CN108456656A

CN108456656A - DBMSCs活性物质、制备方法及其在护肤品中的应用

Info

Publication number: CN108456656A
Application number: CN201810254573.5A
Authority: CN
Inventors: 修冰水; 张峰; 肖娟; 刘明
Original assignee: Beijing Bei Shi Dan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Bei Shi Dan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2018-08-28

Abstract

一种DBMSCs活性物质、制备方法及其在护肤品中的应用，其制备方法为：获得母体底蜕膜组织，剪碎研磨后,利用蛋白酶溶液进行消化，经过过滤以及离心后，制成DBMSCs细胞悬液并进行培养；对培养后的DBMSCs进行细胞传代，并培养至第四代；对于第四代DBMSCs，采用表皮生长因子(EGF)进行诱导培养，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。本发明的DBMSCs活性物质是通过表皮生长因子，诱导培养底蜕膜间充质干细胞而获得的，并按照特定的比例制备相应的护肤品。该护肤品既具备常规皮肤生长的美容修复功能，同时又兼备胎盘底蜕膜间充质干细胞的抗氧化、抗炎症、抵抗外界伤害的功能，在生物美容方面具有很好的应用。

Description

DBMSCs活性物质、制备方法及其在护肤品中的应用

技术领域

本发明涉及护肤品，以及相应成分的制备方法，具体的，涉及一种胎盘底蜕膜间充质干细胞(decidua basalis-derrived mesenchymal stem cells，DBMSCs)活性物质的护肤品，以及从成体胎盘的底蜕膜干细胞分离、培养、诱导并获取DBMSCs活性物质，以及该DBMSCs活性物质在护肤品，以及美容方面的应用。

背景技术

胎盘是母体与胎儿间进行物质交换的器官，依椐《本草纲目》记载，胎盘能温肾、益经、补气、养血，因而增强机体抵抗力，有抗感染及抗老化的功效，被广泛用于美容护肤行业。近些年研究显示：胎盘中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞，是稳定的干细胞来源。由于取材方便、干细胞数量充足、且不存在伦理问题，胎盘干细胞在干细胞治疗及医疗美容领域具有很好的应用前景。

现代医学认为：皮肤的生长和修护依赖真皮内的皮肤干细胞。皮肤干细胞可以分泌大量的生长因子、细胞因子、趋化因子等多种生物活性，以维持其自身及周围的组织和细胞的正常的生命活动及新陈代谢。但随着年龄的增长，干细胞数量逐渐减少，加上紫外线伤害、细菌感染及外力损伤，使皮肤细胞赖以生存的微环境受到破坏，最终导致皮肤颜色暗黄、难以锁住水分、弹性丧失、下垂等衰老迹象。因此，研制以干细胞分泌的活性生物活性为基础、同时能抗外界伤害的护肤品，已经成为皮肤美容修复和抗衰老研究的热点。

胎盘干细胞包含有母体和胎儿两部分，由羊膜、绒毛膜获得的干细胞来自于胎儿，但底蜕膜获得的干细胞为母体干细胞。由于分娩过程中，胎盘的母体部分承受更多的氧化、损伤和炎症压力，因此，由胎盘底蜕膜获得的母体间充质干细胞(decidua basalis-derrived mesenchymal stem cells，DBMSCs)较其他来源的干细胞表现出更高抗氧化、抗炎症、抗外界伤害的效果。由于皮肤长期接触外界坏境，其保护屏障极易氧化和损伤，但直接以DBMSCs为基础进行美容产品的研制的报道并不多见。

随着DBMSCs研究的不断深入，科学家们发现：培养三代DBMSCs呈成纤维细胞形态，表现出多潜能分化和克隆增殖能力，三代和五代的DBMSCs分泌的粘附和细胞因子略有细微区别；同时相比脐带、骨髓等其他干细胞，DBMSCs表达的粘附因子种类更多，提示其在免疫调节、对抗外界伤害和修复中具备特殊功能；另外，DBMSCs表达的细胞因子往往具有双向功能，如即同时表达免疫抑制和激活分子，提示其作中功能依赖其所处的微环境。

因此，如何对于DBMSCs进行定向干预和诱导，获取能够对抗外界环境、批次间产品稳定，并且适用于皮肤生长的微环境，抵抗细胞氧化的美容产品，成为现有技术亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提出一种含有DBMSCs活性物质的护肤品、DBMSCs活性物质的制备方法及其应用，能够既具备正常皮肤干细胞生长更新的美容修复功能，同时，又兼备母体胎盘干细胞所具备的抗细胞氧化、抵抗外界伤害的功能，两者可协同增效，在生物美容方面具有很好的应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)活性物质的制备方法，包括如下步骤：

DBMSCs细胞悬液培养步骤S110：获得母体底蜕膜组织，剪碎研磨后,利用蛋白酶溶液进行消化，经过过滤以及离心后，制成DBMSCs细胞悬液并进行培养；

DBMSCs传代步骤S120：对培养后的DBMSCs进行细胞传代，并培养至第四代；

DBMSCs活性物质诱导及制备步骤S130：对于第四代DBMSCs，采用表皮生长因子(EGF)进行诱导培养，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。

可选的，所述DBMSCs细胞悬液培养步骤S110具体为：取靠近母体面底蜕膜10g，用磷酸盐缓冲液冲洗干净，剪碎研磨，采用胶原蛋白酶溶液进行消化后，采用100微米尼龙网过滤，室温裂解红细胞，将提取的DBMSCs细胞悬液进行培养。

可选的，所述DBMSCs传代步骤S120具体为：当原代细胞生长到80～90％培养瓶底时，采用胰酶消化法进行DBMSCs的细胞传代，并培养至第四代。

可选的，所述DBMSCs活性物质诱导及制备步骤S130具体为：选取第四代胎盘底蜕膜间充质干细胞，当细胞融合度为70％时，去掉原培养液，采用添加0.02％表皮生长因子(EGF)的磷酸盐缓冲液(PBS)进行DBMSCs诱导培养，收获培养基，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。

可选的，所述DBMSCs细胞悬液培养步骤S110进一步具体为：取靠近母体面底蜕膜10g，用PH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗去掉表面血液，精细剪碎研磨后继续用PBS洗3次，1000rpm离心5分钟，沉淀采用胶原蛋白酶溶液37℃消化2小时，所述胶原蛋白酶溶液为磷酸盐缓冲液中含有0.3％的胶原蛋白酶I、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素和0.1mg/ml脱氧核糖核酸酶I，采用100微米尼龙网过滤，室温裂解红细胞45分钟，离心后，制成DBMSCs细胞悬液，采用第一DMEM培养基于CO²细胞培养箱中培养上述细胞，培养密度为3×10⁴个/ml，所述第一DMEM培养基为DMEM中添加10％胎牛血清、100U/mL谷氨酸、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素。

可选的，所述DBMSCs传代步骤S120进一步具体为：当原代细胞生长到80～90％培养瓶瓶底时，进行细胞传代，具体操作为：吸出DMEM培养基，加入5ml磷酸盐缓冲液冲洗，吸出磷酸盐缓冲液，加入2ml胰酶，37℃消化3分钟，加入10ml第二DMEM培养基含有10％胎牛血的DMEM培养基中和胰酶，并将细胞吹打下来，将细胞吸到离心管中，1000rpm离心5分钟，倒出培养液，加入2ml左右所述第二DMEM培养基并吹散细胞，计数后，按照1×10⁴/ml细胞的培养密度进行传代，并培养至第四代，第二DMEM培养基为DMEM中加入10％胎牛血。

可选的，DBMSCs活性物质诱导及制备步骤S130进一步具体为：对于第四代DBMSCs，当细胞融合度为70％时，去掉原培养液，采用添加0.02％表皮生长因子(EGF)的磷酸盐缓冲液(PBS)进行DBMSCs诱导培养，24小时后收获培养基，3000rpm离心20分钟以去除杂质，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。

本发明还公开了一种胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)活性物质，利用上述方法制备而成。

本发明进一步公开了一种包括上述的胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)活性物质的化妆品，包括：90％-94.51％的DBMSCs活性物质、5％-10％的胶原蛋白、以及0.49％的防腐剂。

本发明进一步公开了一种上述的胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)在美容护肤品中的应用。

综上，本发明制备提取了DBMSCs活性物质，并将其应用于护肤品和美容用品。该DBMSCs活性物质是通过表皮生长因子，诱导培养底蜕膜间充质干细胞而获得的，并按照特定的比例制备相应的护肤品。该护肤品既具备常规皮肤生长的美容修复功能，同时又兼备胎盘底蜕膜间充质干细胞的抗氧化、抗炎症、抵抗外界伤害的功能，在生物美容方面具有很好的应用。

附图说明

图1是根据本发明具体实施例的胎盘底蜕膜间充质干细胞的活性物质的制备方法的流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。

参见附图1，示出了根据本发明的实施例的胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)的活性物质的制备方法，包括如下步骤：

其中，所述DBMSCs细胞悬液培养步骤S110具体为：取靠近母体面底蜕膜10g，用磷酸盐缓冲液(PBS，PH值为7.4)冲洗干净，剪碎研磨，采用胶原蛋白酶溶液进行消化后，采用100微米尼龙网过滤，室温裂解红细胞，将提取的DBMSCs细胞悬液进行培养。

DBMSCs传代步骤S120具体为：当原代细胞生长到80～90％培养瓶底时，采用胰酶消化法进行DBMSCs的细胞传代，并培养至第四代；

DBMSCs活性物质诱导及制备步骤S130具体为：选取第四代胎盘底蜕膜间充质干细胞，当细胞融合度为70％时，去掉原培养液，采用添加0.02％表皮生长因子(EGF)的磷酸盐缓冲液(PBS)进行DBMSCs诱导培养，收获培养基，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。

实施例1：

DBMSCs细胞悬液培养步骤S110：采取足月离体胎盘，2小时内冷链运输至实验室，取靠近母体面底蜕膜10g，用PH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗去掉表面血液，精细剪碎研磨后继续用PBS洗3次，1000rpm离心5分钟，沉淀采用胶原蛋白酶溶液37℃消化2小时，所述胶原蛋白酶溶液为磷酸盐缓冲液中含有0.3％的胶原蛋白酶I、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素和0.1mg/ml脱氧核糖核酸酶I，采用100微米尼龙网过滤，室温裂解红细胞45分钟，离心后，制成DBMSCs细胞悬液，采用第一DMEM培养基于CO²细胞培养箱中培养上述细胞，培养密度为3×10⁴个/ml，所述第一DMEM培养基为DMEM中添加10％胎牛血清、100U/mL谷氨酸、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素；

DBMSCs传代步骤S120：当原代细胞生长到80～90％培养瓶瓶底时，进行细胞传代，具体操作为：吸出DMEM培养基，加入5ml磷酸盐缓冲液冲洗，吸出磷酸盐缓冲液，加入2ml胰酶，37℃消化3分钟，加入10ml含有10％胎牛血的第一DMEM培养基中和胰酶，并将细胞吹打下来，将细胞吸到离心管中，1000rpm离心5分钟，倒出培养液，加入2ml左右所述第二DMEM培养基并吹散细胞，计数后，按照1×10⁴/ml细胞的培养密度进行传代，并培养至第四代，第二DMEM培养基为DMEM中加入10％胎牛血；

DBMSCs活性物质诱导及制备步骤S130：对于第四代DBMSCs，当细胞融合度为70％时，去掉原培养液，采用添加0.02％表皮生长因子(EGF)的磷酸盐缓冲液(PBS)进行DBMSCs诱导培养，24小时后收获培养基，3000rpm离心20分钟以去除杂质，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。

通过本发明的方法制备的DBMSCs活性物质能够应用于护肤品中，也能够应用于美容中。例如，可以采用国家法规允许的化妆品原料，科学配比并制备含有胎盘底蜕膜间充质干细胞活性成分的护肤品。

实施例2：

进一步的，本发明公开了一种包含通过上述方法所制备的DBMSCs活性物质的护肤品，包括DBMSCs活性物质、胶原蛋白、乙内酰脲、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯。该配方中除了防腐剂以外，还添加了胶原蛋白，以保障一定的蛋白浓度，防止DBMSCs活性物质中痕量细胞因子的降解。

进一步的，可以包括90％-94.51％的DBMSCs活性物质、5％-10％的胶原蛋白、以及0.49％的防腐剂。

更进一步的，可以包含94.51％的DBMSCs活性物质、5％的胶原蛋白、0.48％的乙内酰脲和0.01％的碘丙炔醇丁基氨甲酸酯。0.48％的乙内酰脲和0.01％的碘丙炔醇丁基氨甲酸酯即为防腐剂。

实施例3：包含DBMSCs的活性物质护肤品的功能评价

招募成年女性志愿者22名，连续28天使用实施例2的产品，一天两次，分别于14天、28天采集右侧面颊、嘴角、眼角等部位的相关数据。采用皮肤颜色测定仪Coloeimeter用于皮肤颜色ITA鉴定，数值越高，说明肤色越亮白，去暗黄效果好；皮肤水分测定仪TewameterTM300用于检测皮肤经表皮失水率，测量值越低，说明皮肤保障好，锁水能力强；采用皮肤纹理扫描仪VC98用于检测皮肤平滑度，测量值越低，说明皮肤越光滑、粗糙度小；采用皮肤弹性测定仪Cutometer MPA580用于检测皮肤紧致、测量值越低，说明皮肤越紧致；F3/F4越接近1，说明皮肤弹性越好。

具体实验结果如表1所示：相比使用前，受试者皮肤在肤色、皮肤经表皮失水率、平滑度、弹性、紧致均有显著改善(P<0.05)，提示本发明能明确提高皮肤的保障能力，防止水分流失和外界伤害造成的肤色暗黄；同时具有综合的生理调节能力，使皮肤紧致和富有弹性，更显年轻。22位志愿者未发生任何过敏反应，提示本发明在在医学美容行业具有很好的应用。

表1含有DBMSCs活性物质的护肤品的美容效果评价

本发明与现有技术相比具有以下特点：

1、基于对抗外界环境的干细胞美容产品

干细胞美容以直接激活皮肤细胞活性，改善细胞生长状态成为生物美容中的领跑者。但以往干细胞美容多数基于胚胎或脐带干细胞等，均未暴露于外界的氧化应激及伤害环境下。相比之下，DBMSCs属于母体干细胞，分娩过程中，胎盘需长期对抗高炎症、高氧化、高伤害的生理环境，因此，以DBMSCs产品具有更接近天然条件下的对抗外界环境、抗氧化抗衰老能力。

2、综合平衡的生物美容产品

细胞因子(如EGF等)已经成为生物美容的重要组成部分。但单一使用，易打破皮肤微环境的平衡。本发明在DBMSCs培养过程中添加EGF进行诱导，获得的活性物质除了含有EGF外，还含有多种DBMSCs自然分泌的细胞因子和、趋化因子等，可有效维护皮肤干细胞生长发育复杂的微环境，同时又兼具EGF的美肤功能，从而达到天然的、生理性的护肤美容效果。

3、质量稳定性的产品

考虑到不同代数干细胞分泌细胞因子及趋化因子的差别和最大化产品产量，本发明均采用4代DBMSCs培养上清进行活性物质的提取和制备，对培养细胞得密度和融合度进行明确限定，以保证产品的批间稳定性，从而达到更好的控制DBMSCs活性物质的产品质量。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定保护范围。

Claims

1.一种胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)活性物质的制备方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述DBMSCs细胞悬液培养步骤S110具体为：取靠近母体面底蜕膜10g，用磷酸盐缓冲液冲洗干净，剪碎研磨，采用胶原蛋白酶溶液进行消化后，采用100微米尼龙网过滤，室温裂解红细胞，将提取的DBMSCs细胞悬液进行培养。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述DBMSCs传代步骤S120具体为：当原代细胞生长到80～90％培养瓶底时，采用胰酶消化法进行DBMSCs的细胞传代，并培养至第四代。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述DBMSCs活性物质诱导及制备步骤S130具体为：选取第四代胎盘底蜕膜间充质干细胞，当细胞融合度为70％时，去掉原培养液，采用添加0.02％表皮生长因子(EGF)的磷酸盐缓冲液(PBS)进行DBMSCs诱导培养，收获培养基，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

所述DBMSCs细胞悬液培养步骤S110进一步具体为：取靠近母体面底蜕膜10g，用PH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗去掉表面血液，精细剪碎研磨后继续用PBS洗3次，1000rpm离心5分钟，沉淀采用胶原蛋白酶溶液37℃消化2小时，所述胶原蛋白酶溶液为磷酸盐缓冲液中含有0.3％的胶原蛋白酶I、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素和0.1mg/ml脱氧核糖核酸酶I，采用100微米尼龙网过滤，室温裂解红细胞45分钟，离心后，制成DBMSCs细胞悬液，采用第一DMEM培养基于CO²细胞培养箱中培养上述细胞，培养密度为3×10⁴个/ml，所述第一DMEM培养基为DMEM中添加10％胎牛血清、100U/mL谷氨酸、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

所述DBMSCs传代步骤S120进一步具体为：当原代细胞生长到80～90％培养瓶瓶底时，进行细胞传代，具体操作为：吸出DMEM培养基，加入5ml磷酸盐缓冲液冲洗，吸出磷酸盐缓冲液，加入2ml胰酶，37℃消化3分钟，加入10ml第二DMEM培养基含有10％胎牛血的DMEM培养基中和胰酶，并将细胞吹打下来，将细胞吸到离心管中，1000rpm离心5分钟，倒出培养液，加入2ml左右所述第二DMEM培养基并吹散细胞，计数后，按照1×10⁴/ml细胞的培养密度进行传代，并培养至第四代，第二DMEM培养基为DMEM中加入10％胎牛血。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

DBMSCs活性物质诱导及制备步骤S130进一步具体为：对于第四代DBMSCs，当细胞融合度为70％时，去掉原培养液，采用添加0.02％表皮生长因子(EGF)的磷酸盐缓冲液(PBS)进行DBMSCs诱导培养，24小时后收获培养基，3000rpm离心20分钟以去除杂质，获取上清液后得到DBMSCs活性物质。

8.一种胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)活性物质，其特征在于，利用权利要求1-7中任意一项所述的方法制备而成。

9.一种包括权利要求8所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)活性物质的化妆品，包括：

90％-94.51％的DBMSCs活性物质、5％-10％的胶原蛋白、以及0.49％的防腐剂。

10.一种如权利要求8所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞(DBMSCs)在美容护肤品中的应用。