CN108421017A - 龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的应用，属于医药用途技术领域。本发明提供了一种龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的应用，所述药物为治疗动脉粥样硬化的药物。所述药物的剂型包括片剂、粉剂、粒剂、丸剂、胶囊剂。所述龙虎人丹的有效作用剂量为50～500mg/kg/d。本发明经实验验证，使用龙虎人丹治疗后，动脉粥样硬化小鼠包括血清学指标、脂质及斑块沉积相关指标等各项脂质代谢指标均有显著改善，说明龙虎人丹具有一定的降血脂和减缓动脉粥样硬化进程的作用，可用于制备降血脂和动脉斑块的药物。

Description

龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药用途技术领域，具体涉及龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的应用。
技术背景
龙虎人丹是上海中华药业有限公司独家生产的中药品种，批准文号为国药准字Z20025168，剂型为丸剂(糊丸)，规格为每丸重0.04g；执行标准为国家药品标准WS-10157(ZD-0157)-2002-2012Z。具有开窍醒神，祛暑化浊，和中止呕功能。用于中暑头晕，恶心呕吐，腹泻及晕车、晕船。用法用量：口服或含服，一次4～8粒，或遵医嘱。
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病，是心脏病和中风的主要病因。据报道，在发达国家和发展中国家，动脉粥样硬化占绝大多数的发病率和死亡率，被认为是一种复杂的多因素心血管疾病，其特点是最初的脂质沉积和炎症反应在内膜中发生。病变特征是血中脂质在动脉内膜上沉积，内膜灶性纤维性增厚和深部成分坏死，转化形成粥样斑块，进而促进动脉壁变厚及管腔狭窄，导致组织供血不足。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此将其称为动脉粥样硬化。动脉粥样硬化严重危害人类身体健康，开发具有预防/治疗动脉粥样硬化的新药物具有重大意义。
血清中总胆固醇(Total cholesterol，TC)和甘油三酯(Triglycerides，TG)水平可用于评价血脂沉积程度。血清总胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和。总胆固醇包括游离胆固醇和胆固醇酯，其合成和贮存的主要器官为肝脏。胆固醇是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料，也是构成细胞膜的主要成分，其血清浓度是脂代谢的一个重要指标，临床上将血清总胆固醇增高称为高胆固醇血症。甘油三酯，又称脂肪，是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。它是由食物脂肪与肝脏合成的，它是血液中血脂最重要的一种。其不溶于水，可与蛋白质结合成脂蛋白，在血液中循环运转。甘油三酯是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成，在脂肪组织中贮存。甘油三脂是血脂检查中比较重要的一项指标。
胆固醇在血液中以脂蛋白的形式存在，血浆中低密度脂蛋白胆固醇(Low densitylipoprotein-cholesterol，LDL-C)是运输内源性胆固醇的主要载体，其水平升高会增加患冠状动脉心脏病的危险性。LDL-C是明确独立的动脉粥样硬化的危险因素，氧化应激、细胞因子等因素能使进入动脉壁的LDL-C被氧化成为氧化性低密度脂蛋白，oxidized LDL，oxLDL)。分化的巨噬细胞上表达的大量的清道夫受体，包括凝集素样-氧化低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized LDL receptor-1，LOX-1)等，能介导胞吞作用吞噬脂质(包括oxLDL)，进而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞，同时血管中膜迁移到内皮下间隙的平滑肌细胞也因此形成平滑肌细胞源性泡沫细胞。泡沫细胞坏死释放出脂质形成脂质核心，进一步形成斑块沉积于动脉壁上。在体内环境中，基础LOX-1表达较低，但在高血压，糖尿病和高脂血症等病理状态可使其表达增加，而这些病理状态与AS的形成有直接或间接相关，它们的存在对LOX-1表达的调节具有累加或协同效应。因此，LDL-C及LOX-1的水平成为检测动脉粥样硬化进程的关键性指标。
随着动脉粥样硬化进程的不断发展，血管中动脉斑块也随之不断形成。因此，动脉斑块的形成情况，是判断动脉粥样硬化进程最直接同时也是最权威的一个指标。而动脉斑块的形成，是由脂质沉积所引起的，故对动脉中脂质面积进行病理学染色及观察，能最为准确地观察动脉斑块的形成情况。由于主动脉是生物体内进行血液运输最重要的血管，其斑块沉积情况较其他血管最为明显。主动脉窦是指主动脉瓣相对的动脉壁向外膨出时瓣膜与主动脉壁之间的内腔，是主动脉与心脏相连的重要部位，其病变情况较血管中其他横切面更为明显，因此，主动脉窦上脂质沉积的情况也成为判断动脉粥样硬化进程的一个重要的诊断指标。
发明内容
龙虎人丹在现有技术中的常规作用为开窍醒神、祛湿化浊、和中止呕；可用于中暑头晕，恶心呕吐，腹泻及晕车、晕船。本发明提供了一种龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的新应用。
在本发明中，龙虎人丹具有显著的降血脂和动脉斑块的作用。使用龙虎人丹治疗后，动脉粥样硬化小鼠包括血清学指标(TC、TG)、脂质及斑块沉积相关指标等各项脂质代谢指标均有显著改善。说明龙虎人丹具有一定的降血脂和减缓动脉粥样硬化进程的作用，可用于制备降血脂和动脉斑块药物，辅助治疗治疗动脉粥样硬化。
在本发明中，所述降血脂和动脉斑块药物的剂型优选包括片剂、粉剂、粒剂、丸剂、胶囊剂。
本发明中，所述龙虎人丹在降血脂和治疗动脉斑块的有效作用剂量优选为50～500mg/kg/d。
附图说明
图1为本发明实施例1所述各组实验小鼠的血清学指标TC结果；
图2为本发明实施例1所述各组实验小鼠的血清学指标TG结果；
图3为本发明实施例1所述各组实验小鼠的血清学指标LDL-C结果；
图4为本发明实施例1所述各组实验小鼠的主动脉油红O染色结果；图
图5为本发明实施例1所述各组实验小鼠的主动脉窦HE染色(10X)结果；
图6为本发明实施例1所述各组实验小鼠的主动脉窦油红O染色(10X)结果；
图7为本发明实施例1所述各组实验小鼠的主动脉窦LOX-1免疫荧光染色(20X)结果；
具体实施方式
本发明提供了一种龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的新应用。
在本发明中，使用龙虎人丹对模型小鼠进行处理后，动脉粥样硬化小鼠包括血清学指标(TC、TG)、脂质及斑块沉积相关指标等各项脂质代谢指标均有显著改善。说明龙虎人丹具有一定的降血脂和减缓动脉粥样硬化进程的作用，可用于制备降血脂和动脉斑块药物。
本发明对所述龙虎人丹的来源没有特别限定，采用本领域已知的龙虎人丹配方自行制备而成(如申请号为200910194559.1的专利记载的龙虎人丹制备方法)，或从市场购买获得均可。在本发明的实施例中，所述龙虎人丹购买自上海中华药业有限公司，药品基本信息如下：
中文名称：龙虎人丹
【剂型】丸剂(糊丸)
【制法】以上所述药材，取冰片、薄荷脑，加入适量95％乙醇，制成混合液；取儿茶加适量水后加热溶解，滤过得儿茶溶液，加入4.5g苯甲酸钠，180.5g糯米粉，边加热边搅匀，制成儿茶糯米浆。其余丁香等8味粉碎成细粉，混匀，加入混合液中，搅拌混合均匀，制成混合粉，取混合粉与儿茶糯米浆搅匀，制成丸块后机制成丸，干燥，使用红氧化铁和石墨进行包衣。制成1000g，即得。
【标准依据】国家药品标准WS-10157(ZD-0157)-2002-2012Z。
除上述明确用于指代产品名称外，本发明所述“龙虎人丹”特指其中的中药组份。
本发明对所述降血脂和动脉斑块药物的制备方法没有特别限定，以龙虎人丹配合其他药用活性成分；或以龙虎人丹作为唯一药用活性成分，配合本领域可以接受的载体，即可制得本发明所述降血脂和动脉斑块药物。在本发明中，所述其他药用活性成分与龙虎人丹的配比为0～100:1；所述降血脂和动脉斑块药物的剂型包括但不限于片剂、粉剂、粒剂、丸剂和胶囊剂，优选为丸剂。
在本发明中，所述龙虎人丹的有效作用剂量优选为50～500mg/kg/d，包括但不限于100mg/kg/d、150mg/kg/d、200mg/kg/d、250mg/kg/d、300mg/kg/d、350mg/kg/d、400mg/kg/d、450mg/kg/d，以及上述有效作用剂量中任意两个数值中的区间及区间数值。更优选的，所述龙虎人丹的有效作用剂量为350～450mg/kg/d，进一步优选为400mg/kg/d。
在本发明中，龙虎人丹优选用稀释药剂对龙虎人丹进行稀释后再使用。本发明对所述龙虎人丹的稀释用药剂没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的药物载体即可，如羟甲基纤维素钠(CMC-Na)。在本发明中，所述羟甲基纤维素钠的质量浓度优选为0.5％。在本发明中，所述稀释用药剂是为了保证施药量，本发明优选采取灌胃给药方式。在本发明中，所述稀释用药剂羟甲基纤维素钠对纤维化无明显影响，仅作为药剂中的常用助悬剂，属于惰性分子，没有明显生物活性。本申请通过研究表明，龙虎人丹可以通过改善血清脂质障碍，并进一步调节了斑块中LOX-1的表达，进而显著改善动脉粥样硬化病变。
在本发明的实施例中，所述龙虎人丹按如下方法进行配药：
小鼠体重以30g/只计，每克每天给药体积为10μL，每组按8只鼠计算，每周(w)灌胃7天(d)，分三个剂量组：低100mg/kg/d，中200mg/kg/d，高400mg/kg/d。龙虎人丹每丸重0.04g，60粒/盒。
(1)给药体积：30g/只×10μL/g/d×8只＝2400μL/d＝2.4mL/d＝16.8mL/w。
(2)配药浓度：
高剂量组：(400mg/kg/d)/(10μL/g/d)＝40mg/mL
中剂量组：(200mg/kg/d)/(10μL/g/d)＝20mg/mL
低剂量组：(100mg/kg/d)/(10μL/g/d)＝10mg/mL
(3)0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶媒的配制：每周配一次药，取38粒龙虎人丹，置于研钵中研碎，用20mL的0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)将其溶解，吸入50mL离心管(EP管，上海生物工程有限公司)中，涡旋使其完全溶解后定容至38mL(A液)。取7个5mL离心管(EP管，上海生物工程有限公司)，每管分装3mL(即高剂量组一天给药量)。另取50mL离心管(EP管，上海生物工程有限公司)，吸取A液11mL，加11mL0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，混匀，取7个5mL离心管(EP管，上海生物工程有限公司)，每管分装3mL(即中剂量组一天给药量)。另取一个50mL离心管(EP管，上海生物工程有限公司)，吸取A液5.5mL，加0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液至22mL，混匀，取7个5mL离心管(EP管，上海生物工程有限公司)，每管分装3mL(即低剂量组一天给药量)。持续10周，共10×38粒＝380粒，约7盒药。
阳性药物阿托伐他汀钙按照如下方法进行配药：
小鼠体重以30g/只计，每克每天给药体积为10μL，每组按8只鼠计算，每周(w)灌胃7天(d)，阿托伐他汀钙按10mg/kg/d的剂量给药。每粒胶囊含药20mg。20粒/盒。
(1)给药体积：
30g/只×10μL/g/d×8只＝2400μL/d＝2.4mL/d＝16.8mL/w。
(2)配药浓度：
(10mg/kg/d)/(10μL/g/d)＝1mg/mL
每粒含药20mg，故一粒可配20mg/(1mg/mL)＝20mL，则配20mL需1粒。
(3)配药方案：取50mL离心管(EP管，上海生物工程有限公司)，加10～12mL的水，将1粒胶囊内颗粒倒入，溶解，之后定容至20mL，混匀。取7个5mL离心管(上海生物工程有限公司)，每管分装2.7mL(即一天给药量)。持续10周，共10×1粒＝10粒，约半盒药。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
通过以下实施例说明龙虎人丹具有降血脂和动脉斑块的功能，减缓动脉粥样硬化进程。
实施例1
高脂诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型
所有动物手术都是按照中国动物福利法的规定进行的，并得到了广东药科大学实验动物伦理委员会的批准。所述龙虎人丹选自上海中华药业有限公司制备生产，所述阿托伐他汀选择辉瑞制药有限公司生产的阿托伐他汀钙片。
SPF级健康C57及ApoE-/-雄性小鼠，6～7周龄，16～20g，购自广东省医学实验动物中心。C57小鼠8只，作为空白对照组；ApoE-/-小鼠40只，随机均分5组：高脂高胆固醇诱导ApoE-/-动脉粥样硬化模型组、龙虎人丹给药组(低、中、高三个剂量分别灌胃给药龙虎人丹100mg/kg/d、200mg/kg/d和400mg/kg/d)和阳性药组(灌胃给药阿托伐他汀钙10mg/kg/d)。除对照组C57小鼠外，其余各组ApoE-/-小鼠在给药的同时进行高脂饲料喂养(饲料含18.5％脂肪，19％蛋白质，50.5％碳水化合物)，持续给药同时高脂喂养10周。
实施例2
对实施例1所述实验小鼠进行血清学指标检测
(1)血清中的总胆固醇(T-CHO)检测
将收集到的血样，37℃保温30min，于5000rpm，离心20min，收集血清，-80℃保存。按南京建成总胆固醇(T-CHO)测试盒(货号A111-1COD-PAP法)说明书测定实验小鼠血清中的TC水平，具体如下：
实验仪器：酶标仪(510nm或505nm)、微量移液器、漩涡混匀器
适用范围：本试剂盒可测各种动物血清(浆)、组织及培养细胞、细胞培养液等样本中TC含量
试剂组成：
操作过程：
混匀后37℃孵育10分钟，510nm处，酶标仪测定各孔吸光度值。
计算公式：
酶标仪比色：
全自动生化分析仪：
注意点：
试剂防止葡萄糖、胆固醇等试剂的污染；
样品含量如超出检测范围上限时，可用生理盐水稀释样本后进行测定，测定结果乘以稀释倍数。
结果如图1所示，经T检验及分析后，与空白对照组的小鼠(3.35mmol/L)对比，模型组的小鼠血清中TC(9.47mmol/L)显著升高(P＜0.0001)；与模型组小鼠比较，用高剂量龙虎人丹治疗后，小鼠血清中的TC的水平(6.33mmol/L)显著下降(P＜0.01)。
血清TC水平可用于评价血脂沉积程度。通过对比模型组合空白对照组小鼠血清中TC的水平发现，模型组小鼠的TC水平明显增加，说明动脉粥样硬化与血清中的TC水平有联系。再通过比较模型组和LHRD组中小鼠血清的TC水平可以发现，经过LHRD治疗后，血清中TC水平有所降低，可以推断龙虎人丹能够起到将胆固醇降血脂作用。
(2)血清中的甘油三酯(TG)检测
将收集到的血样，37℃保温30min，于5000rpm，离心20min，收集血清，-80℃保存。按南京建成甘油三酯(TG)测试盒(货号A111-0GPO-PAP酶法)说明书测定实验小鼠血清中的TG水平，具体如下：
实验仪器：酶标仪(510nm或505nm)、微量移液器、漩涡混匀器
适用范围：本试剂盒可测各种动物血清(浆)、组织及培养细胞、细胞培养液等样本中TG含量
试剂组成：
操作过程：
混匀后37℃孵育10分钟，500nm处，酶标仪测定各孔吸光度值。
计算公式：
酶标仪比色：
全自动生化分析仪：
注意点：
A.试剂防止葡萄糖、胆固醇等试剂的污染；
B.样品含量如超出检测范围上限时，可用生理盐水稀释样本后进行测定，测定结果乘以稀释倍数。
结果如图2所示，经T检验及分析后，与空白对照组的小鼠(1.53mmol/L)对比，模型组的小鼠血清中TG(10.52mmol/L)显著升高(P<0.0001)；与模型组小鼠比较，用高剂量龙虎人丹治疗后，小鼠血清中的TG的水平(7.36mmol/L)显著下降(P<0.05)。
血清TG水平可用于评价血脂沉积程度。通过对比模型组合空白对照组小鼠血清中TG的水平发现，模型组小鼠的TG水平明显增加，说明动脉粥样硬化与血清中的TG水平有联系。再通过比较模型组和LHRD组中小鼠血清的TG水平可以发现，经过LHRD治疗后，血清中TG水平有所降低，可以推断龙虎人丹能够起到降血脂作用。
(3)血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测
将收集到的血样，37℃保温30min，于5000rpm，离心20min，收集血清，-80℃保存。按南京建成低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒(货号A113-1直接法)说明书测定实验小鼠血清中的LDL-C水平，具体如下：
实验仪器：酶标仪(510nm或505nm)、微量移液器、漩涡混匀器
适用范围：本试剂盒可测各种动物血清(浆)、组织及培养细胞、细胞培养液等样本中LDL-C含量
操作过程：
计算公式：
*校准品浓度(mmol/L)/待测样本蛋白浓度(gprot/L)
注意点：
A.试剂防止葡萄糖、胆固醇等试剂的污染；
B.样品含量如超出检测范围上限时，可用生理盐水稀释样本后进行测定，测定结果乘以稀释倍数。
结果如图3所示，经T检验及分析后，与空白对照组的小鼠(1.03mmol/L)对比，模型组的小鼠血清中LDL-C(13.29mmol/L)显著升高(P＜0.0001)；与模型组小鼠比较，用高剂量龙虎人丹治疗后，小鼠血清中的LDL-C的水平(9.32mmol/L)显著下降(P<0.01)。
血清LDL-C水平可用于评价脂质沉积程度。通过对比模型组合空白对照组小鼠血清中LDL-C的水平发现，模型组小鼠的LDL-C水平明显增加，说明动脉粥样硬化脂质沉积程度与血清中的LDL-C水平有联系。再通过比较模型组和LHRD组中小鼠血清的LDL-C水平可以发现，经过LHRD治疗后，血清中LDL-C水平有所降低，可以推断龙虎人丹能够起到减少脂质沉积继而减缓动脉粥样硬化发展的作用。
实施例3
对实施例1所述实验小鼠的主动脉进行油红O染色检测
A.取材和固定
将动脉粥样硬化小鼠解剖使心脏等组织暴露，在小鼠心脏右心房剪口，并在左心室插管灌注冰冷的PBS以清除体内积血，避免影响后续实验研究，当灌注到肝脏颜色变浅并无血色时可视为灌注达到要求。灌注成功后，取显微器械，于脊柱上缓慢分离主动脉，以主动脉弓为起点剥离主动脉，并于主动脉弓处将主动脉与心脏分离，直至肾脏部位为止。在冰冷的PBS中将离体的主动脉上粘附的多余脂肪缓慢剥离，直至剥离干净后，沿着主动脉弓部位纵向剪开主动脉弓，再沿着主动脉弓对侧部位纵向剪开整个主动脉，使整个主动脉呈现“Y”字形。将整个主动脉平铺于滤纸条上并用另一滤纸条将其夹住，于4％多聚甲醛固定液中固定1s，使其维持形态。
B.染色
将动脉条置于60％异丙醇溶液中漂洗1min，再将其置于60％的油红O染色液中(0.5％的油红O母液：水＝3:2)染色5min，立即取出置于60％异丙醇溶液中漂洗30s，再置于新的60％异丙醇溶液中漂洗30s。
C.图像采集
将染色后的动脉条置于PBS中保存，拍照时取出，以黑色卡片为背景，用铁架台固定同一高度夹住相机，用相机连续拍照。
用油红O染色法可以使脂肪特异性染上红色，直接检测脂质沉积，结果如图4所示。由图中可以看到，相对于正常饲料喂养的空白对照组，高脂诱导的动脉粥样硬化模型组的小鼠，主动脉上油红O面积明显增大。但用LHRD治疗后，油红O染色面积显著减少。用IPP软件对油红O处理的空白对照组小鼠、高脂诱导的动脉粥样硬化模型组小鼠、LHRD治疗组小鼠进行油红染色面积统计分析得：与空白组小鼠相比，模型组小鼠动脉粥样硬化程度显著增加(P<0.0001)；而LHRD治疗组小鼠相对于模型组小鼠动脉粥样硬化程度显著性降低(P<0.001)。
高脂诱导ApoE-/-小鼠作为一种典型的动脉粥样硬化模型，具有高效、简便、稳定等特点。该模型可以更快地促进其形成脂质条纹和纤维增生病变，便于短期内在小鼠身上构建较为显著的动脉粥样硬化模型。实验中，高脂诱导的动脉粥样硬化模型组的小鼠相对于正常饲料喂养的空白组小鼠，主动脉壁上脂质沉积程度显著性增高，说明高脂诱导动脉粥样硬化这种模型造模成功。而当用LHRD治疗后，相对于高脂诱导的动脉粥样硬化组小鼠，动脉壁上脂质沉积程度明显降低，因此，龙虎人丹具有减少脂质沉积的作用。
实施例1～3的实验结果见表1：
表1.实施例1～3的实验测定结果
实施例4
(1)对实施例1所述实验小鼠进行主动脉窦HE染色观察：
A.心脏组织的取材
将动脉粥样硬化小鼠解剖使心脏等组织暴露，在小鼠心脏右心房剪口，并在左心室插管灌注冰冷的PBS以清除体内积血，避免影响后续实验研究，当灌注到肝脏颜色变浅并无血色时可视为灌注达到要求。取下心脏于冰冷的PBS中，无需脱水，保持其原形状，直接以OCT(Optimal cutting temperature compound)冰冻切片包埋剂进行包埋，至于-20度冰箱储存。
B.切片及粘片
将包埋于OCT中的心脏组织解冻后，取出并心尖朝下垂直放在Leica冰冻切片机原配的切片固定器上，立即以OCT重新包埋后置于已降温至-20以下的切片机中，待OCT凝固后，用切片机进行切片，切片前必须确认心脏为垂直放置，否则无法切到心脏主动脉窦区域。切片时，先以15um厚度进行修片，切至暴露约1/3心脏横切面积，开始以经过APES处理的粘附载玻片进行收集，并在Olympus显微镜下以10X物镜放大观察切片，当发现接近心脏主动脉窦区域时，开始改为7um厚度进行切片，每切3下收集切片并在显微镜下观察，直至切到心脏主动脉窦区域时，开始收集切片，并将收集好的组织切片置于-20度冰箱中保存。
C.染色
取出切片，室温下放置15分钟使其复温，置于双蒸水中湿润3min，将切片置于苏木素染色液中染色10min；取出切片，清水冲洗5min，待细胞染蓝后，1％盐酸乙醇溶液进行分化，即用清水冲洗10min。用蒸馏水冲洗后，浸入1％伊红溶液中染色20s，用蒸馏水洗去浮色后，经递增梯浓度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。
结果如图5所示，空白对照组(C57BL/6)小鼠主动脉窦处动脉壁细胞排列规则，动脉壁完好，动脉壁内无脂质沉积。模型组ApoE-/-小鼠的斑块中可见大量泡沫细胞形成的脂纹期病变和纤维期病变，并有淋巴细胞、炎性细胞浸润，也存在大量胆固醇结晶，显示出易损斑块的特征。而LHRD给药及阿托伐他汀钙给药组ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块较模型组小鼠薄，浸润的炎性细胞和纤维成分均显著降低，没有胆固醇结晶，多为脂纹期病变，病变程度较模型组明显减轻。
HE染色可直观显示组织大体形态学变化，通过各组变化情况对比，可初步判断龙虎人丹对高脂诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化是具有一定改善作用。
(2)对实施例1所述实验小鼠进行主动脉窦油红O染色
A.取材及切片：将动脉粥样硬化小鼠解剖使心脏等组织暴露，在小鼠心脏右心房剪口，并在左心室插管灌注冰冷的PBS以清除体内积血，避免影响后续实验研究，当灌注到肝脏颜色变浅并无血色时可视为灌注达到要求。取下心脏于冰冷的PBS中，无需脱水，保持其原形状，直接以OCT(Optimal cutting temperature compound)冰冻切片包埋剂进行包埋，至于-20度冰箱储存。用Leica冰冻切片机收集主动脉窦切片，并将收集好的组织切片置于-20度冰箱中保存。
B.染色：取出切片，室温下放置15分钟使其复温，置于双蒸水中湿润3min，将切片置于60％异丙醇溶液中漂洗1min，再将其置于60％的油红O染色液中(0.5％的油红O母液：水＝3:2)染色5min，立即取出置于60％异丙醇溶液中漂洗30s，再置于新的60％异丙醇溶液中漂洗30s。流水冲洗5min。置于苏木素染色液中染色3min；取出切片，清水冲洗5min，待细胞染蓝后，1％盐酸乙醇溶液进行分化，即用清水冲洗5min。用蒸馏水洗去浮色后，经递增梯浓度乙醇脱水，二甲苯透明，胶水或甘油封片。
用油红O染色法可以使脂肪特异性染上红色，直接检测脂质沉积，实验结果见图6。由图中可以看到，相对于正常饲料喂养的空白对照组，高脂诱导的动脉粥样硬化模型组的小鼠，油红O面积增大。但用LHRD治疗后，油红O染色面积显著减少。用Image J、GraphPadPrism 6软件对油红O处理的空白对照组小鼠、高脂诱导的动脉粥样硬化模型组小鼠、LHRD治疗组小鼠进行油红染色面积统计分析得：与空白组小鼠相比，模型组小鼠动脉粥样硬化程度显著增加(P<0.0001)；而LHRD治疗组小鼠相对于模型组小鼠动脉粥样硬化程度显著性降低(P<0.01)。
实验中，高脂诱导的动脉粥样硬化模型组的小鼠相对于正常饲料喂养的空白组小鼠，主动脉窦脂质沉积程度显著性增高(P<0.0001)，说明高脂诱导动脉粥样硬化这种模型造模成功。而当用LHRD治疗后，相对于高脂诱导的动脉粥样硬化组小鼠，动脉粥样硬化程度明显降低(P<0.01)，因此，龙虎人丹能够减少主动脉窦上脂质的沉积，延缓动脉粥样硬化的进程，对心血管相关疾病有一定的治疗作用。
实施例5
利用免疫荧光法，对实施例1所述实验小鼠的脂质沉积形成情况进行检测：
A.取出冰切的心脏主动脉窦组织切片，在室温环境下自然复温10min，置于双蒸水中浸泡5分钟。
B.柠檬酸高温高压修复抗原：柠檬酸盐缓冲液(PH＝6.0)修复15min。(先将水煮沸，然后放入切片，待充气后开始计时)，冷至室温(约20-25分钟)，双蒸水泡2分钟。
C.1％牛血清蛋白(BSA)封闭：用磷酸盐缓冲液(PBS，PH＝7.2-7.4)洗三次，每次5分钟，再用1％牛血清蛋白(BSA，生工A0332)封闭1小时。
D.孵育一抗：加一抗凝集素样-氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)(1％BSA稀释)(置于湿盒中4℃过夜)。
E.孵育二抗：第二天取出片子自然复温30min。蒸馏水泡2分钟，涮三下，磷酸盐缓冲液(PBS，PH＝7.2-7.4)3*5分钟，加二抗室温孵育1小时。
F.磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5分钟，加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1:5000稀释)染核10min。
G.磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5分钟，用荧光封片剂进行封片，置于湿盒中4℃环境保存，
H.采用Leica DMi8显微镜进行荧光图像采集。
结果如图7所示，绿色荧光区域从大到小排序依次是：模型组、龙虎人丹给药组、空白对照组。经t-检验得，阳性区域从大到小排序依次是：模型组、龙虎人丹给药组、空白对照组；龙虎人丹与模型组的阳性区域有显著差异性(P<0.001)，模型组与空白对照组的阳性区域同样具有显著差异性(P<0.001)。
从结果中可以得知，用龙虎人丹治疗的小鼠模型中，凝集素样-氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的表达较模型组明显减少。结果表明，经过给药龙虎人丹，较模型组中的细胞泡沫化明显减少，脂质沉积也相应减少。因此，龙虎人丹可以抑制巨噬细胞的泡沫化，减少脂质沉积的形成，减缓动脉粥样硬化的进程。
经上述血清学指标(TC、TG)、脂质及斑块沉积相关指标等各项脂质代谢指标检测结果表明，使用龙虎人丹治疗后，动脉粥样硬化小鼠包括血清学指标、脂质及斑块沉积相关指标等各项脂质代谢指标均有显著改善，说明龙虎人丹具有一定的降血脂和减缓动脉粥样硬化进程的作用，整体疗效接近阳性对照药阿托伐他汀，有望用于制备降血脂和动脉斑块药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.龙虎人丹在制备降血脂和动脉斑块药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗动脉粥样硬化的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、粒剂、丸剂、胶囊剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述龙虎人丹的有效作用剂量为50～500mg/kg/d。
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