸弃每孔培养基，向每孔加入含有不同浓度的三唑酮类化合物培养基溶液100μL，在37℃和5％CO₂的条件下继续培养48h(阳性对照孔接种细胞不加入三唑酮类化合物，阴性对照孔不接种细胞也不加入三唑酮类化合物且以等体积纯培养基代替)。吸弃每孔培养基，向每孔中加入含有10％CCK-8的培养基溶液100μL，继续在37℃和5％CO₂的条件下继续培养30min。测定每孔在450nm处的吸光度A，依据公式：抑制率％＝(A_{阳性对照孔}-A_化合物孔)/(A_{阳性对照孔}-A_{阴性对照孔})×100％，计算各浓度下三唑酮类化合物的抑制率，并以Graphpad软件计算三唑酮类化合物IC₅₀。实验结果如表4所示。

表4化合物的体外抗肿瘤细胞活性(IC₅₀μM)

从以上表4中的数据可知，这些化合物具有不同水平的抑制肿瘤细胞增殖的活性，其中A、E、F系列化合物抗肿瘤活性较弱，B、C和D系列化合物抗肿瘤活性较强。同时化合物C3和C5的抗肿瘤活性较强，显示出与对照药物Ganetespib相当的水平，强于另一对照药物SAHA。

4、HDAC抑制活性实验

使用上述制备的三唑酮类化合物E1-E7、F1-F10进行HDAC抑制活性实验，阳性对照药物为SAHA。HDAC抑制活性包括对真菌细胞(白念珠菌0304103)总HDAC、人细胞(A549细胞)总HDAC、HDAC1的抑制活性。

材料及仪器：移液枪，黑色96孔板，涡旋仪，EP管，恒温培养箱、多功能酶标仪、HDAC底物Boc-Lys(Ac)-AMC(吉尔生化，上海)、蜗牛酶(生工生物，上海)、蜗牛酶反应液(生工生物，上海)、2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、trypsin(Sigma-Aldrich)。

HDAC活性测试用Buffer：取500mL三蒸水，以配制50mM Tris-HCl(pH＝8)，137mMNaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl₂和0.1mg/mL BSA的水溶液，后置于4℃条件下保存和备用。

HDAC活性测试用终止液：以上述制备的HDAC活性测试用Buffer配置2mg/mLtrypsin，1％NP 40，10μM SAHA而制得。

待测三唑酮类化合物的配制：待测三唑酮类化合物用DMSO溶解，配制成4mg/mL的溶液，置于-20℃冰箱储存备用。

实验步骤：真菌细胞总HDAC抑制活性：收集对数生长末期白念珠菌0304103分散在6mL的蜗牛酶反应液中，向反应液中加入60mg的蜗牛酶和24μL 2-巯基乙醇，在37℃下裂解反应3h以制备白念珠菌原生质体。10000rpm离心2min收集原生质体，后加入20mL的PBS分散，吸取100μL原生质体的PBS分散液接种于透明96孔板的每孔中，并与系列稀释的三唑酮类化合物在35℃下共培养12h(阳性对照孔不加三唑酮类化合物，阴性对照孔不加原生质体和三唑酮类化合物并以等体积纯PBS代替)。向每孔中加入30μL的110μM的HDAC底物Boc-Lys(Ac)-AMC的PBS溶液，在37℃下继续培养6h。向每孔中加入100μL新配置的终止液并在37℃下培养2h。一一对应地吸取每孔100μL的反应液至黑色96孔板中，并读取黑板中每孔在激发波长360nm和发射波长460nm下的荧光强度F，参照公式：抑制率％＝(F_{阳性对照孔}-F_化合物孔)/(F_{阳性对照孔}-F_{阴性对照孔})×100％，计算各浓度下三唑酮类化合物的抑制率，并以Graphpad软件计算化合物IC₅₀。实验结果如表5所示。

人细胞总HDAC抑制活性：将100μL A549细胞的培养基悬浮液，接种于透明96孔板每孔中，在37℃和5％的CO₂条件下培养24h。吸弃每孔培养基，向每孔中加入系列稀释的三唑酮类化合物PBS溶液100μL，在37℃和5％的CO₂条件下继续培养12h(阳性对照孔加入细胞但不加入三唑酮类化合物，阴性对照孔细胞和三唑酮类化合物均不加入并以等体积纯PBS代替)。向每孔中加入110μM的HDAC底物Boc-Lys(Ac)-AMC PBS溶液30μL，继续在37℃下培养6h。向每孔中加入100μL新鲜配置的终止液，并在37℃下培养2h。一一对应地吸取每孔100μL的反应液至黑色96孔板中，并读取黑板中每孔在激发波长360nm和发射波长460nm下的荧光强度F，参照公式：抑制率％＝(F_{阳性对照孔}-F_化合物孔)/(F_{阳性对照孔}-F_{阴性对照孔})×100％，计算各浓度下三唑酮类化合物的抑制率，并以Graphpad软件计算三唑酮类化合物IC₅₀。实验结果如表5所示。

HDAC1抑制活性：向黑色96孔板的每孔中加入含有1ng的HDAC1酶或HDAC6酶的35μL实验用Buffer溶液(阴性对照组以等体积不含HDAC酶的实验用Buffer代替)。向每孔中加入5μL系列稀释的三唑酮类化合物实验用Buffer溶液(阴性和阳性对照组以等体积不含三唑酮类化合物的实验用Buffer代替)，后在37℃下孵育5min。向每孔中加入含HDAC底物Boc-Lys(Ac)-AMC(50μM)以及trypsin(0.5mg/mL)的实验用Buffer溶液10μL，继续在37℃下孵育25min。读取每孔在激发波长360nm和发射波长460nm下的荧光强度F。参照公式：抑制率％＝(F_{阳性对照孔}-F_化合物孔)/(F_{阳性对照孔}-F_{阴性对照孔})×100％，计算各浓度下三唑酮类化合物的抑制率，并以Graphpad软件计算三唑酮类化合物IC₅₀。实验结果如表5所示。

表5化合物的体外HDAC活性(IC₅₀,μM)

从以上表5中的数据可知，除F1-F3外，其它化合物均可不同程度抑制真菌细胞总HDAC、人细胞总HDAC活性，所有化合物能不同程度抑制HDAC1活性，表明它们可作为真菌HDAC与人HDAC的抑制剂。其中，化合物E4、F5、F9以及F10的活性最优。

5、体内协同抗真菌活性

本发明选取三唑酮类化合物F5和F9进行协同氟康唑体内抗真菌活性测试，测试方法为小鼠肾脏荷菌量实验。使用阳性对照药物Ganetespib和SAHA作为对照药物。

选择ICR雌性小鼠作为实验小鼠，每只小鼠经尾静脉注射0.2mL的2.5×10⁶CFU/mL的白念珠菌0304103，向ICR雌性小鼠尾静脉注射0.2mL生理盐水稀释的菌悬液造成侵袭性真菌感染小鼠模型。将小鼠随机分为7组，分别为溶解三唑酮类化合物的溶剂(1％DMSO+5％PEG300+84％生理盐水)Vehicle组，F5(25mg/kg)组、F9(25mg/kg)组、氟康唑(0.3mg/kg)组，F5(25mg/kg)+氟康唑(0.3mg/kg)组、J9(25mg/kg)+氟康唑(0.3mg/kg)组、Ganetespib(25mg/kg)+氟康唑(0.3mg/kg)组、SAHA(25mg/kg)+氟康唑(0.3mg/kg)组，每组5只小鼠。三唑酮类化合物每天给药一次，连续给药5天，给药方式为腹腔注射。于第7天，处死各组小鼠，解剖分离小鼠肾脏，以生理盐水匀浆小鼠左侧肾脏，经生理盐水稀释适宜倍数后，均匀涂布在含SDA培养基的培养皿中(每个小鼠肾脏匀浆液涂布3个培养皿)，在30℃条件下培养48h。对培养皿中生成的菌落数计数，并统计分析各组小鼠肾脏真菌荷菌量(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。结果如图1所示，图1是小鼠肾脏荷菌量的示意图；左图是三唑酮类化合物F5小鼠肾脏荷菌量的示意图，右图是三唑酮类化合物F9小鼠肾脏荷菌量的示意图。结果表明，化合物F5、F9单独给药均不能降低小鼠肾脏荷菌量，但与氟康唑联合给药均能够显著降低小鼠肾脏荷菌量，且优于单独氟康唑给药组、Ganetespib与氟康唑联合给药组和SAHA与氟康唑联合给药组，说明三唑酮类化合物F5和F9在动物水平可表现出优秀的协同抗真菌活性。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (4)

1.一种具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物，其特征在于，所述具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物的结构为以下结构中的一种：

2.一种权利要求1所述的具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物在制备抗真菌和/或抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述真菌为白念珠菌；所述肿瘤为白血病或肺癌。

3.一种权利要求1所述的具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物在制备Hsp90抑制剂或Hsp90-HDAC双靶点抑制剂中的应用。

4.一种权利要求1所述的具有抗真菌与抗肿瘤双重作用的三唑酮类化合物与氟康唑联用在制备抗真菌和/或抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述三唑酮类化合物为以下结构的一种：

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