CN108485980B - 一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置，所述的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法其使用的装置设有注射器、保藏管；所述的注射器包括注射件、注射管和注射针，所述的保藏管包括管体、管盖和接种管，所述厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法包括无菌保藏管的制备、无菌保护剂的制备、菌种培养、保藏管内保护剂的注入、菌种低温保藏和活化等步骤。

Description

一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置

技术领域

本发明涉及一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置。

背景技术

厌氧菌是一类需要在无分子氧条件下才能正常生长繁殖的微生物，在自然界中分布广泛，种类繁多。对厌氧菌菌种资源进行长期有效的保藏是这类资源实施有效共享的前提，其保藏技术的关键是要使该类微生物处于无氧环境中。菌种保藏技术是微生物研究、食品微生物检测等方面必不可少的基础技术，菌种保藏通常选择适宜菌龄的健壮繁殖体，保存于低温﹑隔氧﹑干燥﹑避光等环境中﹐尽量降低或停止微生物的代谢活动﹐减慢或停止生长繁殖，以在较长时期内保持菌株的性状和活力。目前菌种保藏方法主要包括定期移植法、矿油封藏法、沙土管法、麸皮法、液体干燥法、冷冻真空干燥法、低温冻结法、磁珠冷冻法等，但是上述方法应用于厌氧菌的保藏时，需要采用亨盖特厌氧技术或在厌氧操作箱内进行，还需要特制的无菌氮气。对于普通企业的发酵实验室，很难创造无菌且厌氧的实验环境，且菌种的厌氧保藏管在活化后难以排除氧气的干扰，只能废弃，造成利用率低。因此有必要进行改革创新。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、操作便捷的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置，为达到该目的，本发明采用的技术方案是：

本发明的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置，所述的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法其使用的装置设有注射器、保藏管；

所述的注射器设有注射件、注射管和注射针；所述的注射件包括活塞和活塞管,活塞的外径与活塞管内径对应并置入活塞管中，可沿活塞管作上下运动；活塞与活塞杆连接，活塞杆顶端设有手柄，手柄为平台,并与活塞杆构成丅形；活塞管底部直通固定管，固定管与固定套连接，活塞管顶端突出形成提手，提手与活塞管成 “L”形；所述的注射管由细长软管制成，注射管两端分别设有固定套和管针套，管针套连接注射针；在注射管靠近固定套的一端，设有至少一条第一标线，在注射管靠近管针套的一端，设有至少一条第二标线；所述的注射针呈细长管状，顶端膨大形成针尾，针尾连接管针套，注射针底端为针头；所述注射针的长度大于所述管体的长度；所述固定管与固定套的连接，使固定管直通注射管；所述管针套与注射针的连接，使注射管直通注射针；

所述的保藏管设有管体、管盖、以及置于管体内的至少一个接种管；所述的管体呈圆柱形，底部封闭，上端开口，所述管体的上端在外壁设有第二螺纹，所述管体的外壁设有至少一条刻度线；所述的管盖呈圆柱形，上端封闭，底部开口，内测设有第一螺纹；所述第一螺纹与第二螺纹的配合，可将所述的管盖紧密固定于所述的管体；所述的接种管呈细长圆柱形，底端设有至少一个开口，开口上方设有至少一个封隔层，开口下方凹陷形成集液池；

依据上述装置进行厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法包括以下步骤：

a.根据待保藏的菌种选择适宜的液体培养基，取适量注入所述保藏管的管体，再取液体石蜡至管体内，液体石蜡层的高度大于1 cm，并确保管体内置有至少一个接种管，将管盖松弛旋置于管体后，于适宜条件下高压蒸汽灭菌，灭菌后将保藏管迅速转移至洁净环境中、旋紧管盖后冷却备用；

b．配置浓度为50 %的甘油溶液至适宜容器内，再注入适量液体石蜡，并使液体石蜡层的高度大于1 cm，容器封口后置于121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min，之后迅速转移至洁净环境中，冷却，制成保护剂存储瓶，备用；

c.向备用的保藏管内液体培养基中，接种待保藏的菌种，然后将保藏管转移至适宜条件下培养；

d．培养结束后，于洁净环境中，取出无菌注射器的注射针，置于保护剂存储瓶中，所述的针头停留于液体石蜡处，抽动所述注射件的手柄，使液体石蜡经注射管流入活塞管，待活塞管内液体石蜡层的高度大于1 cm时，将注射针的针头由液体石蜡层移动至甘油溶液处，继续抽动手柄，抽取与液体培养基等体积的甘油溶液至活塞管，再将注射针的针头由甘油溶液层移动至液体石蜡层处，继续抽动手柄，当注射管内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管的第一标线处时，停止抽动手柄，静置片刻，待注射管内的液体不再流动时，将注射针自保护剂存储瓶中取出；操作过程中注射器始终保持正置；

e．将注射针插入保藏管内，使所述的针头停留于液体石蜡层处，推动手柄，将液体石蜡由注射管注入保藏管内，当注射管内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管的第二标线处时，将注射针的针头由液体石蜡层移动至液体培养基层，继续推动手柄，将甘油溶液注入液体培养基中，当注射管内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管的第二标线处时，停止推动手柄，轻轻旋转搅动注射针，将甘油溶液与液体培养基搅拌均匀，将注射针自保藏管内取出后，旋紧保藏管的管盖；操作过程中注射器始终保持正置，保藏管始终保持正置；

f．将保藏管正置于低温冷冻环境中保藏；

g． 菌种需要活化转接时，将保藏管自冷冻环境中取出解冻后，轻轻取出一个接种管，将接种管的集液池内的液体转移至适宜的培养基中，之后丢弃接种管，并将保藏管再次正置于低温冷冻环境中保藏备用；将接种的培养基置于适宜的条件培养；

h． 所述的保藏管和保护剂存储瓶在制备、灭菌、保藏和使用过程中始终保持正置。

与现有技术比较，采用本发明的技术方案，可以在普通含氧气的环境下，完成厌氧微生物菌种的保藏，每只保藏管可以多次使用，多次活化目标菌株，且不需要专用的厌氧设备，使厌氧微生物的菌种保藏工作更方便快捷。

本发明的有益效果是：注射器和保藏管的配合使用，采用厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法，可以在普通含氧气的环境下，完成厌氧菌菌种的保藏。且保藏管内置有多个接种管，可以多次活化目标菌种。因此使厌氧菌的菌种保藏工作更加便捷，且不需要专用的厌氧设备。可以加强厌氧微生物资源的安全与质量管理，以达到保护、利用和实现资源共享的目的。

附图说明

为了更清楚的说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明的注射器和保藏管配合使用时的结构示意图；

图2是本发明的保藏管的结构示意图;

图3是本发明的接种管底部的局部放大截面图；

图中：

1—注射件，11—手柄，12—活塞杆，13—提手，14—活塞管，15—活塞，16—固定管，

2—注射管，21—固定套，22—管针套，23—第一标线，24—第二标线，3—注射针，

31—针尾，32—针头，4—保藏管盖，41—第一螺纹，5—保藏管体，51—第二螺纹，

52—刻度线，6—接种管，61—封隔层，62—开口，63—集液池。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步的详细说明，应当理解，所描述的实施例仅仅用以解释本发明，不用于限定本发明。凡是基于本发明的技术方案所作的简化或者等同变化，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

本发明公开了一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置，当本发明被应用于婴儿双歧杆菌（菌株编号：CICC6069）的菌株保藏时，采用以下技术方案以达到本发明的有益效果：

所述的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法其使用的装置设有注射器、保藏管；

所述的注射器包括注射件1、注射管2和注射针3；所述的注射件1包括活塞15和活塞管14,活塞15的外径与活塞管14内径对应并置入活塞管15中，可沿活塞管15作上下运动；活塞15与活塞杆12连接，活塞杆12顶端设有手柄11。手柄11为平台,并与活塞杆12构成“丅”形，所述的“丅”形构造，使手柄11更加方便的受力，可以使手柄11的推拉操作更加便捷；当手柄11被移动时，在活塞杆12的联动下，可实现手柄11、活塞杆12、活塞14的同步运动。

活塞管14底部直通固定管16，固定管16与固定套21连接，固定管16与固定套21的连接较佳的选用可拆式，但是熟悉本技术领域的人员应认识到，固定管16与固定套21的连接也可以是一体成型等不可拆的方式，以及其它可能的方式。

活塞管14顶端突出形成提手13，提手13与活塞管14成“L”形；当活塞14沿着活塞管15作上下运动时，“L”形的提手13，使提手13更加方便的受力，因此提手13与手柄11的配合，可以使活塞14与活塞管15的相对运动更便捷。

熟悉本技术领域的人员应认识到，上述实施例中所涉及的活塞15和活塞管14的形状相同，较佳的选用圆形，但本发明也适用于诸如椭圆形、矩形或其它可能的形状；所述的活塞管14较佳的选用透明材质，以方便活塞管14内液体液面的观察。

所述注射器包括的注射件1、注射管2和注射针3等部件，可以分别选用不同的方式灭菌，例如高压蒸汽灭菌、化学灭菌、射线灭菌等，但是较佳的选用化学灭菌或射线灭菌的方式，将所述注射器的所有部件同时灭菌，灭菌后封装于独立的包装袋内备用。

所述的注射管2由细长软管制成，所述的软管较佳的选用透明的材质制成，其长度可以根据实际需要灵活调节，但是较佳的、所述软管的长度大于两倍注射针3的长度。所述的软管应该选用适当尺寸的内径，较佳的选用内径为2 mm的软管，当所述的内径足够的细时，可以避免不相容的两种液体在重力作用下形成乱流，因此可以保持不相容的两种液体的接触面在注射管2内的相对稳定。

注射管2两端分别设有固定套21和管针套22，管针套22连接注射针3；在注射管2靠近固定套21的一端，设有至少一条第一标线23，在注射管2靠近管针套22的一端，设有至少一条第二标线24；所述的第一标线23和第二标线24可以在厌氧菌菌种保藏的有氧操作时指示液面的移动终点。

所述的注射针3呈细长管状，顶端膨大形成针尾31，针尾31连接管针套22，注射针3底端为针头32；所述注射针3的长度大于所述管体5的长度；因此，在进行厌氧菌菌种保藏的有氧操作时，可以确保注射针3的针头32能够伸至管体5的底部；所述的注射针3的至少一部分较佳的选用刚性材质制成，所述的刚性材料包括玻璃、合成树脂或耐腐蚀金属等。

所述固定管16与固定套21的连接，使固定管16直通注射管2，所述管针套22与注射针3的连接，使注射管2直通注射针3，结合活塞管14底部直通固定管16，因此所述注射管2内腔的一端连通活塞管14的内腔，另一端连通注射针3的内腔，据此形成的内腔通道，可以使活塞管14内的流体（所述的流体包括空气或者液体石蜡或者甘油溶液）沿注射管2的内腔和注射针3的内腔连贯的流入或流出。

所述的保藏管包括管体5、管盖4、以及置于管体内的至少一个接种管6；所述的管体5呈圆柱形，底部封闭，上端开口，所述管体5的上端在外壁设有第二螺纹51，所述管体5的外壁设有至少一条刻度线52；所述的管盖4呈圆柱形，上端封闭，底部开口，内测设有第一螺纹41；所述第一螺纹41与第二螺纹42的配合，可将所述的管盖4紧密固定于所述的管体5；

所述的接种管6呈细长圆柱形，较佳的选用实心圆柱形，也可以选用空心圆柱形，接种管6的制作材质较佳的选用密度大于水的材质，以防止接种管6在保藏管内时受浮力的作用而浮起；所述接种管6的底端设有至少一个开口62，开口62上方设有至少一个封隔层61，当接种管6被设计为空心圆柱形时，封隔层61可以阻止液体在接种管6的空心内腔的流动，同时阻止接种管6上端的空气流入保藏管的液体培养基（MRS肉汤）中；所述的开口62下方凹陷形成集液池63，当婴儿双歧杆菌的保藏菌株需要被活化时，可以提起接种管6，集液池63则截留适量的菌液，以作为菌种转接至新鲜的无菌MRS肉汤培养基。

所述厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法包括以下步骤：

① 婴儿双歧杆菌较适宜的液体培养基为MRS肉汤，取2.5 ml MRS肉汤注入所述保藏管的管体5，再取5 ml液体石蜡至管体5内，管体5的内径被设置为1 cm，此时液体石蜡层的高度大于1 cm，且在管体5内放置20支左右的接种管6，将管盖4松弛旋置于管体5后，于121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，灭菌后将保藏管迅速转移至生物安全柜中、旋紧管盖4后冷却备用。所述MRS肉汤的配方如下：

②配置20 ml浓度为50 %的甘油溶液至50 ml离心管内，再注入20 ml液体石蜡，此时液体石蜡层的高度大于1 cm，容器封口后置于121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min，之后迅速转移至洁净环境中，冷却，制成保护剂存储瓶，备用；高压蒸汽灭菌可以去除液体石蜡和甘油溶液内的溶氧，保护剂存储瓶在灭菌完毕后终保持正置，以维持液体石蜡层处于甘油溶液层上方，液体石蜡层可以隔离空气，避免氧气再次进入甘油溶液。

③向备用的保藏管内液体培养基中，接种待保藏的婴儿双歧杆菌菌种，然后将保藏管转移至36 ℃条件下培养18~24小时。

④培养结束后，于生物安全柜中，取出无菌注射器的注射针3，置于保护剂存储瓶中，所述的针头32停留于液体石蜡处，抽动所述注射件1的手柄11，使液体石蜡经注射管2流入活塞管14，待活塞管14内液体石蜡层的高度大于1 cm时，将注射针3的针头32由液体石蜡层移动至甘油溶液内，继续抽动手柄11，抽取2.5 ml甘油溶液至活塞管14，再将注射针3的针头31由甘油溶液层移动至液体石蜡层处，继续抽动手柄11，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第一标线23处时，停止抽动手柄11，静置片刻，待注射管2内的液体不再流动时，将注射针3自保护剂存储瓶中取出；此时自注射管2的第一标线23处，经注射管2至注射针3，注射管2和注射针3内腔充满液体石蜡，可阻止空气经过注射管2与活塞管14的甘油溶液接触，防止氧气从注射管2进入甘油溶液；操作过程中注射器始终保持正置，活塞管14内液体石蜡层覆盖于甘油溶液上方，可以隔离空气，防止溶氧侵入甘油溶液。

⑤将注射针3插入保藏管内，使所述的针头32停留于液体石蜡层，推动手柄11，将液体石蜡由注射管2注入保藏管内，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第二标线24处时，将注射针3的针头32由液体石蜡层移动至液体培养基层，继续推动手柄11，将甘油溶液注入液体培养基中，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第二标线处24时，停止推动手柄11，轻轻旋转搅动注射针3，将甘油溶液与液体培养基搅拌均匀，将注射针3自保藏管内取出后，旋紧保藏管的管盖4；操作过程中注射器始终保持正置，保藏管始终保持正置。

⑥ 将保藏管正置于零下20℃的环境中保藏。

⑦ 当保藏的婴儿双歧杆菌菌种需要活化转接时，将保藏管自零下20℃的环境中取出解冻后，轻轻取出一个接种管6，将接种管6的集液池63内的菌液转移至新鲜的无菌MRS肉汤中，之后丢弃接种管3，并将保藏管再次正置于零下20℃保藏备用；将接种的MRS肉汤培养基置于36℃的条件培养。

⑧所述的保藏管在制备、灭菌、保藏和使用过程中始终保持正置，以确保液体石蜡层始终覆盖于MRS肉汤层的上方，以达到液体石蜡层有效隔离空气的效果，避免氧气再次进入MRS肉汤中。

婴儿双歧杆菌保藏3个月后，经定量活化，计算所得的存活率为67 %，存活率的计算公式为：

存活率=（保藏后的菌量÷保藏前的菌量）×100 %

实施例2：

本发明公开了一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置，本发明应用于动物双歧杆菌（菌株编号：CICC6165）的菌株保藏，采用以下技术方案以达到本发明的有益效果：所述的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法其使用的装置设有注射器、保藏管；本发明所述的注射器包括注射件1、注射管2和注射针3；所述的注射件1包括活塞15和活塞管14,活塞15的外径与活塞管14内径对应并置入活塞管15中，可沿活塞管15作上下运动；活塞15与活塞杆12连接，活塞杆12顶端设有手柄11。手柄11为平台,并与活塞杆12构成“丅”形，所述的“丅”形构造，使手柄11更加方便的受力，可以使手柄11的推拉操作更加便捷；当手柄11被移动时，在活塞杆12的联动下，可实现手柄11、活塞杆12、活塞14的同步运动。

活塞管14底部直通固定管16，固定管16与固定套21连接，固定管16与固定套21的连接较佳的选用可拆式，但是熟悉本技术领域的人员应认识到，固定管16与固定套21的连接也可以是一体成型等不可拆的方式，以及其它可能的方式。

活塞管14顶端突出形成提手13，提手13与活塞管14成“L”形；当活塞14沿着活塞管15作上下运动时，“L”形的提手13，使提手13更加方便的受力，因此提手13与手柄11的配合，可以使活塞14与活塞管15的相对运动更便捷。

熟悉本技术领域的人员应认识到，上述实施例中所涉及的活塞15和活塞管14的形状相同，较佳的选用圆形，但本发明也适用于诸如椭圆形、矩形或其它可能的形状；所述的活塞管14较佳的选用透明材质，以方便活塞管14内液体液面的观察。

所述注射器包括的注射件1、注射管2和注射针3等部件，可以分别选用不同的方式灭菌，例如高压蒸汽灭菌、化学灭菌、射线灭菌等，但是较佳的选用化学灭菌或射线灭菌的方式，将所述注射器的所有部件同时灭菌，灭菌后封装于独立的包装袋内备用。

所述的注射管2由细长软管制成，所述的软管较佳的选用透明的材质制成，其长度可以根据实际需要灵活调节，但是较佳的、所述软管的长度大于两倍注射针3的长度。所述的软管应该选用适当尺寸的内径，较佳的选用内径为2 mm的软管，当所述的内径足够的细时，可以避免不相容的两种液体在重力作用下形成乱流，因此可以保持不相容的两种液体的接触面在注射管2内的相对稳定。

注射管2两端分别设有固定套21和管针套22，管针套22连接注射针3；在注射管2靠近固定套21的一端，设有至少一条第一标线23，在注射管2靠近管针套22的一端，设有至少一条第二标线24；所述的第一标线23和第二标线24可以在厌氧菌菌种保藏的有氧操作时指示液面的移动终点。

所述的注射针3呈细长管状，顶端膨大形成针尾31，针尾31连接管针套22，注射针3底端为针头32；所述注射针3的长度大于所述管体5的长度；因此，在进行厌氧菌菌种保藏的有氧操作时，可以确保注射针3的针头32能够伸至管体5的底部；所述的注射针3的至少一部分较佳的选用刚性材质制成，所述的刚性材料包括玻璃、合成树脂或耐腐蚀金属等。

所述固定管16与固定套21的连接，使固定管16直通注射管2，所述管针套22与注射针3的连接，使注射管2直通注射针3，结合活塞管14底部直通固定管16，因此所述注射管2内腔的一端连通活塞管14的内腔，另一端连通注射针3的内腔，据此形成的内腔通道，可以使活塞管14内的流体（所述的流体包括空气或者液体石蜡或者甘油溶液）沿注射管2的内腔和注射针3的内腔连贯的流入或流出。

所述的保藏管包括管体5、管盖4、以及置于管体内的至少一个接种管6；所述的管体5呈圆柱形，底部封闭，上端开口，所述管体5的上端在外壁设有第二螺纹51，所述管体5的外壁设有至少一条刻度线52；所述的管盖4呈圆柱形，上端封闭，底部开口，内测设有第一螺纹41；所述第一螺纹41与第二螺纹42的配合，可将所述的管盖4紧密固定于所述的管体5；

所述的接种管6呈细长圆柱形，较佳的选用实心圆柱形，也可以选用空心圆柱形，接种管6的制作材质较佳的选用密度大于水的材质，以防止接种管6在保藏管内时受浮力的作用而浮起；所述接种管6的底端设有至少一个开口62，开口62上方设有至少一个封隔层61，当接种管6被设计为空心圆柱形时，封隔层61可以阻止液体在接种管6的空心内腔的流动，同时阻止接种管6上端的空气流入保藏管的液体培养基（MRS肉汤）中；所述的开口62下方凹陷形成集液池63，当动物双歧杆菌的保藏菌株需要被活化时，可以提起接种管6，集液池63则截留适量的菌液，以作为菌种转接至新鲜的无菌MRS肉汤培养基。

所述厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法包括以下步骤：

①动物双歧杆菌较适宜的液体培养基为MRS肉汤（所述MRS肉汤的配方同实施例1），取2.5 ml MRS肉汤注入所述保藏管的管体5，再取5 ml液体石蜡至管体5内，管体5的内径被设置为1 cm，此时液体石蜡层的高度大于1 cm，且在管体5内放置20支左右的接种管6，将管盖4松弛旋置于管体5后，于121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，灭菌后将保藏管迅速转移至生物安全柜中、旋紧管盖4后冷却备用。

② 配置20 ml浓度为50 %的甘油溶液至50 ml离心管内，再注入20 ml液体石蜡，此时液体石蜡层的高度大于1 cm，容器封口后置于121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min，之后迅速转移至洁净环境中，冷却，制成保护剂存储瓶，备用；高压蒸汽灭菌可以去除液体石蜡和甘油溶液内的溶氧，保护剂存储瓶在灭菌完毕后终保持正置，以维持液体石蜡层处于甘油溶液层上方，液体石蜡层可以隔离空气，避免氧气再次进入甘油溶液。

③向备用的保藏管内液体培养基中，接种待保藏的动物双歧杆菌菌种，然后将保藏管转移至36 ℃条件下培养18~24小时。

④培养结束后，于生物安全柜中，取出无菌注射器的注射针3，置于保护剂存储瓶中，所述的针头32停留于液体石蜡处，抽动所述注射件1的手柄11，使液体石蜡经注射管2流入活塞管14，待活塞管14内液体石蜡层的高度大于1 cm时，将注射针3的针头32由液体石蜡层移动至甘油溶液内，继续抽动手柄11，抽取2.5 ml甘油溶液至活塞管14，再将注射针3的针头31由甘油溶液层移动至液体石蜡层处，继续抽动手柄11，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第一标线23处时，停止抽动手柄11，静置片刻，待注射管2内的液体不再流动时，将注射针3自保护剂存储瓶中取出；此时自注射管2的第一标线23处，经注射管2至注射针3，注射管2和注射针3内腔充满液体石蜡，可阻止空气经过注射管2与活塞管14的甘油溶液接触，防止氧气从注射管2进入甘油溶液；操作过程中注射器始终保持正置，活塞管14内液体石蜡层覆盖于甘油溶液上方，可以隔离空气，防止溶氧侵入甘油溶液。

⑤将注射针3插入保藏管内，使所述的针头32停留于液体石蜡层，推动手柄11，将液体石蜡由注射管2注入保藏管内，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第二标线24处时，将注射针3的针头32由液体石蜡层移动至液体培养基层，继续推动手柄11，将甘油溶液注入液体培养基中，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第二标线处24时，停止推动手柄11，轻轻旋转搅动注射针3，将甘油溶液与液体培养基搅拌均匀，将注射针3自保藏管内取出后，旋紧保藏管的管盖4；操作过程中注射器始终保持正置，保藏管始终保持正置。

⑥将保藏管正置于零下70℃的环境中保藏。

⑦当保藏的动物双歧杆菌菌种需要活化转接时，将保藏管自零下20℃的环境中取出解冻后，轻轻取出一个接种管6，将接种管6的集液池63内的菌液转移至新鲜的无菌MRS肉汤中，之后丢弃接种管3，并将保藏管再次正置于零下70℃保藏备用；将接种的MRS肉汤培养基置于36℃的条件培养。

⑧所述的保藏管在制备、灭菌、保藏和使用过程中始终保持正置，以确保液体石蜡层始终覆盖于MRS肉汤层的上方，以达到液体石蜡层有效隔离空气的效果，避免氧气再次进入MRS肉汤中。

动物双歧杆菌保藏3个月后，经定量活化，计算所得的存活率为49 %，存活率的计算公式同实施例1

实施例3

本发明公开了一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法及其装置，本发明应用于产气荚膜梭菌（菌株编号：ATCC13124）的菌株保藏时，也可以达到本发明的有益效果，采用的技术方案为：所述的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法其使用的装置设有注射器、保藏管；所述的注射器包括注射件1、注射管2和注射针3；所述的注射件1包括活塞15和活塞管14,活塞15的外径与活塞管14内径对应并置入活塞管15中，可沿活塞管15作上下运动；活塞15与活塞杆12连接，活塞杆12顶端设有手柄11。手柄11为平台,并与活塞杆12构成“丅”形，所述的“丅”形构造，使手柄11更加方便的受力，可以使手柄11的推拉操作更加便捷；当手柄11被移动时，在活塞杆12的联动下，可实现手柄11、活塞杆12、活塞14的同步运动。

活塞管14底部直通固定管16，固定管16与固定套21连接，固定管16与固定套21的连接较佳的选用可拆式，但是熟悉本技术领域的人员应认识到，固定管16与固定套21的连接也可以是一体成型等不可拆的方式，以及其它可能的方式。

活塞管14顶端突出形成提手13，提手13与活塞管14成“L”形；当活塞14沿着活塞管15作上下运动时，“L”形的提手13，使提手13更加方便的受力，因此提手13与手柄11的配合，可以使活塞14与活塞管15的相对运动更便捷。

熟悉本技术领域的人员应认识到，上述实施例中所涉及的活塞15和活塞管14的形状相同，较佳的选用圆形，但本发明也适用于诸如椭圆形、矩形或其它可能的形状；所述的活塞管14较佳的选用透明材质，以方便活塞管14内液体液面的观察。

所述注射器包括的注射件1、注射管2和注射针3等部件，可以分别选用不同的方式灭菌，例如高压蒸汽灭菌、化学灭菌、射线灭菌等，但是较佳的选用化学灭菌或射线灭菌的方式，将所述注射器的所有部件同时灭菌，灭菌后封装于独立的包装袋内备用。

所述的注射管2由细长软管制成，所述的软管较佳的选用透明的材质制成，其长度可以根据实际需要灵活调节，但是较佳的、所述软管的长度大于两倍注射针3的长度。所述的软管应该选用适当尺寸的内径，较佳的选用内径为2 mm的软管，当所述的内径足够的细时，可以避免不相容的两种液体在重力作用下形成乱流，因此可以保持不相容的两种液体的接触面在注射管2内的相对稳定。

注射管2两端分别设有固定套21和管针套22，管针套22连接注射针3；在注射管2靠近固定套21的一端，设有至少一条第一标线23，在注射管2靠近管针套22的一端，设有至少一条第二标线24；所述的第一标线23和第二标线24可以在厌氧菌菌种保藏的有氧操作时指示液面的移动终点。

所述的注射针3呈细长管状，顶端膨大形成针尾31，针尾31连接管针套22，注射针3底端为针头32；所述注射针3的长度大于所述管体5的长度；因此，在进行厌氧菌菌种保藏的有氧操作时，可以确保注射针3的针头32能够伸至管体5的底部；所述的注射针3的至少一部分较佳的选用刚性材质制成，所述的刚性材料包括玻璃、合成树脂或耐腐蚀金属等。

所述固定管16与固定套21的连接，使固定管16直通注射管2，所述管针套22与注射针3的连接，使注射管2直通注射针3，结合活塞管14底部直通固定管16，因此所述注射管2内腔的一端连通活塞管14的内腔，另一端连通注射针3的内腔，据此形成的内腔通道，可以使活塞管14内的流体（所述的流体包括空气或者液体石蜡或者甘油溶液）沿注射管2的内腔和注射针3的内腔连贯的流入或流出。

所述的保藏管包括管体5、管盖4、以及置于管体内的至少一个接种管6；所述的管体5呈圆柱形，底部封闭，上端开口，所述管体5的上端在外壁设有第二螺纹51，所述管体5的外壁设有至少一条刻度线52；所述的管盖4呈圆柱形，上端封闭，底部开口，内测设有第一螺纹41；所述第一螺纹41与第二螺纹42的配合，可将所述的管盖4紧密固定于所述的管体5；

所述的接种管6呈细长圆柱形，较佳的选用实心圆柱形，也可以选用空心圆柱形，接种管6的制作材质较佳的选用密度大于水的材质，以防止接种管6在保藏管内时受浮力的作用而浮起；所述接种管6的底端设有至少一个开口62，开口62上方设有至少一个封隔层61，当接种管6被设计为空心圆柱形时，封隔层61可以阻止液体在接种管6的空心内腔的流动，同时阻止接种管6上端的空气流入保藏管的液体培养基（FT肉汤）中；所述的开口62下方凹陷形成集液池63，当产气荚膜梭菌的保藏菌株需要被活化时，可以提起接种管6，集液池63则截留适量的菌液，以作为菌种转接至新鲜的无菌FT肉汤培养基。

所述厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法包括以下步骤：

①产气荚膜梭菌较适宜的液体培养基为FT肉汤，取2.5 ml FT肉汤注入所述保藏管的管体5，再取5 ml液体石蜡至管体5内，管体5的内径被设置为1 cm，此时液体石蜡层的高度大于1 cm，且在管体5内放置20支左右的接种管6，将管盖4松弛旋置于管体5后，于121℃高压蒸汽灭菌15 min，灭菌后将保藏管迅速转移至生物安全柜中、旋紧管盖4后冷却备用。所述FT肉汤的配方如下：

酪胨（胰酶水解）	15.0 g/l
		L—胱氨酸	0.5 g/l
葡萄糖	5.0 g/l
		酵母浸出粉	5.0 g/l
氯化钠	2.5 g/l
		硫乙醇酸钠	0.5 g/l
刃天青	0.001 g/l
		25℃时的pH值	7.1±0.2

②配置20 ml浓度为50 %的甘油溶液至50 ml离心管内，再注入20 ml液体石蜡，此时液体石蜡层的高度大于1 cm，容器封口后置于121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min，之后迅速转移至洁净环境中，冷却，制成保护剂存储瓶，备用；高压蒸汽灭菌可以去除液体石蜡和甘油溶液内的溶氧，保护剂存储瓶在灭菌完毕后终保持正置，以维持液体石蜡层处于甘油溶液层上方，液体石蜡层可以隔离空气，避免氧气再次进入甘油溶液。

③向备用的保藏管内液体培养基中，接种待保藏的产气荚膜梭菌菌种，然后将保藏管转移至36 ℃条件下培养18~24小时。

④培养结束后，于生物安全柜中，取出无菌注射器的注射针3，置于保护剂存储瓶中，所述的针头32停留于液体石蜡处，抽动所述注射件1的手柄11，使液体石蜡经注射管2流入活塞管14，待活塞管14内液体石蜡层的高度大于1 cm时，将注射针3的针头32由液体石蜡层移动至甘油溶液内，继续抽动手柄11，抽取2.5 ml甘油溶液至活塞管14，再将注射针3的针头31由甘油溶液层移动至液体石蜡层处，继续抽动手柄11，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第一标线23处时，停止抽动手柄11，静置片刻，待注射管2内的液体不再流动时，将注射针3自保护剂存储瓶中取出；此时自注射管2的第一标线23处，经注射管2至注射针3，注射管2和注射针3内腔充满液体石蜡，可阻止空气经过注射管2与活塞管14的甘油溶液接触，防止氧气从注射管2进入甘油溶液；操作过程中注射器始终保持正置，活塞管14内液体石蜡层覆盖于甘油溶液上方，可以隔离空气，防止溶氧侵入甘油溶液。

⑤ 将注射针3插入保藏管内，使所述的针头32停留于液体石蜡层，推动手柄11，将液体石蜡由注射管2注入保藏管内，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第二标线24处时，将注射针3的针头32由液体石蜡层移动至液体培养基层，继续推动手柄11，将甘油溶液注入液体培养基中，当注射管2内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管2的第二标线处24时，停止推动手柄11，轻轻旋转搅动注射针3，将甘油溶液与液体培养基搅拌均匀，将注射针3自保藏管内取出后，旋紧保藏管的管盖4；操作过程中注射器始终保持正置，保藏管始终保持正置。

⑥将保藏管正置于零下70℃的环境中保藏。

⑦ 当保藏的产气荚膜梭菌菌种需要活化转接时，将保藏管自零下20℃的环境中取出解冻后，轻轻取出一个接种管6，将接种管6的集液池63内的菌液转移至新鲜的无菌FT肉汤中，之后丢弃接种管3，并将保藏管再次正置于零下70℃保藏备用；将接种的FT肉汤培养基置于36℃的条件培养。

⑧所述的保藏管在制备、灭菌、保藏和使用过程中始终保持正置，以确保液体石蜡层始终覆盖于FT肉汤层的上方，以达到液体石蜡层有效隔离空气的效果，避免氧气再次进入FT肉汤中。

产气荚膜梭菌保藏19个月后，经定量活化，计算所得的存活率为83 %，存活率的计算公式同实施例1

以上通过对所列实施方式的介绍，阐述了本发明的基本构思和基本原理。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并非限定性穷举。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法，其特征在于，所述的厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法其使用的装置设有注射器、保藏管；所述的注射器设有注射件、注射管和注射针；所述的注射件包括活塞和活塞管,活塞的外径与活塞管内径对应并置入活塞管中，可沿活塞管作上下运动；活塞与活塞杆连接，活塞杆顶端设有手柄，手柄为平台,并与活塞杆构成丅形；活塞管底部直通固定管，固定管与固定套连接，活塞管顶端突出形成提手，提手与活塞管成 “L”形；所述的注射管由细长软管制成，注射管两端分别设有固定套和管针套，管针套连接注射针；在注射管靠近固定套的一端，设有至少一条第一标线，在注射管靠近管针套的一端，设有至少一条第二标线；所述的注射针呈细长管状，顶端膨大形成针尾，针尾连接管针套，注射针底端为针头；所述注射针的长度大于所述保藏管管体的长度；所述固定管与固定套的连接，使固定管直通注射管；所述管针套与注射针的连接，使注射管直通注射针；

所述的保藏管设有管体、管盖、以及置于管体内的至少一个接种管；所述的管体呈圆柱形，底部封闭，上端开口，所述管体的上端在外壁设有第二螺纹，所述管体的外壁设有至少一条刻度线；所述的管盖呈圆柱形，上端封闭，底部开口，内测设有第一螺纹；所述第一螺纹与第二螺纹的配合，可将所述的管盖紧密固定于所述的管体；所述的接种管呈细长圆柱形，底端设有至少一个开口，开口上方设有至少一个封隔层，开口下方凹陷形成集液池；

依据上述装置进行厌氧菌菌种保藏的有氧操作方法包括以下步骤：

a.根据待保藏的菌种选择适宜的液体培养基，取适量注入所述保藏管的管体，再取液体石蜡至管体内，液体石蜡层的高度大于1 cm，并确保管体内置有至少一个接种管，将管盖松弛旋置于管体后，于适宜条件下高压蒸汽灭菌，灭菌后将保藏管迅速转移至洁净环境中、旋紧管盖后冷却备用；

b．配置浓度为50 %的甘油溶液至适宜容器内，再注入适量液体石蜡，并使液体石蜡层的高度大于1 cm，容器封口后置于121 ℃条件下高压蒸汽灭菌30 min，之后迅速转移至洁净环境中，冷却，制成保护剂存储瓶，备用；

c.向备用的保藏管内液体培养基中，接种待保藏的菌种，然后将保藏管转移至适宜条件下培养；

d．培养结束后，于洁净环境中，取出无菌注射器的注射针，置于保护剂存储瓶中，所述的针头停留于液体石蜡处，抽动所述注射件的手柄，使液体石蜡经注射管流入活塞管，待活塞管内液体石蜡层的高度大于1 cm时，将注射针的针头由液体石蜡层移动至甘油溶液处，继续抽动手柄，抽取与液体培养基等体积的甘油溶液至活塞管，再将注射针的针头由甘油溶液层移动至液体石蜡层处，继续抽动手柄，当注射管内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管的第一标线处时，停止抽动手柄，静置片刻，待注射管内的液体不再流动时，将注射针自保护剂存储瓶中取出；操作过程中注射器始终保持正置；

e．将注射针插入保藏管内，使所述的针头停留于液体石蜡层处，推动手柄，将液体石蜡由注射管注入保藏管内，当注射管内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管的第二标线处时，将注射针的针头由液体石蜡层移动至液体培养基层，继续推动手柄，将甘油溶液注入液体培养基中，当注射管内的液体石蜡与甘油溶液的接触面移动至注射管的第二标线处时，停止推动手柄，轻轻旋转搅动注射针，将甘油溶液与液体培养基搅拌均匀，将注射针自保藏管内取出后，旋紧保藏管的管盖；操作过程中注射器始终保持正置，保藏管始终保持正置；

f．将保藏管正置于低温冷冻环境中保藏；

g． 菌种需要活化转接时，将保藏管自冷冻环境中取出解冻后，轻轻取出一个接种管，将接种管的集液池内的液体转移至适宜的培养基中，之后丢弃接种管，并将保藏管再次正置于低温冷冻环境中保藏备用；将接种的培养基置于适宜的条件培养；

h． 所述的保藏管和保护剂存储瓶在制备、灭菌、保藏和使用过程中始终保持正置。

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