CN108414662B - 液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测方法 - Google Patents
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Abstract
液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测方法，其步骤如下：1)样品前处理；2)液相色谱串接质谱进行检测的色谱质谱条件：流动相：有机相为乙腈，水相为浓度为15mmol/L，每升含1.5mL甲酸的乙酸铵‑甲酸溶液；梯度洗脱；流速0.30mL/min；进样量25uL；离子源：电喷雾离子源ESI，正离子扫描；质谱扫描方式为多反应监测MRM；喷雾电压4200V；壳气压力40arb；碰撞气(Ar/m)Torr:1.5。该检测方法的回收率、精密度符合相关的技术规范，可有效检测出茶叶中三甲基锍的残留，满足欧盟对茶叶中三甲基锍残留限量的检测要求。
Description
技术领域
本发明申请涉及茶叶中的三甲基锍的检测，尤其是指用液相色谱串接质谱联用仪对茶叶中三甲基锍进行检测的检测检测方法
背景技术
农药草甘膦(glyphosate)是一种广谱、苗后、非选择性的除草剂,以草甘膦酸或者盐的形式存在，常见的有草甘膦异丙酸盐、草甘膦三甲基锍盐、草甘膦钾盐等。草甘膦具有良好的除草效果，在全球各地都得到了广泛的使用。当使用草甘膦三甲基锍盐作为除草剂使用时，会在茶叶中产生三甲基锍(trimethylsulfonium)的残留。为此，欧盟对输入该地区的茶叶中的三甲基锍设定了最高残留限量。其中非有机茶叶的残留限量为50ug/kg；有机茶叶依据国际有机农业联盟以及国际食品法典委员会制定的原则，则采用了一律标准，均要求不得检出(检出限为10ug/kg)。中国是世界最大的茶叶生产和贸易国，也是欧盟茶叶的最大输入国。据相关资料统计，2014年中国出口到欧盟的茶叶为2.49万吨，货值达到1.04亿美元。近年来，欧盟不断地调整、修改茶叶中农药残留的限量要求，实施了越来越严格的残留限量标准。2015年，欧盟通报中国产茶叶的农药残留不合格就达到22次，造成中国茶叶出口多次受阻。
由于国内对于茶叶中的三甲基锍的检测的检出率比较低，如何提高茶叶中三甲基锍的检出率就亟待解决。基于目前国内国际均没有采用质谱技术检测茶叶中的三甲基锍，也没有公开的文献报道。因此发明人质谱技术方面着手进行了深入研究，基于风险分析的考虑，有必要建立三甲基锍的检测方法，对相关茶叶中的残留情况进行筛查。本研究选择了四种茶叶：绿茶、红茶、铁观音、茉莉花茶作为研究对象。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用液相色谱串接质谱对茶叶中三甲基锍的检测方法，其可以有效检出茶叶中三甲基锍的含量，提高茶叶中三甲基锍的检出率。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测方法，其步骤如下：1)样品前处理；2)液相色谱串接质谱进行检测的色谱质谱条件：流动相：有机相为乙腈，水相为浓度为15mmol/L，每升含1.5mL甲酸的乙酸铵-甲酸溶液；梯度洗脱；流速0.30mL/min；进样量25uL；离子源：电喷雾离子源ESI，正离子扫描；质谱扫描方式为多反应监测MRM；喷雾电压4200V；壳气压力40arb；碰撞气(Ar/m)Torr:1.5。
步骤1)中样品前处理的方法包括制备液相色谱质谱检测用样品的方法：取待测茶叶打碎过100目筛，收集筛下物作为样品；称取样品100mg置于容器中，加入15mL提取液以及2mL过氧化氢溶液，浸泡20min；然后加热沸腾至剩余的提取液大约为3mL左右，取下冷却至室温后，置于离心管中，用少量样品提取液分3次清洗所述容器后用样品提取液定容至刻度，以8000r/min速率离心5min；取上清液1mL加入100mg PSA,涡旋1min，10000r/min速率离心5min，取上清液2mL过亲水膜，所得滤液供液相色谱质谱检测使用；其中所述提取液为浓度为0.77g/L、每升含2mL甲酸的乙酸铵水溶液。
步骤1)中样品前处理的方法包括样品基质液的处理方法，其步骤为称取粉碎过20目筛后的茶叶样品100mg置于容器中，加入15mL提取液以及2mL过氧化氢溶液，浸泡20min；加热沸腾至剩余的提取液约为3mL左右，取下冷却至室温后，转移至离心管中；用少量样品提取液分3次清洗所述容器后用样品提取液定容至刻度，以8000r/min速率离心5min；取上清液8mL加入300mg PSA,涡旋1min，10000r/min速率离心5min，取上清液6mL过亲水膜，所得滤液为样品基质液，用于倍比稀释三甲基溴化锍的标准溶液生成标准曲线；其中所述提取液为浓度为0.77g/L、每升含2mL甲酸的乙酸铵水溶液。
色谱柱为Hillic亲水柱。
检测母离子为77.1m/z，定量子离子62.4m/z、碰撞能量15ev，定性子离子47.4m/z、碰撞能量25ev。
本发明方法的检出限、定量限分别为4.0ug/kg和10.0ug/kg。该检测方法的回收率、精密度符合相关的技术规范，满足欧盟对茶叶中三甲基锍残留限量的检测要求。该方法不仅可以用于茶叶中三甲基锍的检测，也为其他植物产品中三甲基锍的检测提供了参考基础。
附图说明
图1，三甲基溴化锍的标准工作曲线。
图2，绿茶、红茶、铁观音样品基质液配制的标准曲线。
图3，三甲基溴化锍的总离子流图。
图4.绿茶阴性样品总离子流图。
图5，绿茶加标样品总离子流图。
图6，红茶阴性样品总离子流图。
图7，红茶加标样品总离子流图。
具体实施方式
本发明涉及到各仪器及药品规格如下：
Thermo TSQ Quantan Access液相色谱-串接质谱仪：配电喷雾离子源(ESI)和自动进样器(Finnigen Surveyor)；电子天平：感量0.1mg(瑞士梅特勒公司)；3K15高速冷冻离心机(Sigma公司)；
乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；甲酸、乙酸铵、过氧化氢为分析纯(上海国药集团)；N-丙基乙二胺固体粉末(PSA，上海安普公司)。实验用水为Milli-Q高纯水。高脚烧杯(直径30mm，50mL)。15mL带刻度的离心管(上海安普公司)。石墨化炭黑(GCB，深圳逗点公司)。亲水膜(0.22um，上海安普公司)。样品提取液(0.77g乙酸铵/1000mL水，含2mL甲酸)。
三甲基溴化锍标准品购自德国Dr.Ehrenstorfe公司，纯度大于99％。标准溶液：用乙腈将三甲基溴化锍标准品配制为10.0mg/L的标准储备液，于4℃保存。根据实验需要用样品提取液稀释至适当浓度作为三甲基溴化锍标准溶液。
实验所用的样品采购自当地市场，均为经过有机认证公司认证的有机产品。
本发明的液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测其步骤如下。
1)样品制备
取100g绿茶茶叶样品，用组织捣碎机打碎后过100目的筛子，收集筛下物20g充分混合均匀作为样品用于检测。
1.1)样品基质液的制备
称取绿茶样品100mg(精确至1mg)，置于高脚烧杯中，加入15mL样品提取液以及2mL过氧化氢溶液，浸泡20min。放到电炉上加热沸腾至剩余的提取液大约为3mL左右，取下冷却至室温后，转移至15mL带刻度的离心管中。用少量提取液分3次清洗高脚烧杯，合并于上述离心管中，用提取液定容至刻度，以8000r/min速率离心5min。取上清液8mL加入300mg PSA,涡旋1min，10000r/min速率离心5min，取上清液6mL过亲水膜，所得滤液为样品基质液，用于倍比稀释三甲基溴化锍的标准溶液生成标准曲线。
1.2)制备液相色谱质谱检测用样品
称取绿茶样品100mg(精确至1mg)，置于高脚烧杯中，加入15mL提取液以及2mL过氧化氢溶液，浸泡20min。放到电液相色谱质谱检测用样品制备炉上加热沸腾至剩余的提取液大约为3mL左右，取下冷却至室温后，转移至15mL带刻度的离心管中。用少量提取液分3次清洗高脚烧杯，合并于上述离心管中，用提取液定容至刻度，以8000r/min速率离心5min。取上清液1mL加入100mg PSA,涡旋1min，10000r/min速率离心5min，取上清液2mL过亲水膜，所得滤液作为检测样品供液相色谱质谱检测使用。
1.3)三甲基溴化锍标准工作曲线确定
吸取50.0uL三甲基锍标准溶液(20.0ug/L)于950.0uL经1.1)步骤中制备的样品基质液中，涡旋混合均匀。再用样品基质液进行倍比稀释，共计6个点：0.032、0.062、0.125、0.25、0.50、1.0ug/L。以峰面积对质量浓度作图，得到标准工作曲线，见图1。结果显示，在所测定的质量浓度范围内工作曲线有良好的线性，相关系数(R2)大于0.995。
在本发明中，三甲基溴化锍标准品是利用样品基质液倍比稀释，而未采用样品提取液进行倍比稀释，其原因在于针对样品提取液配比标准品制作标注曲线进行了相关的实验。称取茶叶样品100mg(精确至1mg)，置于15mL离心管中，加入10mL样品提取液浸泡30min，超声30min后，以8000r/min速率离心5min，取上清液3mL加入25mg GCB、100mg PSA。涡旋1min，以10000r/min速率离心5min，取上清液取2mL过亲水膜，供液质使用。在采用提取液配制标准曲线的情况下，四种茶叶的回收率都不到15％。虽然采用梯度洗脱的方式分离待测组分，出峰时间也比较晚，但是实验数据显示茶叶中的基质对待测组分还是有很强的抑制效应。
采用1.1)步骤的方法分别处理四种茶叶样品，用各自的基质液配制标准溶液，再各自检测自己的品种，可以获得理想的回收率。但是采用一种品种的基质液配制标准溶液去计算其他三种茶叶的检测结果，差异很大且重复性也不好，难以形成统一的样品前处理的方法。绿茶、红茶、铁观音样品基质液配制的标准曲线数据见表1，标准曲线见图2。
表1绿茶、红茶、铁观音样品基质液配制的标准曲线的浓度和峰面积
| 浓度(ug/L) | 0.032 | 0.062 | 0.125 | 0.25 | 0.50 | 1.00 |
| 峰面积(红茶) | 6116 | 19869 | 45269 | 88844 | 196148 | 460950 |
| 峰面积(绿茶) | 114442 | 132450 | 179141 | 283650 | 523395 | 965815 |
| 峰面积(铁观音) | 8349 | 21731 | 56466 | 116811 | 255448 | 554458 |
但是经过实验得知，在样品基质液及制备液相色谱质谱检测用样品时，对茶叶样品进行适当的氧化可实现采用一种品种的基质液配制标准溶液去计算其他三种茶叶的检测结果。其原因在于：茶叶中也含有一些酸性物质和酚类物质，要想氧化这些物质，低浓度的高锰酸钾、重铬酸钾、过氧化氢等氧化剂都可以选择。考虑到多余的高锰酸钾、重铬酸钾的清除需要加入还原剂，导致实验步骤比较复杂；清楚不干净也会对色谱柱和质谱产生损害。因此选择了过氧化氢去除一些活性羟基的干扰。通过正交试验，对处理的时间、温度、过氧化氢的用量进行了考察。实验数据显示加热提取液，挥发至3mL左右不仅能够加速这种氧化效果，还可以将剩余的过氧化氢彻底清楚干净，避免对色谱柱和质谱产生损害。经过过氧化氢处理后，用绿茶的样品基质液配制标准曲线去定量计算四种茶叶的检测结果，回收率、精密度、重复性均可以满足相关的技术要求。
2)液相色谱串接质谱进行检测
色谱串接质谱检测条件及参数如下：
色谱：色谱柱为Se QuantTM 
-Hillic亲水柱(150mm×2.1mm，5um)；流动相：有机相为乙腈，水相为乙酸铵-甲酸溶液(15mmol/L，含1.5mL甲酸)，梯度洗脱(洗脱参数见表2)，洗脱流速0.30mL/min；进样量25uL；柱温25℃。
质谱：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式扫描；质谱扫描方式：多反应监控(MRM)；喷雾电压4200V；离子源温度360℃；辅助气压力10arb；壳气压力40arb；碰撞气(Ar/m)Torr:1.5。定性、定量离子对，碰撞能量以及方法的检出限、定量限各参数见表3。标准溶液的总离子流图见图3。
表2色谱梯度洗脱条件
表3三甲基溴化锍的质谱参数、回归方程、相关系数、检出限、定量限
其中：Y为峰面积；X：质量浓度,ug/L
针对色谱柱的选择，做了相应的实验。选择了C18柱(Agilent Eclipse PlusC18)、C8柱(Agilent Eclipse Plus C8)、亲水柱(Thermo Fotis-Hillic、CNW AthenaHillic(2)、Se QuantTM 
-Hillic)、SCX柱(Welch Ultimate XB-SCX)、MCX(TurboflowCyclone MCX)等几款色谱柱用于待测组分的分离。其中C18、C8柱对待测组分基本没有保留，并且因为出峰太快，样品中的极性物质会对待测组分的响应值产生很强的抑制效应，样品的回收率比较低。MCX、SCX对待测组分的保留比较强，拖尾严重，峰型差。在采用表2的条件梯度洗脱时，CNW Athena Hillic(2)和Thermo Fotis-Hillic色谱柱会产生一定的柱残留。Se QuantTM 
-Hillic色谱柱在峰型、保留时间方面都比较好，并且没有柱残留。因此选择该色谱柱进行色谱检测。
3)加标实验
首先，参照EPA中的方法(Assigning Values to Non detected/Non-QuantifiedPesticide Residues in Human health Food Exposure Assessments)，先计算仪器的检出限和定量限。然后在仪器的定量限上做实际样品的加标回收，以7次平行试验的标准偏差计算方法的检出限和定量限(见表3)。
用四种有机茶叶做加标回收实验，添加水平为10.0、20.0和40.0ug/L,每个加标水平测定6次，方法的平均回收率78.1％～127.3％，相对标准偏差(RSDs)为3.9％～10.4％，具体参数见表4。绿茶、红茶阴性样品以及加标样品的总离子流图分别见图4至图7。
表4四种茶叶阴性样品的加标回收率、精密度
还用4种茶叶进行了加标高温试验，考察在持续高温的情况下，三甲基锍有无可能与茶叶中的基质进行甲酯化。称取100mg的绿茶、红茶、铁观音、茉莉花茶各3份于15mL离心管中。一份作为空白，另外两份加入不同浓度的标准溶液，旋紧盖子，放到80℃的烘箱中恒温72h。取出后按照1.2)步骤处理样品，进行测定。回收率结果显示，在持续高温的情况下，不会出现自然酯化反应的情况。
本发明建立了茶叶中三甲基锍的液相色谱串接质谱的检测方法，该方法的检出限、定量限分别为4.0ug/kg和10.0ug/kg。由以上实验数据可知，该检测方法的回收率、精密度符合相关的技术规范，满足欧盟对茶叶中三甲基锍残留限量的检测要求。该检测方法不仅可以用于茶叶中三甲基锍的检测，也为其他植物产品中三甲基锍的检测提供了参考基础。
Claims (4)
1.液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测方法，其步骤如下：1)样品前处理：将茶叶粉碎过筛，取筛下物加入提取液及过氧化氢溶液浸泡，然后加热沸腾至剩余的提取液约为3mL，定容离心，取上清液加入PSA，涡旋离心后取上清液过亲水膜，所得滤液供液相色谱串接质谱检测使用；其中所述提取液为浓度为0.77g/L、每升含2mL甲酸的乙酸铵水溶液；
2)液相色谱串接质谱进行检测的色谱质谱条件：色谱柱为Hillic亲水柱；流动相：有机相为乙腈，水相为浓度为15mmol/L，每升含1.5mL甲酸的乙酸铵-甲酸溶液；梯度洗脱：0.0-1.0min，有机相100％；1.0-1.5min,有机相从100％变为80％，水相从0变为20％；1.5-3.5min，有机相80％、水相20％；3.5-4.0min，有机相从80％变为50％，水相从20％变为50％；4.0-6.0min，有机相50％、水相50％；6.0-8.0min，有机相从50％变为5％、水相从50％变为95％；8-8.5min，有机相从5％变为100％，水相从95％变为0；8.5-11.0min，有机相100％；流速0.30mL/min；进样量25uL；离子源：电喷雾离子源ESI，正离子扫描；质谱扫描方式为多反应监测MRM；喷雾电压4200V；壳气压力40arb；碰撞气:1.5Torr。
2.根据权利要求1所述的液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测方法，其特征在于步骤1)中样品前处理的方法包括制备液相色谱质谱检测用样品的方法：取待测茶叶打碎过100目筛，收集筛下物作为样品；称取样品100mg置于容器中，加入15mL提取液以及2mL过氧化氢溶液中浸泡大于20min；然后加热沸腾至剩余的提取液约为3mL，取下冷却至室温后，置于离心管中，用提取液定容至刻度，以8000r/min速率离心5min；取上清液1mL加入100mg PSA,涡旋1min，10000r/min速率离心5min，取上清液2mL过亲水膜，所得滤液供液相色谱质谱检测使用；其中所述提取液为浓度为0.77g/L、每升含2mL甲酸的乙酸铵水溶液。
3.根据权利要求1所述的液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测方法，其特征在于步骤1)中样品前处理的方法包括样品基质液的处理方法，其步骤为称取粉碎过100目筛后的茶叶样品100mg置于容器中，加入15mL提取液以及2mL过氧化氢溶液中浸泡大于20min；加热沸腾至剩余的提取液约为3mL，取下冷却至室温后，转移至离心管中用提取液定容至刻度，以8000r/min速率离心5min；取上清液8mL加入300mg PSA,涡旋1min，10000r/min速率离心5min，取上清液6mL过亲水膜，所得滤液为样品基质液，用于倍比稀释三甲基溴化锍的标准溶液生成标准曲线；其中所述提取液为浓度为0.77g/L、每升含2mL甲酸的乙酸铵水溶液。
4.根据权利要求1所述的液相色谱串接质谱联用仪检测茶叶中的三甲基锍的检测方法，其特征在于检测母离子为77.1m/z，定量子离子62.4m/z、碰撞能量15ev，定性子离子47.4m/z、碰撞能量25ev。
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