CN108610433A - 可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物及制备方法 - Google Patents

可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种可有效抑制肝肿瘤细胞Hca‑F的笼目海带提取物及制备方法，所述笼目海带提取物中多糖质量为53.0～65.0%，硫酸根质量为23.0～35.0%，多酚质量为1.0～1.3%，多糖由岩藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸及木糖组成，岩藻糖至少为多糖质量的24.0%，葡萄糖醛酸至少为多糖质量的6.0%。是以纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按比例配制成复合酶，对笼目海带进行酶解提取，不仅可有效抑制肝肿瘤细胞Hca‑F，还可提高机体免疫力，操作简单、可操作性强，适合工业化生产。

Description

可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物及制备方法
技术领域
本发明涉及一种笼目海带提取物，尤其是一种可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物及制备方法。
背景技术
褐藻中含有很多生物活性物质，以不同藻类为原料，采用不同的提取方法，其产物组成成分、结构及生物活性存在较大差异。中国发明专利申请号为ZL200510047582.X的发明专利公开了一种“酶法水解褐藻制备岩藻聚糖硫酸酯的方法”，是将纤维素酶和果胶酶按比例配制成复合酶，对褐藻进行酶解并蒸煮以提取岩藻聚糖硫酸酯，克服了酸解法破坏性大、污染严重的缺点……所提取的岩藻聚糖硫酸酯可制备抗凝血、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、增强机体免疫机能的保健产品或作为药品的先导物。
笼目海带（Kjellmaniella crassifolia Miyabe）为褐藻优势种质资源，它在系统分类上属于海带目（Laminariales），海带科（Laminariaceae），Kjellmaniella属，是经济价值很高的亚寒带大型褐藻，在亚洲主要分布在日本北海道南部。天然藻体长度2m左右，宽约30cm，栽培藻体长达5m以上，因叶片表面布满网目状条纹，在日本被称之为“篭布”。笼目海带因其多糖含量较高，已成为目前重点研究的主要藻类，笼目海带多糖在保健类食品及医药产品开发领域具有很大潜力。
但是，迄今为止并没有关于可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物及提取方法的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物及制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物，其特征在于：所述笼目海带提取物中多糖质量为53.0～65.0%，硫酸根质量为23.0～35.0%，多酚质量为1.0～1.3%，多糖由岩藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸及木糖组成，岩藻糖至少为多糖质量的24.0%，葡萄糖醛酸至少为多糖质量的6.0%。
一种如权利要求1所述可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将纤维素酶、果胶酶和蛋白酶配制成复合酶，所述纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的质量比为5：5～8：0.1～0.5；
b. 以清洗后的笼目海带为原料，向原料中加入复合酶，在 pH4.0～pH5.5和温度40～60℃条件下酶解40~70分钟，所述复合酶添加量为原料质量的0.51～0.90%，然后在96～100℃水浴加热3～4小时，降至室温，离心得上清液A；
c. 在上清液A中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%产生沉淀，离心得上清液B；
d. 在上清液B中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，离心得沉淀；
e. 将沉淀溶于水中，加入乙醇至乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心去沉淀得上清液C；
f. 在上清液C中继续添加乙醇至乙醇质量浓度为70%产生沉淀，离心得沉淀；
e. 冷冻干燥沉淀得白色粉末。
本发明是以纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按比例配制成复合酶，对笼目海带进行酶解提取，其提取物不仅含有多糖和硫酸根，还含有质量百分比为1.0～1.3%的多酚，可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F及提高机体免疫力。本发明操作简单、可操作性强，适合工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1所得提取物弱阴离子交换色谱（DEAE-Sepharose fastflow）的分离图谱。
图2是本发明实施例1所得提取物中多糖组成分析的液相色谱图。
图3是本发明实施例对肝癌细胞Hca-F的体外抑制活性实验效果图。
具体实施方式
实施例1：
a. 取2.0g纤维素酶，2.0g果胶酶和0.08g蛋白酶，混合配制成4.08g复合酶；所述纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的酶活分别为80,000u/g、80,000 u/g和1,000,000 u/g；
b. 称500g干笼目海带为原料，向干笼目海带中加入9000g的水，并加入所配制的复合酶（占原料重量的0.82%），在pH为4.5、50℃条件下酶解60分钟，然后以100℃水浴加热3小时，降至室温，离心得上清液A；
c. 在上清液A中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%，产生沉淀，离心得上清
液B；
d. 在上清液B中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，收集沉淀；
e. 将d步骤所得沉淀重新溶于水中，搅拌均匀，加入乙醇至乙醇质量浓度
为30%，产生沉淀，离心得上清液C；
f. 在上清液C中继续添加乙醇至乙醇质量浓度为70%，离心得沉淀，冷冻干燥得白色粉末。
所提取的白色粉末得率为5.2%，分子量1~18万道尔顿。
将实施例1所得白色粉末F采用弱阴离子交换色谱（DEAE-Sepharose fast flow）进行分离纯化，结果如图1所示。
从图1可以看出弱阴离子交换色谱DEAE-Sepharose fast flow交换柱层析分离得到流出峰F1馏分、洗脱峰F2和F3馏分。然后利用液相色谱将每一组分进行了组成成分及多糖组成分析，结果分别如表1所示。
表1
表中数据为三个平行样的平均值（Mean values from three analyses）。
从表1可以看出，本发明实施例提取物中多糖质量含量大于58.0%，硫酸根质量含量大于23.0%，多酚质量含量大于1.0%。
实施例1提取物（F）的多糖组成分析的液相色谱图如图2所示，从图2可以看出，本发明实施例1提取物（F）的多糖主要由岩藻糖、半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖和葡糖糖醛酸组成。
实施例2：
a. 取1.7g纤维素酶，2.1果胶酶，0.04g蛋白酶，混合配制成3.84g复合酶；所述纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的酶活分别为80,000u/g、80,000 u/g和1,000,000 u/g；
b. 称500g笼目海带海带为原料，向干笼目海带中加入10000g的水，并加入所配制的复合酶（占原料质量的0.77%），在pH为5.0、50℃条件下酶解60分钟，然后以96℃水浴加热3.5小时，降至室温，离心得上清液A；
c. 在上清液A中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%，产生沉淀，离心得上清液B；
d. 在c步骤所得上清液B中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，收集沉淀；
e. 将d步骤所得沉淀重新溶入水中，加入乙醇使乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心得上清液C；
f. 在e步骤所得上清液C中加入95%乙醇使乙醇质量浓度为70%产生沉淀，收集沉淀；
g. 真空冷冻干燥沉淀得白色粉末。
所提取的白色粉末得率为5.1%，分子量1~18万道尔顿。
实施例3：
a. 取1.8g纤维素酶，1.8g果胶酶和0.1g蛋白酶，混合配制成3.7g复合酶；所述纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的酶活分别为80,000u/g、80,000 u/g和1,000,000 u/g；
b. 称500g干笼目海带为原料，向干笼目海带中加入7500g的水，并加入所配制的复合酶（占原料重量的0.74%），在pH为5.0、40℃的条件下酶解70分钟，然后以100℃水浴加热3.5小时，降至室温，离心得上清液A；
c. 在上清液A中加入乙醇使乙醇质量浓度为20%产生沉淀，离心得上清液B；
d. 在c步骤所得上清液B中加入乙醇使乙醇质量浓度为60%产生沉淀，收集沉淀；
e. 将d步骤所得沉淀重新溶解至水中，加入乙醇使乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心得上清液C；
f. 在e步骤所得上清液C中加入乙醇使乙醇质量浓度为70%产生沉淀，收集沉淀；
g. 真空冷冻干燥沉淀得白色粉末。
所提取的白色粉末得率为5.0%，分子量1~18万道尔顿。
实验：
1. MTT实验
对本发明实施例1提取物F、分离流出峰F1、分离洗脱峰F2和F3及按照ZL200510047582.X的发明专利公开了一种“酶法水解褐藻制备岩藻聚糖硫酸酯的方法”，以海带为原料所提取的岩藻聚糖硫酸酯S，对Hca-F的体外抑制活性进行了MTT实验，结果如图3所示。图3中Con，对照样； CP，环磷酰胺（cyclophosphamide, 5μg/mL）。
从图3中可以看出，本发明实施例1提取物F和流出峰F1均对肿瘤细胞Hca-F具有抑制作用，比较对照样品，提取物F和流出峰F1对肿瘤细胞Hca-F抑制率为30~40%，而洗脱峰F2和F3以及现有技术的岩藻聚糖硫酸酯S抑制活性均很低。
2. 体内实验
将冻存管中的Hca-F肝癌细胞复苏培养后，利用含10%胎牛血清和1%青霉素&链霉素的RPMI1640完全培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。取对数生长期的Hca-F肝癌细胞，通过血球计数板进行细胞计数，调整细胞密度为1×106个/mL，吸取0.2mL细胞液接种于615小鼠腹腔内，进行体内肿瘤细胞培养，两周后抽取615小鼠腹水，利用红细胞裂解液破碎红细胞，并进行离心处理除去红细胞上清液，再用磷酸盐缓冲溶液清洗肝癌细胞，在冰浴条件下用生理盐水制备细胞悬液，通过血球计数板调整细胞密度为5×106个/mL。将ICR小鼠随机分为11组，每组10只，共计110只，将调整好密度的生理盐水细胞悬液接种于ICR小鼠右腋皮下，每只接种0.2 mL，操作迅速，在30 min内完成接种。
保留10只未接种肝癌细胞的ICR小鼠作为实验空白组，并设置模型组和药物组（环磷酰胺组），实验组中笼目海带岩藻聚糖硫酸酯粗品F、流出峰F1、分离峰F2和F3组设定低、高二个剂量组，浓度分别为150mg/kg﹒d、450mg/kg﹒d，ICR小鼠具体分组如表2：
表2
组别 剂量(mg/kg•d)
正常组 ——
模型组 -——
环磷酰胺组CP 30
F低剂量组FL 150
F高剂量组FH 450
F-1低剂量组F-1L 150
F-1高剂量组F-1H 450
F-2低剂量组F-2L 150
F-2高剂量组F-2H 450
F-3低剂量组F-3L 150
F-3高剂量组F-3H 450
模型组每天给予等体积的生理盐水，阳性对照组灌胃环磷酰胺药物，浓度为30mg/kg﹒d。接种3天后于小鼠右腋接种部位扪及米粒大小的瘤结节，开始每天灌胃，共21天，21次，末次给药24h后，称小鼠体重，内眦取血，收集各组血清保存， 颈椎脱臼法处死小鼠，快速取各组肿瘤组织，称重，部分迅速冷冻；部分10%中性福尔马林固定，计算抑瘤率，结果如表3。
胸腺指数=胸腺质量（mg）/小鼠体重（g）
抑瘤率%=（1-实验组瘤质量/对照组瘤质量）×100%
表3
实验鼠组 存活率 鼠肿瘤块 (g/mouse) 胸腺指数 (mg/g)
Normal 100% - 2.7±0.8**
Control 60% 7.5±3.0 1.5±0.8
CP 90% 2.4±1.4* 0.7±0.3*
FL 70% 7.5±2.3 1.4±0.4
FH 60% 2.6±1.0* 1.6±0.6
F1L 40% 8.7±1.8 1.7±0.5
F1H 60% 5.8±3.5 1.5±0.7
F2L 40% 5.7±3.0 1.8±0.9
F2H 60% 6.8±4.0 1.4±0.9
F3L 40% 6.6±3.8 1.8±0.8
F3H 30% 10.4±2.5 4.7±3.4
* p<0.05 模型组比较, ** p<0.01 与模型组比较。
# p<0.05 与对照组比较, ## p<0.01与对照组比较。
由表3可以看出：环磷酰胺组CP和FH的实验鼠肿瘤块与模型组显著减小；环磷酰胺组CP实验鼠的存活率最高，而F3L、F3H组的实验鼠存活率最低。所有肿瘤Hca-F接种实验鼠的脾脏指数增大，环磷酰胺阳性组的实验鼠脾脏指数缩小，说明环磷酰胺对脾脏具有毒性，而提取物F、流出峰F1、洗脱峰F2和F3均无毒性。

Claims (2)

1.一种可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物，其特征在于：所述笼目海带提取物中多糖质量为53.0～65.0%，硫酸根质量为23.0～35.0%，多酚质量为1.0～1.3%，多糖由岩藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸及木糖组成，岩藻糖至少为多糖质量的24.0%，葡萄糖醛酸至少为多糖质量的6.0%。
2.一种如权利要求1所述可有效抑制肝肿瘤细胞Hca-F的笼目海带提取物的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将纤维素酶、果胶酶和蛋白酶配制成复合酶，所述纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的质量比为5：5～8：0.1～0.5；
b. 以清洗后的笼目海带为原料，向原料中加入复合酶，在 pH4.0～pH5.5和温度40～60℃条件下酶解40~70分钟，所述复合酶添加量为原料质量的0.51～0.90%，然后在96～100℃水浴加热3～4小时，降至室温，离心得上清液A；
c. 在上清液A中加入乙醇至乙醇质量浓度为20%产生沉淀，离心得上清液B；
d. 在上清液B中加入乙醇至乙醇质量浓度为60%产生沉淀，离心得沉淀；
e. 将沉淀溶于水中，加入乙醇至乙醇质量浓度为30%产生沉淀，离心去沉淀得上清液C；
f. 在上清液C中继续添加乙醇至乙醇质量浓度为70%产生沉淀，离心得沉淀；
e. 冷冻干燥沉淀得白色粉末。
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