CN113666822B - 用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针及其应用，本发明所述的荧光探针为简单常规小分子(1苯环，分子量小于198)，且毒副作用小，原料来源广泛。检测铝离子时只需借助简单紫外光照射，不受共存离子的干扰，可快速比色判断，通过荧光光谱更能准确定量铝离子含量。将本发明所述的荧光探针分子在试纸结合紫外光照射可快速检测铝离子的存在，待测试液配成溶液可运用荧光光谱定量测定，且检测限较小。

Description

用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针及其应用
【技术领域】
本发明涉及检测技术领域，具体涉及用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针及其应用。
【背景技术】
金属铝因其优良的化学物理性质，被广泛的运用与生产生活各个领域，如自水处理厂、食品添加剂、药物、止汗剂、除臭剂、铝制炊具、罐头、漂白面粉、抗酸剂、轻合金生产等。由于酸雨和人类活动的影响，环境中游离Al3+的暴露日益增多，虽然铝是生命系统的非必需元素，但Al3+的大小(0.051nm)和电荷，使其成为Mg2+(0.066nm)、Ca2+(0.099nm)和Fe3+(0.055nm)、Zn(0.060nm)等几个具有相似特征的必需元素的竞争性抑制剂，导致因肾功能不全而无法清除Al3+的患者出现透析性痴呆，以及肌萎缩性侧索硬化等疾病。此外，铝中毒会导致小细胞低色素性贫血、与铝有关的骨病(ARBD)和脑病，还可能产生一些类似于阿尔茨海默病的神经行为和神经病理变化。植物系统中的铝中毒同样也是一个严重的问题，特别是在酸性土壤(土壤的酸碱度低于5.0)，其中植物毒性Al3+占主导地位。通常，它会干扰根尖和侧根的细胞分裂，干扰控制糖磷酸化的酶活性，细胞壁多糖的沉积和几种必需营养素(钙、镁、钾、磷和铁)的吸收、运输和使用。
因此，研究出一种快速、简便、灵敏、成本低的Al3+检测方法对人类健康和生态环境保护，资源的合理开发利用有重要的现实意义。在各种检测分析方法中，荧光探针由于具有灵敏度高，对分析物损伤小和“裸眼”检测等优点而备受关注。而目前大部分Al3+检测的荧光探针都是具有较大共轭体系或者席夫碱类有机分子。荧光探针用于生物离子实时传感和荧光成像已成为现代医学和科学众多领域不可或缺的工具。例如中国专利CN201610128435-一种荧光探针的制备方法及其在铝离子检测中的应用，通过2-羟基-1-萘醛和碳酰肼以加热回流方式反应，得到荧光探针，提供的荧光探针结构中C＝N双键上的N原子受光诱导的电子转移效应的影响，在与铝离子结合后抑制了光诱导的电子转移效应，同时增强了平面共轭，两种机制共同导致荧光发射明显增强，对铝离子具有良好的选择性和灵敏度，实现了对铝离子的高选择性识别，在5×10-6-4×10-5mol/L范围具有较好的线性关系，检测限低至1.89×10-8mol/L，是一种具有生色传感功能的荧光探针。
由于荧光技术的非破坏性、高灵敏度、瞬时响应和广泛的指示染料的可用性，与其他方法相比，在活细胞内检测金属离子的方面，荧光技术具有显著的优势。目前，铝离子的检测技术主要是运用大型仪器，原子光谱，紫外光谱，荧光光谱，已经报道和申请了专利的铝离子探针主要是通过复杂合成的含大的共轭基团或希夫碱类有机物(含3个以上苯环)，但其分子量大，毒性较大。
因此，迫切需要合成简单、快速高效、水溶性好和成本低的Al3+选择性荧光探针。
【发明内容】
针对现有技术中铝离子探针主要是通过复杂合成的含大的共轭基团或希夫碱类有机物(含3个以上苯环)，存在分子量大、毒性较大等不足，本发明提供了用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针及其应用，所述的荧光探针为简单常规小分子(1苯环，分子量小于198)，且毒副作用小，原料来源广泛。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，所述的小分子荧光探针为2，5-二羟基对苯二甲酸(简称DB)，其分子式为：C8H6O6，结构式为：
Figure BDA0003226956990000021
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，紫外光照射下，DB发黄色荧光，加入Al3+后荧光显示为绿色，且Al3+的浓度越高，绿色荧光越明显。
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，荧光光谱中DB在有Al3+时，荧光强度显著增强，并伴随蓝移现象，且随着Al3+浓度的递增，荧光强度不断增大。
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测Al3+的同时，不会受到被检测物中其它共存金属离子的干扰，所述其它共存金属离子包括：Cu2+、Co2+、Al3+、Ba2+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ag+以及Fe2+。
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测时，DB与Al3+会以1:1的比例形成络合物，在0.5-1.5min内完成，且可反复循环络合Al3+。
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的试纸检测方法，包括如下步骤：
1)将滤纸裁剪成pH试纸大小的长条形；
2)将上步骤裁剪好的滤纸放入2×10-4mol/L的DB水溶液中浸泡湿透，或者在上步骤裁剪好的滤纸上直接喷涂2×10-4mol/L的DB水溶液至湿透；
3)将上步骤浸泡或者喷涂好的滤纸夹出，置于空气中自然风干或者烘干后制成DB试纸；
4)将不同铝离子浓度的溶液、分别喷到或滴到上步骤得到的DB试纸上，置于紫外光下观察颜色变化。
本发明中：
步骤1)所述的滤纸，是定性滤纸或者定量滤纸。
步骤2)通过浸泡或者喷涂，保证滤纸上附着有DB探针化合物以用来检验铝离子。
步骤3)所述的将上步骤中浸泡好的滤纸夹出，是用镊子。
步骤3)所述的烘干，是置于真空干燥箱中30-60min，温度45℃，真空度为0.08Mpa。
步骤4)所述的不同铝离子浓度的溶液，是1.0×10-8mol/L-1.0×10-3mol/L；所述的不同金属离子浓度的溶液是1.0×10-8mol/L-9.0×10-3mol/L。
步骤4)所述的置于紫外光下观察颜色变化，所述的紫外光是365nm紫外光，所述的颜色变化是颜色由黄色变为亮绿色。
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的溶液比色检测方法，包括如下步骤：
1)配制系列铝离子浓度分别为5×10-8mol/L，1×10-8mol/L，5×10-7mol/L，1×10- 7mol/L，5×10-6mol/L，1×10-6mol/L，5×10-5mol/L，1×10-5mol/L，5×10-4mol/L，1×10- 4mol/L，5×10-3mol/L，1×10-3mol/L溶液，其中每个溶液含DB浓度为1×10-3mol/L；
2)将上述溶液于暗室，365nm紫外光下拍照，记录各呈色图片，做为比色卡；
3)配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的DB水溶液作为探针溶液；
4)配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的铝水溶液作为待测溶液；
5)将步骤3)、步骤4)的溶液按照(1-2):1的摩尔比混合，反应20-30s；
6)将上步骤混合后的溶液通过紫外光照射观察颜色变化光谱是否有明显增强，与步骤2)中比色卡比对，判断浓度范围。
本发明中：
步骤5)中，是将步骤3)、步骤4)的溶液按照1:1的摩尔比混合，反应30s。
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的定量检测方法，包括如下步骤：
1)配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的DB水溶液作为探针溶液；
2)配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的铝水溶液作为待测溶液；
3)将步骤1)、步骤2)的溶液按照(1-2):1的摩尔比混合，反应20-30s；
4)将上步骤混合后通过荧光光谱测定荧光强度。
本发明中：
步骤3)中，是将步骤1)、步骤2)的溶液按照1:1的摩尔比混合，反应30s。
本发明所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的应用，包括：
1)DB试纸对铝离子快速检测；
2)DB溶液对铝离子的比色检测；
3)DB溶液对铝离子的定量检测；
4)DB溶液对生物体外的Al3+检测与成像；
5)DB溶液对复杂环境下非生物体的Al3+检测与成像。
和现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，所述的荧光探针为2，5-二羟基对苯二甲酸，是简单常规小分子(1苯环，分子量小于198)，且毒副作用小，原料来源广泛，对环境友好。检测铝离子时只需借助简单紫外光照射，不受共存离子的干扰，可快速比色判断，通过荧光光谱更能准确定量铝离子含量。
2、本发明所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的应用，将用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针和浸泡铝离子或金属离子的试纸结合紫外光照射可快速检测铝离子的存在，待测试液配成溶液可运用荧光光谱定量测定，且检测限较小。
【附图说明】
图1是本发明中DB对各单一金属离子的荧光响应情况的图。
图2是本发明中DB对各单一金属离子的荧光响应柱状图。
图3是本发明中DB对单一金属紫外光下的显色的图。
图4是本发明中共存其它离子DB对Al3+的荧光响应的图。
图5是本发明中共存其它离子DB对Al3+的荧光响应柱状图。
图6是本发明中共存其它离子DB对Al3+的荧光下呈色图。
图7是本发明中DB在血清中对铝离子的检测呈色图。
图8是本发明中DB试纸对铝离子检测的图。
图9是本发明中DB对不同浓度的铝离子检测的荧光图和试纸检测BSA环境铝离子图。
图10是本发明中DB对不同铝离子浓度检测的图。
图11是本发明中DB与Al3+可逆性和络合比的图，其中(a)DB与Al3+可逆性，(b)DB与Al3+络合比。
图12是本发明中DB与Al3+动力学的图。
图13是本发明中DB与DB-Al3+对pH的响应的图，其中(a)DB对pH的响应，(b)DB-Al3+对pH的响应。
图14是本发明中DB对Al3+的检测限的图。
图15是本发明中MTT细胞毒性的图。
图16是本发明中细胞成像的图。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例1：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，所述的小分子荧光探针为2，5-二羟基对苯二甲酸(简称DB)，其分子式为：C8H6O6，结构式为：
Figure BDA0003226956990000051
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，紫外光照射下，DB发黄色荧光，加入Al3+后荧光显示为绿色，且Al3+的浓度越高，绿色荧光越明显；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，荧光光谱中DB在有Al3+时，荧光强度显著增强，并伴随蓝移现象，且随着Al3+浓度的递增，荧光强度不断增大；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测Al3+的同时，不会受到被检测物中其它共存金属离子的干扰，所述其它共存金属离子包括：Cu2+、Co2+、Al3+、Ba2+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ag+以及Fe2+；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测时，DB与Al3+会以1:1的比例形成络合物，在0.5-1.5min内完成，且可反复循环络合Al3+。
实施例2：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的试纸检测方法，包括如下步骤：
1)将定性滤纸裁剪成pH试纸大小的长条形；
2)将上步骤裁剪好的滤纸放入2×10-4mol/L的DB水溶液中浸泡湿透，保证滤纸上附着有DB探针化合物以用来检验铝离子；
3)将上步骤浸泡或者喷涂好的滤纸用镊子夹出，置于空气中自然风干；
4)将1.0×10-8mol/L-1.0×10-3mol/L的不同铝离子浓度的待测溶液，喷到上步骤得到的DB试纸上，置于365nm紫外光下观察颜色变化，颜色由黄色变为亮绿色。
实施例3：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的试纸检测方法，包括如下步骤：
1)将定量滤纸裁剪成pH试纸大小的长条形；
2)在上步骤裁剪好的滤纸上直接喷涂2×10-4mol/L的DB水溶液至湿透，保证滤纸上附着有DB探针化合物以用来检验铝离子；
3)将上步骤浸泡或者喷涂好的滤纸用镊子夹出，置于真空干燥箱中30-60min，温度45℃，烘干后制成DB试纸；
4)将1.0×10-8mol/L-1.0×10-3mol/L的不同铝离子浓度的待测溶液，滴到上步骤得到的DB试纸上，置于365nm紫外光下观察颜色变化，颜色由黄色变为亮绿色。
实施例4：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的试纸检测方法，包括如下步骤：
1)将定性滤纸裁剪成pH试纸大小的长条形；
2)在上步骤裁剪好的滤纸上直接喷涂2×10-4mol/L的DB水溶液至湿透，保证滤纸上附着有DB探针化合物以用来检验铝离子；
3)将上步骤浸泡或者喷涂好的滤纸用镊子夹出，置于真空干燥箱中30-60min，温度45℃，烘干后制成DB试纸；
4)将1.0×10-8mol/L-1.0×10-3mol/L的不同铝离子浓度的待测溶液滴到上步骤得到的DB试纸上，置于365nm紫外光下观察颜色变化，颜色由黄色变为亮绿色。
实施例5：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的溶液比色检测方法，包括如下步骤：
1)配制系列铝离子浓度分别为5×10-8mol/L，1×10-8mol/L，5×10-7mol/L，1×10- 7mol/L，5×10-6mol/L，1×10-6mol/L，5×10-5mol/L，1×10-5mol/L，5×10-4mol/L，1×10- 4mol/L，5×10-3mol/L，1×10-3mol/L溶液，其中每个溶液含DB浓度为1×10-3mol/L；
2)将上述溶液于暗室，365nm紫外光下拍照，记录各呈色图片，做为比色卡；
3)配制1×10-3mol/L的DB水溶液作为探针溶液；
4)配制1×10-3mol/L的铝水溶液作为待测溶液；5)将步骤3)、步骤4)的溶液按照1:1的摩尔比混合，反应30s；
6)将上步骤混合后的溶液置于365nm紫外光下观察颜色变化，与步骤2)中比色卡比对，判断浓度范围。
实施例6：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的定量检测方法，包括如下步骤：
1)配制1×10-4mol/L的DB水溶液作为探针溶液；
2)配制1×10-4mol/-1×10-8mol/L的铝水溶液作为待测溶液；
4)将步骤1)、步骤2)的溶液按照1:1的摩尔比混合，反应30s；
5)将上步骤混合后的溶液通过用荧光光谱测试荧光强度；
6)荧光强度明显增强，约为原来强度的1-3倍。
实施例7：
用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的定量检测方法，包括如下步骤：
1)配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的DB水溶液作为探针溶液；
2)配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的铝水溶液作为待测溶液；
3)配制1.0×10-8mol/L-1.0×10-3mol/L的不同金属离子浓度的溶液作为杂质干扰溶液；
4)将步骤1)-步骤3)的溶液按照1:1:1的摩尔比混合，反应30s；
5)将上步骤混合后的溶液通过用荧光光谱测试荧光强度；
6)荧光强度明显增强，约为原来强度的1-3倍。
实验例：
实验例1：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的金属离子选择性与竞争性试验。
依次量取2.0mL 2.0×10–3mol·L–1(Cu2+、Co2+、Al3+、Ba2+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ag+、Fe2+、Fe3+)不同金属离子溶液，再分别各加3.0mL 2.0×10–5mol·L–1的DB水溶液，将其混合均匀，5min后用相应的激发波长下扫描荧光发射光谱，并在365nm紫外光照射下拍照。如图1、2所示，只有加入Al3+时DB在特定波长处呈现荧光发射峰，并伴随着荧光蓝移的现象。如图3所示，在365nm紫外光的照射下，DB本身发射出一种黄色荧光，加入Al3+后荧光颜色发生改变，变为绿色。
为进一步探究DB对Al3+的选择性，进行了混合金属离子的竞争性实验，测试其它金属离子与Al3+共存时DB对Al3+检测的影响。量取3mL浓度为2.0×10–5mol·L–1的DB水溶液，分别加入1mL 2.0×10–3mol·L–1其它金属离子，5min后在相应的激发波长下，扫描荧光光谱。再分别加1mL浓度为2.0×10–4mol·L–1的Al3+溶液，扫描其荧光光谱。结果如图4、5所示，除存在Fe3+的混合金属溶液有荧光猝灭的现象外，其它的金属离子溶液在加入Al3+后荧光强度明显增大。同时在紫外灯下进行拍摄，结果如图6所示。存在Al3+溶液的荧光颜色为一种颜色，而没有Al3+的溶液呈另一种荧光颜色，有Fe3+存在的溶液无荧光。
为了考察在复杂生物环境中DB对Al3+选择性检测的结果，量取3mL浓度为2.0×10–4mol·L–1的DB水溶液，分别加入1mL浓度为200μg·mL–1的牛血清白蛋白(BSA)水溶液，混匀，再分别加入1mL浓度为2.0×10–3mol·L–1的不同金属溶液，5min后放置比色皿中，在紫外光照射下拍摄。以滤纸作为载体，测试DB对BSA溶液中的Al3+选择性检测。选择定性滤纸将其裁剪成大小适宜的形状，裁剪好的滤纸放入浓度为2.0×10–4mol·L–1的DB溶液中浸泡，5min后用镊子夹出，晾干后制成DB试纸。再将浓度为2.0×10–3mol·L的不同含有铝离子的BSA溶液分别喷洒或者滴加到DB试纸上，晾干后，在紫外灯下拍摄。
结果如图7所示，其结果与在水溶剂中的检测结果相同，只有加Al3+的DB的BSA溶液被点亮。该结果说明即使在较复杂的生物环境中，DB对Al3+的选择性依旧不受影响。
为了探究以滤纸作为载体时，DB对Al3+选择性检测。选择定性滤纸将其裁剪成大小适宜的形状，裁剪好的滤纸放入浓度为2.0×10–4mol·L–1的DB溶液中浸泡，5min后用镊子夹出，晾干后制成DB试纸。再将浓度为2.0×10–3mol·L的不同金属离子溶液分别喷洒或者滴加到DB试纸上，晾干后，在紫外灯下拍摄。结果如图8所示，DB试纸本身呈现一种荧光颜色，只有接触过Al3+溶液的试纸从呈现亮绿色荧光，接触其它金属离子溶液的试纸均未呈现出明显的荧光颜色的改变。以上实验证明在探针DB附着在试纸上依旧能检验出Al3+，与在溶剂中鉴定Al3+相比，检测试纸制作容易，成本低廉，高效，也可以减轻实验废弃液对水资源的污染，在一定程度上具有环境保护的功能。
实验例2：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的对不同浓度铝离子的相应情况实验。
配制2.0×10–3mol·L–1的Al3+储备液，逐级稀释至所需浓度。依次量取3mL浓度为2.0×10–5mol·L–1的DB水溶液，分别加入2mL浓度为4.0×10–5，8.0×10–5，0.1×10–3，0.2×10–3，0.4×10–3，0.8×10–3，1.2×10–3，1.6×10–3，2.0×10–3mol·L–1的Al3+溶液，混匀，5min后放置比色皿中，在紫外光下拍摄，并扫描荧光光谱。
在水溶剂中，将DB与不同浓度的Al3+溶液混合摇匀后，在相应的激发波长条件下进行荧光光谱检测。如图9(a)所示，随着A13+浓度的逐渐增加，DB的荧光最大发射峰处的强度逐渐增强，而且变化趋势非常明显。与在365nm紫外光照射下观察的荧光现象一致，如图9(b)，溶液荧光强度随着Al3+浓度的升高变强，DB试纸上随着铝离子浓度变化也出现了明显的亮度差别，如图9(c)。在含BSA的复杂溶剂和同样进行了DB与不同浓度Al3+溶液的实验，如图10所示，在紫外灯照射下，反应现象与在水溶剂中的一致，再次证明了DB对不同浓度Al3+的检测不受介质和载体的影响。
实验例3：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的铝离子吸附可逆性试验。
选择向体系中加入EDTA来探究DB对Al3+检测的可逆性。如图11(a)所示，在DB-Al3+体系中加入EDTA后，EDTA可从DB-Al3+中络合掉Al3+，使得DB不能与Al3+的结合，即将Al3+掩蔽起来，探针无法检测到Al3+，从而使体系的荧光强度减弱。而再次加入Al3+可DB探针又能识别到有新的Al3+，重新形成DB-Al3+络合物，体系的荧光强度增大。三次循环后，体系依然保持较高的荧光强度。因此DB-Al3+可以实现对Al3+的循环检测，同时证明Al3+与探针是通过弱相互作用识别。
实验例4：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的金属离子结合模式的研究。
通过摩尔比连续变换法来测定DB和Al3+之间的结合比，如图11(b)所示，将DB与Al3 +的浓度之和维持在2.0×10–5mol/L，通过改变DB与Al3+之间的浓度比例，测得其Job‘s plot曲线。结果显示，在Al3+的摩尔分数从0.1-0.9之间，当Al3+在一定摩尔分数时，荧光强度最大。由此可以证明，DB、和Al3+的化学计量结合模式。
实验例5：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的金属离子时间响应的研究。
量取2mL浓度为2.0×10–5mol·L–1的DB水溶液，加入至2mL浓度为2.0×10–5mol·L–1的Al3+溶液中，立即放置比色皿内，选择荧光分光光度计的动力学模式，测量荧光强度随时间的变化。
探针DB与Al3+的时间响应如图12所示，当向DB水溶液中加入Al3+溶液后，DB的荧光强度在很短时间内达到最大值，之后荧光强度基本保持稳定，而且DB的荧光强度在一段时间内基本保持不变。证明DB能够对Al3+快速响应且可以很快达到平衡，不会发生光猝灭及光漂泊现象。
实验例6：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的pH影响的研究。
如图13(a)、(b)所示，配制母液浓度为2×10-3mol·L–1的DB，DB-Al3+无水乙醇溶液，分别用不同的pH溶液定容到2×10-5mol·L–1，测量其荧光光谱。
结果显示，纯DB溶液的荧光强度随溶液pH＝1升到pH＝4，荧光强度从10588个单位逐渐增强至22284个单位；pH在继续升至5，6荧光强度基本不变；pH增加到7荧光强度又明显下降，继续增加碱性至pH14，溶液荧光减至2000个单位强度。发射峰也从pH＝1时的507nm红移至pH＝14时的541nm。而DB与铝结合的溶液的荧光强度随溶液pH＝1升到pH＝4，荧光强度从10658个单位逐渐增强至21762个单位；pH在继续升至5，6荧光强度基本不变；pH增加到7-10荧光强度稍有下降，但没有纯DB溶液下降得快。继续增加碱性至pH14，溶液荧光减至5732个单位强度。发射峰也从pH＝1时的505nm红移至pH＝14时的540nm。由此可知，DB探针的最佳定量工作范围时pH＝4-6，而定性工作范围可以从pH＝3-10.
实验例7：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针对Al3+的检测限的研究。
移取3mL浓度为2×10-3、2×10-4、2×10-5mol·L–1的DB水溶液，每次加入20μL浓度为2×10-3、2×10-4、2×10-5mol·L–1的Al3+水溶液(由于每次加入20μL的Al3+水溶液体积相较于3mL的探针溶液体积差距极大，因此可忽略溶液体积的变化)。测试两者混合后的荧光强度，以Al3+溶液增加量为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制二者线性关系图，如图14所示。
根据检测限的计算公式3σ/k，(其中σ代表空白条件下DB溶液10次荧光强度的标准偏差，k表示铝离子浓度与荧光强度之间线性变化的斜率)计算出荧光探针分子对Al3+检测极限。DB对铝离子的检测限8.81×10-8mol/L，结合常数8.64×105L·mol。通过查阅相关文献可知，世界卫生组织规定对于饮用水中Al3+含量的最低标准为7.4×10-6mol/L，即DB探针可以满足对生活用水中铝离子检测的要求。
实验例8：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的细胞毒性研究。
采用MTT法检测DB对宫颈癌细胞HeLa的细胞毒性，将1×105个/mL的HeLa细胞接种至96孔板中，用200μL完全培养基(含10％胎牛血清和适量抗生素的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)培养，于培养箱中贴壁生长24h，弃去原完全培养基，给药孔加入用完全培养基稀释至12、24、36、48、60、72、84、96μmol·L–1的DB溶液，培养箱继续培养24h。避光加入MTT溶液10μL，继续孵育4h。最后，吸掉给药孔的培养液，每孔加150μL DMSO，将96孔板放置摇床上室温震荡10min，用酶标仪测量492nm处各给药孔的OD值。
在细胞荧光成像实验前，选用HeLa细胞作为模型细胞，以MTT法来检测DB的细胞毒性评价，如图15所示，在浓度为12、24、36、48、60、72、84、96μmol·L–1的DB中分别培养HeLa细胞24h，细胞的成活率基本在80％以上，说明DB对HeLa细胞的毒性较小，生物相容性比较好，可以应用于细胞成像。
实验例9：一种可用于铝离子检测与细胞成像的荧光探针的细胞内Al3+检测与成像研究。
将HeLa细胞悬液接种至孔板，用完全培养基培养，并放置培养箱中贴壁生长24h后，吸掉原培养基，给药孔加入DB(2μmol·L–1)孵育1h后，PBS清洗三次，除掉未进入细胞的DB，使用Zeiss LSM-880激光共聚焦显微镜观察细胞成像，之后继续加入Al3+(2μmol·L–1)溶液，孵育1h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞成像，同时，选用了商用染料商业染料DAPI(染核)与Dil(染膜)共定位。
由图16可知，探针DB能很好通过细胞膜，进入细胞质中。呈现绿色荧光(λex＝488nm，接收波段为λem＝492-560nm)。蓝色荧光(λex＝405nm，接收波段为λem＝405-470nm)为DAPI染料，细胞核呈蓝色。红色荧光(λex＝561nm，接收波段为λem＝570-670nm)为Dil染料，将染膜和细胞质都染成了红色。由此可见此系列探针在生物学领域具有潜在的应用价值。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的试纸检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将滤纸裁剪成pH试纸大小的长条形；
2）将上步骤裁剪好的滤纸放入2×10-4mol/L的DB水溶液中浸泡湿透，或者在上步骤裁剪好的滤纸上直接喷涂2×10-4mol/L的DB水溶液至湿透；
3）将上步骤浸泡或者喷涂好的滤纸夹出，置于空气中自然风干或者烘干后制成DB试纸；
4）将不同铝离子浓度的溶液、不同金属离子浓度的溶液，分别喷到或滴到上步骤得到的DB试纸上，置于紫外光下观察颜色变化；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针为2，5-二羟基对苯二甲酸，简称DB，其分子式为：C8H6O6，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的试纸检测方法，其特征在于：所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，紫外光照射下，DB发黄色荧光，加入Al3+后荧光显示为绿色，且Al3+的浓度越高，绿色荧光越明显；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，荧光光谱中DB在有Al3+时，荧光强度显著增强，并伴随蓝移现象，且随着Al3+浓度的递增，荧光强度不断增大；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测Al3+的同时，不会受到被检测物中其它共存金属离子的干扰，所述其它共存金属离子包括：Cu2+、Co2+、Al3+、Ba2+、Ni2 +、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ag+以及Fe2+；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测时，DB与Al3+会以1:1的比例形成络合物，在0.5-1.5min内完成，且可反复循环络合Al3+。
3.根据权利要求1所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的试纸检测方法，其特征在于：步骤1）所述的滤纸，是定性滤纸或者定量滤纸；
步骤2）通过浸泡或者喷涂，保证滤纸上附着有DB探针化合物以用来检验铝离子；
步骤3）所述的将上步骤中浸泡好的滤纸夹出，是用镊子；
步骤3）所述的烘干，是置于真空干燥箱中30-60min，温度45℃，真空度为0.08Mpa；
步骤4）所述的不同铝离子浓度的溶液，是1.0×10-8mol/L-1.0×10-3mol/L；所述的不同金属离子浓度的溶液是1.0×10-8mol/L-9.0×10-3mol/L；
步骤4）所述的置于紫外光下观察颜色变化，所述的紫外光是365nm紫外光，所述的颜色变化是颜色由黄色变为亮绿色。
4.用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的溶液比色检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）配制系列铝离子浓度分别为5×10-8mol/L，1×10-8mol/L，5×10-7mol/L，1×10-7mol/L，5×10-6mol/L，1×10-6mol/L，5×10-5mol/L，1×10-5mol/L，5×10-4mol/L，1×10-4mol/L，5×10-3mol/L，1×10-3mol/L溶液，其中每个溶液含DB浓度为1×10-3mol/L；
2）将上述溶液于暗室，365nm紫外光下拍照，记录各呈色图片，做为比色卡；
3）配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的DB水溶液作为探针溶液；
4）配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的铝水溶液作为待测溶液；
5）将步骤3）、步骤4）的溶液按照(1-2):1的摩尔比混合，反应20-30s；
6）将上步骤混合后的溶液通过紫外光照射观察颜色变化光谱是否有明显增强，与步骤2）中比色卡比对，判断浓度范围；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针为2，5-二羟基对苯二甲酸，简称DB，其分子式为：C8H6O6，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
5.根据权利要求4所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的溶液比色检测方法，其特征在于：所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，紫外光照射下，DB发黄色荧光，加入Al3+后荧光显示为绿色，且Al3+的浓度越高，绿色荧光越明显；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，荧光光谱中DB在有Al3+时，荧光强度显著增强，并伴随蓝移现象，且随着Al3+浓度的递增，荧光强度不断增大；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测Al3+的同时，不会受到被检测物中其它共存金属离子的干扰，所述其它共存金属离子包括：Cu2+、Co2+、Al3+、Ba2+、Ni2 +、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ag+以及Fe2+；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测时，DB与Al3+会以1:1的比例形成络合物，在0.5-1.5min内完成，且可反复循环络合Al3+。
6.根据权利要求4所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的溶液比色检测方法，其特征在于：步骤5）中，是将步骤3）、步骤4）的溶液按照1:1的摩尔比混合，反应30s。
7.用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的DB水溶液作为探针溶液；
2）配制1×10-3mol/L-1×10-8mol/L的铝水溶液作为待测溶液；
3）将步骤1）、步骤2）的溶液按照(1-2):1的摩尔比混合，反应20-30s；
4）将上步骤混合后通过荧光光谱测定荧光强度；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针为2，5-二羟基对苯二甲酸，简称DB，其分子式为：C8H6O6，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
8.根据权利要求7所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的定量检测方法，其特征在于：所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，紫外光照射下，DB发黄色荧光，加入Al3+后荧光显示为绿色，且Al3+的浓度越高，绿色荧光越明显；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，荧光光谱中DB在有Al3+时，荧光强度显著增强，并伴随蓝移现象，且随着Al3+浓度的递增，荧光强度不断增大；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测Al3+的同时，不会受到被检测物中其它共存金属离子的干扰，所述其它共存金属离子包括：Cu2+、Co2+、Al3+、Ba2+、Ni2 +、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ag+以及Fe2+；
所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针，在检测时，DB与Al3+会以1:1的比例形成络合物，在0.5-1.5min内完成，且可反复循环络合Al3+。
9.根据权利要求7所述的用于铝离子检测与细胞成像的小分子荧光探针的定量检测方法，其特征在于：步骤3）中，是将步骤1）、步骤2）的溶液按照1:1的摩尔比混合，反应30s。
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