CN110055180A - 一种厌氧菌的菌种保藏方法 - Google Patents

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何宏魁
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明公开了一种厌氧菌的菌种保藏方法，首先将待保藏菌种接种于无氧的液体培养基中，培养生长至对数期；然后在厌氧工作站中使用注射器将对数期新鲜培养菌液转移入菌种保藏冻存管中，加入防冻剂震荡混匀菌液；最后加入液体石蜡—氧气隔离剂后于‑80℃冷冻保藏。本发明菌种保藏方法适合于厌氧菌(兼性厌氧菌/绝对厌氧菌)的长期保藏。采用本发明的保藏方法，能够大大降低菌种的保藏成本，实现菌种在无氧条件下长期有效的保藏，有利于对厌氧微生物的研究和利用。

Description

一种厌氧菌的菌种保藏方法
技术领域
本发明涉及一种厌氧菌的菌种保藏方法，属于微生物技术领域。
背景技术
微生物菌种保藏技术是微生物领域一种很基础且重要的技术。厌氧微生物是一类需要在无分子氧或者低氧化还原电位条件下才能正常生长繁殖的微生物。由于氧气对厌氧微生物的生理毒性，其培养和保藏技术的关键是要使该类微生物处于无氧或氧化还原电位低的环境中。因而，厌氧菌的长期保藏技术存在操作相对繁琐，成功率相对低的问题。
现存的针对厌氧菌的菌种保藏方法，诸如：定期移植保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温保藏法和-80℃低温冷冻等。这些菌种保藏方法依其保藏条件的苛刻程度不同，保存时间长度不同。定期移植保藏法虽然操作简单，但是保藏周期较短，一般1～3个月转接一次，且易污染杂菌或引致死亡，菌种也易发生变异；冷冻干燥法保藏法虽然保藏周期较长，但操作过程中易与氧气接触而导致严格厌氧菌存活率不高；而液氮超低温保藏法虽然保藏周期也较长，由于液氮极易挥发，保藏成本较高，且液氮危险系数较高；而-80℃低温冷冻保藏在厌氧菌保藏方面操作技术比较笼统。
发明内容
本发明为了避免上述现有技术所存在的不足之处，在-80℃低温冷冻保藏方法的基础上，提供了一种厌氧菌的菌种保藏方法，该方法操作相对简便，保藏周期超过2年。
本发明所提供的菌种保藏方法对于那些具有厌氧菌基本培养设施的实验室即可应用，不需要亨盖特滚管技术、安剖瓶技术等复杂的操作技术或设备。
本发明厌氧菌的菌种保藏方法，包括无氧培养基的配制、待保藏菌液的富集、待保藏菌种的密封和保藏、保藏菌种的复苏等步骤；
步骤1：无氧液体培养基的配制
根据待保藏厌氧菌生长所需要的营养成分配制新鲜的液体培养基，调到合适的pH值，排除培养基中的氧气，高温灭菌冷却后即可获得无氧液体培养基；
所述液体培养基的组成：MES 0.3‰～1‰、KH2PO4 0.3‰～0.7‰、Na2SO4 0.1‰～0.5‰、NaCl 0.8‰～1.2‰、MgCl2·6H2O 0.2‰～0.7‰、NaHCO3 0.2‰～0.4‰、CaCl2·2H2O 0.1‰～0.3‰、酵母提取物1‰～3‰、蛋白胨1‰～3‰、D-葡萄糖0.2‰～0.7‰、可溶性淀粉1‰～5‰、还原剂0.5‰～3‰、刃天青0.03‰～0.07‰、窖泥浸提液20％～30％、黄水10％～15％，pH值6.5-7.0。
所述窖泥浸提液是通过如下方法获得：将新鲜老窖泥(窖龄≥50年)与去离子水按照质量体积比1g:5mL混合均匀，于10000rmp/min离心10min，吸取上清液即得窖泥浸提液。
步骤2：待培养菌种的富集
在无菌无氧条件下，将待保藏菌种接种于步骤1配制的液体培养基中，然后在无氧、33℃～35℃、90～100rpm/min条件下培养至对数期，以保证菌种最佳生命状态；本步骤视菌种对氧气的耐受情况不同在满足其对氧气含量要求的容器中培养，比如绝对厌氧菌需要在隔绝氧气效果好的带有丁基塞的厌氧瓶中进行。
步骤3：待保藏菌种的保藏
在无菌无氧条件下，用无菌注射器吸取对数期菌液至无菌除氧的保藏管中；接着吸取防冻保护剂加入保藏管中，将保藏管上下颠倒充分混匀；随后加入液体石蜡后封盖，置于-80℃保藏。液体石蜡和保藏管的盖子，作为隔离氧气的双重保障。无菌注射器在使用前须在无氧环境下多次换气，以保证彻底消除注射器中携带的氧气。本步骤使用的菌种保藏管视待保藏厌氧菌对氧气的耐受情况而定，如待保藏厌氧菌为绝对厌氧菌，则保藏管应选用带螺纹的菌种保藏管，以保证其对氧气的隔绝程度。
步骤4：保藏菌种的复苏
活化菌种时，取出保藏管于室温融化，或者于适宜温度(该温度不得高于菌种的最高耐受温度)下水浴融化，然后在无菌无氧条件下接种于无氧的液体培养基中，于三气培养箱中33℃～35℃培养3～5天，观察菌株存活情况。
本发明厌氧菌的菌种保藏方法，最终的菌种保藏液中含有20％～40％体积分数的菌液，20％～40％体积分数的防冻保护剂，8％～12％体积分数的液体石蜡。所述体积分数是指液体所占菌种保藏管的体积之比。
步骤1中，所述还原剂为L-半胱氨酸盐酸盐或Na2S；液体培养基灭菌前先进行除氧处理(如通N2)，以保证培养基的无氧状态。
步骤3中，所述防冻保护剂根据不同微生物要求不同，选择不同，如甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、吐温-80等中的一种或几种。
步骤3中，防冻保护剂和液体石蜡均经过除氧和灭菌处理，以保证无氧气携入菌种保藏管。
进一步地，液体培养基、防冻保护剂和液体石蜡在除氧时须加入氧气指示剂(如刃天青等)后通N2直到氧气指示剂显示氧气去除干净为止。防冻保护剂和液体石蜡的高温灭菌条件为121℃灭菌20min。
进一步地，步骤3中，用无菌注射器在无氧环境(如厌氧工作站)下，换气多次保证其无氧气存在后，吸取1～2mL对数期菌液至5mL保存管(提前灭菌处理)中；然后向保存管中加入1～2mL无氧防冻保护剂，上下颠倒混匀；最后再加入0.3～0.6mL的液体石蜡(提前氮气除氧灭菌处理)后放入-80℃超低温冰箱中保存。
进一步地，步骤4中，活化菌种时，将保藏管于35℃～40℃恒温水浴中快速摇动直至全部融化，然后在无氧环境中(如厌氧工作站)接种于无氧的液体培养基中(提前除氧灭菌处理)，于三气培养箱中33℃～35℃下培养3～5天，观察菌株存活情况。
步骤1中，液体培养基的高温灭菌条件视不同培养基有所差异，本发明中的液体培养基灭菌条件为115℃灭菌20min。
采用本发明的保藏方法，能够大大降低菌种的保藏成本，实现菌种在无氧条件下长期有效的保藏，有利于对厌氧微生物的研究和利用。本发明菌种保藏方法适合于厌氧菌(兼性厌氧菌以及绝对厌氧菌)的长期保藏。
具体实施方式
实施例1：液体培养基的配制
称取0.5g MES、0.5g KH2PO4、0.2g Na2SO4、1.0g NaCl、0.4g MgCl2·6H2O、0.3gNaHCO3、0.15g CaCl2·2H2O、1.0g酵母提取物、1.5g蛋白胨、0.5g D-葡萄糖、1.0g L-半胱氨酸盐酸盐、6mg刃天青加入到烧杯中，再称取5g可溶性淀粉于小烧杯中加入适量纯水加热至完全溶解，将量取的200mL窖泥浸提液、100mL黄水和完全溶解的淀粉倒入烧杯中，加水至1L，充分混匀溶解，然后调整pH值在6.5～7之间，将培养基分装于100mL的带有丁基塞的厌氧瓶中，通入N2除氧至指示剂颜色消失，115℃灭菌20min，得到液体培养基。
实施例2：
本实施例为单个厌氧菌种的保藏方法，具有以下步骤：
(1)将厌氧菌Oscillibacter valericigenes接种于实施例1制得的液体培养基中培养至对数期；
(2)用无菌注射器吸取1mL Oscillibacter valericigenes菌液于无菌除氧的5mL冻存管中，取防冻剂1mL加入冻存管中，将冻存管上下颠倒几次使防冻剂与菌液充分混匀，再加入0.5mL除氧灭菌后的液体石蜡以隔绝菌液与氧气的接触；
(3)菌株Oscillibacter valericigenes做5管保藏，在冻存管上做好标记，并放入-80℃超低温冰箱中保存。
(4)复苏时，从冰箱中取出一支冻存管于37℃水浴中快速摇动，直至管中的冰全部融化为止，在厌氧工作站中接种于无菌除氧的新鲜液体培养基中，34℃培养3天，观察菌株存活情况。
步骤(1)(4)中的液体培养基添加刃天青作为无氧指示剂，有氧时液体培养基呈现紫色或粉红色，无氧时呈现培养基的颜色。
实施例3：
将Ruminococcaceae bacterium、Clostridium guangxiense、Clostridiumsaccharobutylicum、Clostridium celerecrescens等厌氧菌按照实施例2的菌种保藏方法进行保藏，并对所保藏菌种在两年内的不同时间段复苏后的存活性进行检测，结果见表1。
表1不同保藏时期菌种活力检测
由表1可知，使用本发明的方法保藏的厌氧菌菌种在保藏两年内的不同时间段进行复苏后，所有的菌种均存活。

Claims (8)

1.一种厌氧菌的菌种保藏方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：无氧液体培养基的配制
根据待保藏厌氧菌生长所需要的营养成分配制新鲜的液体培养基，调到合适的pH值，排除培养基中的氧气，高温灭菌冷却后即可获得无氧液体培养基；
步骤2：待培养菌种的富集
在无菌无氧条件下，将待保藏菌种接种于步骤1配制的液体培养基中，然后在无氧、33℃～35℃、90～100rpm/min条件下培养至对数期，以保证菌种最佳生命状态；
步骤3：待保藏菌种的保藏
在无菌无氧条件下，用无菌注射器吸取对数期菌液至无菌除氧的保藏管中；接着吸取防冻保护剂加入保藏管中，将保藏管上下颠倒充分混匀；随后加入液体石蜡后封盖，置于-80℃保藏；
步骤4：保藏菌种的复苏
活化菌种时，取出保藏管于室温融化，或者于适宜温度下水浴融化，然后在无菌无氧条件下接种于无氧的液体培养基中，于三气培养箱中33℃～35℃培养3～5天，观察菌株存活情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述液体培养基的组成：MES 0.3‰～1‰、KH2PO4 0.3‰～0.7‰、Na2SO4 0.1‰～0.5‰、NaCl 0.8‰～1.2‰、MgCl2·6H2O 0.2‰～0.7‰、NaHCO3 0.2‰～0.4‰、CaCl2·2H2O 0.1‰～0.3‰、酵母提取物1‰～3‰、蛋白胨1‰～3‰、D-葡萄糖0.2‰～0.7‰、可溶性淀粉1‰～5‰、还原剂0.5‰～3‰、刃天青0.03‰～0.07‰、窖泥浸提液20％～30％、黄水10％～15％，pH值6.5-7.0。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤1中，所述还原剂为L-半胱氨酸盐酸盐或Na2S。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤3中，用无菌注射器在无氧环境下，换气多次保证其无氧气存在后，吸取1～2mL对数期菌液至5mL保存管中；然后向保存管中加入1～2mL无氧防冻保护剂，上下颠倒混匀；最后再加入0.3～0.6mL的液体石蜡后放入-80℃超低温冰箱中保存。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：
步骤3中，所述防冻保护剂选自甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、吐温-80等中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤4中，所述适宜温度为低于菌种的最高耐受温度。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤4中，活化菌种时，将保藏管于35℃～40℃恒温水浴中摇动直至全部融化，然后在无氧环境中接种于无氧的液体培养基中，于三气培养箱中33℃～35℃下培养3～5天，观察菌株存活情况。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
菌种保藏液中含有20％～40％体积分数的菌液，20％～40％体积分数的防冻保护剂，8％～12％体积分数的液体石蜡。
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