CN108548804B

CN108548804B - 一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+的方法

Info

Publication number: CN108548804B
Application number: CN201810358113.7A
Authority: CN
Inventors: 曾晞; 廖贤; 方浚安; 许万里; 田雁; 牟兰
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN108548804A

Abstract

本发明公开一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+；本发明方法能实现对多目标离子的检测，本发明中的探针与Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺在细胞内分别形成探针‑Ca²⁺、探针‑Sr²⁺、探针‑Ba²⁺配合物，发射不同波长强烈荧光，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，能实现实时在线检测细胞内Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺。

Description

一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca2+、Sr2+和Ba2+ 的方法

技术领域

本发明涉及一种单通道荧光成像检测活细胞中微量离子的方法，特别是一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法。

背景技术

在细胞生物学和医学研究中，荧光探针因其高空间分辨能力和最小限度扰动活体的特征，能够允许研究者实时监测到发生于活细胞及生物活体中的事件，作为最强有力的工具之一，被越来越重视和使用。探针作为研究金属离子传输载体以及在药物传输系统中细胞膜的跨越行为尤为重要。荧光成像检测细胞内离子能够提供生命体系中离子的时空分布最直接的信息，由于它的无创性、高灵敏、高选择等特征，在生物体系中是追踪金属离子最可靠的技术之一。

钙、锶、钡均为周期表中IIA族碱土金属，是地壳中含量较多的元素，它们在生物学的功能中有着同样重要作用，参与各种生理功能和代谢过程，影响器官组织的活动。其中，钙是人体中含量最丰富且必须的营养元素，也是人体中最常见的一种矿物质离子。钙对身体中骨骼和对软组织发育过程中如骨盐沉积、血凝固、肌肉收缩、神经刺激管理和细胞生长及变异都及其重要。反常高或低的血浆水平中的钙被认为是高或低钙血症。钙信号的异常会导致神经退行性变，心脏病，骨骼肌缺陷以及中枢神经紊乱等。因此，检测细胞及血浆中微量钙是非常必要的。虽然，锶在生理学中的相关性不如Ca²⁺那样密切，但由于存在于某些合金、染料及铁氧磁体和荧光灯中等商业用途，特别是具有放射性的 Sr²⁺的高灵敏和快速及实时检测能够有助环境安全及决策。钡及其化合物用途甚广，常见钡盐有硫酸钡、碳酸钡、氯化钡硫化钡、硝酸钡、氧化钡等，除硫酸钡外，其他钡盐均有毒性，存在着钡中毒的可能。钡广泛用于颜料、玻璃及烟花制品等许多行业，为其进入环境提供了途径。Ba²⁺在生物系统中同样起着重要作用。人体中Ba²⁺水平增高会导致急性胃肠炎，肌肉麻痹，呼吸衰竭等。因此，对于钙、锶、钡离子的检测十分重要

作为细胞成像检测微量金属离子的探针已有很多报道，但大多是单探针对单一目标离子检测，存在检测不方便，选择性差，不能实现单一探针对细胞中多目标离子的高效检测等问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、 Sr²⁺和Ba²⁺的方法，本发明方法能实现对多目标离子的检测，本发明中的探针与 Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺在细胞内分别形成探针-Ca²⁺、探针-Sr²⁺、探针-Ba²⁺配合物，使探针原本的荧光猝灭，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，能实现实时在线检测细胞内Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺。

本发明的技术方案：一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺；所述的探针的化学结构式为：

前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，所述的以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr² ⁺和Ba²⁺，是用探针和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺分别对活细胞进行孵化，使探针和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺先后分别进入细胞内，在细胞内结合生成探针-Ca²⁺、Sr²⁺、 Ba²⁺配合物导致探针发出的荧光猝灭，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活细胞荧光像，具体方法为：

(1)活性Hela细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗RPMI 1640 的培养基中，在温度为37℃，5％CO₂及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔 2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次；所述的RPMI为英文Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所，RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号；

(2)将步骤(1)中清洗后的Hela细胞浸入含25μM探针的培养液中，培养液的组成为98％培养基和2％N,N-二甲基甲酰胺，置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱内孵育90min，吸出含探针的培养液，用新鲜的RPMI Medium Modified 培养基清洗细胞三次，置于荧光倒置显微镜下分别进行亮场和暗场拍照；荧光倒置显微镜的绿色通道下观察染色后细胞的荧光图像，绿色通道的激发波长为 450nm～490nm，细胞呈现的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像；

(3)在上述(2)中细胞孔板内再分别加入0.5mL含60μM Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培养液，培养液的组成为98％培养基和2％H₂O，在恒温培养箱内孵育40min，进行细胞内探针对Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色，吸出含Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培养液，用新鲜的RPMI Medium Modified培养基洗三次，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色后的荧光像，绿色通道的激发波长为 450nm～490nm，细胞的绿色荧光猝灭，表明探针能在活性Hale细胞中检测微量 Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子。

前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，所用活体Hale细胞是人体宫颈癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，所述的探针；是按下述合成路线合成的：

前述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，所述的探针；是按下述步骤进行制备：

①间体1的制备：

取对叔丁基苯酚，加入1000ml的三口圆底烧瓶中，然后按照对叔丁基苯酚：氢氧化钠：37％甲醛水溶液为0.67mol：33.75mmol：80ml的比例依次向对叔丁基苯酚中加入氢氧化钠以及37％甲醛水溶液，在氮气流下吹出90％以上的水，加热到110-120℃，机械搅拌1.5-2.5h后，停止反应，冷却至室温，按37％甲醛水溶液与二苯醚为80：500的体积比向其中倒入85℃的二苯醚，并继续搅拌，将烧瓶中的混合物加热回流，反应2.5-3.5h后，停止反应，冷却至室温，按二苯醚与乙酸乙酯为500：2000的体积比向烧瓶中加入乙酸乙酯，搅拌至白色沉淀析出，静置，抽滤，并依次用乙酸乙酯、乙酸和蒸馏水各洗涤1次，共洗涤3 次，干燥，即得白色粉末中间体1；

②中间体2的制备：

中间体1放入250ml圆底烧瓶中，按中间体1：甲苯：苯酚：无水AlCl₃为 30.87mmol：150ml：154.3mmol：185.2mmol的比例依次向圆底烧瓶中加入甲苯、苯酚和无水AlCl₃，氮气保护下室温搅拌，反应3.5-4.5h后，将反应液倒入1M 盐酸水溶液中，依次用盐酸溶液和水洗涤，分液，并蒸发掉溶剂，按甲苯与甲醇为1：1的体积比向所得固体中加入甲醇回流25-35min，冷却抽滤，得到中间体2；

③中间体3的制备：

乙腈加入三口烧瓶中，按乙腈：中间体2：K₂CO₃为150ml：11.8mmol：12.92mmol 的比例向装有乙腈的三口烧瓶中依次加入中间体2和K₂CO₃，搅拌加热回流 25-35min后，按乙腈：溴乙酸乙酯为150：6的体积比向烧瓶中加入溴乙酸乙酯，搅拌加热回流17-19h，反应混合物抽滤，滤液旋干，得到固体，用二氯甲烷溶解，用10％的盐酸洗两次，水洗涤两次，分液，有机层用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用氯仿溶解，再加入甲醇，重结晶得到无色固体中间体3；

④中间体4的制备：

在三口瓶中加入中间体3，按中间体3：干氯仿为1.23mmol：30ml的比例向三口瓶中加入干氯仿，室温搅拌下，按中间体3：Cl₂CH₂OCH₃：TiCl₄为1.23mmol： 25.42mmol：49.24mmol的比例依次加入Cl₂CH₂OCH₃和TiCl₄，室温氮气氛围中反应18-20h，反应毕，将溶液倒入装有冰的5％盐酸溶液烧杯中，残留在壁上的黑色固体用5％盐酸洗涤两次均倒入烧杯，搅拌，分层，分液，有机相用水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，固体经硅胶柱分离，洗脱液是体积比为2：1 的石油醚：乙酸乙酯，得无色固体中间体4；

⑤探针的制备

按中间体4：碘化氮甲基四甲基吡啶：甲醇：氯仿为1.56mmol：2.80mmol： 40ml：10ml的比例将中间体4、碘化氮甲基四甲基吡啶、甲醇、氯仿置于三口瓶中，氮气保护回流8-12min后，按甲醇与哌啶的体积比为40：0.3滴入哌啶回流2.5-3.5h，冷却室温，抽滤，固体分别用乙醚，甲醇，丙酮洗涤，得黄色固体，用丙酮重结晶，最后抽滤烘干得探针化合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)选择在N,N-二甲基甲酰胺/水混合介质中，以405nm为激发波长，探针选择性识别Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺，探针发射510nm绿色色荧光，探针-Ca²⁺、探针-Sr²⁺、探针-Ba²⁺荧光猝灭，据此利用探针实现细胞内Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺荧光成像；

(2)激发波长为405nm而发射波长为510nm，消除了激发波长对发射波长的影响；

(3)作为一种活细胞内微量Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的成像试剂，具有监测方便、可视性强、灵敏度高、选择性好受其他离子的干扰小，可实现实时在线检测。

(4)通过发明人合成的一种对Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺高灵敏、高选择性检测的荧光探针，探针先与细胞孵育，使探针渗透进入细胞内，再用孵育有探针的细胞分别对Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺进行孵育，使探针与Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺在细胞内形成配合物，在荧光倒置显微镜下进行荧光成像检测，在单个激发通道下能实现对活细胞中多种微量金属离子Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的成像检测。

因此，本发明方法中探针与Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的配合能力好，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，受其他离子的干扰小，且能实现实时在线检测。

附图说明：

图1是探针检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的荧光光谱；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别不加金属离子或加入200μM金属离子 Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg² ⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺， Ag⁺，Fe³⁺后的荧光光谱。Ca²⁺、Sr²⁺、Ba² ⁺的加入使探针在510nm处的荧光强度显著减弱。而其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的荧光光谱和强度，表明在此条件下探针选择性检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺。测试的激发波长为405nm；

图2是探针检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的紫外-可见吸收光谱；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别不加金属离子或加入200 μM金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Hg²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺， Co²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Ag²⁺，Cu²⁺后的紫外-可见吸收光谱。Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子的加入使探针在560nm、570nm、580nm处的吸光度显著增强，而其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的吸收光谱和强度。表明在此条件下探针选择性检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺；

图3是共存金属离子对探针检测Ca²⁺的荧光强度影响；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入200μM的金属离子 Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺， Ag⁺，Fe³⁺后，测定510nm处的荧光强度，Ca²⁺的加入能使探针的荧光强烈的下降。再分别向探针-Ca²⁺混合溶液中加入200μM的上述其他金属离子后，测定510mn 处的荧光强度的变化。白色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在510mn 处的荧光强度；黑色条表示在探针-Ca²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在510nm处的荧光强度的变化。表明探针检测Ca²⁺的荧光强度不受上述离子共存的影响。测试的激发波长为405nm，荧光发射波长为510nm。纵坐标为荧光强度值，横坐标为金属离子；

图4是共存金属离子对探针检测Sr²⁺的荧光强度影响；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入200μM的金属离子 Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺， Ag⁺，Fe³⁺后，测定510nm处的荧光强度，Sr²⁺的加入能使探针的荧光强烈的下降。再分别向探针-Sr²⁺混合溶液中加入200μM的上述其他金属离子后，测定510mn 处的荧光强度的变化。白色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在510mn 处的荧光强度；黑色条表示在探针-Sr²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在510nm处的荧光强度的变化。表明探针检测Sr²⁺的荧光强度不受上述离子共存的影响。测试的激发波长为405nm，荧光发射波长为510nm。纵坐标为荧光强度值，横坐标为金属离子；

图5是共存金属离子对探针检测Ba²⁺的荧光强度影响；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入200μM的金属离子 Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺， Fe³⁺后，测定510nm处的荧光强度，Sr²⁺的加入能使探针的荧光强烈的下降。再分别向探针-Ba²⁺混合溶液中加入200μM的上述其他金属离子后，测定510mn处的荧光强度的变化。白色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在510mn处的荧光强度；黑色条表示在探针--Ba²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在510nm处的荧光强度的变化。表明探针检测-Ba²⁺的荧光强度不受上述离子共存的影响。测试的激发波长为405nm，荧光发射波长为510nm。纵坐标为荧光强度值，横坐标为金属离子；

图6是共存金属离子对探针检测Ca²⁺的紫外-可见吸收影响；浓度为10μM 的探针在体体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入200μM的金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Fe³⁺后，测定560nm处的吸光度，Ca²⁺的加入能使探针产生强烈吸收。再分别向探针-Ca²⁺混合溶液中加入200μM的上述其他金属离子后，测定 560mn处的吸光度值的变化。白色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在 560mn处的吸光度；黑色条表示在探针-Ca²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在560nm处的吸光度值的变化。表明探针检测Ca²⁺的吸光度不受上述离子共存的影响。测试的最大吸收波长为560nm；纵坐标为吸光度值，横坐标为金属离子；

图7共存金属离子对探针检测Sr²⁺的紫外-可见吸收影响；浓度为10μM的探针在体体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入200μM的金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺， Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Fe³⁺后，测定570nm处的吸光度，Sr²⁺的加入能使探针产生强烈吸收。再分别向探针-Sr²⁺混合溶液中加入200μM的上述其他金属离子后，测定 570mn处的吸光度值的变化。白色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在 570mn处的吸光度；黑色条表示在探针-Sr²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在570nm处的吸光度值的变化。表明探针检测Sr²⁺的吸光度不受上述离子共存的影响。测试的最大吸收波长为570nm；纵坐标为吸光度值，横坐标为金属离子；

图8是共存金属离子对探针检测Ba²⁺的紫外-可见吸收影响；浓度为10μM 的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入200μM的金属离子Al³⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺，Co²⁺， Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Fe³⁺后，测定580nm处的吸光度，Ba²⁺的加入能使探针产生强烈吸收。再分别向探针-Ba²⁺混合溶液中加入200μM的上述其他金属离子后，测定 580mn处的吸光度值的变化。白色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在 580mn处的吸光度；黑色条表示在探针-Ba²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在580nm处的吸光度值的变化。表明探针检测Ba²⁺的吸光度不受上述离子共存的影响。测试的最大吸收波长为580nm。纵坐标为吸光度值，横坐标为金属离子；

图9是不同浓度的Ca²⁺与探针的荧光光谱滴定；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Ca²⁺到探针溶液中，测得的荧光光谱。探针在510nm处的荧光强度随Ca²⁺浓度增加而线性减弱；测试的激发波长为405nm。

图10不同浓度的Sr²⁺与探针的荧光光谱滴定；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Sr²⁺到探针溶液中，测得的荧光光谱。探针在510nm处的荧光强度随Sr²⁺浓度增加而线性减弱；测试的激发波长为405nm；

图11是不同浓度的Ba²⁺与探针的荧光光谱滴定；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Ba²⁺到探针溶液中，测得的荧光光谱。探针在510nm处的荧光强度随Ba²⁺浓度增加而线性减弱。测试的激发波长为405nm。

图12不同浓度的Ca²⁺与探针的紫外-可见吸收光谱滴定。浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Ca²⁺到探针溶液中，测得的紫外-可见吸收光谱。探针在560nm处吸光度随Ca²⁺浓度增加而线性增强，在在405nm处吸光度随Ca²⁺浓度增加而线性减弱。

图13是不同浓度的Sr²⁺与探针的紫外-可见吸收光谱滴定；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Sr²⁺到探针溶液中，测得的紫外-可见吸收光谱；探针在570nm处吸光度随Sr²⁺浓度增加而线性增强，在405nm处吸光度随Sr²⁺浓度增加而线性减弱；

图14是不同浓度的Ba²⁺与探针的紫外-可见吸收光谱滴定；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Ba²⁺到探针溶液中，测得的紫外-可见吸收光谱；探针在580nm处吸光度随Ba²⁺浓度增加而线性增强，在405nm处吸光度随Ba²⁺浓度增加而线性减弱；

图15是探针检测Ca²⁺的荧光强度校正曲线；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中分别加入不同浓度Ca²⁺，测定510nm波长处荧光强度值。纵坐标为荧光强度值，横坐标为Ca²⁺的浓度；激发波长为405nm；

图16是探针检测Sr²⁺的荧光强度校正曲线；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中分别加入不同浓度Sr²⁺，测定510nm波长处荧光强度值。纵坐标为荧光强度值，横坐标为Sr²⁺的浓度；激发波长为405nm；

图17是探针检测Ba²⁺的荧光强度校正曲线；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中分别加入不同浓度Ba²⁺，测定510nm波长处荧光强度值。纵坐标为荧光强度值，横坐标为Ba²⁺的浓度；激发波长为405nm；

图18是探针检测Ca²⁺的紫外-可见吸收光谱法校正曲线；浓度为10μM的探针体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Ca²⁺，测定 560nm处的吸光度；纵坐标为吸光度值，横坐标为Ca²⁺的浓度；

图19是探针检测Sr²⁺的紫外-可见吸收光谱法校正曲线；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Sr²⁺，测定560nm处的吸光度；纵坐标为吸光度值，横坐标为Sr²⁺的浓度；

图20是探针检测Ba²⁺的紫外-可见吸收光谱法校正曲线；浓度为10μM的探针在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，分别加入不同浓度Ba²⁺，测定560nm处的吸光度；纵坐标为吸光度值，横坐标为Ba²⁺的浓度；

图21是探针对活性Hela细胞中Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的荧光成像监测照片；a、 b、c经浓度为25μM的探针孵育90min后的Hela细胞的荧光倒置显微镜的明场照片，细胞贴壁正常，呈饱满状态，证明探针在该测试条件下对Hela细胞没有毒性；d、e、f为上述经探针孵育过的Hela细胞在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞图片，观测到清晰的绿色荧光分布于细胞；g、h、l为上述经25μM 的探针孵育90min的Hela细包，再分别用60μM的Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺孵育40min 后，在荧光倒置显微镜绿色通道下拍摄的细胞图片，观测到绿色荧光猝灭，证明探针与Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子在细胞内实现了染色；拍摄用的荧光倒置显微镜绿色通道的激发波长为450nm～490nm。

具体实施方式

实施例1：

1、探针的在制备：

探针的化学结构式为：

其合成路线如下：

具体制备方法为：

①间体1的制备：

取100克(0.67mol)的对叔丁基苯酚，加入1000ml的三口圆底烧瓶中，然后依次加入1.55g(33.75mmol)氢氧化钠以及80ml的37％甲醛水溶液，在氮气流下吹出90％以上的大部分水，加热到115℃(110-120℃)，机械搅拌2h后，停止反应，冷却至室温，向其中倒入500ml的85℃的二苯醚，并继续搅拌，将烧瓶中的混合物加热到回流温度，反应3h后，停止反应，冷却至室温，用2000ml 乙酸乙酯加入到烧瓶中，搅拌至白色沉淀析出，静置，抽滤，并依次用50ml 乙酸乙酯、50ml乙酸和50ml蒸馏水各洗涤1次，共洗涤3次，干燥得到白色粉末中间体1。结构表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ(ppm)：1.26(s,9H, CH₃),3.34(d,J＝10Hz,1H,ArCH₂),4.30(d,J＝10Hz,1H,ArCH₂),7.09(s,2H, ArH),10.39(s,2H,ArOH)。

②中间体2的制备：

将20g(30.87mmol)中间体1加入到含有150ml干甲苯的250ml圆底烧瓶中，然后加入14.51g(154.3mmol)苯酚以及24.63g(185.2mmol)无水AlCl₃，氮气保护下室温搅拌，反应4h后，将反应液倒入1M盐酸水溶液中，依次用盐酸溶液和水洗涤，分液，并蒸发掉溶剂，向所得固体加入150ml甲醇回流30min，冷却抽滤，得到中间体2。结构表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ(ppm)： 3.58(s,1H,ArCH₂),4.31(s,1H,ArCH₂),6.77(t,J＝7.5Hz,1H,ArH),7.10(d, J＝5Hz,2H,ArH),10.24(s,1H,ArOH)。

③中间体3的制备：

向装有150ml乙腈的三口烧瓶中依次加入5g(11.8mmol)中间体2，1.78g K₂CO₃(12.92mmol)，加热搅拌，回流0.5h后加入6ml溴乙酸乙酯(54.25mmol)，回流18h，反应混合物抽滤，滤液旋干，得到固体用100ml二氯甲烷溶解，用 10％的盐酸50ml洗两次，100ml水洗涤两次，分液，有机层用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用氯仿/甲醇重结晶得到无色固体中间体3。结构表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ(ppm)：1.41(t,J＝5Hz,3H,-CH₂CH₃),3.555(d,J＝5Hz, 2H,ArCH₂),4.415(q,J＝5Hz,2H,-CH₂CH₃),4.51(d,J＝10Hz,2H,ArCH₂),4.77(s,2H,-OCH₂-),6.86(t,J＝5Hz,1H,ArH),7.02(d,J＝10Hz,2H,ArH), 7.67(s,2H,ArH),8.74(s,1H,ArOH),9.82(s,1H,ArCHO)。

④中间体4的制备：

在100ml三口瓶中加入0.733g(1.23mmol)中间体3和30ml干氯仿，室温搅拌，快速加入2.3ml(25.42mmol)Cl₂CH₂OCH₃和5.4ml(49.24mmol)TiCl₄，室温氮气氛围中反应19h，反应毕，将溶液倒入装有20ml冰的5％盐酸溶液烧杯中，残留在壁上的黑色固体用5％盐酸洗涤两次均倒入烧杯，搅拌，分层，分液，有机相用30ml水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，固体经硅胶柱分离，洗脱液是体积比为2/1的石油醚/乙酸乙酯，得0.56g无色固体中间体4，产率 70％。结构表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ1.41(t,J＝7.5Hz,3H, -CH₂CH ₃),3.555(d,J＝15Hz,2H,ArCH ₂),4.415(q,J＝5Hz,2H,-CH ₂CH₃),4.51 (d,J＝10Hz,2H,ArCH2),4.77(s,2H,-OCH₂-),6.86(t,J＝7.5Hz,1H,J＝10Hz, 2H,ArH),7.67(s,2H,ArH),8.74(s,1H,ArOH),9.82(s,1H,ArCHO)。

⑤探针的制备：

取1g(1.56mmol)中间体4，0.66g(2.80mmol)碘化氮甲基四甲基吡啶， 40ml甲醇和10ml氯仿于100ml的三口瓶中，氮气保护回流10min后滴入0.3ml 哌啶回流3h，冷却室温，抽滤，固体分别用乙醚，甲醇，丙酮洗涤，得黄色固体，用丙酮重结晶，最后抽滤烘干得探针化合物1.18g，产率71％。结构表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ(ppm)：3.49(d,J＝20Hz,2H,ArCH₂),4.17 (s,3H,CH₃),4.335(d,J＝15Hz,2H,ArCH₂),4.82(s,2H,-OCH₂CO-),7.03(t,J＝10Hz,1H,ArH),7.28(d,J＝20Hz,2H,ArH),7.60(s,2H,ArH),7.75 (s,1H,-OH),7.80(d,J＝20Hz,1H,-CH＝CH-),8.05(d,J＝5Hz,2H,ArH), 8.36(s,1H,ArOH),8.73(d,J＝10Hz,2H,ArH).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ (ppm)：47.19,52.65,56.55,72.78,100.00,120.38,123.24,127.03, 129.03,129.87,133.52,141.64,145.33,152.81,153.47,155.87,169.89. IR(KBr)υ_max：υ＝1590cm^-1(-C＝C-),υ＝1748cm^-1(-C＝O),υ＝3410cm^-1(-COOH). MS-FAB；m/z：1029.631[M-H]⁺.Anal.Calcd for C₅₀H₄₈I₂N₂O₈。

实施例2.试剂的配制：

(1)探针溶液的配制：称取10.3mg的探针(按上述方法制备)，用N,N- 二甲基甲酰胺溶解，配制成浓度为1mM的溶液10mL。

(2)Ca²⁺离子储备液配制：称量高氯酸钙0.3110g，用超纯水溶解，分别配制成浓度为20mM的溶液50mL，再用超纯水稀释到所需浓度。

(3)Sr²⁺离子储备液配制：称量高氯酸锶0.3946g，用超纯水溶解，分别配制成浓度为20mM的溶液50mL，再用超纯水稀释到所需浓度。

(4)Ba²⁺离子储备液配制：称量高氯酸钡0.3903g，用超纯水溶解，分别配制成浓度为20mM的溶液50mL，再用超纯水稀释到所需浓度。

(5)75％的乙醇溶液：无水乙醇75mL加蒸馏水至100mL，混匀，室温保存备用。

(6)磷酸盐缓冲溶液(D-hanks平衡盐溶液)：0.4g KCl、0.06g KH₂PO₄、8.0g NaCl、1.0g葡萄糖、0.35g NaHCO₃、0.152g Na₂HPO₄·12H₂O、10万IU双抗，调整pH为7.2～7.4，去离子水定容至1000mL，针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装备用。

(7)1万单位(IU)/mL双抗溶液：将青霉素钠(80万单位)溶于40mL D-hanks 溶液中，配成终浓度2万单位/mL；将硫酸链霉素(160万单位)溶于80mL D-hanks 溶液中，配成终浓度2万单位/mL。分别取等体积的青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液混合，得到青霉素钠和硫酸链霉素的终浓度均为1万单位/mL的溶液；针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

(8)0.25％胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶，溶解于100mL的D-hanks液中，针式滤器(0.22um进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

(9)0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)：将0.02g EDTA，溶解于100mL的D-hanks 液中，针式滤器(0.22μm进口微孔滤膜)过滤除菌，分装1mL/支，-20℃保存备用。

(10)培养液：用无菌移液管量取10mL已灭活的胎牛血清、90mL培养基(改良型RPMI-1640)以及1mL双抗液混合于100mL的无菌培养瓶中，2～8℃保存备用。

本发明所用荧光分光光度计型号为Cary Eclipse荧光分光光度计，美国 VARIAN公司生产；紫外-可见分光光度计型号为UV-1800，日本岛津公司公司生产；ThermoFisher8000储水型CO₂细胞培养箱；IX-71型荧光倒置相差显微镜，日本Olympus公司；AR1530/C电子天平；25cm²细胞培养瓶，美国Corning公司立式压力蒸汽灭菌器(LS-B75)；DHG-9230A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

实施例3：荧光光谱法检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺

在10mL容量瓶中加入探针(1mM，100μL)，用N,N-二甲基甲酰胺/水稀释，使探针溶液的组成为体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，摇匀。在 1cm的比色皿中加入约3ml，以405nm为荧光激发波长，进行荧光光谱测定。

在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，浓度为10μM的探针溶液在510nm波长处有荧光发射。分别加入200μM的金属离子Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺， Ca²⁺，Ba²⁺，Hg²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Ag²⁺，Cu²⁺时，没有观察到荧光光谱明显的变化，只有加入200μM的Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺使探针在510nm 处的荧光峰显著降低(见图1)。

在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，对浓度为10μM探针溶液分别用不同浓度的Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子，进行荧光光谱滴定(见图9、10、11)。分别测定Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺浓度变化时探针在510nm处的荧光强度，获得荧光校正曲线(见图15、16、17)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的浓度线性范围和检出限列于表 1。

探针检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺在510nm处的荧光强度在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Ca²⁺、探针-Sr²⁺、探针-Ba²⁺混合溶液中，当浓度与Ca²⁺、 Sr²⁺、Ba²⁺相同时，共存金属离子对探针检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的荧光强度的不干扰 (见图1)。

表1探针荧光法检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的分析参数

实施例4：紫外-可见吸收光谱检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺

在10mL容量瓶中加入探针(1mM，100μL)，用体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液稀释，使探针溶液的组成为N,N-二甲基甲酰胺/水的体积比是 9/1，摇匀，在1cm的比色皿中加入约3ml，进行紫外-可见吸收光谱测定。

在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水溶液中，浓度为10μM的探针，分别加入200μM的金属离子Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Hg²⁺，Al³⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Co²⁺， Pb²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Ag²⁺，Cu²⁺时，没有观察到紫外吸收光谱明显的变化，只有Ca²⁺、 Sr²⁺、Ba²⁺的加入分别使探针在560nm、570nm、580nm处的吸光度显著增强(见图2)。

在体积比为9/1的N,N-二甲基甲酰胺/水中，对10μM探针溶液分别用不同浓度的Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子进行吸收光谱滴定(见图12、13、14)。测定Ca²⁺浓度变化时探针在560nm处的吸光度的变化，获得吸光度校正曲线(见图18)。测定Sr²⁺浓度变化时探针在570nm处的吸光度的变化，获得吸光度校正曲线(见图19)。测定Ba²⁺浓度变化时探针在580nm处的吸光度的变化(见图20)。获得吸光度校正曲线由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针紫外-可见吸收法检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的浓度线性范围和检出限分别列于表2。

探针检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺在560nm、570nm、580nm处的吸光度在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Ca²⁺混合溶液中、探针-Sr²⁺混合溶液中、探针-Ba²⁺混合溶液中，当浓度与Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺相同时，共存金属离子对探针检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的吸光度不干扰(见图6、7、8)。

表2探针紫外-可见吸收法检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺的分析参数

实施例5.活体Hale细胞的荧光显微成像：

(1)复苏细胞：

从-80℃冰箱内取出Hale细胞，置于37℃的水中快速晃动细胞冻存管，于1-2分钟内完全解冻，在无菌操作台内，将其吸入离心管内，加11ml培养基 (含10％胎牛血清，1％双抗RPMI 1640液)混均，并将此细胞悬液于1000r/min 离心机上离心5min，去除上层清液，将底部沉淀的细胞加培养基轻吹打散混均转移到培养瓶内，使培养瓶中培养液体积在5-7mL内，并置入37℃，含5％CO₂的培养箱内进行培养。

(2)观察→传代→接板

每日更换一次培养基，并在显微镜下观察细胞生长情况，直至Hale细胞贴壁长满于整个培养瓶壁上，即可传代，在无菌操作台内倒掉旧培养基，加入1mL 的EDTA液侵入细胞30s后倒掉，再加入1mL的胰蛋白酶液进行消化，在显微镜下观察直至细胞缩小变圆后，拍打培养瓶使细胞脱落并立即加入培养基阻止消化，将它一分为二培养于2个培养瓶中，待传代后的细胞贴壁铺满于整个培养瓶壁上时，与传代操作相同，加入EDTA和胰蛋白酶后使细胞消化脱落并立即加入3mL的培养液阻止消化，准备接种于12孔板内。在每个孔板内加入200μL的已阻止消化的细胞液，再加3mL新的培养基混匀后将孔板置入37℃，含5％CO₂的培养箱内进行培养。

(3)细胞染色

次日观察孔板内的细胞生长状况，待细胞贴壁生成，弃去旧培养基，用新配的培养基洗涤3次，备用。

将Hale细胞浸入含25μM探针的培养液中(98％培养基,2％N,N-二甲基甲酰胺，v/v)，置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱内孵育90分钟后，用新鲜的RPMI Medium Modified培养基清洗孔板内的细胞三次后，置于荧光倒置显微镜下进行明场成像拍照(图21-a、21-b、21-c)和绿色通道(激发波长450nm～490nm) (图21-d、21-e、21-f)，细胞有绿色荧光。

再往孔板内再加入0.5mL含60μM的Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培养液(98％培养基,2％H₂O，v/v)，在恒温培养箱内孵育40分钟后用新鲜的RPMI Medium Modified培养基洗三次，置于荧光倒置显微镜绿色(450nm～490nm)通道下观察，细胞的绿色荧光消失(图21-g、21-h、21-l)。表明探针具有良好细胞膜通透性，可以在活性Hale细胞中响应检测Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子。

Claims

1.一种单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：是以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺；所述的探针的化学结构式为：

2.如权利要求1所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的以经典杯[4]芳烃衍生物作为探针，通过单通道荧光成像分别检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺，是用探针和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺分别对活细胞进行孵化，使探针和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺先后分别进入细胞内，在细胞内结合生成探针-Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺配合物导致探针发出的荧光猝灭，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活细胞荧光像，具体方法为：

(1)活性Hela细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗RPMI 1640的培养基中，在温度为37℃，5％CO₂及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次；

(2)将步骤(1)中清洗后的Hela细胞浸入含25μM探针的培养液中，培养液的组成为98％培养基和2％N,N-二甲基甲酰胺，置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱内孵育90min，吸出含探针的培养液，用新鲜的RPMI Medium Modified培养基清洗细胞三次，置于荧光倒置显微镜下分别进行亮场和暗场拍照；荧光倒置显微镜的绿色通道下观察染色后细胞的荧光图像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞呈现的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像；

(3)在上述(2)中细胞孔板内再分别加入0.5mL含60μM Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培养液，培养液的组成为98％培养基和2％H₂O，在恒温培养箱内孵育40min，进行细胞内探针对Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色，吸出含Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培养液，用新鲜的RPMI Medium Modified培养基洗三次，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色后的荧光像，绿色通道的激发波长为450nm～490nm，细胞的绿色荧光猝灭，表明探针能在活性Hale细胞中检测微量Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺离子。

3.如权利要求2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所用活体Hale细胞是人体宫颈癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

4.如权利要求1或2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的探针，是按下述合成路线合成的：

5.如权利要求1或2所述的单通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的探针，是按下述步骤进行制备：

①中间体1的制备：

取对叔丁基苯酚，加入1000ml的三口圆底烧瓶中，然后按照对叔丁基苯酚：氢氧化钠：37％甲醛水溶液为0.67mol：33.75mmol：80ml的比例依次向对叔丁基苯酚中加入氢氧化钠以及37％甲醛水溶液，在氮气流下吹出90％以上的水，加热到110-120℃，机械搅拌1.5-2.5h后，停止反应，冷却至室温，按37％甲醛水溶液与二苯醚为80：500的体积比向其中倒入85℃的二苯醚，并继续搅拌，将烧瓶中的混合物加热回流，反应2.5-3.5h后，停止反应，冷却至室温，按二苯醚与乙酸乙酯为500：2000的体积比向烧瓶中加入乙酸乙酯，搅拌至白色沉淀析出，静置，抽滤，并依次用乙酸乙酯、乙酸和蒸馏水各洗涤1次，共洗涤3次，干燥，即得白色粉末中间体1；

②中间体2的制备：

中间体1放入250ml圆底烧瓶中，按中间体1：甲苯：苯酚：无水AlCl₃为30.87mmol：150ml：154.3mmol：185.2mmol的比例依次向圆底烧瓶中加入甲苯、苯酚和无水AlCl₃，氮气保护下室温搅拌，反应3.5-4.5h后，将反应液倒入1M盐酸水溶液中，依次用盐酸溶液和水洗涤，分液，并蒸发掉溶剂，按甲苯与甲醇为1：1的体积比向所得固体中加入甲醇回流25-35min，冷却抽滤，得到中间体2；

③中间体3的制备：

乙腈加入三口烧瓶中，按乙腈：中间体2：K₂CO₃为150ml：11.8mmol：12.92mmol的比例向装有乙腈的三口烧瓶中依次加入中间体2和K₂CO₃，搅拌加热回流25-35min后，按乙腈：溴乙酸乙酯为150：6的体积比向烧瓶中加入溴乙酸乙酯，搅拌加热回流17-19h，反应混合物抽滤，滤液旋干，得到固体，用二氯甲烷溶解，用10％的盐酸洗两次，水洗涤两次，分液，有机层用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后，用氯仿溶解，再加入甲醇，重结晶得到无色固体中间体3；

④中间体4的制备：

在三口瓶中加入中间体3，按中间体3：干氯仿为1.23mmol：30ml的比例向三口瓶中加入干氯仿，室温搅拌下，按中间体3：Cl₂CH₂OCH₃：TiCl₄为1.23mmol：25.42mmol：49.24mmol的比例依次加入Cl₂CH₂OCH₃和TiCl₄，室温氮气氛围中反应18-20h，反应毕，将溶液倒入装有冰的5％盐酸溶液烧杯中，残留在壁上的黑色固体用5％盐酸洗涤两次均倒入烧杯，搅拌，分层，分液，有机相用水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，固体经硅胶柱分离，洗脱液是体积比为2：1的石油醚：乙酸乙酯，得无色固体中间体4；

⑤探针的制备

按中间体4：碘化氮甲基四甲基吡啶：甲醇：氯仿为1.56mmol：2.80mmol：40ml：10ml的比例将中间体4、碘化氮甲基四甲基吡啶、甲醇和氯仿置于三口瓶中，氮气保护回流8-12min后，按甲醇与哌啶的体积比为40：0.3滴入哌啶回流2.5-3.5h，冷却室温，抽滤，固体分别用乙醚，甲醇，丙酮洗涤，得黄色固体，用丙酮重结晶，最后抽滤烘干得探针化合物。