CN108486018A - 一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌 - Google Patents

一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)AR281菌株，该短物乳杆菌AR281菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12890。本发明的短乳杆菌AR281可以有效的改善因去卵巢而引起骨吸收作用的加剧，使骨吸收恢复到正常水平，缓解因骨吸收过快而引起的骨骼抗形变能力的减弱和骨折风险的增高。

Description

一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌。
背景技术
骨的功能是为肌肉收缩提供附着处及保护内脏等重要的生命器官，一般认为，骨在细胞水平上是不活跃的，事实上骨的细胞在不停地进行着细胞代谢，有两种细胞在骨代谢中起着重要的作用，一种是吸收骨基质的破骨细胞，另一种是合成骨基质的成骨细胞。二者分布在骨膜、骨小梁及骨皮质处。成骨细胞起源于多能的间充质干细胞，破骨细胞则由有造血功能的骨髓单核细胞分化而来，单核细胞是破骨细胞、巨噬细胞和树突状细胞的共同前体细胞，局部微环境影响着单核细胞的分化方向，在巨噬细胞集落刺激因子M-CSF存在的情况下，能够增加破骨细胞的增殖和存活，并且提高细胞中核因子κB受体因子RANK的表达量，抑制核因子κB受体活化因子RANKL，从而促进破骨细胞的形成。在成骨细胞和破骨细胞相互作用的部位被称作为基本多细胞单位。在每一个基本多细胞单位，骨可因破骨细胞的吸收而消失，也能被重新合成骨的成骨细胞所取代。
由雌激素缺乏引起的骨质疏松症通常是高骨转换型骨质疏松症，即骨吸收和骨形成水平均高于健康人群，绝经后妇女是高骨转换骨质疏松症的高发人群，面临较高的骨折风险。因此，开发一种具有良好的降低骨吸收的能力，并缓解由骨吸收增高导致的骨骼抗形变能力减弱的短乳杆菌，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌。
本发明提供了一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)AR281菌株，具有这样的特征：短乳杆菌AR281菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12890。
本发明还提供了短乳杆菌(Lactobacillus brevis)AR281菌株在发酵制备用于缓解骨吸收症状的乳酸菌产品中的应用。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌，可以有效的改善因去卵巢而引起骨吸收作用的加剧，使骨吸收恢复到正常水平，缓解因骨吸收过快而引起的骨骼抗形变能力的减弱和骨折风险的增高。
附图说明
图1是本发明的实施例中的小鼠尿脱氧吡啶交联(DPD)含量示意图；
图2是本发明的实施例中的小鼠血清骨碱性磷酸酶(BALP)含量示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
下述实施例中，所采用的试剂如无特殊说明均从一般商业途径获得，未注明的实验条件均参照常规实验条件或遵照供应商建议的条件。
实施例一：短乳杆菌AR281的分离、培养及保藏
1、菌种分离与培养
步骤1，采集黄酒酒槽，以浓度梯度稀释法进行稀释，得到稀释液。
步骤2，取100uL的稀释液涂布于MRS培养基平板上进行40-56h的37℃的厌氧培养后，根据菌落的形状、大小、颜色等，将不同性状的分别挑至新的MRS培养基平板，进行划线分离纯化，得到分离菌株。
其中，每升MRS培养基的制作方法为：取牛肉浸出粉10g、酪蛋白胨10g、酵母浸粉5g、葡萄糖20g、三水乙酸钠8.3g、磷酸氢二钾2g、七水合硫酸镁0.58g、一水合硫酸锰0.25g，吐温-801mL，使用去离子水定容至1L，然后在115℃的条件下进行20min的灭菌。
步骤3，将分离菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶触试验，然后根据乳酸菌革兰氏染色阳性和无过氧化氢酶的特点来选取革兰氏染色阳性和过氧化氢酶触阴性的菌株。
步骤4，提取菌株的DNA，使用乳酸菌16srDNA片段通用引物27F/1492R，经PCR扩增后进行测序，然后与NCBI基因库中基因序列进行同源比较，得到短乳杆菌AR281菌株。
其中，27F为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R为5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
2、菌种保藏与活化
将短乳杆菌AR281菌株配置成植物乳杆菌AR281菌液，在菌液中加入终浓度20％的甘油，混匀后置于-80℃冰箱，可保存2-3年，在活化时将甘油冻存管取出，冰浴条件下融化，用无菌接种环将菌液接种到事先准备好的MRS培养皿中，置于厌氧培养箱中生长40h左右直至培养皿中长出完整菌落，即可进行传代。
另外，短乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR281菌株已经于2016年08月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.12890。
实施例二：短乳杆菌AR281缓解骨吸收症状功效评价
1、建立动物模型
SPF级雌性C57BL/6小鼠适应环境1周后，取体重18g±1g小鼠32只，禁食12小时(不禁水)，随机分组，每组8只，对每组的小鼠的腹腔注射70mg/kg麻醉剂戊巴比妥钠，并对其中8只在相应部位只作手术切口，不摘除卵巢作为假手术组，其余24只进行双侧卵巢摘除术，小鼠术后可正常活动，自行饮水摄食，术后伤口愈合正常，没有红肿、渗出、化脓等现象。
1.1双侧卵巢摘除术的方法
在对小鼠进行麻醉且麻醉成功后进行背位固定，在距最末肋骨下约1cm的位置剪毛，切开约1.5-2cm的皮肤，将距切口处左右两侧2cm范围内的的背肌和皮肤分离，视野中可见背肌下面白色的脂肪团，卵巢即包埋其中；用弯头眼科镊轻夹脂肪团拉到切口外，即可见到粉红色蜂窝状卵巢；用4号手术缝合线扎紧连接卵巢的输卵管，以防出血，再将卵巢完整摘除，同法摘除另一侧卵巢最后将子宫顺势送回原位，依次缝合背肌和皮肤。
2、动物分组及给药
将假手术组小鼠记为SHAM组，术后恢复正常的小鼠随机分为3组，分别记为OVX组，AR281组和E2组，SHAM组和OVX组给予0.9％生理盐水，AR281组给予短乳杆菌AR281菌悬液，E2组给予0.02％17β-雌二醇溶液，然后灌胃给药，给药体积为100μL/10g体重，每天给药，连续8周，并在给药过程中，每天称量一次体重，根据体重调整灌胃量。
其中，短乳杆菌AR281菌悬液的配制方法为：在温度为4℃，速度为6000rpm的条件下离心传至第三代的菌液，每代接种量为2％，生长时间为16h，弃上清，0.9％生理盐水重悬，重复上述步骤3次，直至离心后的上清液无色透明，根据AR281OD600的吸光值与CFU/mL的关系，用紫外可见分光光度计调节菌浓度，使得菌悬液最终浓度为10^9CFU/mL。
3、样品采集
4组小鼠均在末次给药后禁食12小时(不禁水)，然后称量体重，收集尿液和粪便，存放于-80℃冰箱，接着腹腔注射70mg/kg麻醉剂戊巴比妥钠，小鼠心脏穿刺取血并处死小鼠，血浆在25℃的室温下静置40min后以3500rpm的速度离心10min，然后小心吸取上层血清，存放于-80℃冰箱。
4、尿肌酐(Cr)测定
采用肌酐测定试剂盒(苦味酸法)测定小鼠尿液中Cr浓度，在碱性条件下，尿液中的肌酐能够和苦味酸作用形成橘黄色的复合物，用酶标仪检测505nm波长处吸光度的变化，即可计算出尿液中肌酐浓度。
4.1实验操作
步骤1，尿液样品前处理：以4000rpm的速度离心5min，小心吸取上层清液，然后用0.9％生理盐水稀释20倍用于肌酐检测。
步骤2，加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品有3个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取20μL，然后用排枪快速加入200μL工作液，轻轻晃动混匀后使用酶标仪在505nm处检测吸光值，精确计时5min后再检测第二次吸光值。
其中，R1：主要成分为0.32mol/L氢氧化钠，R2：主要成分为35mmol/L苦味酸，标准品：134mmol/L肌酐(水基质)，工作液：按1：1的比例将R1和R2混合而成的混合液，且现配现用。
4.2计算
用两次读取吸光度的差值，以空白管校零，计算ΔA空白及ΔA样本。然后根据公式计算样品肌酐浓度c(Cr样品)：
5、骨吸收标志物测定
采用小鼠脱氧吡啶交联(DPD)试剂盒测定小鼠尿DPD浓度，采用双抗体夹心法测定尿液样品中小鼠DPD的水平，用纯化的小鼠DPD抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入DPD，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的DPD抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的DPD呈正相关。计算出DPD浓度后用尿肌酐校正即为最终小鼠尿DPD含量。
5.1实验操作
步骤1，加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、标准孔、待测样品孔(每个样品3个复孔)。在酶标包被板上标准品和样品均准确加样50μL，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动摇匀。
步骤2，温育：用封板模封板后置37℃温育30min。
步骤3，洗涤：小心揭掉封板模，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
步骤4，加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
步骤5，温育：用封板模封板后置37℃温育30min。
步骤6，洗涤：小心揭掉封板模，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
步骤7，显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。
步骤8，终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
步骤9，测定：以空白孔调零，酶标仪450nm波长测量各孔的吸光值。测定应在加终止液后15min以内进行。
其中，试剂一：DPD标准品0.3mL×6瓶，分别为6.25nmol/L、12.5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L和200nmol/L；试剂二：标准品稀释液1.5mL×1瓶；试剂三：酶标试剂(HRP)6mL×1；试剂四：显色剂A液6mL×1瓶；试剂五：显色剂B液6mL×1瓶；试剂六：终止液6mL×1瓶，洗涤液：20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后的稀释液，现配现用。
5.2计算
图1是本发明的实施例中的小鼠尿脱氧吡啶交联(DPD)含量示意图。
以6个标准品得出的吸光值为纵坐标，DPD浓度横坐标，得到标准曲线(一次函数)，要求R2＞0.99。依据标准曲线计算样本DPD浓度，然后求得DPD与Cr的比值，即为小鼠尿液中DPD含量，结果如图1所示。
6、骨形成标志物测定
采用骨碱性磷酸酶Elisa试剂盒，测定小鼠血清BALP。用纯化的小鼠BALP抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入BALP，再与HRP标记的BALP抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加入底物TMB显色，HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的BALP呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中小鼠BALP浓度。
6.1实验操作
步骤1，加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、标准孔、待测样品孔(每个样品3个复孔)。在酶标包被板上标准品和样品均准确加样50μL，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动摇匀。
步骤2，温育：用封板模封板后置37℃温育30min。
步骤3，洗涤：小心揭掉封板模，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
步骤4，加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
步骤5，温育：用封板模封板后置37℃温育30min。
步骤6，洗涤：小心揭掉封板模，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
步骤7，显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。
步骤8，终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
步骤9，测定：以空白孔调零，酶标仪450nm波长测量各孔的吸光值。测定应在加终止液后15min以内进行。
其中，试剂一：BALP标准品0.3mL×6瓶，分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/L；试剂二：标准品稀释液1.5mL×1瓶；试剂三：酶标试剂(HRP)6mL×1；试剂四：显色剂A液6mL×1瓶；试剂五：显色剂B液6mL×1瓶；试剂六：终止液6mL×1瓶，洗涤液：20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后的稀释液，现配现用。
6.2计算
图2是本发明的实施例中的小鼠血清骨碱性磷酸酶(BALP)含量示意图。
以6个标准品得出的吸光值为纵坐标，BALP浓度横坐标，得到标准曲线(一次函数)，要求R2＞0.99。依据标准曲线计算样本BALP浓度，然后求得小鼠血清中BALP的含量，结果如图2所示。
7、股骨材料力学强度测定
使用万能材料试验机对右侧股骨进行三点弯曲试验，测定股骨最大弯曲应力、最大弯曲载荷和弹性模量，评价其抗形变能力，结果如表1所示。
表1：小鼠股骨材料力学强度
实施例的作用与效果
本发明的上述实施例中，采用小鼠骨质疏松模型，检测尿液中骨吸收标志物脱氧吡啶交联(DPD)和血清中骨形成标志物骨碱性磷酸酶(BALP)，并对小鼠股骨进行三点弯曲试验，评价短乳杆菌AR281干预后对骨吸收和骨形成，以及骨骼抗形变能力的影响。
通过OVX组与SHAM组相比，DPD含量极显著升高(p<0.01)，BALP含量极显著降低(p<0.01)，AR281干预后DPD含量较OVX组显著降低(p<0.05)，BALP含量无显著性差异，在使用万能材料试验机进行的三点弯曲试验中，OVX组较SHAM组，弹性模量显著降低，在AR281干预后，表现骨骼抗形变能力的弹性模量显著增高，甚至高于假手术组水平。由此可见，短乳杆菌AR281能够有效缓解由雌激素缺乏引起的骨吸收异常增强，并降低该症状带来的高骨折风险。
因此，本发明实施例所筛选出的短乳杆菌AR281可以有效的改善因去卵巢而引起骨吸收作用的加剧，使骨吸收恢复到正常水平，缓解因骨吸收过快而引起的骨骼抗形变能力的减弱和骨折风险的增高，所以该短乳杆菌AR281可以用来制备用于缓解骨吸收症状的乳酸菌产品，从而保证机体的健康。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种具有缓解骨吸收症状的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)AR281菌株，其特征在于：所述短乳杆菌AR281菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12890。
2.根据权利要求1所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)AR281菌株在发酵制备用于缓解骨吸收症状的乳酸菌产品中的应用。
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