CN115925646A - 检测汞离子的荧光探针、固态传感薄膜及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及汞离子检测技术领域，具体涉及检测汞离子的荧光探针以及所述的荧光探针的制备和在汞离子荧光检测中的应用。本发明所述的荧光探针(TPE‑4TA、TPE‑2TA)具有高的荧光发射强度，良好的汞离子检测灵敏度和反应速度，可在原位实现汞离子浓度的实时动态分析。

Description

检测汞离子的荧光探针、固态传感薄膜及其制备和应用

技术领域：

本发明涉及汞离子检测技术领域，尤其涉及一类荧光探针的设计合成和荧光探针检测水体中汞离子的检测方法。

背景技术：

人类活动对其赖以生存的环境构成巨大的压力，环境污染问题日益严重。在众多环境问题中，水污染问题更为突出，水中含有重金属及其化合物在环境中难以降解，最终通过食物链传递到人体，对人体健康构成极大威害。汞离子(Hg²⁺)作为最为常见的有毒重金属离子之一，其污染的主要来源包括矿业生产、化学制造、废物焚烧和化石燃料燃烧。此外，火山活动、森林火灾和大气汞沉积也可能导致汞污染，并且汞污染不能自然降解，一旦暴露在环境中，它会进一步造成大气污染、土壤污染以及水污染，进而对生物造成巨大的危害。其无论以无机汞盐形式存在还是以有机汞形式存在都是具有强毒性的。其毒性主要集中在三方面：神经毒性、肾毒性和肺毒性；且汞离子的生物积累性强，进入生物体不易排出，当积累到一定程度时会引发多种疾病，如脑损伤、水俣病与呼吸疾病等其中汞离子不仅会对中枢神经系统造成伤害，同时会造成肠胃溃疡、腹泻、呕吐、呼吸困难、肺水肿、呼吸衰竭甚至死亡。因此，迫切需要开发一种灵敏的环境中Hg²⁺的检测方法。建立能够用于汞离子快速、准确定性及定量的检测方法对于环境监测、食品安全及医学诊断等方面具有十分重要的意义。

目前，研究者已经报道了多种用于汞离子检测的方法，包括原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和离子色谱法等，然而这些传统的分析方法由于受到样品前处理步骤复杂、仪器昂贵、破坏样品分子等因素的影响，在一定程度上限制了其在汞离子检测方面的应用。而与传统的汞离子检测方法相比，荧光分子探针检测技术具有检测灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，受到了人们的广泛关注。

为实现汞离子的检测，许多汞离子特异性识别探针被设计出来，包括多种聚合物材料、金属纳米颗粒、核酸和蛋白质等探针。在众多针对汞离子信号输出的检测中，荧光信号检测因其高选择性、高灵敏度和快速反应的优点，是最常用的一种检测方法。目前，“turn-off”型探针分子因其在水相环境中会有自淬灭效应限制了其灵敏度；而比率型荧光探针具有自矫正的优势，但探针分子设计较为复杂；相比而言“turn-on”型荧光探针为荧光从无到有的可视化过程，且灵敏度高分子设计门槛较低，其检测机制总结主要包括以下几种：1、汞离子导致的探针分子脱硫反应形成更大的共轭体系，从而使探针分子荧光增强；2、汞离子催化的醚键断裂使得荧光探针的淬灭基团脱离，探针荧光得以恢复；3、配位荧光增强型探针：探针分子在具有孤对电子的情况下与汞离子发生配位络合，进一步发生聚集堆积，发出强烈荧光。由此可见，基于上述荧光机理，荧光探针法可利用丰富多样的发光基团，设计多种性质不一的荧光探针。

发明内容：

本发明的第一目的在于提供一种检测水体中汞离子的荧光探针；

本发明的第二目的在于提供一种包含所述的荧光探针的固态传感薄膜及其制备方法；

本发明的第三目的在于提供水体中汞离子的检测方法，旨在提高检测灵敏度。

本发明提供一类检测水体汞离子的荧光探针，为具有式I、式II结构式的至少一种化合物：

其中R，R′，R″或R″′中的至少一个选自取代基选取如下结构式的取代基，

剩余取代基独立选自氢、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的至少一种。

本发明涉及汞离子检测技术领域，尤其涉及一类荧光探针的合成和荧光探针检测水体中汞离子的检测方法。例如，本发明的荧光探针可以适量溶解于水中，且当探针在水溶液中自由溶解时，因其四苯乙烯荧光基团的聚集诱导发光活性可以将激发能量通过非辐射跃迁而湮灭，导致探针无法被激发出荧光；然而，当水环境中的汞离子与探针发生配位结合后，荧光探针分子与汞离子络合形成高分子络合物，进一步发生聚集使四苯乙烯基团的非辐射途径被限制，导致探针可以被激发出强烈的荧光。本发明中的荧光探针分子具有对汞离子检测灵敏度高、检测时间迅速的优点。

所述的检测汞离子的荧光探针，优选为具有以下式1-A、式1-B结构式中的至少一种化合物：

其中R₁和R₂基团选自氢、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的至少一种；优选为H、C₁～C₆的烷基、C₁～C₆的烷氧基、C₂～C₆的烯烃基、C₃～C₆的环烷基、环戊基、环己基、苯基、四氮唑、呋喃基或吡啶基。

本发明研究发现，优选的式1-A以及式1-B具有更优的汞离子荧光检测效果，特别是式1-B，可以意外地表现出更优的汞离子检测限、线性范围和灵敏度。

本发明中，所述的式1-A(TPE-4TA)最佳激发波长360nm，最大发射波长在499nm处。所述的式1-B(R₁/R₂为H，TPE-2TA)；TPE-2TA最佳激发波长345nm，最大发射波长在490nm处。

本发明还提供了一种检测汞离子的固态传感薄膜，包括膜基底以及复合在膜基底中的所述的检测汞离子的荧光探针。

本发明所述的检测汞离子的固态传感薄膜，对膜基底的材料种类没有特别的要求，例如，所述的膜基底为亲水性高分子材料；进一步优选为壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇中的至少一种。

本发明还涉及所述的检测汞离子的固态传感薄膜的制备方法，将膜基底材料和所述的检测汞离子的荧光探针混合并成膜，制得所述的材料；

本发明优选的检测汞离子的固态传感薄膜的制备，将所述的荧光探针溶解后和亲水性高分子材料如聚乙烯醇和对苯二硼酸溶液混合，随后置于模具中，陈化后，浸泡于水中，完成溶剂交换，制得所述的检测汞离子的固态传感薄膜。

本发明还提供了一种水体中的汞离子的荧光测定方法，将待测的水溶液和所述的荧光探针接触，随后进行荧光激发后进行荧光测定。

本发明中，可以采用液液或者液固方式使所述的待测的水溶液和荧光探针接触。

本发明一种利用所述的荧光探针进行测定的方案，步骤例如为：将所述的待测的水溶液和所述的荧光探针进行液相接触(液液接触)混合，随后对混合液进行荧光激发和荧光测定；

本发明另一种利用所述的荧光探针进行测定的方案，步骤例如为：将待测的水溶液和所述的固态传感薄膜液-固接触；随后对接触后的固态传感薄膜进行荧光激发和荧光测定。

本发明所述的测定方法，所述的待测的水溶液的pH为5～7.5。

作为优选，测定过程在340～500nm光照下进行荧光激发处理；优选的激发波长为340～375nm的光照下进行荧光激发处理。

更进一步优选，当所述的荧光探针为TPE-2TA，其激发波长为300～350nm，更进一步优选为345～350nm；当所述的荧光探针为TPE-4TA，其激发波长为350～380nm，更进一步优选为360～365nm。

本发明中，所述的荧光探针性质稳定、抗环境干扰能力强，选择性强，测定线性好。以所述的荧光探针为TPE-4TA、TPE-2TA为例，其对水样中汞离子检测限分别可达3.4nM(0.682ppb)和1.2nM(0.241ppb)。荧光探针浓度为1.0×10^-5M时，检测汞离子的线性区间分别为[3.4nM—5μM]、[1.2nM—10μM]，具有优异的测定效果。

附图说明：

图1为本发明的荧光探针与汞离子结合后被激发出荧光的示意图；

图2为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA分别在加入汞离子前后的UV-Vis图；

图3为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA的激发谱图和在不同汞离子浓度体系下的荧光滴定曲线图；

图4为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA在图3数据基础上进行的数据拟合线性图；

图5为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA与不同金属离子响应曲线图；

图6为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA在汞离子与其他金属离子共存条件下的竞争性实验；

图7为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA分别在加入汞离子前后的荧光寿命图；

图8为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA在加入汞离子后的DLS图；

图9为本发明荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA在不同pH条件与汞离子响应的耐受性图；

图10为本发明荧光探针TPE-4TA在制成薄膜后对不同汞离子浓度体系下的响应曲线图及对该组数据的线性拟合图；

图11为探针分子TPE-2TA的核磁氢谱图。

具体实施方式：

本发明涉及的荧光探针为TP4-4TA、TP4-2TA，

本发明的两种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

TPE-2TA合成步骤：

在0℃下，向二苯基甲烷的四氢呋喃溶液中加入正丁基锂，在30分钟内产生二苯基甲基锂的橙红色溶液。在0℃下，向该高度着色的溶液中加入固体4,4’-二溴二苯基甲酮，将所得混合物升温至室温并搅拌6小时。用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，随后进行标准水溶液处理，得到几乎定量产率的相应醇；将粗醇溶解在甲苯中，并在催化量的对甲苯磺酸存在下回流，使用迪安-斯塔克阱共沸除去水，通过从二氯甲烷和甲醇的混合物中简单结晶，以46％的分离产率制备得到产物TPE-2Br。

S2、将TPE-2Br、CuCN和二甲基甲酰胺(DMF)加入到双颈圆底烧瓶中。混合物在N₂下回流加热60小时，然后悬浮在300毫升水中。加入乙二胺后，混合物在100℃搅拌1小时，然后过滤。沉淀的固体用二氯甲烷萃取。用无水硫酸镁干燥合并的有机相。过滤和溶剂蒸发后，残留物通过硅胶柱色谱纯化，使用己烷/二氯甲烷(1/1，v/v)作为洗脱剂，得到产物TPE-2CN。

S3、向烧瓶中加入叠氮化钠、溴化锌和水。将TPE-2CN在N-甲基吡咯烷酮中注射到上述溶液中。混合物在150℃搅拌过夜。混合物用盐酸水溶液(3M)酸化至pH≈1，并剧烈搅拌30分钟。有机混合物用乙酸乙酯萃取，用盐酸洗涤，浓缩得到粗固体。将该粗产物加入氢氧化钠溶液中，然后剧烈搅拌1小时。之后，过滤所得悬浮液以除去固体。滤液用乙酸乙酯洗涤，用3M盐酸酸化至pH＝1。搅拌下沉淀出四唑产物，再次将其提取到乙酸乙酯中，分离有机层。水层用乙酸乙酯洗涤。合并有机层，浓缩，真空干燥，得到相应产物TPE-2TA。

采用TPE-2TA类似步骤可合成探针分子TPE-4TA。

利用所述列举的荧光探针进行汞离子测定的过程例如为：

测定(1)：液相测定：

在合成上述荧光探针的基础上，本发明公开了一种检测水体中汞离子的检测方法。进一步还包括365nm手提式紫外灯、具塞石英比色皿、洗瓶、枪头盒、擦镜纸、移液枪等配件以及荧光光谱仪仪器设备，其中，手提式紫外灯可随时用于提供365nm波长的激发光源，检测待测水样的荧光响应情况；具塞石英比色皿用于观察紫外灯激发下其内部溶液的荧光响应情况；洗瓶用于盛装蒸馏水或去离子水，对使用后的比色皿进行清洗；擦镜纸用于比色皿清洗后的初步擦拭；移液枪用于精确吸取荧光探针溶液和水样，保证试验的准确性、重复性；荧光光谱仪用于实时检测配置好的水样，分别在其最佳激发波长条件下进行荧光强度测试。其检测汞离子的步骤如下：

S1、荧光探针母液的配置：准确称取固体探针样品溶于甲醇溶液中，配置成浓度为5.0×10^-4M的母液。

S2、将待测水样(pH需在图9所示的范围内)加入至四通比色皿中，搅拌均匀后使用波长为365nm的紫外手提灯进行照射，可初步观察此时溶液几乎不发光或只发出微弱的荧光，然后将含水样的四通皿转移至荧光光谱仪中测试得到其最大发射强度，作为参比。

S3、在含待测水样的比色皿中使用移液枪加入荧光探针母液，探针的最终浓度为1.0×10^-5M，搅拌均匀后再次使用波长为365nm的紫外手提灯进行照射可观察到溶液由原来的弱发光变为发出强烈的黄绿色荧光，然后将含水样的四通皿转移至荧光光谱仪中设置最佳激发光激发测试得到其最大发射强度，与已有数据进行对比即可得到水体中汞离子的含量。

基于上述荧光探针检测水体汞离子的检测方法，因所用荧光探针TPE-2TA、TPE-4TA都具有灵敏度高，检测迅速的优点，与痕量的汞结合即可产生强烈的荧光，并在紫外灯照射下肉眼可见，对水样中汞离子检测限分别可达3.4nM(0.682ppb)和1.2nM(0.241ppb)。此外，该荧光探针还具有性质稳定、抗环境干扰能力强、选择性高等优点，分别在345nm、360nm激发光下使用荧光光谱仪可观测到分别在490nm、499nm出处有显著的荧光增强，且增强的强度在一定范围内与汞的量成正比，由此即可进行水体汞离子的定量检测。

本发明仅用少量甲醇溶液配制荧光探针母液，在实际水样酸碱度下，荧光探针都具备检测活性，无需在任何缓冲体系下进行汞离子检测。

进一步，在检测体系下，使用的TPE-2TA、TPE-4TA荧光探针浓度为1.0×10^-5M时，检测汞离子的线性区间分别[3.4nM—5μM]、[1.2nM—10μM]。

本发明所合成的这两种荧光探针分别在纯水中加入不同金属离子进行荧光测试，检测两种探针对汞离子金属响应的特异性，经过测试研究得到探针分子对汞离子具有特异性响应，但是溶液中存在较大浓度的铜离子时，会使得探针失活。

本发明另一测试方式(测定二)，将所述的荧光探针复合形成固态传感薄膜，并将其用于汞离子的测定，其步骤如下：

S1、荧光传感薄膜的制备：将所述的荧光探针溶于甲醇溶液，以二甲亚砜为溶剂配制聚乙烯醇溶液及对苯二硼酸溶液。取聚乙烯醇溶液，加入荧光探针母液，进一步与对苯二硼酸溶液混合，混合液快速倒入模具凹槽，室温陈化后，浸泡于水中，完成溶剂交换。

S2、汞离子检测标准曲线的测试：将HgCl₂或Hg(NO₃)₂溶于水配制汞浓度为1.0×10^-3M的母液，进一步用纯水稀释为一系列浓度梯度的标准溶液。将凝胶薄膜浸入不同浓度的标准溶液中浸泡，待离子平衡后，将薄膜移入荧光光谱仪中使用探针最佳激发光进行激发，可在特定波长处出现最大发射，使用最大发射位置的荧光强度与溶液浓度进行线性拟合，即可得到汞离子与荧光强度的标准曲线。

S3、将水凝胶薄膜浸入待测水样，待水样中汞离子与凝胶内探针充分接触后，使用荧光光谱仪，对样本进行检测和定量分析。并可使用波长为365nm的紫外手提灯进行照射，可通过观察到溶液由原来的弱发光变为发出蓝绿色荧光的现象，定性判断水样中汞离子的浓度。

实施例1：

使用移液枪吸取60.0μL(5×10^-4M)TPE-2TA溶液加入3mL具塞四通石英比色皿中，再使用移液枪吸取2940μL纯水加入比色皿中，搅拌振荡混匀，确保溶液澄清透明，无肉眼可见的悬浮物；然后，可初步使用波长为365nm的手提紫外灯照射比色皿，观察此时溶液性状，后移入荧光光谱仪中设置使用最佳激发波长为345nm的激发光进行激发，可在490nm处出现最大发射，用以对比参照；

使用移液枪吸取60.0μL(5×10^-4M)TPE-2TA溶液加入3mL具塞四通石英比色皿中，再使用移液枪吸取1940μL纯水样加入比色皿中，搅拌振荡混匀，确保溶液澄清透明，无肉眼可见的悬浮物，再使用移液枪吸取1000μL不同浓度梯度的(0——1×10^-6M)HgCl₂(也可以是Hg(NO₃)₂溶液)加入上述比色皿中；然后，使用波长为365nm的手提紫外灯照射比色皿，观察此时溶液荧光情况，比色皿中可以观察到肉眼可见的黄绿色荧光，表明溶液中有汞离子的存在，后移入荧光光谱仪中设置使用最佳激发波长为345nm的激发光进行激发，可在490nm处出现最大发射，即可定量检测水样中汞离子浓度，测试结果如附图3(左)，即随着汞离子含量的增加，荧光强度也在逐步增强，且通过动态光散射表征和扫描电子显微镜成像(附图4左)能很直观的得出探针分子在传感过程中会伴随着聚集体的形成。

实施例2：

使用移液枪吸取60.0μL(5×10^-4M)TPE-4TA溶液加入3mL具塞四通石英比色皿中，再使用移液枪吸取2940μL纯水加入比色皿中，搅拌振荡混匀，确保溶液澄清透明，无肉眼可见的悬浮物；然后，使用波长为365nm的手提紫外灯照射比色皿，观察此时溶液性状，后移入荧光光谱仪中设置使用最佳激发波长为360nm的激发光进行激发，可在499nm处出现最大发射，用以对比参照；

使用移液枪吸取60.0μL(5×10^-4M)TPE-4TA溶液加入3mL具塞四通石英比色皿中，再使用移液枪吸取1940μL纯水样加入比色皿中，搅拌振荡混匀，确保溶液澄清透明，无肉眼可见的悬浮物，再使用移液枪吸取1000μL不同浓度梯度的(0——1×10^-6M)HgCl₂或Hg(NO₃)₂溶液加入上述比色皿中；然后，使用波长为365nm的手提紫外灯照射比色皿，观察此时溶液荧光情况，比色皿中可以观察到肉眼可见的深黄绿色荧光，表明溶液中有汞离子的存在，后移入荧光光谱仪中设置使用最佳激发波长为360nm的激发光进行激发，可在499nm处出现最大发射，即可定量检测水样中汞离子浓度，测试结果如附图3(右)，即随着汞离子含量的增加，荧光强度也在逐步增强，且通过动态光散射表征和扫描电子显微镜成像(附图4右)能很直观的得出探针分子在传感过程中会伴随着聚集体的形成。

实施例3：

在3mL四通比色皿中，取60.0μL(5×10^-4M)TPE-2TA或TPE-4TA溶于2850μL的纯水中，分别在上述探针溶液中加入90μL(1×10^-3M)的金属盐溶液(Na⁺,K⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺,Cu²⁺,Hg²⁺,Pb²⁺,Ni²⁺,Cd²⁺,Fe²⁺,Co²⁺,Fe³⁺和Al³⁺)，在荧光光谱仪中设置最佳激发波长(TPE-2TA最佳激发光345nm，TPE-4TA最佳激发光360nm)测试溶液的荧光强度变化。测试结果如附图5；在上述测试结果表明该探针对汞离子具有良好的选择性。

实施例4：

在3mL四通比色皿中，取60.0μL(5×10^-4M)TPE-2TA或TPE-4TA溶于2820μL的纯水中，将30.0μLHg²⁺溶液(1×10^-3M)和90μL其他金属离子盐溶液(间图6，浓度为1×10^-3M)混合均匀后，用移液枪加入至上述探针溶液中，在荧光光谱仪中设置最佳激发波长(TPE-2TA最佳激发光345nm，TPE-4TA最佳激发光360nm)测试溶液的荧光强度变化。测试结果如附图6。即这两种探针在有其他金属离子共存的条件下(除Cu²⁺)，也能对汞离子有一个很好的传感效果。

实施例5：

以二甲亚砜为溶剂配制5.0×10^-2M聚乙烯醇溶液及6.0×10^-2M对苯二硼酸溶液。取聚乙烯醇溶液600μL，用移液枪吸取TPE-4TA(5×10^-4M)加入，后与150μL对苯二硼酸溶液混合，混合液快速倒入模具凹槽，室温陈化10min。将材料分散浸泡于纯水中，4小时内每隔10min更换一次水，以完成溶剂交换，即可制得汞离子传感薄膜。

实施例6：

将上述汞离子传感薄膜(实施例5)浸于待测水样中2min后，使用波长为365nm的紫外灯照射比色皿，观察此时薄膜荧光情况，薄膜可以观察到肉眼可辨的蓝绿色荧光增强，表明溶液中有汞离子的存在，后移入荧光光谱仪中，设置使用354nm的激发光进行激发，可在484nm处出现最大发射，即可定量检测水样中汞离子浓度。

Claims (10)

1.一类检测汞离子的荧光探针，其特征在于，为具有式Ⅰ、式Ⅱ结构式的至少一种化合物：

其中R，R′，R″或R″′中的至少一个取代基选取如下结构式的取代基，剩余取代基独立选自氢、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的至少一种；

2.根据权利要求1所述检测汞离子的染料探针，其特征在于，为具有以下式1-A、式1-B结构式中的至少一种化合物：

其中R₁和R₂基团选自氢、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的至少一种；优选为H、C₁～C₆的烷基、C₁～C₆的烷氧基、C₂～C₆的烯烃基、C₃～C₆的环烷基、环戊基、环己基、苯基、四氮唑、呋喃基或吡啶基。

3.一种检测汞离子的固态传感薄膜，其特征在于，包括膜基底以及复合在膜基底中的权利要求1或2所述的检测汞离子的荧光探针。

4.如权利要求3所述的检测汞离子的固态传感薄膜，其特征在于，所述的膜基底为亲水性高分子材料；进一步优选为壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇中的至少一种。

5.一种权利要求3或4所述的检测汞离子的固态传感薄膜的制备方法，其特征在于，将膜基底材料和所述的检测汞离子的荧光探针混合并成膜，制得所述的材料；

优选地，将所述的荧光探针溶解后与亲水性高分子材料和对苯二硼酸溶液混合，随后置于模具中，陈化后，浸泡于水中，完成溶剂交换，制得所述的检测汞离子的固态传感薄膜。

6.一种水体中的汞离子的荧光测定方法，其特征在于，将待测的水溶液和包含权利要求1或2所述的荧光探针接触，随后光激发后进行荧光测定。

7.如权利要求6所述的水体中的汞离子的荧光测定方法，其特征在于，将所述的待测的水溶液和所述的荧光探针进行液相接触混合，随后对混合液进行荧光激发和荧光测定；

或者，将待测的水溶液和权利要求3或4所述的固态传感薄膜液-固浸泡接触；随后对浸泡后的固态传感薄膜进行光激发和荧光测定。

8.如权利要求6所述的水体中的汞离子的荧光测定方法，其特征在于，所述的待测的水溶液的pH为5～7.5。

9.如权利要求6所述的水体中的汞离子的荧光测定方法，其特征在于，在340～500nm光照下进行荧光激发处理；优选的激发波长为340～375nm的光照下进行荧光激发处理。

10.如权利要求9所述的水体中的汞离子的荧光测定方法，其特征在于，当所述的荧光探针为TPE-2TA，其激发波长为300～350nm，更进一步优选为345～350nm；当所述的荧光探针为TPE-4TA，其激发波长为350～380nm，更进一步优选为360～365nm。

Images