CN108479110A - 一种细胞培养液脱色剂及脱色方法 - Google Patents

一种细胞培养液脱色剂及脱色方法 Download PDF

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
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    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/14—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the introduction of the feed to the apparatus

Abstract

本发明提供了一种细胞培养液脱色剂及脱色方法，其中，所述细胞培养液脱色剂包括：壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种；其中，在细胞培养液中各组分的浓度控制为：壳聚糖100‑2000mg/L；聚氯化铝50‑150mg/L；新生磷酸钙20‑150mM。所述细胞培养液脱色剂实现在单抗或诊断试剂等生化产品的生产中，对细胞培养液中的色素和杂质的充分纯化和脱色，纯化效率高，为进一步的提取、过滤等工作减轻了负担，大大降低了纯化和生产的成本，给细胞培养液的生产、研发和使用带来巨大的方便。

Description

一种细胞培养液脱色剂及脱色方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种细胞培养液脱色剂及脱色方法。
背景技术
随着生物技术领域的快速发展，哺乳动物细胞广泛的用于包括单抗药物，诊断试剂等生物制品的生产，对人类医疗健康起着重要作用。
单抗药物、诊断试剂在细胞培养液中需经过澄清纯化等步骤提取。然而在细胞培养过程中为了提高产量和抗体的质量，通常需要添加各种各样的营养物质，导致培养液中大量积累色素，增加纯化步骤的负担，尤其对于诊断试剂，存在大量的色素会干扰诊断的灵敏度。
目前，在单抗生产尤其是诊断试剂生产中，大多采用先离心或通过成本高昂的滤材过滤，进而再通过protein A或其他种类的预装柱进行提取，由于培养液中存在传统纯化技术中很多在无法纯化的杂质和色素，导致对于进一步的protein A或其他种类的预装柱的寿命造成较大损害而无法再生利用，纯化成本高昂，影响终产品的质量，给细胞培养液的生产、研发和使用带来巨大的不便。
发明内容
本发明提供一种细胞培养液脱色剂及脱色方法，以解决现有的技术中的不足。
为解决上述问题，本发明提供一种细胞培养液脱色剂，包括：
壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种；
其中，在细胞培养液中各组分的浓度控制为：
壳聚糖100-2000mg/L；
聚氯化铝50-150mg/L；
新生磷酸钙20-150mM。
优选地，在所述细胞培养液中各组分的浓度控制为：
壳聚糖500-1500mg/L；
聚氯化铝80-100mg/L；
新生磷酸钙40-120mM。
优选地，还包括助溶剂；
所述助溶剂为浓盐酸；
所述助溶剂在所述细胞培养液中的终浓度控制为0.001-0.1mg/L。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种细胞培养液脱色方法，包括：
将壳聚糖通过助溶剂进行助溶溶解，得到壳聚糖溶液；
在进行培养液脱色时配制新生磷酸钙；然后，取所述壳聚糖溶液、聚氯化铝及新生磷酸钙的一种或多种分别加入所述待脱色的培养液；其中，分别配制所述新生磷酸钙、壳聚糖、聚氯化铝的量以达到预设终浓度，得到混合培养液；
将所述混合培养液进行混合并离心，即得到脱色后的细胞培养液。
优选地，所述“将壳聚糖通过助溶剂进行助溶溶解，得到壳聚糖溶液”包括：
基于预设壳聚糖溶液浓度，将0.1-5份的所述壳聚糖加入水中混合，得到浓缩溶液；
在所述浓缩溶液中加入0.001-0.1份的所述助溶剂，即得到壳聚糖溶液。
优选地，所述预设壳聚糖溶液浓度为3-10g/L。
优选地，所述“在进行培养液脱色时配制新生磷酸钙”，包括：
取氯化钙和磷酸二氢钠加入水中反应生成磷酸钙，混合后即制备得到所述新生磷酸钙。
优选地，所述预设终浓度为：
壳聚糖100-2000mg/L；
聚氯化铝50-150g/L；
磷酸钙40-120mM。
优选地，所述“将所述混合培养液进行混合并离心，即得到脱色后的细胞培养液”包括：
将所述混合溶液在室温条件下进行搅拌5-10分钟，搅拌速度为50-100rpm，得到搅拌混合溶液；
对所述搅拌混合溶液进行离心离心力设置为8000-12000g，温度2-8℃，时间20-30分钟，即得到所述脱色后的细胞培养液。
本发明提供一种细胞培养液脱色剂及脱色方法。其中，所述细胞培养液脱色剂通过使用壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种组合所得到的细胞培养液脱色剂，利用壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙的絮凝吸附作用，通过在细胞培养液中添加壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种组合来吸附色素，进而将色素随着细胞一并去除，从而达到脱色效果，从而实现在单抗或诊断试剂等生化产品的生产中，对细胞培养液中的色素和杂质的充分纯化和脱色，纯化效率高，为进一步的提取、过滤等工作减轻了负担，大大降低了纯化和生产的成本，给细胞培养液的生产、研发和使用带来巨大的方便。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
本发明提供一种细胞培养液脱色剂，包括：
壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种；
其中，在细胞培养液中各组分的浓度控制为：
壳聚糖100-2000mg/L；
聚氯化铝50-150mg/L；
新生磷酸钙20-150mM。
上述，需要说明的是，壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。
上述，需要说明的是，俗称净水剂，又名聚氯化铝，简称聚铝，英文名字PAC。和碱式聚合氯化铝，喷雾干燥聚合氯化铝同属于相关类净水药剂。是一种多羟基，多核络合体的阳离子型无机高分子絮凝剂，固体产品外观为黄色或白色固体粉末，其化学分子式为AL2(OH)nCL6-nm，式中，1≤n≤5,m≤10，且易溶于水，有较强的架桥吸附性，在水解过程中伴随电化学，凝聚，吸附和沉淀等物理化变化，最终生成AL2(OH)3(OH)3,从而达到净化目的。无毒，但是里面含铝离子对人体有害，过多摄入会导致缺钙，对大脑造成损伤，积聚在肝、脾、肾等部位，妨碍人体的消化吸收功能。
本发明提供一种细胞培养液脱色剂及脱色方法。其中，所述细胞培养液脱色剂通过使用壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种组合所得到的细胞培养液脱色剂，利用壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙的絮凝吸附作用，通过在细胞培养液中添加壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种组合来吸附色素，进而将色素随着细胞一并去除，从而达到脱色效果，从而实现在单抗或诊断试剂等生化产品的生产中，对细胞培养液中的色素和杂质的充分纯化和脱色，纯化效率高，为进一步的提取、过滤等工作减轻了负担，大大降低了纯化和生产的成本，给细胞培养液的生产、研发和使用带来巨大的方便。
此外，在所述脱色剂中，也可以加入其他与实际成分相反应产生絮凝物或沉淀的净化剂，可以包括但不限于聚合氯化铝、聚合氯化铝铁、碱式氯化铝、聚丙烯酰胺、硫酸亚铁、硫酸铝、聚合硫酸铁等。其加入量可以按照终浓度30-60mM进行加入，例如30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM。
此外，在所述脱色剂中，可以加入EDTA起到一定的净化作用，EDTA又名乙二胺四乙酸，是一种有机化合物，其化学式为C10H16N2O8，常温常压下为白色粉末。它是一种能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂；也可用于去除重金属离子对酶的抑制作用。上述EDTA的加入量可以添加重量份数为0.5-20份，其加入量可以为0.5份、1份、3份、3.5份、7份、10份、12份、15份、17份、19份、19.5份、20份等。
此外，在所述脱色剂中，也可以加入例如活性炭的强吸附剂进行对部分成分的吸附作用。可进行根据实际需要选择添加不同粒径的活性炭，例如纳米级别的活性炭等。其加入量可以根据具体需要进行添加，在吸附完成后再通过离心或过滤去除失效的活性炭。此外，也可通过晾晒或清洗等其他方法对所述活性炭进行活化，从而进行再次使用，降低成本。例如添加量可以为50-100份。
此外，在所述脱色剂中，也可以加入硅胶或其他试剂试药，例如可以包括但不限于正向硅胶、反相硅胶(RP18\RP20等)、葡聚糖凝胶(LH-20)、三氯化铝等起到过滤或分子筛等作用的材质或试剂。具体使用方法可以为直接加入再过滤去除吸附后的滤材，或者为进行装柱过滤的方式实现去除色素。
上述，新生磷酸钙，为通过不同化合物反应生成的沉淀磷酸钙，需要现配现用。
优选地，在所述细胞培养液中各组分的浓度控制为：
壳聚糖500-1500mg/L；
聚氯化铝80-100mg/L；
新生磷酸钙40-120mM。
优选地，
还包括助溶剂；
所述助溶剂为浓盐酸；
所述助溶剂在所述细胞培养液中的终浓度控制为0.001-0.1mg/L。
上述，由于壳聚糖粉难溶于水，不能直接添加入培养液中，故脱色处理前先用超纯水将壳聚糖搅拌配制成浓缩溶液，用浓盐酸助溶直至完成溶解。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种细胞培养液脱色方法，包括：
将壳聚糖通过助溶剂进行助溶溶解，得到壳聚糖溶液；在进行培养液脱色时配制新生磷酸钙；然后，取所述壳聚糖溶液、聚氯化铝及新生磷酸钙的一种或多种分别加入所述待脱色的培养液；其中，分别配制所述新生磷酸钙、壳聚糖、聚氯化铝的量以达到预设终浓度，得到混合培养液；
将所述混合培养液进行混合并离心，即得到脱色后的细胞培养液。
上述，在进行脱色的过程中，也可以在得到混合培养液前或得到混合培养液后进行加入起到一定吸附作用的不同粒径的活性炭、正相硅胶、反相硅胶、葡聚糖凝胶、三氯化铝、大孔吸附树脂等吸附剂或者分子筛，从而达到一定的脱色效果。其加入量可以以实际在待脱色的细胞培养液中色素的量进行调配，例如，加入细胞培养液总质量的5％-10％的上述吸附剂或分子筛。此外，也可通过将上述吸附剂或分子筛进行自填料装柱，进而通过制备或半制备HPLC进行快速过柱，以达到高效的对细胞培养液进行脱色的效果。
上述，混合方式可以为通过摇床振摇，或者根据具体培养液的量或通过不同型号的搅拌设备进行搅拌，直到均匀为止。
上述，离心设备可以为离心机，也可以根据实际的生物产品需要选择温度或其他条件，例如可以为超低温离心或真空离心。
上述，助溶剂为盐酸，此外，也可以根据具体培养液中的产品选择其他对产品的影响较小的酸性试剂，例如盐酸、磷酸、醋酸等。
上述，在得到所述脱色后的细胞培养液后，也可以对脱色后的细胞培养液进行不同方式的检验以实现质量控制，例如进行肉眼观察实验、紫外分光光度法通过OD值或浊度计测其浊度判断澄清度，或通过高效液相色谱法对细胞培养液进行检验等。
上述，加入的脱色剂根据实际预设终浓度进行配置，也可以根据实际需要量进行添加，直至达到澄清位置，因为不同的细胞培养液也存在含有不同含量的色素或氮、氨等杂质，可根据实际需要进行对脱色剂的加入量进行摸索实验，从而确定实际加入量。
优选地，所述“将壳聚糖通过助溶剂进行助溶溶解，得到壳聚糖溶液”包括：
基于预设壳聚糖溶液浓度，将0.1-5份的所述壳聚糖加入水中混合，得到浓缩溶液；
在所述浓缩溶液中加入0.001-0.1份的所述助溶剂，即得到壳聚糖溶液。
优选地，所述预设壳聚糖溶液浓度为3-10g/L。
上述，壳聚糖溶液的浓度可以为3-10g/L，优选的，在本实施例中可以为5g/L。
优选地，所述“在进行培养液脱色时配制新生磷酸钙”，包括：
取氯化钙和磷酸二氢钠加入水中反应生成磷酸钙，混合后即制备得到所述新生磷酸钙。
优选地，所述预设终浓度为：
壳聚糖100-2000mg/L；
聚氯化铝50-150mg/L；
新生磷酸钙20-150mM。
优选地，所述“将所述混合培养液进行混合并离心，即得到脱色后的细胞培养液”包括：
将所述混合溶液在室温条件下进行搅拌5-10分钟，搅拌速度为50-100rpm，得到搅拌混合溶液；
对所述搅拌混合溶液进行离心，离心力设置为8000-12000g，温度2-8，时间20-30分钟，即得到脱色后的细胞培养液。
上述，离心时的离心力，优选为8000g，此外，离心时温度的范围可以保持在2-8℃，必要时使用超低温离心机进行离心处理。为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。表1实施例1-9中培养液处理方法中数据及参数
1、实施例1-9中细胞培养液脱色方法：
壳聚糖处理和加入方法：基于预设壳聚糖溶液浓度，将壳聚糖加入水中混合，得到浓缩溶液；在所述浓缩溶液中加入助溶剂，即得到壳聚糖溶液；
新生磷酸钙制备和加入方法：取氯化钙和磷酸二氢钠加入水中反应生成磷酸钙，混合后即制备得到所述的新生磷酸钙；并且，
步骤1，取细胞培养液脱色剂加入待脱色的细胞培养液中分别配制达到预设终浓度，得到混合培养液；
步骤2，将所述混合溶液在室温条件下进行搅拌5-10分钟，搅拌速度为50-100rpm，得到搅拌混合溶液；
步骤3，对所述搅拌混合溶液进行离心，离心力设置为8000-12000g，温度2-8℃，时间20-30分钟，即得到脱色后的细胞培养液。
具体方法中的终浓度和处理方法等参数，根据实施例的不同参见表1中的数据参数。
2、阳性对照组处理方法：取待脱色的细胞培养液进行离心，离心力设置为8000-12000g，温度2-8℃，时间20-30分钟，得到待测样品。
3、阴性对照组处理方法：取未脱色、未离心的所述待脱色的细胞培养液，得到待测样品。
4、检测方法：
4.1浊度计测浊度值：
实验设备：WZT-2000型光电浊度计(上海劲佳仪器)；
测量瓶；
实验方法：
取30mL样品加入到测量瓶中，放入仪器测量槽，测量并记录，具体结果见表1。
4.2视觉比对法：
取待测样品分别放入相应的20mL生化离心管，进行直接观察
实施例1：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例2：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例3：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例4：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例5：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例6：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例7：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例8：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例9：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实施例10：
基于表1中本实施例的数据及参数，通过上述细胞培养液脱色方法对待脱色的细胞培养液进行脱色，结果见表2。
实验结果与讨论：
表2实施例1-9中培养液脱色后的检测结果对比
通过上述脱色方法，对实施例1-9，以及阳性对照组、阴性对照组分别进行处理，并对最终得到的待测样品分别进行浊度值检测并对比，以及肉眼对颜色及澄明度的观察对比，具体结果见表2。通过表2中可以得知，实施例1-10所处理的培养液通过添加脱色剂预处理后与阳性对照组相比，细胞收获液的浊度值下降，有色物质的浓度下降，液体颜色由深褐色变为浅褐色，脱色效果显著。

Claims (9)

1.一种细胞培养液脱色剂，其特征在于，包括：
壳聚糖、聚氯化铝和新生磷酸钙中的一种或多种；
其中，在细胞培养液中各组分的浓度控制为：
壳聚糖 100-2000mg/L；
聚氯化铝 50-150mg/L；
新生磷酸钙 20-150mM。
2.如权利要求1所述细胞培养液脱色剂，其特征在于，在所述细胞培养液中各组分的浓度控制为：
壳聚糖 500-1500mg/L；
聚氯化铝 80-100mg/L；
新生磷酸钙 40-120mM。
3.如权利要求1或2所述细胞培养液脱色剂，其特征在于，
还包括助溶剂；
所述助溶剂为浓盐酸；
所述助溶剂在所述细胞培养液中的终浓度控制为0.001-0.1mg/L。
4.一种细胞培养液脱色方法，其特征在于，包括：
将壳聚糖通过助溶剂进行助溶溶解，得到壳聚糖溶液；
在进行培养液脱色时配制新生磷酸钙；然后，取所述壳聚糖溶液、聚氯化铝及新生磷酸钙的一种或多种分别加入所述待脱色的培养液；其中，分别配制所述新生磷酸钙、壳聚糖、聚氯化铝的量以达到预设终浓度，得到混合培养液；
将所述混合培养液进行混合并离心，即得到脱色后的细胞培养液。
5.如权利要求4所述细胞培养液脱色方法，其特征在于，所述“将壳聚糖通过助溶剂进行助溶溶解，得到壳聚糖溶液”包括：
基于预设壳聚糖溶液浓度，将0.1-5份的所述壳聚糖加入水中混合，得到浓缩溶液；
在所述浓缩溶液中加入0.001-0.1份的所述助溶剂，即得到壳聚糖溶液。
6.如权利要求5所述细胞培养液脱色方法，其特征在于，所述预设壳聚糖溶液浓度为3-10g/L。
7.如权利要求4所述细胞培养液脱色方法，其特征在于，所述“在进行培养液脱色时配制新生磷酸钙”，包括：
取氯化钙和磷酸二氢钠加入水中反应生成磷酸钙，混合后即制备得到所述新生磷酸钙。
8.如权利要求4所述细胞培养液脱色方法，其特征在于，所述预设终浓度为：
壳聚糖 100-2000mg/L；
聚氯化铝 50-150g/L；
磷酸钙 40-120mM。
9.如权利要求4所述细胞培养液脱色方法，其特征在于，所述“将所述混合培养液进行混合并离心，即得到脱色后的细胞培养液”包括：
将所述混合溶液在室温条件下进行搅拌5-10分钟，搅拌速度为50-100rpm，得到搅拌混合溶液；
对所述搅拌混合溶液进行离心离心力设置为8000-12000g，温度2-8℃，时间20-30分钟，即得到所述脱色后的细胞培养液。
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