CN106084086A - 田螺多糖提取液的脱蛋白方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种田螺多糖提取液的脱蛋白方法，采用冻融循环处理技术脱除田螺多糖提取液中的蛋白质杂质，首先对田螺多糖提取液进行冻融循环处理，然后对冻融循环处理的解冻液进行离心及水系滤膜过滤分离，得脱蛋白田螺多糖提取液。该脱蛋白方法采用冻融循环处理技术，整个脱蛋白过程不使用有机溶剂，不仅具有绿色无污染和多糖回收率高等优点，而且操作安全、方便，成本低。

Description

田螺多糖提取液的脱蛋白方法
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种田螺多糖提取液的脱蛋白方法。
背景技术
多糖因其在调节免疫、抗癌及抗病毒等方面的显著疗效而成为近年来的研究热点。然而，蛋白质的溶解性能与多糖极其相似，导致多糖提取液常伴随蛋白质杂质。蛋白质杂质的存在，将严重影响多糖的纯化分级、结构鉴定及药理活性，因此，蛋白质的有效脱除为多糖研究与开发过程中的热点和难点。
田螺多糖提取液来源于蛋白质丰富的中华圆田螺肉体。其多糖中蛋白质杂质含量高达37.5%，明显高于植物源多糖，因此，必须采用适当的方法将其蛋白充分脱除后才能进行进一步开发。然而，传统的Sevage法脱蛋白，需要消耗大量的氯仿和正丁醇，不仅污染环境，而且易引起毒性有机溶剂在多糖中残留，并严重威胁操作人员身体健康。因此，开发绿色脱蛋白方法是该多糖研究的重点和发展方向之一。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种田螺多糖提取液的脱蛋白方法，脱蛋白过程不使用有机溶剂，绿色无污染，多糖回收率高，操作安全、方便，成本低。
本发明的技术解决方案是：该田螺多糖提取液的脱蛋白方法，它包括步骤（1）田螺多糖提取液：粉碎中华圆田螺全脱脂干燥肉体，过60目筛，按中华圆田螺全脱脂干燥肉粉质量（g）与去离子水体积（mL）1:25的比例将中华圆田螺全脱脂干燥肉粉和去离子水加入回流装置中，于95℃ 提取2 h；提取液放置室温后，用离心机于3000 rpm离心30 min，分离上清液后的残渣按上述相同的提取方法重复提取2次，合并3次提取的上清液，充分混合后得田螺多糖提取液；其特征是：采用冻融循环处理技术脱除田螺多糖提取液中的蛋白质杂质，具体步骤如下：
（2）冻融：将步骤（1）的田螺多糖提取液置于-40~-60℃超低温冰箱内冷冻贮藏80~100h；达到冷冻贮藏时间后，冻结的田螺多糖提取液置于4~10℃恒温环境进行自然静态解冻；
（3）冻融循环：将步骤（2）的解冻液在与步骤（2）冻融过程相同的工艺参数下，重复冻融循环处理9~12次；
（4）沉淀分离：完成步骤（3）冻融循环处理的解冻液，用离心机于4000rpm离心45min，收集上清液；上清液0.45μm水系滤膜进行过滤分离，收集滤液，得脱蛋白田螺多糖提取液。
其中，在冻融及冻融循环处理过程中，盛装多糖提取液的容器为圆形聚乙烯塑料瓶，溶液盛装量为直径和高度比是1:5~1:9。
本发明的优点是：采用冻融循环处理技术，整个脱蛋白过程不使用有机溶剂，相对于多糖脱蛋白的传统Sevage法，不仅具有绿色无污染和多糖回收率高的优点，而且操作安全、方便，成本低，保护环境，利于工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例详述本发明的技术解决方案，但本发明的技术解决方案并不限于下面的实施例。
实施例1：依以下步骤对田螺多糖提取液进行脱蛋白处理
（1）田螺多糖提取液：粉碎中华圆田螺全脱脂干燥肉体，过60目筛；将10 g中华圆田螺全脱脂干燥肉粉置于回流装置装置中，加入25 mL去离子水，于95℃提取2 h；提取液放置室温后，用离心机于3000 rpm离心30 min；分离上清液后的残渣，按照相同的提取方法重复提取2次，合并3次提取的上清液，充分混合，得田螺多糖提取液；
（2）田螺多糖提取液的脱蛋白处理：将田螺多糖提取液装入圆形聚乙烯塑料瓶中，溶液盛装量为直径和高度比1:5；置于-40℃超低温冰箱内冷冻贮藏80 h；达到冷冻贮藏时间后，冻结的田螺多糖提取液置于4℃恒温环境进行自然静态解冻；解冻液在相同的工艺参数下，重复冻融循环处理9次；完成冻融循环处理的解冻液，用离心机于4000 rpm离心45 min，收集上清液；上清液0.45 μm水系滤膜进行过滤分离，收集滤液，得脱蛋白田螺多糖提取液。
该实施例1所得产品为试验组产品。与此同时，同批次的田螺多糖提取液，采用Sevage法处理，所得的脱蛋白田螺多糖提取液为对照组产品。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定田螺多糖提取液脱蛋白前后各自的多糖含量和蛋白质含量，计算并比较各方法的多糖保留率（R r %）、蛋白脱除率（D r %）及对蛋白选择性去除的系数（K c ）及有机溶剂的消耗量，结果见表1。
实施例2：依以下步骤对田螺多糖提取液进行脱蛋白处理
（1）田螺多糖提取液：田螺多糖提取液的制备同实施例1；
（2）田螺多糖提取液的脱蛋白处理：将田螺多糖提取液装入圆形聚乙烯塑料瓶中，溶液盛装量为直径和高度比1:9；置于-60℃超低温冰箱内冷冻贮藏100 h；达到冷冻贮藏时间后，冻结的田螺多糖提取液置于10℃恒温环境进行自然静态解冻；解冻液在相同的工艺参数下，重复冻融循环处理12次；完成冻融循环处理的解冻液，用离心机于4000 rpm离心45min，收集上清液；上清液0.45 μm水系滤膜进行过滤分离，收集滤液，得脱蛋白田螺多糖提取液。
该实施例2所得产品为试验组产品。与此同时，同批次的田螺多糖提取液，采用Sevage法处理，所得的脱蛋白田螺多糖提取液为对照组产品。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定田螺多糖提取液脱蛋白前后各自的多糖含量和蛋白质含量，计算并比较各方法的多糖保留率（R r %）、蛋白脱除率（D r %）及对蛋白选择性去除的系数（K c ）及有机溶剂的消耗量，结果见表1。
实施例3：依以下步骤对田螺多糖提取液进行脱蛋白处理
（1）田螺多糖提取液：田螺多糖提取液的制备同实施例1；
（2）田螺多糖提取液的脱蛋白处理：将田螺多糖提取液装入圆形聚乙烯塑料瓶中，溶液盛装量为直径和高度比为1:7；置于-50℃超低温冰箱内冷冻贮藏90 h；达到冷冻贮藏时间后，冻结的田螺多糖提取液置于7℃恒温环境进行自然静态解冻；解冻液在相同的工艺参数下，重复冻融循环处理10次；完成冻融循环处理的解冻液，用离心机于4000 rpm离心45min，收集上清液；上清液0.45 μm水系滤膜进行过滤分离，收集滤液，得脱蛋白田螺多糖提取液。
该实施例3所得产品为试验组产品。与此同时，同批次的田螺多糖提取液，采用Sevage法处理，所得的脱蛋白田螺多糖提取液为对照组产品。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定田螺多糖提取液脱蛋白前后各自的多糖含量和蛋白质含量，计算并比较各方法的多糖保留率（R r %）、蛋白脱除率（D r %）及对蛋白选择性去除的系数（K c ）及有机溶剂的消耗量，结果见表1。
实施例4：依以下步骤对田螺多糖提取液进行脱蛋白处理
（1）田螺多糖提取液：田螺多糖提取液的制备同实施例1；
（2）田螺多糖提取液的脱蛋白处理：将田螺多糖提取液装入圆形聚乙烯塑料瓶中，溶液盛装量为直径和高度比为1:6；置于-60℃超低温冰箱内冷冻贮藏80 h；达到冷冻贮藏时间后，冻结的田螺多糖提取液置于10℃恒温环境进行自然静态解冻；解冻液在相同的工艺参数下，重复冻融循环处理11次；完成冻融循环处理的解冻液，用离心机于4000 rpm离心45min，收集上清液；上清液0.45 μm水系滤膜进行过滤分离，收集滤液，得脱蛋白田螺多糖提取液。
该实施例4所得产品为试验组产品。与此同时，同批次的田螺多糖提取液，采用Sevage法处理，所得的脱蛋白田螺多糖提取液为对照组产品。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定田螺多糖提取液脱蛋白前后各自的多糖含量和蛋白质含量，计算并比较各方法的多糖保留率（R r %）、蛋白脱除率（D r %）及对蛋白选择性去除的系数（K c ）及有机溶剂的消耗量，结果见表1。
表1 本发明与Sevage法对田螺多糖提取液的脱蛋白效果对比
注：*表示相对于对照组，P ＜ 0.05。

Claims (2)

1.田螺多糖提取液的脱蛋白方法，它包括步骤（1）田螺多糖提取液：粉碎中华圆田螺全脱脂干燥肉体，过60目筛，按中华圆田螺全脱脂干燥肉粉质量（g）与去离子水体积（mL）1:25的比例将中华圆田螺全脱脂干燥肉粉和去离子水加入回流装置中，于95℃ 提取2 h；提取液放置室温后，用离心机于3000 rpm离心30 min，分离上清液后的残渣按上述相同的提取方法重复提取2次，合并3次提取的上清液，充分混合后得田螺多糖提取液；其特征是：采用冻融循环处理技术脱除田螺多糖提取液中的蛋白质杂质，具体步骤如下：
（2）冻融：将步骤（1）的田螺多糖提取液置于-40~-60℃超低温冰箱内冷冻贮藏80~100h；达到冷冻贮藏时间后，冻结的田螺多糖提取液置于4~10℃恒温环境进行自然静态解冻；
（3）冻融循环：将步骤（2）的解冻液在与步骤（2）冻融过程相同的工艺参数下，重复冻融循环处理9~12次；
（4）沉淀分离：完成步骤（3）冻融循环处理的解冻液，用离心机于4000rpm离心45min，收集上清液；上清液0.45μm水系滤膜进行过滤分离，收集滤液，得脱蛋白田螺多糖提取液。
2.根据权利要求1所述的田螺多糖提取液的脱蛋白方法，其特征在于：在冻融及冻融循环处理过程中，盛装多糖提取液的容器为圆形聚乙烯塑料瓶，溶液盛装量为直径和高度比是1:5~1:9。
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