CN108440414B - 吡唑酮酰胺类抗真菌药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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    • A61P31/10—Antimycotics

Abstract

本发明公开了一种吡唑酮酰胺类抗真菌化合物或其在药学上可接受的盐，该化合物的结构如通式I所示：
Figure DDA0001662229310000011
其中，X为O或S；R1为氢，或者位于苯环的任意位置的单取代基或多取代基；R2为氢，取代或未取代的芳香环、脂肪环，或低级酰基；R3和R4一个为氨基，另一个为羰基氧。本发明还公开了该化合物的制备方法及其在制备抗真菌药物中的应用。体外抗真菌活性实验结果显示，本发明的通式I的大部分化合物表现出良好的抗真菌活性特点，对包括真菌白念珠菌、耐氟康唑白念珠菌、新生隐球菌和光滑念珠菌等等的抗真菌活性优于阳性药氟康唑。

Description

吡唑酮酰胺类抗真菌药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具体涉及一类具有抗真菌活性的吡唑酮酰胺类衍生物及其药学上可接受的盐类，以及制备方法，以及化合物抗真菌活性，可用于治疗真菌感染类疾病。
背景技术
近年来，侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，尤其在HIV、肿瘤、器官移植、血液病、重症监护患者中侵袭性真菌感染的发病率和死亡率不断升高。白念珠菌(Candidaalbicans)，新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)和烟曲霉菌(Aspergillusfumigates)是目前发病率和死亡率最高的三大致病真菌。
目前，临床上只有四类药物用于治疗深部真菌感染：多烯类(两性霉素B)、核酸类(5-氟胞嘧啶)和唑类(氟康唑、伊曲康唑等)。尽管上述药物使得真菌感染从预防到治疗都取得了很大进展，但深部真菌感染的治疗，尤其是难治性真菌病(如隐球菌脑膜炎)仍然存在很大的困难。两性霉素B至今仍为中枢神经系统隐球菌病的首选药物之一，但毒副作用严重；5-氟胞嘧啶单独使用极易产生耐药，多与两性霉素B联合应用，且对肝、肾、造血系统均有损害；氟康唑虽副作用较轻，但单独使用治疗隐球菌脑膜炎疗效并不理想，且耐药性日趋严重，进一步降低了疗效；伊曲康唑药代动力学性质不佳，多与两性霉素B合用或作为维持治疗用药；而棘白菌素类抗真菌药物则对隐球菌无效。
因此，研发全新结构类型、作用机制和抗耐药的抗深部真菌感染药物十分重要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一类新的抗真菌小分子抑制剂。
该抗真菌小分子抑制剂为一种吡唑酮酰胺类抗真菌化合物或其在药学上可接受的盐，该化合物的结构如通式I所示：
Figure BDA0001662229290000011
其中，X为O或S，优选S；
R1为氢，或者位于苯环的任意位置的单取代基或多取代基，各取代基独立地为卤素、低级烷基、低级卤代烷基、低级羟基烷基、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级卤代烷氧基、低级卤代烷基氨基、低级环烷基氨基、低级链炔基氨基、酰胺基、低级环烷基酰胺基、低级酰胺基烷基、苄基、取代苄基、硝基、乙炔基、吗啉基、取代哌嗪基或腈基；
R2为氢，取代或未取代的芳香环、脂肪环，或低级酰基；
R3和R4一个为氨基，另一个为羰基氧。
其中，所述的“低级”是指含1至6个碳原子的直链或支链饱和脂肪烃基团；所述的低级链炔基是指含有只是一个碳碳三键的2至6个碳原子的直链或支链不饱和烃基团，所述的芳香环是指苯环或芳香杂环；所述脂肪环3～7元的环烷基或杂环烷基。
R3和R4一个为氨基，另一个为羰基氧，是指当R3和为氨基时，R4为羰基氧；当R3为羰基氧时，R4为氨基，通式I可变为以下通式Ia或通式Ib。
Figure BDA0001662229290000021
本发明的一些较佳实施例中，R1为氢。
本发明的另一些较佳实施例中，R1为位于苯环任意位置的单取代基，取代位置优选对位或间位。具体的：
当R1是卤素时，可以是氟、氯、溴、碘，优选氯；
当R1是低级烷基时，可以选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基和正己基等，优选甲基和乙基；
当R1是低级烷氧基时，可选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基等，优选甲氧基和乙氧基。
当R1是低级卤代烷基时，优选三氟甲基；
当R1是低级卤代烷氧基时，优选三氟甲氧基。
本发明的另一些较佳实施例中，R1为位于苯环任意位置的双取代基，优选的双取代位置为对位和间位。
进一步的，苯环的对位和间位均为取代基氯时，抗菌效果尤佳。
本发明的一些较佳实施例中，R2为取代或未取代的芳香环时，优选取代或未取代的苯基。
本发明的一些较佳实施例中，R2为低级酰基，优选乙酰基。
本发明的一些较佳实施例中，所述的盐为有机酸盐或无机酸盐。
当所述的盐为有机酸盐时，所述有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸。
所述的盐为无机酸盐时，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸。
本发明的第二目的在于提供一种制备上述通式I的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：以化合物1、化合物2、化合物4为原料，采用分步反应或一锅反应制得目标化合物；其中化合物1为取代或未取代的苯胺，化合物2为羰基二咪唑或硫代羰基二咪唑，化合物4为取代或未取代的氰基乙酰肼或异氰基乙酰肼；
采用分步反应时，包括反应：a)化合物2与取代或未取代的苯胺1反应制得异硫氰酸苯酯中间体3；b)中间体3和化合物4反应制得中间体5；c)中间体5在NaOH水溶液中反应关环得到通式I所示的化合物；反应式为：
Figure BDA0001662229290000031
采用一锅反应时，化合物2直接与化合物1和化合物4一锅反应制得通式I所示的化合物；反应式如下：
Figure BDA0001662229290000032
上述的X、R1、R2、R3和R4的定义如权利要求1所述，R5为氰基或异氰基。
其中，步骤a以及一锅反应的反应溶剂优选四氢呋喃，化合物1投料前可先用二氯甲烷或三氯甲烷溶解。步骤b的反应溶剂优选四氢呋喃。
R5为异氰基时，化合物4变为化合物9，其由乙氧基异氰基酮化合物8在乙醇体系中与水合肼反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001662229290000033
上式中，R2优选取代的或未取代的苯基。
本发明所述方法的一些较佳实施例中，化合物1优选硫代羰基二咪唑，即X为S。
当R3为氨基，R4为羰基氧时，所述方法中，化合物4优选取代或未取代的氰基乙酰肼，化合物1、化合物2、化合物4优选分步反应。
当R3为羰基氧，R4为氨基时，所述方法中，化合物4优选取代或未取代的异氰基乙酰肼，化合物1、化合物2、化合物4的反应优选分步反应。
当R3为氨基，R4为羰基氧，R2为取代或未取代的芳香环时，化合物1、化合物2、化合物4通过一锅反应即可得目标化合物。
当制得I所示的化合物中R2为氢时，所述方法还包括进一步的酰基化步骤，R2由氢经酰基化转换为低级酰基。以此可制得R2为低级酰基的化合物。
本发明的第三目的在于公开所述的咔啉类抗真菌化合物及其药学上可接受的盐在制备抗真菌药物中的应用。
将本发明的通式I的化合物进行真菌生长抑制的测试，菌株选用临床常见致病真菌白念珠菌(C.alb.SC5314)、耐氟康唑白念珠菌(C.alb.0304103)、新生隐球菌(C.neo.H99)和光滑念珠菌(C.gla.8535)，阳性对照药为氟康唑(FLC)。实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗真菌活性，部分化合物的抗真菌活性优于阳性药氟康唑。因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗真菌药物。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供了一类新的抗真菌小分子抑制剂，即通式I的吡唑酮酰胺类抗真菌化合物及其在药学上可接受的盐，体外抗真菌活性实验结果显示，本发明的通式I的大部分化合物表现出良好的抗真菌活性特点，对包括真菌白念珠菌(C.alb.SC5314)、耐氟康唑白念珠菌(C.alb.0304103)、新生隐球菌(C.neo.H99)和光滑念珠菌(C.gla.8535)等等的抗真菌活性优于阳性药氟康唑。因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗真菌药物。
附图说明
图1为化合物7a、6d、11a和FLC对C.neo.H99的被膜抑制活性示意图；
图2为线虫真菌感染模型的生存曲线；
图3为化合物7a作用于C.neo.H99的时间-生长曲线；
图4为FLC作用于C.neo.H99的时间-生长曲线；
图5为化合物7a和FLC对C.neo.H99疏水性的作用示意图；
图6为系统性C.neo.H99感染小鼠模型实验结果。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，给出以下系列具体实施例，但本发明并不受这些具体实施例的限制，任何了解该领域的技术人员对本发明的些许改动将可以达到类似的结果，这些改动也包含在本发明之中。
下列实施例中所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1～2 A系列化合物7a和7b
合成路线1
Figure BDA0001662229290000051
具体步骤
实施例1：3-氨基-N-(3,4-二氯苯基)-5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(7a)
称取硫代羰基二咪唑(300mg，1.69mmol)于反应瓶中，加入10mL干燥的四氢呋喃(THF)，3,4-二氯苯胺(272mg，1.69mmol)溶于2mL干燥二氯甲烷(DCM)后缓慢滴加至反应瓶中，再加入2mL三乙胺(TEA)，室温反应4h后，分批加入氰基乙酰肼(167mg，1.69mmol)，室温下反应过夜，TLC检测反应完全后，用水萃取，收集水相，冰浴下滴加5M的HCl，调节pH至弱碱性或中性，析出固体，抽滤水洗，烘干，可制备得到黄色固体7a共241mg，得，收率:48％。
实施例2：3-氨基-N-(4-氯苯基)-5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(7b)
参照实施例1，对氯苯胺与硫代羰基二咪唑、三乙胺、氰基乙酰肼反应，得3-氨基-N-(4-氯苯基)-5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺223mg，淡黄色固体，收率:51％。
实施例3～17 B系列化合物6a～6s
合成路线2
Figure BDA0001662229290000061
具体步骤
实施例3：5-氨基-N-(4-氯苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6a)
称取硫代羰基二咪唑(300mg，1.69mmol)于反应瓶中，加入10mL干燥的THF，对氯苯胺(235mg，1.85mmol)溶于2mL干燥DCM后缓慢滴加至反应瓶中，室温反应2h，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)纯化得到中间体对氯异硫氰酸苯酯(145mg，0.86mmol)，干燥后，将中间体溶于10mL干燥的THF，分批加入氰基乙酰肼(85mg，0.86mmol)，室温下反应过夜，TLC检测中间体反应完全后，将反应液浓缩旋干，产物用DCM打浆后，抽滤水洗，可制备得到中间体N-(4-氯苯基)-2-(2-氰基乙酰基)肼硫代酰胺共182mg。将该中间体(182mg，0.68mmol)溶于水中，加入1当量的NaOH固体，室温下反应1h，反应完全后，缓慢滴加5M的HCl至不再有固体析出，抽滤水洗，烘干，可得到目标产物6a共102mg，淡黄色固体，收率:56％。
实施例4：5-氨基-N-(4-碘苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6b)
参照实施例3，对碘苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物112mg，淡黄色固体，收率:77％。
实施例5：5-氨基-N-(4-溴苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6c)
参照实施例3，对溴苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物135mg，黄色固体，收率:57％。
实施例6：5-氨基-N-(3,4-二氯苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6d)
参照实施例3，3,4-二氯苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物97mg，黄色固体，收率:53％。
实施例7：5-氨基-N-(4-乙氧基苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6e)
参照实施例3，对乙氧基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物107mg，淡黄色固体，收率:51％。
实施例8：5-氨基-N-(4-氰基苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6f)
参照实施例3，对氰基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物114mg，黄色固体，收率:56％。
实施例9：N-([1,1'-联苯]-4-基)-5-氨基-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6g)
参照实施例3，4-氨基联苯与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物105mg，淡黄色固体，收率:48％。
实施例10：5-氨基-N-(4-吗啉代苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6h)
参照实施例3，4-吗啉代苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物96mg，淡黄色固体，收率:77％。
实施例11：5-氨基-N-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6i)
参照实施例3，4-甲氧基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物113mg，淡黄色固体，收率:53％。
实施例12：5-氨基-N-(4-硝基苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6j)
参照实施例3，4-硝基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物153mg，黄色固体，收率:58％。
实施例13：5-氨基-N-(4-乙炔基苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6k)
参照实施例3，4-乙炔基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物126mg，淡黄色固体，收率:46％。
实施例14：5-氨基-3-氧代-N-(对甲苯基)-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6l)
参照实施例3，对甲苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物132mg，淡黄色固体，收率:58％。
实施例15：5-氨基-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6o)
参照实施例3，4-甲基哌嗪苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物92mg，黄色固体，收率:54％。
实施例16：5-氨基-N-(2-氯苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6r)
参照实施例3，2-氯苯苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物122mg，黄色固体，收率:57％.
实施例17：5-氨基-N-(3-氯苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6s)
参照实施例3，3-氯苯苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物117mg，淡黄色固体，收率:77％。
实施例18～22 C系列化合物11a～11e
合成路线3
Figure BDA0001662229290000081
具体步骤
实施例18：3-氨基-N-(3,4-二氯苯基)-5-氧代-4-苯基-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(11a)
称取硫代羰基二咪唑(300mg，1.69mmol)于反应瓶中，加入10mL干燥的THF，3,4-二氯苯胺(297mg，1.85mmol)溶于2mL干燥DCM后缓慢滴加至反应瓶中，室温反应2h，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)纯化得到中间体3,4-二氯异硫氰酸苯酯(224mg，0.86mmol)。3-乙氧基-1-异氰基-1-苯基-2-酮(300mg，1.48mmol)溶于20mL乙醇中，缓慢加入水合肼10mL，反应得到中间体2-异氰基-2-苯基乙酰肼(223mg，1.29mmol)。将3,4-二氯异硫氰酸苯酯溶于10mL干燥的THF，分批加入中间体11(150mg，0.86mmol)，室温下反应过夜，TLC检测中间体反应完全后，将反应液浓缩旋干，产物用DCM打浆后，抽滤水洗，得中间体2-(2-氰基-2-苯基乙酰基)-N-(3,4-二氯苯基)肼硫代甲酰胺，将该中间体(150mg，0.39mmol)溶于水中，加入1当量的NaOH固体，室温下反应1h，反应完全后，缓慢滴加5M的HCl至不再有固体析出，抽滤水洗，烘干，可得到目标产物11a共94mg，淡黄色固体，收率:63％。
实施例19：3-氨基-N-(4-氟苯基)-5-氧代-4-苯基-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(11b)
参照实施例19，4-氟苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物97mg，淡黄色固体，收率:63％。
实施例20：3-氨基-N-(4-碘苯基)-5-氧代-4-苯基-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(11c)
参照实施例19，4-碘苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物104mg，淡黄色固体，收率:69％。
实施例21：3-氨基-N-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-4-苯基-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(11d)
参照实施例19，4-甲氧基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物117mg，黄色固体，收率:74％。
实施例22：3-氨基-N-(4-硝基苯基)-5-氧代-4-苯基-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(11e)
参照实施例19，4-硝基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物114mg，黄色固体，收率:73％。
实施例23～26 D系列化合物13a～13d
合成路线3
Figure BDA0001662229290000091
具体步骤
实施例23：N-(2-((3,4-二氯苯基)硫代氨基甲酰基)-5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-3-基)乙酰胺(13a)
称取中间体5-氨基-N-(3,4-二氯苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(6d)100mg，0.33mmol，溶于DCM中，加入2mL三乙胺(TEA)，搅拌片刻，加入1当量的乙酰氯，室温下反应1h，萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩旋干，得到目标产物13a共49mg，黄色固体，收率:43％。
实施例24：N-(2-((4-氟苯基)硫代氨基甲酰基)-5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-3-基)乙酰胺(13b)
参照实施例23，4-氟苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物54mg，淡黄色固体，收率:39％。
实施例25：N-(2-((4-碘苯基)硫代氨基甲酰基)-5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-3-基)乙酰胺(13c)
参照实施例23，4-碘苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物63mg，黄色固体，收率:37％。
实施例26：4-乙酰基-5-氨基-N-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(13d)
参照实施例23，4-甲氧基苯胺与硫代羰基二咪唑、氰基乙酰肼反应，得目标产物62mg，淡黄色固体，收率:47％。
上述各实施例制备的本发明化合物的化学结构式、NMR和MS数据详见表1。
表1本发明部分优选化合物的NMR和MS数据
Figure BDA0001662229290000101
Figure BDA0001662229290000111
Figure BDA0001662229290000121
Figure BDA0001662229290000131
Figure BDA0001662229290000141
Figure BDA0001662229290000151
效果实施例1：本发明化合物体外抗真菌活性测试
1、测试菌株
采用以下四种常见的致病真菌进行体外抗真菌活性测试：
新生隐球菌(C.neo.H99)、白色念珠菌(C.alb.SC5314)、耐氟康唑白念珠菌(C.alb.0304103)、光滑念珠菌(C.gla.8535)。
2、待测药物
本发明实施例1～26的化合物。
对照药：氟康唑(FLC)。
3、材料及仪器
移液枪，96孔板，血细胞计数板，涡旋仪，玻璃管，EP管，超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)。
4、培养基配制
YEPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，加入2mg/mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)，后于4℃保存备用。
RPMI1640液体培养液：RPMI1640(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(MOPS)34.5g，NaOH 2.7g，三蒸水定容至1000mL，抽滤灭菌，后于4℃保存备用。
PBS缓冲溶液：NaCl 8.0g，Na2HPO4 12H2O 3.57g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，15min)，室温保存备用。
5、待测药物的配制
待测药物用DMSO溶解，配制成2mg/mL的溶液，置于-20℃冰箱储存备用。
6、菌悬液的制备
用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取单克隆的菌株，接种至1mLYEPD培养液中，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1.5mL EP管，离心(3000g，5min，4℃)，吸弃上清液，用1mL PBS缓冲液吹打混匀，用PBS缓冲溶液吹洗2次，用1mL RPMI 1640培养液吹打混匀，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×103cells/mL。
7、加药及检测
将配制好的菌悬液加入96孔板中，第1列加入200μL，2至11列加入100μL。第12列加入1640培养基做空白对照。每个待测药物(2mg/mL)都取6.4μL于第一列菌悬液中，作三复孔，倍半稀释10个浓度梯度，即终浓度为64μg/mL–0.125μg/mL，第11列不加药，作阳性对照。
放入35℃恒温培养箱中孵育48h，用酶标仪测定OD630。以阳性对照的OD值为100％，最低抑菌浓度(MIC50)为50％OD值的最低化合物浓度。实验结果如表2所示。
表2化合物体外抗真菌活性测试(MIC50，μg/mL，48h)
Figure BDA0001662229290000161
Figure BDA0001662229290000171
体外抗真菌活性实验结果显示，本发明大部分化合物表现出良好的抗真菌活性特点，部分发明的化合物结果优于对照药氟康唑，具有优秀的抗真菌活性。
效果实施例2：本发明化合物被膜形成抑制实验
取数只15mL离心管，加5mL菌浓度为2×105cells/mL的1640培养基，加入梯度浓度的待测药物，空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5％。30℃，200rpm振荡培养，分别于2、4、6、8、10、12、24、48h取10μL不同药物浓度的真菌悬液，以血细胞计数板计数。
测试结果如图1所示，结果表明，化合物7a、6d和11a对新生隐球菌的被膜形成具有明显的抑制作用，且抑制效果优于阳性对照药氟康唑，其中，化合物7a抑制被膜生长效果最好。
效果实施例3：本发明化合物线虫真菌感染模型实验
1、材料
线虫：Caenorhabditis elegans glp-4；sek-1strain
感染菌株：白色念珠菌C.alb.SC5314
2、培养基
OP50培养液，NGM培养基，BHI培养基，BHI培养液，M9缓冲液，沙堡葡萄糖，琼脂固体培养基(SDA)，YPD培养液，线虫裂解液
3、实验方法
1)线虫的培养：应用线虫Caenorhabditis elegans glp-4；sek-1strain，于NGM琼脂培养基上培养繁殖，以大肠杆菌OP50为食饲养线虫。新孵化出的线虫于25℃培养3天，使其成长为成虫，用于实验。
2)线虫的同期化：秀丽隐杆线虫于15℃培养5～6d至育卵后，用6mL M9缓冲液冲下，加入到15mL离心管中，以3000转离心1min，弃上清液，留下500μL，加入500μL裂解液，在显微镜下观察成虫有断裂后在15mL离心管中加M9至15mL，3000转离心1min，弃上清，留100μL，用M9缓冲液反复洗三次，最后用5mL M9缓冲液重悬剩余的100μL虫卵，在垂直混合仪中M9缓冲液中孵化过夜，得到L1期幼虫，将幼虫转移到NGM培养基上25℃培养3d，得到同步化的成虫。
3)线虫白念珠菌感染实验模型的建立：将白念珠菌于YPD液体培养基中30℃培养过夜(24h)，取200μL涂布于BHI琼脂平板(含45μg/mL卡那霉素，用于抑制细菌生长)，30℃培养24小时。用无菌M9缓冲液从NGM琼脂培养基上小心收集线虫成虫，将400-500条线虫置于BHI琼脂平板上白念珠菌生长坪的中央，25℃孵育4小时，让线虫有足够的时间吞食白念珠菌。用6mL无菌M9缓冲液非常小心地将线虫收集入15mL锥形管，用无菌M9缓冲液清洗线虫4次。将线虫转移至12孔板中，每个实验组30只，12孔板中各个孔分别加入2mL液体培养基(含80％M9，20％BHI和45μg/ml卡那霉素)。
4)药效监测
本发明化合物终浓度为10μg/mL，氟康唑为20μg/mL，加入到以上含感染线虫的培养基中，观察记录线虫生存情况。线虫真菌感染模型的生存曲线如图2所示。
结果表明，与空白组相比，化合物7a、6d和11a均能明显地延长线虫的生存期。
效果实施例4：本发明化合物时间-生长曲线测试
用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取单克隆的菌株，接种至1mLYEPD培养液中，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1.5mL EP管，离心(3000g，5min，4℃)，吸弃上清液，用1mL PBS缓冲液吹打混匀，用PBS缓冲溶液吹洗2次，用1mL RPMI 1640培养液吹打混匀，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至2×105cells/mL。
取数只15mL离心管，加5mL菌浓度为2×105cells/mL的1640培养基，加入梯度浓度的待测药物7a和FLC，空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5％。30℃，200rpm振荡培养，分别于2、4、6、8、10、12、24、48h取10μL不同药物浓度的真菌悬液，以血细胞计数板计数。
化合物7a和FLC作用于C.neo.H99的时间-生长曲线分别如图3和4所示，结果表明，化合物7a可以呈浓度依赖地抑制新生隐球菌的生长，且抑制作用优于阳性对照药氟康唑。
效果实施例5：本发明化合物疏水性实验
将最终菌悬液浓度调整为1×106cells/mL，菌悬液加入6孔板后，37℃恒温培养90min后，加入一定浓度的待测药物，37℃恒温培养24h。取出。吸弃上清RPMI1640药液。用YEPD培养基冲洗刮取被膜，离心，去上清。再用3mL PBS制成混悬液，每组取1.2mL菌悬液至于5mL EP管中，加入0.3mL正辛烷。涡旋混匀3min，静置15min使得两相分离。两相分离后立即测定水相的OD600值。以不加正辛烷的YEPD培养基的OD600值作为阴性对照。根据实验结果计算相对疏水性(CSH)。
CSH的计算方法为：相对疏水性＝(OD600对照-OD600实验)/OD600对照。
化合物7a和FLC对C.neo.H99疏水性的计算结果如图5所示，结果表明，新生隐球菌经化合物7a作用后，其真菌细胞表面疏水性显著性降低(P<0.001)，降低真菌表面粘附能力，而氟康唑对真菌细胞表明疏水性无抑制效果。
效果实施例6：本发明化合物小鼠系统性真菌感染实验
选用雌性ICR小鼠作为实验动物(20g左右)，给药前4天、前1天，给予200mg/Kg的环磷酰胺，造成免疫缺陷模型，经尾静脉注射，给予1×106cells/mL浓度的新生隐球菌C.neo.H99，造成系统性真菌感染模型。一定浓度的待测药物经腹腔注射给药，1天1次给药，共6天，观察并记录小鼠的生存情况。结果如图6和表3所示。
表3系统性C.neo.H99感染小鼠模型实验结果
Figure BDA0001662229290000191
结果表明，化合物7a(P<0.05)在一定程度上提高系统性新生隐球菌感染小鼠的生存率和中位生存期。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (2)

1.一种吡唑酮酰胺类抗真菌化合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，该化合物的结构为以下结构中的一种：
Figure FDA0003061823360000011
Figure FDA0003061823360000021
2.如权利要求1所述的吡唑酮酰胺类抗真菌化合物或其在药学上可接受的盐在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的抗真菌药物指抗隐球菌、光滑念珠菌、白念珠菌和耐药白念珠菌中的一种或多种的药物。
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