CN101402982A - 黄泥螺粘液多糖其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产品深加工领域，特别涉及一种软体动物粘液多糖及其制备方法，是以活体黄泥螺的粘液为原料制备而成的多糖粉末，粗多糖得率为5％～9％，纯化后的多糖得率为1％～3％，经苯酚－硫酸法测定黄泥螺粘液多糖的质量为82％～90％。生产工艺包括浸提，浓缩，沉降，纯化，分离，干燥等步骤。本发明提供的产品粘液多糖具有较高的抑制肿瘤细胞增殖和黑色素生成的功效。本发明提供的生产工艺简单，对于活体软体动物的粘液提取具有普遍适应性，且多糖提取率高，纯度高。
Description
技术领域
本产品涉及水产品深加工领域，特别涉及一种黄泥螺粘液多糖及制备方法以及该多糖的药物用途。
背景技术
黄泥螺，俗称“吐铁”，广泛生长于我国沿海滩涂地区，其味道鲜美，营养丰富，是一种集营养，保健，防病于一体的食品。我国的黄泥螺有十几种，其中经济价值较高的是江浙一带的黄泥螺，其具有适应性强、生长快、产量高等特点。近年来，随着人们对于海洋生物活性物质关注的不断提高，各种海洋生物体内生物活性物质的研究被大量报道，其中就有黄泥螺肉及其内脏中的蛋白质和多糖类生物活性研究。黄泥螺之所以具有很好的保健功能，与其含有多种生物活性成分有着密切的关系。黄泥螺粘液多糖具有提高机体免疫力，抗肿瘤，抗氧化，抗疲劳以及预防各种心脑血管疾病等多种功效，因此黄泥螺粘液多糖在保健品市场中具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有调节免疫功能、抑制黑色素生成和抑制肿瘤生长的黄泥螺粘液多糖。
本发明的另一个目的是提供了从活体黄泥螺粘液中制备多糖的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种活体黄泥螺粘液的制备方法，包括如下步骤：
a、原料处理：将新鲜的黄泥螺在海水中浸泡72-100小时，取浸泡液45～55℃真空干燥至原液体体积的1/5，45～60℃水浴加热4～6小时，过滤，得富含黄泥螺粘液的淡黄色澄清浸泡液；
b、酶解与灭酶：调节浸泡液的pH值2～4，添加质量比为10％～15％的胃蛋白酶，进行酶解，再调节pH值8～10，添加质量比为0.1％～0.8％的胰蛋白酶，再次酶解；或者添加胰蛋白酶两次，然后闪蒸灭酶；
c、离心：将酶解液低速离心15～30分钟，然后高速冷冻离心10～15分钟，弃沉淀，取上清液；
d、脱蛋白：采用sevage法脱蛋白。在上清液中加入1/5体积的氯仿，然后再加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合，剧烈震荡20分钟，离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质即可，此操作需要反复进行2～5次，取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；或采用三氯醋酸法脱蛋白：将上述所得离心上清液用草酸调节pH至7，然后再加适量3％三氯醋酸，静置过夜，弃沉淀；取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；
e、醇沉：在上述所得浓缩液中加入3～5倍体积的无水乙醇，作为沉降介质，进行沉降分离，然后低速离心15～30分钟，高速冷冻离心10～15分钟，得到的离心沉降物即为黄泥螺粘液粗多糖，粗多糖得率为5％～9％。；
f、纯化：首先在黄泥螺粘液粗多糖中依次加入少量丙酮和乙醚，将粗多糖充分浸泡，清洗，过滤，取沉淀干燥后溶于1～4倍体积的水，再加入1/3体积的30％的双氧水，30℃～60℃水浴，脱色30～50分钟，离心，去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到白色絮状黄泥螺粘液多糖复合物。将复合多糖溶于水后，分别经过离子纤维素柱和葡聚糖凝胶柱的分离，得到多糖吸收峰的收集液，合并收集液，并用双蒸水透析72小时；
g、干燥：将脱盐后的溶液再次冷冻干燥，得到纯净的黄泥螺粘液多糖。多糖得率1％～3％，经苯酚-硫酸法测定黄泥螺粘液多糖质量含量为82％～90％。
其中，黄泥螺浸泡温度为4℃；胃蛋白酶的使用环境pH值为2～4，酶解时间为12～24小时，胰蛋白酶的使用环境pH值为8～10，酶解时间为8～12小时；低速离心时离心转速为1000～4000rpm，高速冷冻离心时离心转速为8000～10000rpm，温度为4℃；离子纤维素柱的缓冲液为硼酸型，洗脱液为0.1mol/l～0.5mol/l的NaOH，葡聚糖凝胶柱的洗脱液为双蒸水；冷冻干燥条件为：真空度为60～80Pa，板温为45℃～80℃。
对采用以上方法制备的黄泥螺粘液多糖的功能效价进行评估(黄泥螺粘液多糖对小鼠黑色素瘤细胞B16的增殖及黑色素生成的抑制实验)：
a、B16细胞的培养：细胞株购于上海市中科院细胞生物学研究所。用RPMI1640培养液，细胞生长至融合状态，0.25％胰蛋白酶消化，以每瓶约105个细胞传代至25cm2培养瓶，37℃、5％CO2饱和湿度环境培养，每3天传代1次。
b、黑素细胞活力测定：待细胞生长到对数生长期，PBS洗涤，0.25％胰酶消化，锥虫蓝染色，血球计数板计数。调整细胞2×104个细胞/ml，每孔取100μl量接人96孔板，12h后添加待测药物。药物终浓度设为1.0、10、20、40、80μg/ml，每一浓度设置4个孔，对照组不加药物，空白孔不接种细胞。37℃、5％CO2孵箱中孵育72h。药物作用72h后，每孔加人5g/l的MTT溶液20μl，继续孵育4h。弃去上清液，每孔加二甲基亚砜150μl，选择490nm波长以空白孔调零，在酶联免疫检测仪上测各孔吸光度值。B16细胞增殖抑制率：
c、黑素含量测定：采用改良的Hideya Ando方法，调节细胞密度至105个/ml左右，各吸取细胞悬液分别置于3个离心管中，离心后重新弃去上清。加人200μl PBS缓冲液重新悬浮，然后加人1ml乙醇乙醚(1∶1)液，在室温下放置30min。3000rpm离心5min后弃去上清。加入1ml 10％的DMSO，1mol/l NaOH溶液，80℃水浴45min后于470nm波长处测定吸光度值。黑素合成抑制率：
d、统计结果：制备不同浓度下细胞增殖抑制率和黑色素生成抑制率的标准曲线，选取对比效果显著的50μg/ml的药剂计量。
| 药剂(50μg/ml) | 对照组 | 熊果苷 | 曲酸 | 抗坏血酸 | 多糖样品 |
| 细胞增殖抑制率 | 0％ | 50％ | 42.85％ | 38.57％ | 82.14％ |
| 黑素生成抑制率 | 0％ | 78.12％ | 64％ | 53.16％ | 36.09％ |
本发明方法与其它现有技术相比，有如下优点：
1、从活体黄泥螺的粘液中提取活性物质，既简化了提取步骤，节省了时间，更保证了原料的可再生性，同时也保证了黄泥螺可被完整地继续利用，可以说是“变废为宝”。
2、在采用sevage法或三氯醋酸法去蛋白之前，先对其进行加热处理和外源酶处理，使蛋白质脱除的更加彻底，从而提高了多糖的纯度。
3、采用多次真空浓缩、冷冻干燥技术，避免了对粘液中有效成分的破坏。
4、采用此方法制备的黄泥螺粘液多糖有显著的抗肿瘤效果，且有较好的黑色素生成抑制率。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面的实施例可以帮助本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
a、原料处理：将产自宁波的新鲜的活体黄泥螺(拉丁文名：Bullacta Exarata(黄泥螺))在4℃一般海水中浸泡72小时，取浸泡液45～55℃真空干燥至原液体体积的1/5，45℃水浴加热6小时使蛋白质变性，过滤；
b、酶解与灭酶：调节浸泡液的pH值为2，添加质量比为10％(w/w)的胃蛋白酶，酶解24小时，再调节pH值为8，添加质量比为0.3wt％的胰蛋白酶，再次酶解8小时；
c、离心：将酶解液于4000rpm下低速离心15～30分钟，然后于4℃，8000rpm高速冷冻离心10～15分钟，弃沉淀，取上清液；
d、脱蛋白：采用sevage法脱蛋白。在上清液中加入1/5体积的氯仿，然后再加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合，剧烈震荡20分钟，离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质即可，此操作需要反复进行3次，取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；
e、醇沉：在上述所得浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，作为沉降介质，进行沉降分离，然后于4000rpm下低速离心15分钟，于4℃，48000rpm高速冷冻离心10分钟，得到的离心沉降物即为黄泥螺粘液粗多糖，粗多糖得率为9％；
f、纯化：首先在黄泥螺粘液粗多糖中依次加入少量丙酮和乙醚，分别将粗多糖充分浸泡，清洗，过滤，取沉淀干燥后溶于4倍体积的水，再加入1/3体积的30％的双氧水，60℃水浴，脱色30分钟，离心，去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到白色絮状黄泥螺粘液多糖复合物。将复合多糖溶于水后，分别经过离子纤维素柱和葡聚糖凝胶柱的分离，得到多糖吸收峰的收集液，合并收集液，并用双蒸水透析72小时；
g、干燥：将脱盐后的溶液再次冷冻干燥，得到纯净的黄泥螺粘液多糖粉末。整个提取过程的多糖得率为3％，经苯酚-硫酸法测定黄泥螺粘液多糖质量含量为90％。
实施例2
a、原料处理：将新鲜的活体黄泥螺在0℃海水中浸泡100小时，取浸泡液45～55℃真空干燥至原液体体积的1/5，40℃水浴加热5小时，过滤；
b、酶解与灭酶：调节浸泡液的pH值为3，添加质量比为12％的胃蛋白酶，酶解20小时，再调节pH值为9，添加质量比为0.1％的胰蛋白酶，再次酶解10小时；
c、离心：将酶解液于3500rpm下低速离心20分钟，然后于4℃，9000rpm高速冷冻离心12分钟，弃沉淀，取上清液；
d、脱蛋白：采用sevage法脱蛋白。在上清液中加入1/5体积的氯仿，然后再加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合，剧烈震荡20分钟，离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质即可，此操作需要反复进行5次，取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；
e、醇沉：在上述所得浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，作为沉降介质，进行沉降分离，然后于3500rpm下低速离心20分钟，于4℃，9000rpm高速冷冻离心12分钟，得到的离心沉降物即为黄泥螺粘液粗多糖，粗多糖得率为8.8％；
f、纯化：首先在黄泥螺粘液粗多糖中依次加入少量丙酮和乙醚，分别将粗多糖充分浸泡，清洗，过滤，取沉淀干燥后溶于3倍体积的水，再加入1/3体积的30％的双氧水，55℃水浴，脱色35分钟，离心，去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到白色絮状黄泥螺粘液多糖复合物。将复合多糖溶于水后，分别经过离子纤维素柱和葡聚糖凝胶柱的分离，得到多糖吸收峰的收集液，合并收集液，并用双蒸水透析72小时；
g、干燥：将脱盐后的溶液再次冷冻干燥，得到纯净的黄泥螺粘液多糖。多糖得率2.7％，经苯酚-硫酸法测定黄泥螺粘液多糖质量含量为88％。
实施例3
a、原料处理：将新鲜的黄泥螺在10℃海水中浸泡72小时，取浸泡液45～55℃真空干燥至原液体体积的1/5，45℃水浴加热4小时，过滤。
b、酶解与灭酶：调节浸泡液的pH值为4，添加质量比为15％的胃蛋白酶，酶解20小时，再调节pH值为8.5，添加质量比为0.5％的胰蛋白酶，再次酶解9小时。
c、离心：将酶解液于3200rpm下低速离心25分钟，然后于4℃，10000rpm高速冷冻离心10分钟，弃沉淀，取上清液；
d、脱蛋白：采用三氯醋酸法脱蛋白：将上述所得离心上清液用草酸调节pH至7，然后再加适量3％三氯醋酸，静置过夜，弃沉淀；取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；
e、醇沉：在上述所得浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，作为沉降介质，进行沉降分离，然后于3200rpm下低速离心25分钟，于4℃，10000rpm高速冷冻离心10分钟，得到的离心沉降物即为黄泥螺粘液粗多糖，粗多糖得率为7.4％；
f、纯化：首先在黄泥螺粘液粗多糖中依次加入原体积1/5的丙酮和乙醚混合液，其体积比为4∶1，分别将粗多糖充分浸泡，清洗，过滤，取沉淀干燥后溶于3倍体积的水，再加入1/3体积的30％的双氧水，55℃水浴，脱色45分钟、离心，去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到白色絮状黄泥螺粘液多糖复合物。将复合多糖溶于水后，分别经过离子纤维素柱和葡聚糖凝胶柱的分离，得到多糖吸收峰的收集液，合并收集液，并用双蒸水透析72小时；
g、干燥：将脱盐后的溶液再次冷冻干燥，得到纯净的黄泥螺粘液多糖。多糖得率1.2％，经苯酚-硫酸法测定黄泥螺粘液多糖质量含量为82％。
实施例4
a、原料处理：将新鲜的黄泥螺在4℃海水中浸泡72小时，取浸泡液45～55℃真空干燥至原液体体积的1/5，50℃水浴加热6小时，过滤；
b、酶解与灭酶：调节浸泡液的pH值为2.2，添加质量比为11％的胃蛋白酶，酶解22小时，再调节pH值为8.3，添加质量比为0.4％的胰蛋白酶，再次酶解8小时；
c、离心：将酶解液于4000rpm下低速离心15分钟，然后于4℃，10000rpm高速冷冻离心10分钟，弃沉淀，取上清液；
d、脱蛋白：采用三氯醋酸法脱蛋白：将上述所得离心上清液用草酸调节pH至7，然后再加适量3％三氯醋酸，静置过夜，弃沉淀；取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；
e、醇沉：在上述所得浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，作为沉降介质，进行沉降分离，然后于4000rpm下低速离心15分钟，于4℃，10000rpm高速冷冻离心10分钟，得到的离心沉降物即为黄泥螺粘液粗多糖，粗多糖得率为7.8％；
f、纯化：首先在黄泥螺粘液粗多糖中依次加入少量丙酮和乙醚，分别将粗多糖充分浸泡，清洗，过滤，取沉淀干燥后溶于3倍体积的水，再加入1/3体积的30％的双氧水，55℃水浴，脱色30分钟，离心，去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到白色絮状黄泥螺粘液多糖复合物。将复合多糖溶于水后，分别经过离子纤维素柱和葡聚糖凝胶柱的分离，得到多糖吸收峰的收集液，合并收集液，并用双蒸水透析72小时；
g、干燥：将脱盐后的溶液再次冷冻干燥，得到纯净的黄泥螺粘液多糖。多糖得率1.6％，经苯酚-硫酸法测定黄泥螺粘液多糖质量含量为86％。
Claims (10)
1、一种活体黄泥螺粘液多糖的制备方法，其特征在于，包括将活体黄泥螺在海水中浸泡一段时间，取其粘液浸泡液真空干燥并水浴加热使得蛋白质变性；随后依次用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解。
2、据权利要求1所述的方法，具体包括
a、原料处理：将活体黄泥螺在海水中浸泡72～100小时，取浸泡液在一定温度下真空干燥至原液体体积的1/5，45～60℃水浴加热4-6小时，过滤，得富含黄泥螺粘液的淡黄色澄清浸泡液；
b、酶解与灭酶：调节浸泡液的pH值，添加质量比为10％～15％w/w的胃蛋白酶，在酸性条件下进行酶解，再调节pH值，添加质量比为0.1％～0.8wt％的胰蛋白酶，在碱性条件下再次酶解，然后闪蒸灭酶。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于活体黄泥螺浸泡温度为0-10℃；浸泡液真空干燥的温度在45～55℃之间。
4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于使用胃蛋白酶环境的pH值为2～4，酶解时间为12～24小时；使用胰蛋白酶环境的pH值为8～10，酶解时间为8～12小时。
5、根据权利要求2所述的方法，还包括
c、离心：将酶解液低速离心15～30分钟，然后高速冷冻离心10～15分钟，弃沉淀，取上清液；
d、脱蛋白：采用sevage法脱蛋白，在上清液中加入1/5体积的氯仿，然后再加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合，剧烈震荡20分钟，离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质即可，此操作需要反复进行2～5次，取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；或采用三氯醋酸法脱蛋白：将上述所得离心上清液用草酸调节pH至中性，然后再加适量3％三氯醋酸，静置过夜，弃沉淀；取上清液，然后进行减压浓缩，得浓缩液；
e、醇沉：在上述所得浓缩液中加入3～5倍体积的无水乙醇，作为沉降介质，进行沉降分离，然后低速离心15～30分钟，高速冷冻离心10～15分钟，得到的离心沉降物即为黄泥螺粘液粗多糖，粗多糖得率为5％～9％；
f、纯化：首先在黄泥螺粘液粗多糖中依次加入少量丙酮和乙醚，将粗多糖充分浸泡，清洗，过滤，取沉淀干燥后溶于1～4倍体积的水，再加入1/3倍体积的30％的双氧水，30℃～60℃水浴，脱色30～50分钟，离心，去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到白色絮状黄泥螺粘液多糖复合物，将复合多糖溶于水后，分别经过离子纤维素柱和葡聚糖凝胶柱的分离，得到多糖吸收峰的收集液，合并收集液，并用双蒸水透析72小时；
g、干燥：将脱盐后的溶液再次冷冻干燥，得到纯净的黄泥螺粘液多糖。
6、据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤c、e中低速离心时离心转速为1000～4000rpm，高速冷冻离心时离心转速为8000～10000rpm，温度为0-4℃。
7、根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤f中离子纤维素柱的缓冲液为硼酸型，洗脱液为0.1mol/l～0.5mol/l的NaOH；葡聚糖凝胶柱的洗脱液为双蒸水。
8、根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤f、g中冷冻干燥的条件为：真空度为60～80Pa；板温为45℃～80℃。
9、一种由权利要求1～8任意一项所述的方法制得的黄泥螺粘液多糖，外观为白色粉末。
10、由权利要求1～8任意一项所述方法制得的黄泥螺粘液多糖应用于制备抑制肿瘤细胞生长以及黑色素增殖的药物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090408 |