CN103146580A - 厌氧超低温菌种保藏剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种厌氧超低温菌种保藏剂，该保藏剂由以下体积百分比的原料组成：营养肉汤20.0~21.1%、保护剂26.3~30.0%、分散剂30.0~31.5%以及去离子水19.3~21.4%。同时本发明还公开了该保藏剂的制备方法。本发明依据菌种保藏的基本原理，充分创造有利于微生物休眠的环境条件，最大限度地降低菌种的基础代谢水平，对有氧、严格厌氧或兼性厌氧微生物都有很好的保护率，保护效果稳定，菌种变异程度极小，复苏率高，并且既可以用于菌种的厌氧超低温保藏，也可以用于菌种的液氮（-196℃）超低温保藏及低温冷冻干燥保藏，增大了保藏剂的使用范围，从而解决了厌氧超低温条件下的菌种保藏难题，延长菌种的保藏期达几十年。

Description

厌氧超低温菌种保藏剂

技术领域

本发明涉及一种菌种保藏剂，尤其涉及厌氧超低温菌种保藏剂。

背景技术

一切从生产实践或科学研究所获得的具有优良性状的菌种，包括野生菌种以及优良变异菌株或基因工程菌株等，都是国家的重要种质资源。因此，菌种保藏是一切微生物工作的基础，菌种保藏的目的是使菌种被保藏后不死亡、不变异、不被杂菌污染，并保持其优良性状，以利于生产和科研的应用。

保藏剂对于微生物菌株厌氧超低温保藏的存活率有较大的影响，选择得当的保藏剂是提高微生物厌氧超低温保藏存活率、延长菌种保藏期的关键因素。保藏剂可分为小分子保藏剂（如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类）和大分子保藏剂（如蛋白质、多肽类和多糖类）。小分子保藏剂，一般具有很强的亲水性，分子结构含有3个以上氢键的小分子保藏剂，在菌种的保藏过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。大分子保藏剂通过“包裹”形式保护菌体，同时促进小分子保藏剂发挥作用。

细菌的保藏方法中，最为理想的方法是低温真空干燥法，基本原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低细胞新陈代谢的速度，使细菌的生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的。但是此项技术设备条件要求高，一般实验室难以达到。除此之外，在冻干前的准备过程中，不可避免地会引入氧气及杂菌的污染，这使得严格厌氧微生物的生命活动受到抑制，甚至死亡。

超低温菌种保存法是将菌种保存在-80.0℃冰箱中，通过冷冻减缓细胞的新陈代谢，降低菌种变异率，其操作过程简便，设备要求低，且在操作过程中，可以预先准备无氧的菌种保藏瓶，配合无氧保藏剂使用，使严格厌氧菌的新陈代谢不受外界环境的影响，菌株的优良性状得以保护，因此该方法广泛适用于各类微生物菌种的保藏。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在厌氧超低温条件下能够为有氧、严格厌氧或兼性厌氧微生物提供保护作用的厌氧超低温菌种保藏剂。

为解决上述问题，本发明所述的厌氧超低温菌种保藏剂，其特征在于：该保藏剂由以下体积百分比的原料组成：营养肉汤20.0~21.1%、保护剂26.3~30.0%、分散剂30.0~31.5%以及去离子水19.3~21.4%。

所述营养肉汤由0.3~1.0%的多肽类物质、1.0~1.6%的蛋白质类物质及97.5~98.7%的去离子水按质量百分比混合而成；所述多肽类物质是指牛肉膏粉、酵母浸粉、麦芽汁浸粉中的一种或几种；所述蛋白质类物质是指蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉中的一种或几种。

所述保护剂由35.0~40.0%的醇类、35.0~40.0%的抗冻剂、20.0~25.0%的脂肪酸类按质量百分比混合而成；所述醇类是指丙三醇、异丙醇、丙二醇中的一种或几种经80.0℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇；所述抗冻剂是指亚砜、二甲基亚砜、二甲基砜中的一种或几种；所述脂肪酸类是指亚油酸、亚麻酸、共轭亚油酸中的一种或几种。

所述分散剂由65.0~68.0%的蛋白质类、31.4~34.4%的糖类、0.3~0.5%的谷氨酸钠、0.15~0.3%的L-半胱氨酸按质量百分比混合而成；所述蛋白质类是指全脂牛奶、脱脂牛奶中的一种或几种；所述糖类是指乳糖、麦芽糖、果糖中的一种或几种。

所述去离子水为无氧的去离子水，且其电阻值为18.0兆欧。

如上所述的厌氧超低温菌种保藏剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴量取35.0~40.0%醇类和35.0~40.0%抗冻剂于烧杯Ⅰ中，充分混合后转移至锥形瓶Ⅰ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅰ中，标记为A瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑵量取97.5~98.7%、电阻值为18.0兆欧的去离子水于烧杯Ⅱ中，按照顺序依次将0.3~1.0%多肽类物质、1.0~1.6%蛋白质类物质、31.4~34.4%糖类、0.3~0.5%谷氨酸钠和0.15~0.3% L-半胱氨酸加入所述烧杯Ⅱ，充分溶解后转移至锥形瓶Ⅱ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅱ中，标记为B瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑶量取按体积百分比占保藏剂19.3~21.4%的去离子水在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅲ中，标记为C瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑷用无氧氮气填充厌氧瓶Ⅳ进行除氧，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；一次性无菌注射器经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；

⑸将所述厌氧瓶Ⅰ、厌氧瓶Ⅱ、厌氧瓶Ⅲ、厌氧瓶Ⅳ及所述一次性无菌注射器放到厌氧手套箱中，打开紫外灯灭菌30分钟；

⑹调整所述厌氧手套箱中无氧氮气流量，使其达到完全无氧后，在出气端连接0.22μm的微孔空气滤膜，以用来过滤无氧氮气；

⑺用一次性无菌注射器将所述A瓶和所述B瓶所对应的溶液混合到提前备好的除氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑻无菌条件下量取65.0~68.0%蛋白质类，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用所述一次性无菌注射器分装于所述厌氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑼无菌条件下称取20.0~25.0%脂肪酸类，用所述C瓶厌氧瓶Ⅲ中已灭菌的无氧去离子水溶解，同时在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用所述一次性无菌注射器分装于所述厌氧瓶Ⅳ中混合均匀，做标记后于4.0℃低温保存即可。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明依据菌种保藏的基本原理，充分创造有利于微生物休眠的环境条件，其本身及其制作过程都能够达到严格厌氧，最大限度地降低菌种的基础代谢水平，对有氧、严格厌氧或兼性厌氧微生物都有很好的保护率，保护效果稳定，菌种变异程度极小，复苏率高，并且既可以用于菌种的厌氧超低温保藏，也可以用于菌种的液氮（-196℃）超低温保藏及低温冷冻干燥保藏，增大了保藏剂的使用范围，从而解决了厌氧超低温条件下的菌种保藏难题，延长菌种的保藏期达几十年。

2、本发明既包含小分子保藏剂（如乳糖、无水甘油、谷氨酸钠），又包含大分子保藏剂（如蛋白胨、牛肉膏粉、脱脂牛奶），各种成分之间优势互补，形成了很好的厌氧超低温保藏剂的组合，最大限度地阻止了微生物菌体内外冰晶形成，使微生物的细胞壁（膜）损伤降到最低程度，有效地保护了菌种。

具体实施方式

实施例1    厌氧超低温菌种保藏剂，该保藏剂由以下体积百分比（ml/ml）的原料组成：营养肉汤20.8%、保护剂26.3%、分散剂31.5%以及去离子水21.4%。

其中：

营养肉汤由0.3%的多肽类物质——酵母浸粉、1.0%的蛋白质类物质——鱼粉、98.7%的去离子水按质量百分比（g/g）混合而成。

保护剂由35.0%的醇类——异丙醇经80.0℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇、40.0%的抗冻剂——亚砜、25.0%的脂肪酸类——亚油酸按质量百分比（g/g）混合而成。

分散剂由66.8%的蛋白质类——全脂牛奶、32.4%的糖类——麦芽糖、0.5%的谷氨酸钠、0.3%的L-半胱氨酸按质量百分比（g/g）混合而成。

去离子水为无氧的去离子水，且其电阻值为18.0兆欧。

该厌氧超低温菌种保藏剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴量取35.0%醇类和40.0%抗冻剂于烧杯Ⅰ中，充分混合后转移至锥形瓶Ⅰ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅰ中，标记为A瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑵量取98.7%、电阻值为18.0兆欧的去离子水于烧杯Ⅱ中，按照顺序依次将0.3%多肽类物质、1.0%蛋白质类物质、32.4%糖类、0.5%谷氨酸钠和0.3% L-半胱氨酸加入烧杯Ⅱ，充分溶解后转移至锥形瓶Ⅱ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅱ中，标记为B瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑶量取按体积百分比占保藏剂21.4%的去离子水在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅲ中，标记为C瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑷用无氧氮气填充厌氧瓶Ⅳ进行除氧，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；一次性无菌注射器经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；

⑸将所述厌氧瓶Ⅰ、厌氧瓶Ⅱ、厌氧瓶Ⅲ、厌氧瓶Ⅳ及所述一次性无菌注射器放到厌氧手套箱中，打开紫外灯灭菌30分钟；

⑹调整厌氧手套箱中无氧氮气流量，使其达到完全无氧后，在出气端连接0.22μm的微孔空气滤膜，以用来过滤无氧氮气；

⑺用一次性无菌注射器将所述A瓶和所述B瓶所对应的溶液混合到提前备好的除氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑻无菌条件下量取66.8%蛋白质类，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器等量分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑼无菌条件下称取25.0%脂肪酸类，用C瓶厌氧瓶Ⅲ中已灭菌的无氧去离子水溶解，同时在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀，做标记后于4.0℃低温保存即可。

实施例2    厌氧超低温菌种保藏剂，该保藏剂由以下体积百分比（ml/ml）的原料组成：营养肉汤20.0%、保护剂29.8%、分散剂30.3%以及去离子水19.9%。

其中：

营养肉汤由0.5%的多肽类物质——牛肉膏粉、1.5%的蛋白质类物质——蛋白胨、98.0%的去离子水按质量百分比（g/g）混合而成。

保护剂由40.0%的醇类——丙三醇经80.0℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇、40.0%的抗冻剂——二甲基亚砜、20.0%的脂肪酸类——共轭亚油酸按质量百分比（g/g）混合而成。

分散剂由68.0%的蛋白质类——脱脂牛奶、31.4%的糖类——乳糖、0.4%的谷氨酸钠、0.2%的L-半胱氨酸按质量百分比（g/g）混合而成。

去离子水为无氧的去离子水，且其电阻值为18.0兆欧。

该厌氧超低温菌种保藏剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴量取40.0%醇类和40.0%抗冻剂于烧杯Ⅰ中，充分混合后转移至锥形瓶Ⅰ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅰ中，标记为A瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑵量取98.0%、电阻值为18.0兆欧的去离子水于烧杯Ⅱ中，按照顺序依次将0.5%多肽类物质、1.5%蛋白质类物质、31.4%糖类、0.4%谷氨酸钠和0.2% L-半胱氨酸加入烧杯Ⅱ，充分溶解后转移至锥形瓶Ⅱ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅱ中，标记为B瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑶量取按体积百分比占保藏剂19.9%的去离子水在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅲ中，标记为C瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑷用无氧氮气填充厌氧瓶Ⅳ进行除氧，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；一次性无菌注射器经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；

⑸将所述厌氧瓶Ⅰ、厌氧瓶Ⅱ、厌氧瓶Ⅲ、厌氧瓶Ⅳ及所述一次性无菌注射器放到厌氧手套箱中，打开紫外灯灭菌30分钟；

⑹调整厌氧手套箱中无氧氮气流量，使其达到完全无氧后，在出气端连接0.22μm的微孔空气滤膜，以用来过滤无氧氮气；

⑺用一次性无菌注射器将所述A瓶和所述B瓶所对应的溶液混合到提前备好的除氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑻无菌条件下量取68.0%蛋白质类，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器等量分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑼无菌条件下称取20.0%脂肪酸类，用C瓶厌氧瓶Ⅲ中已灭菌的无氧去离子水溶解，同时在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀，做标记后于4.0℃低温保存即可。

实施例3    厌氧超低温菌种保藏剂，该保藏剂由以下体积百分比（ml/ml）的原料组成：营养肉汤21.1%、保护剂29.0%、分散剂30.2%以及去离子水19.7%。

其中：

营养肉汤由0.4%的多肽类物质——麦芽汁浸粉、1.6%的蛋白质类物质——蚕蛹粉、98.0%的去离子水按质量百分比（g/g）混合而成。

保护剂由40.0%的醇类——丙二醇经80.0℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇、35.0%的抗冻剂——二甲基砜、25.0%的脂肪酸类——亚麻酸按质量百分比（g/g）混合而成。

分散剂由68.0%的蛋白质类——全脂牛奶与脱脂牛奶按1:1的体积比（ml/ml）混合的混合物、31.55%的糖类——果糖、0.3%的谷氨酸钠、0.15%的L-半胱氨酸按质量百分比（g/g）混合而成。

去离子水为无氧的去离子水，且其电阻值为18.0兆欧。

该厌氧超低温菌种保藏剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴量取40.0%醇类和35.0%抗冻剂于烧杯Ⅰ中，充分混合后转移至锥形瓶Ⅰ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅰ中，标记为A瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑵量取98.0%、电阻值为18.0兆欧的去离子水于烧杯Ⅱ中，按照顺序依次将0.4%多肽类物质、1.6%蛋白质类物质、31.55%糖类、0.3%谷氨酸钠和0.15% L-半胱氨酸加入烧杯Ⅱ，充分溶解后转移至锥形瓶Ⅱ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅱ中，标记为B瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑶量取按体积百分比占保藏剂19.7%的去离子水在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅲ中，标记为C瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑷用无氧氮气填充厌氧瓶Ⅳ进行除氧，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；一次性无菌注射器经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；

⑸将所述厌氧瓶Ⅰ、厌氧瓶Ⅱ、厌氧瓶Ⅲ、厌氧瓶Ⅳ及所述一次性无菌注射器放到厌氧手套箱中，打开紫外灯灭菌30分钟；

⑹调整厌氧手套箱中无氧氮气流量，使其达到完全无氧后，在出气端连接0.22μm的微孔空气滤膜，以用来过滤无氧氮气；

⑺用一次性无菌注射器将所述A瓶和所述B瓶所对应的溶液混合到提前备好的除氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑻无菌条件下量取68.0%蛋白质类，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器等量分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑼无菌条件下称取25.0%脂肪酸类，用C瓶厌氧瓶Ⅲ中已灭菌的无氧去离子水溶解，同时在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀，做标记后于4.0℃低温保存即可。

实施例4    厌氧超低温菌种保藏剂，该保藏剂由以下体积百分比（ml/ml）的原料组成：营养肉汤20.7%、保护剂30.0%、分散剂30.0%以及去离子水19.3%。

其中：

营养肉汤由1.0%的多肽类物质——牛肉膏粉与酵母浸粉按1:1的质量比（g/g）混合的混合物、1.5%的蛋白质类物质——蛋白胨与鱼粉按1:1的质量比（g/g）混合的混合物、97.5%的去离子水按质量百分比（g/g）混合而成。

保护剂由38.5%的醇类——丙三醇与异丙醇按1:1的体积比（ml/ml）混合的混合物经80.0℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇、39.0%的抗冻剂——亚砜与二甲基亚砜按1:1的体积比（ml/ml）混合的混合物、22.5%的脂肪酸类——亚油酸与亚麻酸按1:1的体积比（ml/ml）混合的混合物，按质量百分比（g/g）混合而成。

分散剂由65.0%的蛋白质类——全脂牛奶、34.4%的糖类——乳糖与麦芽糖按1:1的质量比（g/g）混合的混合物、0.4%的谷氨酸钠、0.2%的L-半胱氨酸按质量百分比（g/g）混合而成。

去离子水为无氧的去离子水，且其电阻值为18.0兆欧。

该厌氧超低温菌种保藏剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴量取38.5%醇类和39.0%抗冻剂于烧杯Ⅰ中，充分混合后转移至锥形瓶Ⅰ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅰ中，标记为A瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑵量取97.5%、电阻值为18.0兆欧的去离子水于烧杯Ⅱ中，按照顺序依次将1.0%多肽类物质、1.5%蛋白质类物质、34.4%糖类、0.4%谷氨酸钠和0.2% L-半胱氨酸加入烧杯Ⅱ，充分溶解后转移至锥形瓶Ⅱ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅱ中，标记为B瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑶量取按体积百分比占保藏剂19.3%的去离子水在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅲ中，标记为C瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑷用无氧氮气填充厌氧瓶Ⅳ进行除氧，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；一次性无菌注射器经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；

⑸将所述厌氧瓶Ⅰ、厌氧瓶Ⅱ、厌氧瓶Ⅲ、厌氧瓶Ⅳ及所述一次性无菌注射器放到厌氧手套箱中，打开紫外灯灭菌30分钟；

⑹调整厌氧手套箱中无氧氮气流量，使其达到完全无氧后，在出气端连接0.22μm的微孔空气滤膜，以用来过滤无氧氮气；

⑺用一次性无菌注射器将所述A瓶和所述B瓶所对应的溶液混合到提前备好的除氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑻无菌条件下量取65.0%蛋白质类，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器等量分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑼无菌条件下称取22.5%脂肪酸类，用C瓶厌氧瓶Ⅲ中已灭菌的无氧去离子水溶解，同时在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀，做标记后于4.0℃低温保存即可。

实施例5    厌氧超低温菌种保藏剂，该保藏剂由以下体积百分比（ml/ml）的原料组成：营养肉汤20.5%、保护剂28.8%、分散剂31.1%以及去离子水19.6%。

其中：

营养肉汤由0.4%的多肽类物质——牛肉膏粉与酵母浸粉及麦芽汁浸粉按1:1:1的质量比（g/g）混合的混合物、1.6%的蛋白质类物质——蛋白胨与鱼粉及蚕蛹粉按1:1:1的质量比（g/g）混合的混合物、98.0%的去离子水按质量百分比（g/g）混合而成。

保护剂由40.0%的醇类——丙三醇与异丙醇及丙二醇按1:1:1的体积比（ml/ml）混合的混合物经80.0℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇、38.5%的抗冻剂、21.5%的脂肪酸类——亚油酸与亚麻酸及共轭亚油酸按1:1:1的体积比（ml/ml）混合的混合物，按质量百分比（g/g）混合而成。

分散剂由67.5%的蛋白质类——脱脂牛奶、32.0%的糖类——乳糖与麦芽糖及果糖按1:1:1的质量比（g/g）混合的混合物、0.3%的谷氨酸钠、0.2%的L-半胱氨酸按质量百分比（g/g）混合而成。

去离子水为无氧的去离子水，且其电阻值为18.0兆欧。

该厌氧超低温菌种保藏剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴量取40.0%醇类和38.5%抗冻剂于烧杯Ⅰ中，充分混合后转移至锥形瓶Ⅰ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅰ中，标记为A瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑵量取98.0%、电阻值为18.0兆欧的去离子水于烧杯Ⅱ中，按照顺序依次将0.4%多肽类物质、1.6%蛋白质类物质、32.0%糖类、0.3%谷氨酸钠和0.2% L-半胱氨酸加入烧杯Ⅱ，充分溶解后转移至锥形瓶Ⅱ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅱ中，标记为B瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑶量取按体积百分比占保藏剂19.6%的去离子水在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅲ中，标记为C瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑷用无氧氮气填充厌氧瓶Ⅳ进行除氧，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；一次性无菌注射器经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；

⑸将所述厌氧瓶Ⅰ、厌氧瓶Ⅱ、厌氧瓶Ⅲ、厌氧瓶Ⅳ及所述一次性无菌注射器放到厌氧手套箱中，打开紫外灯灭菌30分钟；

⑹调整所述厌氧手套箱中无氧氮气流量，使其达到完全无氧后，在出气端连接0.22μm的微孔空气滤膜，以用来过滤无氧氮气；

⑺用一次性无菌注射器将所述A瓶和所述B瓶所对应的溶液混合到提前备好的除氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑻无菌条件下量取67.5%蛋白质类，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器等量分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑼无菌条件下称取21.5%脂肪酸类，用C瓶厌氧瓶Ⅲ中已灭菌的无氧去离子水溶解，同时在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用一次性无菌注射器分装于厌氧瓶Ⅳ中混合均匀，做标记后于4.0℃低温保存即可。

Claims (6)

1.厌氧超低温菌种保藏剂，其特征在于：该保藏剂由以下体积百分比的原料组成：营养肉汤20.0~21.1%、保护剂26.3~30.0%、分散剂30.0~31.5%以及去离子水19.3~21.4%。

2.如权利要求1所述的厌氧超低温菌种保藏剂，其特征在于：所述营养肉汤由0.3~1.0%的多肽类物质、1.0~1.6%的蛋白质类物质及97.5~98.7%的去离子水按质量百分比混合而成；所述多肽类物质是指牛肉膏粉、酵母浸粉、麦芽汁浸粉中的一种或几种；所述蛋白质类物质是指蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的厌氧超低温菌种保藏剂，其特征在于：所述保护剂由35.0~40.0%的醇类、35.0~40.0%的抗冻剂、20.0~25.0%的脂肪酸类按质量百分比混合而成；所述醇类是指丙三醇、异丙醇、丙二醇中的一种或几种经80.0℃鼓风干燥过夜后得到的无水醇；所述抗冻剂是指亚砜、二甲基亚砜、二甲基砜中的一种或几种；所述脂肪酸类是指亚油酸、亚麻酸、共轭亚油酸中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的厌氧超低温菌种保藏剂，其特征在于：所述分散剂由65.0~68.0%的蛋白质类、31.4~34.4%的糖类、0.3~0.5%的谷氨酸钠、0.15~0.3%的L-半胱氨酸按质量百分比混合而成；所述蛋白质类是指全脂牛奶、脱脂牛奶中的一种或几种；所述糖类是指乳糖、麦芽糖、果糖中的一种或几种。

5.如权利要求1或2所述的厌氧超低温菌种保藏剂，其特征在于：所述去离子水为无氧的去离子水，且其电阻值为18.0兆欧。

6.如权利要求1所述的厌氧超低温菌种保藏剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴量取35.0~40.0%醇类和35.0~40.0%抗冻剂于烧杯Ⅰ中，充分混合后转移至锥形瓶Ⅰ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅰ中，标记为A瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑵量取97.5~98.7%、电阻值为18.0兆欧的去离子水于烧杯Ⅱ中，按照顺序依次将0.3~1.0%多肽类物质、1.0~1.6%蛋白质类物质、31.4~34.4%糖类、0.3~0.5%谷氨酸钠和0.15~0.3% L-半胱氨酸加入所述烧杯Ⅱ，充分溶解后转移至锥形瓶Ⅱ中，在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅱ中，标记为B瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑶量取按体积百分比占保藏剂19.3~21.4%的去离子水在常温常压下加热煮沸的同时通入无氧氮气进行除氧，然后用可调定量加液器等量分装于2只无氧的厌氧瓶Ⅲ中，标记为C瓶，加塞封口，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后备用；

⑷用无氧氮气填充厌氧瓶Ⅳ进行除氧，经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；一次性无菌注射器经115.0℃高压蒸汽灭菌30分钟后完全干燥备用；

⑸将所述厌氧瓶Ⅰ、厌氧瓶Ⅱ、厌氧瓶Ⅲ、厌氧瓶Ⅳ及所述一次性无菌注射器放到厌氧手套箱中，打开紫外灯灭菌30分钟；

⑹调整所述厌氧手套箱中无氧氮气流量，使其达到完全无氧后，在出气端连接0.22μm的微孔空气滤膜，以用来过滤无氧氮气；

⑺用一次性无菌注射器将所述A瓶和所述B瓶所对应的溶液混合到提前备好的除氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑻无菌条件下量取65.0~68.0%蛋白质类，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用所述一次性无菌注射器分装于所述厌氧瓶Ⅳ中混合均匀；

⑼无菌条件下称取20.0~25.0%脂肪酸类，用所述C瓶厌氧瓶Ⅲ中已灭菌的无氧去离子水溶解，同时在常温常压下加热煮沸除氧，然后在通入无菌无氧氮气的条件下冷却至室温，用所述一次性无菌注射器分装于所述厌氧瓶Ⅳ中混合均匀，做标记后于4.0℃低温保存即可。