CN110157413B - 一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针，合成路线如下：以4，4’‑二甲氧基二苯甲酮为起始原料，通过麦克默里耦合反应合成1，1，2，2‑四(4‑甲氧基苯基)乙烯；获得物质由甲氧基经BBr3处理后的羟基转化而成；通过1，1，2，2‑四(4‑羟基苯基)乙烯和氯乙酸乙酯之间亲核取代进一步引入四种羧酸酯，得到2,2'，2”，2”‑((乙烷‑1,1,2,2‑四(苯‑4,1‑二基))四(氧)乙酸四乙酯，继而用氢氧化钠水解得到探针TPE‑4CO2Na；将本发明制备的探针在拟南芥根细胞铝离子活体细胞成像方面的应用；该发明能够定性定量区分测定铝离子和铅离子，水溶性好，并且在生物细胞内具有良好的成像性能。

Description

一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子探针技术领域，特别是涉及一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
随着工业化程度的加剧，一些在不同的生物过程中起着不可或缺的作用的金属离子暴露重金属和有毒的金属离子中的程度也越来越高，因此对金属离子的高选择性的精确测定也成为化学家们面临的巨大挑战。铝作为地壳中第三丰富的元素，随着酸雨的增加，不断地进入生态圈和生物圈。现有证据表明，铝离子的摄入对包括植物和人类在内的有机体造成了严重的毒性。此外，铅离子是另一种在环境中广泛存在的重要污染物，其对有机物有高度的毒性。这些有毒金属离子的定量测定和成像通常需要依赖于荧光指示剂的精确和特定的光学方法。尽管已经开发出了针对Al3+和Pb2+的荧光探针，但大多数都是基于传统染料的聚集诱导猝灭(ACQ)特性。这些ACQ荧光团在长期的激发光照射下，由于聚集和显著的光漂白，常常会出现亮度的明显下降。
聚集诱导发光(AIE)自发现以来就在传感和成像领域表现出了广阔的应用前景。和聚集诱导猝灭发光团相比,聚集诱导发光荧光团在溶解状态时发光微弱，但在聚集或固体状态表现出强烈的荧光。聚集诱导发光发光团这种独特的性质可以被用来构建新的基于聚集诱导发光检测策略。与现有的聚集诱导猝灭探针相比，这些AIE活性探针在长程成像方面展现出了优异的光稳定性。目前，基于配位触发聚集过程，发展了用于Ag+、Hg2+、Zn2+和Ca2 +等金属离子检测的AIE活性探针，但目前用于检测Al3+的AIE分子探针仅报道了两种。其中一个由一个羧基和一个四苯基乙烯单元组成，另一个由一个供体-受体-供体单元和两个羟基组成，它们都对Al3+有特异性反应。然而，由于探针在水中的溶解性较差，对Al3+进行定量和成像需要同时加入二甲基亚砜。AIE探针在水溶液中的溶解度很低，在成像过程中可能会在活体细胞内产生自沉淀的假信号，这将极大地影响生物系统中跟踪Al3+的灵敏度和准确性。
申请号2018101055194发明专利申请文件中公开了一种铝离子和锌离子双通道荧光素类荧光探针及其制备方法和应用中开了一种具有对铝离子和锌离子都具有选择性的荧光探针，但是同时对铝离子和铅离子都具有良好选择性和定性定量分析功能的分子探针尚且没有。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针，该发明能够定性定量区分测定铝离子和铅离子，水溶性好。
为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针，化学名称为：2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸钠。
本发明的第二个目的在于提供一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针的制备方法，该发明产率高，获得分子探针选择性好，灵敏。
为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯；
将锌粉和TiCl4混合于干燥THF中，在氮气气氛下回流获得悬浮液；
将存于干燥THF中的4,4-二羟基二苯甲酮添加到上述悬浮液中；
保持80℃回流12h；
将反应混合物冷却至室温后，向反应混合物中添加K2CO3的水溶液；
用乙酸乙酯萃取所得1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯。
步骤二、合成1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯；
在-20℃下，在含有1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯的干燥DCM溶液中添加一定量的BBr3获得混合物；
室温下将混合物搅拌，在真空下浓缩；
将浓缩后的混合物倒入100毫升水中，加入乙醇搅拌，生成大量白色沉淀；将制得的白色沉淀经过滤干燥后得到1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯；
步骤三、合成2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯；
将1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯、Cs2CO3和氯乙酸乙酯加入DMF中，80℃搅拌48h获得混合物；
将混合物倒入水中后生成白色沉淀；经洗涤干燥后得到2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯；
步骤四、合成分子探针2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸钠；
将2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯与NaOH置于甲醇中反应生成白色沉淀，过滤干燥后收集白色沉淀即为分子探针。
优选步骤一制得的1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯使用正己烷乙酯经硅胶柱纯化，其中乙酸乙酯作为洗脱剂，提高1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯的纯度。
优选步骤一中1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯收率为70％，利于获得提高分子探针的产率。
优选步骤二中1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯的收率为97％，利于获得提高分子探针的产率。
优选步骤三中2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯的收率为90％，利于获得提高分子探针的产率。
优选步骤四中2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸钠(以下简称为TPE-4CO2Na)产率为95％，利于获得提高分子探针的产率。
本发明的第三个目的在于提供一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针用于在拟南芥根细胞铝离子活体细胞成像方面的应用，该发明具有良好体内成像性能。
为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种所述的分子探针在拟南芥根细胞铝离子活体细胞成像方面的应用，包括以下步骤：
将拟南芥根苗置于检测溶液中连续培养一段时间；其中检测溶液中包含有2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸钠和一定浓度的铝离子；
将经过检测溶液培养的拟南芥根苗使用激光扫描共聚焦显微镜图像显示拟南芥幼苗根系细胞被标记为绿色进行成像。
优选所述检测溶液中2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸钠以2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸的形式存在。
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果是：
一、本发明设计合成了一种新型具有AIE特性的高水溶性分子探针，该探针能够基于离子引发的聚集诱导发射来鉴别铝离子和铅离子；分子探针由四苯基乙烯单元和四个羧酸基组成，在四苯乙烯单元中引入四个羧酸基团，不仅能够提高配位亲和力，而且有利于增加探针的水溶性，避免了水溶液中的自沉淀。
二、本发明将在制备过程中将四个羧酸基加入四苯乙烯单元形成分子探针，引入这些羧酸基团不仅使探针在水中具有良好的溶解性，而且为目标金属离子提供了识别单元，通过金属离子与羧酸基团的配位反应，TPE-4CO2Na探针可以被Al3+和Pb2+有效地聚集。四个羧酸基对铝离子和铅离子具有很高的结合亲和力，探针可以通过配位触发AIE过程，被铝离子和铅离子选择性点亮，对铝离子和铅离子有特定的荧光开启响应，在合适的掩蔽试剂的辅助下，探针TPE-4CO2Na可以以荧光信号开启的方式实现对Al3+或Pb2+的区分和定量测定。
三、使用本发明中的TPE-4CO2Na作为探针对拟南芥幼苗细胞铝离子进行成像，避免了铅离子的干扰，具有良好的光稳定性，适合长期成像。
四、本发明探针应用于拟南芥幼苗细胞铝离子进行成像结果表明，探针的酸性形式具有细胞渗透性，能够选择性地成像活细胞中的铝离子，由探针和铝离子组成的荧光聚集体具有良好的光稳定性，本发明中的探针适用于离子的长期成像，且不存在明显的光漂白现象。因此本发明中的探针具有良好的体内成像性能。
五、本发明拓展了AIE活性探针在金属离子鉴别检测中的应用范围
从而实现本发明的上述目的。
附图说明
图1、TPE-4CO2Na水溶液及粉末的PL光谱；其中插图为TPE-4-CO2Na粉末在紫外光下的发光照片。
图2、(A)TPE-4CO2Na水溶液在不同量THF存在下的PL光谱；其中插图为对应的荧光图像；(B)TPE-4CO2Na水溶液在1.0到5.0的不同pH值下的PL光谱；其中插图为TPE-4CO2Na水溶液在1.0到5.0的不同pH值对应的荧光图像。
图3、(A)TPE-4CO2Na(20.0μM)的HEPES溶液在不同金属离子(500.0μM)存在下的PL光谱；其中插图为对应的荧光图像；(B)金属离子的I/I0增强比；(C)Al3+(500.0μM)存在下TPE-4-CO2Na(20.0μM)的扫描电镜图像；(D)在Pb2+(500.0μM)存在下TPE-4CO2Na(20.0μM)的扫描电镜图像。
图4、(A)不同组分存在下的探针TPE-4CO2Na的PL光谱：(a)探针(20.0μM)；(b)探针(20.0μM)和GSH(100.0μM)；(c)探针(20.0μM),GSH(100.0μM)和Pb2+(100.0μM)；(d)探针(20.0μM),GSH(100.0μM),Pb2+(100.0μM)和Al3+(100.0μM).(B)不同组分存在下的探针TPE-4CO2Na的PL光谱：(a)探针(20.0μM)；(b)探针(20.0μM)和NaBF4(100.0μM)；(c)探针(20.0μM),NaBF4(100.0μM)和Al3+(100.0μM)；(d)探针(20.0μM),NaBF4(100.0μM),Al3+(100.0μM)和Pb2+(100.0μM)；(C)随Al3+浓度从0.0到650.0μm的PL光谱图；(D)随Pb2+浓度从0.0到500.0μm的PL光谱图。
图5、不同条件下拟南芥幼苗根系激光扫描共聚焦显微镜图像：(a，d)模拟对照；(b，e)用TPE-4CO2H(0.5mM)孵育30s；(c)用TPE-4CO2H(0.5mM)和Al3+(0.5mM)孵育30s；(f)用TPE-4CO2H(0.5mM)和Pb2+(0.5mM)孵育30s。
图6、在不同时间长度的辐射下的拟南芥幼苗根系的激光扫描共聚焦显微镜图像，其中(a，d)1分钟，(b，e)3分钟，(c，f)5分钟。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
本发明公开一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针及其制备方法和应用。
本实施例公开首先公开分子探针TPE-4CO2Na的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯；
合成方法如下：
将锌粉(1.84g，28mmol)和TiCl4(1.58ml，14mmol)在50ml干燥THF中，在氮气气氛下回流2h。将存于干THF(20ml)中的4,4-二羟基二苯甲酮(1.50g，7.0mmol)溶液添加到上述悬浮液中，然后在80℃回流12h。将反应混合物冷却至室温后，添加含有10％K2CO3(50mL)的水溶液。用乙酸乙酯萃取所得产物。溶剂在真空下蒸发，粗产物用正己烷乙酯经硅胶柱纯化：乙酸乙酯(1:1，V/V)作为洗脱剂。1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯的收率为70％(1.01g)。
步骤二、合成1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯；
在-20℃下，首先在含有1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯(2.00g，4.42mmol)的50ml干燥DCM溶液中添加一定量的BBr3(4mL,44.2mmol)。在室温下将混合物搅拌40h，然后在真空下浓缩。将混合物倒入100毫升水中，加入3毫升乙醇搅拌5分钟，然后生成大量白色沉淀。经过滤干燥后得到最终产物，收率为97％(1.7g)。
步骤三、合成2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯；
将合成1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯(1.5g，3.78mmol)、Cs2CO3(8.631g,26.49mmol)和氯乙酸乙酯(3.142ml，26.49mmol)加入80ml DMF中，80℃搅拌48h。将混合物倒入水中后生成白色沉淀。经洗涤干燥后得到最终产物合成1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯，收率为90％(2.57g)。
步骤四、合成TPE-4CO2Na；
TPE-4CO2Na是由2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯(1.3g，1.75mmol)与NaOH(0.28g，7mmol)在40ml甲醇中反应合成的。过滤干燥后收集白色沉淀即为TPE-4CO2Na，产物的产率为95％。
TPE-4CO2Na探针的合成路线为：
以4，4’-二甲氧基二苯甲酮为起始原料，通过麦克默里耦合反应合成1，1，2，2-四(4-甲氧基苯基)乙烯；
1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯由甲氧基经BBr3处理后的羟基转化而成；
通过1，1，2，2-四(4-羟基苯基)乙烯和氯乙酸乙酯之间亲核取代进一步引入四种羧酸酯，得到2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯；
用氢氧化钠水解2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸四乙酯得到探针TPE-4CO2Na。
所有中间体和最终产物均得到较高的产率，完全纯化并使用1H NMR、1C NMR和质量光谱测定法(MS)表征。
以四苯基乙烯为典型的AIE荧光团作为信号单元，以羧酸基团作为探针的识别单元。将四个羧酸基团引入探针中，提高探针在水中的溶解度。
如图1所示，探针TPE-4CO2Na在水中溶解性好，但在THF等常见有机溶剂中几乎不溶解。TPE-4CO2Na水溶液只有很弱的蓝色荧光，肉眼难以观察到。其荧光光谱表明在最佳激发波长264nm的激发下，其最大发射波长为400nm。根据时间分辨PL衰减曲线，确定其寿命为0.7ns。与溶解态相比，TPE-4CO2Na固体粉末在紫外光下发出强烈的绿光。结果表明，相对于溶解态，TPE-4CO2Na粉末的发射出现了明显的红移。根据时间分辨PL衰减曲线，468nm处的寿命延长至2.1ns。测定得到的TPE-4CO2Na粉末的量子产率为0.25。固态发光效率远高于溶解态，说明TPE-4CO2Na具有显著的AIE行为。这种AIE性质由不良的溶剂和水溶液中的pH变化引起的聚集过程从图2可知，TPE-4CO2Na具有明显的AIE行为，并具有良好的水溶性，避免了水溶液自沉淀的虚假信号。
实施例2
本实施例使用实施例1制得的探针TPE-4CO2Na对铝离子和铅离子鉴别检测：为了定量检测Al3+，首先在缓冲HEPES buffer(pH7.0)配制得到固定浓度(20.0μM)的TPE-4CO2Na溶液，然后将0.0–650.0μM范围内不同量的Al3+分别加入到上述的TPE-4CO2Na溶液中。使用氙弧灯在355nm激发下记录所得混合物的PL光谱。将Pb2+代替Al3+，用同样的方法进行Pb2+的定量检测，Pb2+的用量在0.0–500.0μM范围内，如图4(C)和(D)所示。
对Al3+和Pb2+的选择性试验如下；
在HEPES缓冲液中的TPE-4CO2Na溶液(20.0μM)中分别加入定量的不同种类的金属阳离子(100.0μM)，包括K+,Mg2+,Ca2+,Ba2+,Al3+,Pb2+,Cd2+,Co2+,Fe2+,Ag+,Zn2+,Hg2+,Cu2+,Mn2 +,Cr3+和Fe3+，然后用荧光光谱仪在480nm发射下监测得到的溶液。如图3(A)和(B)所示，首先TPE-4CO2Na探针对16种常见金属离子包括K+,Mg2+,Ca2+,Ba2+,Al3+,Pb2+,Cd2+,Co2+,Fe2+,Ag+,Zn2+,Hg2+,Cu2+,Mn2+,Cr3+和Fe3+PL响应，只有加入Al3+(650.0μM)或Pb2+(500.0μM)会引起TPE-4-CO2Na探针明显的PL增强，引入Al3+或Pb2+后明亮的绿色发光可以很容易被肉眼观察到。同等量的Al3+相比Pb2+会引发更加明亮的荧光，这通过它们各自的PL增强率可以清楚地反映出来，其中Al3+的I/I0增强比为186,Pb2+生物I/I0增强比为111。结合图3(C)和(D)可知，由Al3+和Pb2+引起的PL增强是由于金属离子和TPE-4CO2Na之间配位产生大量毫米级的大聚集体引起的。
基于离子触发的AIE的Al3+和Pb2+鉴别检测
本实施例中选用掩蔽剂GSH和NaBF4的辅助下，分别用谷胱甘肽和NaBF4掩盖铅离子和铝离子的作用，其浓度为100.0μM，利用TPE-4CO2Na探针可以很容易地实现对Al3+和Pb2+的鉴别检测。从图4可知，随着Al3+在0.0–650.0μM范围内的连续添加，TPE-4CO2Na的PL逐渐增强，并且在20.0–400.0μM范围内建立了PL强度和Al3+浓度之间较好的线性关系，其检测限为0.7μM，优于大多数基于ACQ荧光团的方法(1.0–21.7μM)。Pb2+在0.0-500.0μM之间的浓度范围也呈现出相似的PL增加趋势，并获得了Pb2+浓度在2.0-300.0μM之间的校准曲线，计算得到的Pb2+的检测限为0.6μM。
对于铝离子和铅离子的鉴别检测，除了添加掩蔽试剂外，其检测方法与常规检测方法相同。所有检测至少重复三次。
实施例3
本实施例使用实施例制得的TPE-4CO2Na在拟南芥根细胞铝离子活体细胞成像，具体步骤如下：
拟南芥根细胞中存在大量的谷胱甘肽，谷胱甘肽对铅离子具有掩盖作用，因此基于TPE-4CO2Na的铝离子对铅离子的鉴别检测策略，能够在活细胞中特异性地成像Al3+。
具体操作步骤如下：
步骤一、对拟南芥野生型种子进行表面消毒，在4℃黑暗中浸泡3天，然后播种到0.5×培养基1.5％(w/v)平板上；
步骤二、将播种有拟南芥野生型种子的平板置于在气候控制生长室中将幼苗垂直生长在平板上；
气候控制生长室的培育条件如下：
昼/夜温度：22/20℃；
光周期：16/8h；
光强：80μE s-1m-2；
步骤三、将5天生健康根苗分为3组；第一组被用作模拟对照；第二组先用0.5mM 2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸钠溶液处理10分钟，然后用三次蒸馏水洗涤后，在0.5mM铝离子溶液中培养10分钟；第三组用0.5mM 2,2'，2”，2”-((乙烷-1,1,2,2-四(苯-4,1-二基))四(氧)乙酸在DMSO/水混合溶液中处理30s，洗涤后在0.5mM铝离子或铅离子溶液中培养10min；
所有组均使用共聚焦激光扫描显微镜在475-530nm的发射范围内成像。
在活细胞中，拟南芥作为模型植物被选择用来检验TPE-4CO2Na探针在活细胞中的成像性能。这里选用拟南芥5天生苗，因为其透明的根系有利于可见光的激发和发射的穿透。如图5所示，水溶性TPE-4CO2Na探针的细胞渗透性和成像能力用TPE-4CO2Na处理的拟南芥苗木，其根系细胞的自发荧光强度与模拟对照相比非常弱，但用TPE-4CO2Na和Al3+连续处理后，可以观察到根尖明显的绿色。这种微弱的荧光信号表明，水溶性TPE-4CO2Na具有细胞渗透性，但在10分钟内细胞内积累量很小。为了提高探针的细胞渗透性，使用其于混合溶剂中的酸性形式TPE-4CO2H。不同组别幼苗根系的激光扫描共聚焦显微镜图像显示在一定的条件下，模拟对照几乎没有荧光信号，用TPE-4CO2H处理的拟南芥幼苗根系细胞只观察到很弱的荧光，表明在活细胞内的生理条件下，TPE-4CO2H不会聚集。在给定浓度的Al3+下，将幼苗连续培养10分钟，产生亮绿色荧光，几乎所有的细胞都清晰地标记出强烈的绿色。然而，引入相当数量的Pb2+到Al3+中并没有产生强烈的发射信号。在拟南芥活体细胞内存在丰富的谷胱甘肽，TPE-4CO2H能够从Pb2+中选择性地对Al3+进行鉴别成像。
本实施例进一步评价了TPE-4CO2H与铝离子结合后的光稳定性，如图6所示，荧光强度随辐射时间从1到5分钟的延长而变化。通过比较激光扫描共聚焦显微镜图像，发现荧光强度没有明显下降，在给定的时间过程中也没有明显的光漂白现象，表明探针具有良好的光稳定性和更适合长程成像。
本发明检测机理如下：
本发明将四个羧酸基加入到探针中的四苯乙烯单元中，设计并合成了一种高水溶性分子探针，用于基于离子触发聚集诱导发射的Al3+和Pb2+的定量分析。引入这些羧酸基团不仅使探针在水中具有良好的溶解性，而且为目标金属离子提供了识别单元。通过金属离子与羧酸基团的配位反应，TPE-4CO2Na探针可以被Al3+和Pb2+有效地聚集。在掩蔽剂的辅助下，探针TPE-4CO2Na可以以荧光信号开启的方式实现对Al3+或Pb2+的区分和定量测定。利用GSH对铅离子的掩蔽作用，使用该探针对拟南芥幼苗细胞铝离子进行成像，结果表明本发明中的探针在生物体内具有良好的体内成像性能。

Claims (1)

1.一种选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针在检测铅离子方面的应用，其特征在于：
所述选择性识别铅离子和铝离子的聚集诱导发光分子探针制备方法包括以下步骤：
步骤一、制备1，1，2，2-四（4-甲氧基苯基）乙烯；
将锌粉和TiCl4混合于干燥THF中，在氮气气氛下回流获得悬浮液；
将存于干燥THF中的4,4-二羟基二苯甲酮添加到上述悬浮液中；
保持80℃回流12 h；
将反应混合物冷却至室温后，向反应混合物中添加K2CO3的水溶液；
用乙酸乙酯萃取所得1，1，2，2-四（4-甲氧基苯基）乙烯；
步骤二、合成1，1，2，2-四（4-羟基苯基）乙烯；
在-20℃下，在含有1，1，2，2-四（4-甲氧基苯基）乙烯的干燥DCM溶液中添加一定量的BBr3获得混合物;
室温下将混合物搅拌，在真空下浓缩；
将浓缩后的混合物倒入100毫升水中，加入乙醇搅拌，生成大量白色沉淀；将制得的白色沉淀经过滤干燥后得到合成1，1，2，2-四（4-羟基苯基）乙烯；
步骤三、合成2,2'，2''，2''-（（乙烯-1,1,2,2-四（苯-4,1-二基））四（氧）乙酸四乙酯；
将1，1，2，2-四（4-羟基苯基）乙烯、Cs2CO3和氯乙酸乙酯加入DMF中，80℃搅拌48h获得混合物；
将混合物倒入水中后生成白色沉淀；经洗涤干燥后得到2,2'，2''，2''-（（乙烯-1,1,2,2-四（苯-4,1-二基））四（氧）乙酸四乙酯；
步骤四、合成分子探针2,2'，2''，2''-（（乙烯-1,1,2,2-四（苯-4,1-二基））四（氧）乙酸钠；
将2,2'，2''，2''-（（乙烯-1,1,2,2-四（苯-4,1-二基））四（氧）乙酸四乙酯与NaOH置于甲醇中反应生成白色沉淀，过滤干燥后收集白色沉淀即为分子探针。
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