CN1084141C - 山葵种苗的繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种山葵种苗的快速繁殖方法，属于植物种苗的快速繁殖技术领域。本发明包括：无菌条件下切取山葵顶芽或根状茎上的侧芽，通过对培养基的选择、激素配比、培养条件的改变，进行试管苗诱导、试管苗的快速增殖培养、试管苗壮苗培养、生根培养、驯化移栽使山葵组培苗的增殖迅速，其繁殖系数能达到4.0-5.0，增殖培养形成的试管苗直接用于生产，省工省力，省地，速度快，降低生产成本。

Description

山葵种苗的繁殖方法
本发明属于植物种苗的繁殖技术领域，它是专用于山葵(山嵛菜)组培苗快速繁殖及试管苗田间栽培的技术。
山葵(Wasabi)学名为Eutrema wasabi Maxim；Wasabi japonica matum，又名山嵛菜，为十字花科多年生草本半阴生植物，是一种经济价值极高的植物，其根状茎、叶片、叶柄具有丰富的营养，不但可以食用，而且具有很高的药用价值，其根状茎磨成糊是日本及东南亚等国人食用生鱼片等海鲜的必备调味品，具有强烈的杀菌和助消化功能，有良好的防病治病作用。在国际市场上价格非常昂贵，东京批发市场上每kg根状茎批发价为40美元(1995年)。而且供不应求，发展山葵生产出口创汇会产生巨大的经济效益。
山葵生长发育对环境条件要求非常严格，喜阴凉湿润的条件，不耐高温和低温忌过强光照，栽培相当困难。加之山葵种苗繁殖困难，繁殖速度慢，因此其价格极高。我国从而1994年开始引种栽培山葵，急需大量种苗，目前生产上主要是利用从国外进口种苗生产，价格非常高，平均每株15-20元，不符合生产的要求。山葵种苗繁殖主要靠营养繁殖法进行，繁殖系数较低，繁殖速度较慢，一株山葵通过分株法繁殖一年内最多只能繁殖20株左右，难以满足大规模生产的要求，利用组织培养法是解决种苗繁殖问题的有效途径，通过组织培养的方法不但可在短时间内获得大量苗木，而且无菌苗移栽后，生长迅速，不易感病。根据南京农业大学光盘检索的结果，国内目前尚无人对山葵的组织培养进行研究和报道。国外只有日本研究和报道较多。但利用茎尖培养，其繁殖系数都在3.0左右，所用培养基为MS+6-BA0.1mg/L+蔗糖2％(农业及园艺，1986，61(8))；MS+6-BA0.2mg/L+蔗糖3％(园学杂，62别(2)1993)。以上研究结果虽然有一定的参考价值，但对于商品化生产来说，其繁殖系数仍显较低，用他们的方法生产种苗成本仍较高，不能在短时间内获得足够的种苗，因此急需一种繁殖系数更高、速度更快的繁殖方法进行种苗生产。
本发明的目的就是提供一种山葵组培苗繁殖的有效方法，使山葵组培苗的增殖迅速，其繁殖系数能达到4.0-5.0，增殖培养形成的试管苗直接用于生产，省工省力，省地，速度快，降低生产成本。
本发明所提供的山葵组培苗繁殖方法，具体操作步骤如下：1)无菌苗诱导：无菌条件下切取山葵顶芽和根状茎上的侧芽，接种于MS或B5+BA0.1-1mg/L+NAA0.05mg/l+GA30.05-0.2mg/l+糖类2-3％(质量百分比，以下同)，接种后3-5周分化出幼芽；
2)试管苗增殖：将试管苗转入MS或B5+6-BA0.1-2mg/l+KT0.1-2.0mg/l+NAA0.01-0.5mg/l或IBA0.01-0.5mg/l或IAA0.01-0.5mg/l+GA30.01-0.5mg/l的增殖培养基上，添加糖类3-5％，接种后幼芽叶片基部腋芽逐渐萌发，转接后25-35天可形成芽丛，继代增殖；
3)生根培养：增殖培养的无菌苗，经切分后接种于MS或B5+NAA0.01-0.2mg/l或IBA0.01-0.2mg/l和IAA0.01-0.2mg/l+糖类2-3％的生根培养基上，经过15-25天，苗基部生根成为完整植株；
4)上述各培养基中琼脂含量为0.6-0.8％(质量百分比，以下同)，pH5.8-6.2，各阶段的培养条件为：温度18-22℃，光照1500-2000Lux，照光14-16小时/天。
所用糖类是指蔗糖、葡萄糖、果糖，以蔗糖为最好。
在继代增殖过程中，增加试管苗壮苗培养过程，将试管苗转入壮苗培养基：MS或B5+6-BA0.1-1mg/l+KT0.1-1.0mg/l+NAA0.05mg/l+GA30.1-0.5mg/l+糖类3-4％，促进叶片叶柄伸展，然后再转入上述增殖培养基中促进其分化，能使其更有效地繁殖。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1.与直接分株法繁殖山葵种苗以及已有的组织培养技术繁殖山葵种苗的技术相比，方法简便易行，不受季节限制，通过多种激素相结合，增殖培养与壮苗培养相交替，以及渗透调节和改变培养条件等方法进行培养，其繁殖速度更快，繁殖效率更高。利用本发明，一株山葵试管苗在30天内可以繁殖4-5株，一年内可连续繁殖9-10代，能生产试管苗49-10株，而常规分株法一年内一株最多繁殖20株，利用已有的组织培养技术一年内最多繁殖39-10株，繁殖速度有显著的提高，更符合商品化生产的要求。
2.与已报道的试管苗驯化及栽培方法相比，试管苗成活率更高，可达到85％以上，而且只需要简单的设施，成本较低，方法简单，实用可靠。
3.通过茎尖培养进行增殖，山葵种苗的遗传特性稳定，不会发生变异。适合商品化生产。
4.本发明所提供的繁殖方法及栽培技术适用于各种类型的山葵品种。
实施例1：
①试管苗诱导：切取“岛根3号”山葵根状茎侧芽，无菌条件下切成0.5cm大小，接种于诱导培养基，诱导培养基配方为1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖3％+琼脂粉0.65％，pH6.0，培养条件为，温度20℃，光照1500Lux，照光16小时，30天后叶片展开形成试管苗，试管苗诱导率可达100％。
②试管苗的快速增殖培养：当山葵试管苗长至1.5-2.0cm大小时，切取幼芽接种于分化培养基，分化培养基为MS+6-BA0.2mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖4％，pH6.0，琼脂0.65％，培养条件同前，30天后，每个幼芽可分化4-5株左右，再将幼芽切下，转入相同的培养基重复培养，大量繁殖，试管苗繁殖系数可达4.0-5.0。
③试管苗壮苗培养：经连续培养若干代后，试管苗长势有时会减弱，分化过旺，这时可将试管苗幼芽切下后转入壮苗培养基，壮苗培养基为MS+6-BA0.1mg/L+KT0.1mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖3％。促进叶片叶柄伸展，培养1-2代后，再转入上述增殖培养基，促进其分化。
④生根培养：增殖培养的试管苗，切取其幼芽，接种于生根培养基上，生根培养基配方为1/2MS+NAA0.05mg/L+蔗糖2％，培养温度为18℃，光照1500Lux，20天后基部可长出白色不定根4-5条，而且较粗壮，生根率可达90％以上。
⑤驯化移栽：生根的试管苗移栽前打开瓶盖进行适应性锻炼一周，然后取出冲洗掉培养基，移栽于装有灭菌蛭石的营养钵中，从下面浇水，使水分渗入蛭石表面，保持基质湿度，控制空气温度在20-25，两周浇一次营养液，30天左右即可长出新根成活，成活率可达85％以上。当试管苗成活后，取出移栽于田间，种植田块预先整地，施足基肥，按株行距30cm×40cm开穴，进行移栽驯化成活的试管苗，移栽成活率可达80％以上。
实施例2：
①无菌苗的诱导：切取山葵品种“真妻”的顶芽，无菌条件下切成0.5cm大小，接种于诱导培养基，诱导培养基配方为1/2MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖3％+琼脂粉0.6％，pH6.0，培养条件为，温度20℃，光照1500Lux，照光14小时，30天后叶片展开形成试管苗，试管苗诱导率可达100％。
②试管苗的快速增殖培养：当山葵试管苗长至1.5-2.0cm大小时，切取幼芽接种于分化培养基，分化培养基为MS+6-BA0.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖5％+琼脂0.7％，pH6.0，培养条件同前，30天后，每个幼芽可分化4-5株左右，再将幼芽切下，转入相同的培养基重复培养，大量繁殖，试管苗繁殖系数可达4.0-5.0。
③生根培养：增殖培养的试管苗，切取其幼芽，接种于生根培养基上，生根培养基配方为1/2MS+IBA0.1mg/L+蔗糖2％，培养温度为18℃，光照1500Lux，20天后基部可长出白色细长的不定根4-5条，生根率可达92％。
④驯化移栽：生根的试管苗移栽前先打开瓶盖，采取半揭半盖得方法防止杂菌污染，进行锻炼一周，然后取出冲洗掉培养基，移栽于装有新鲜蛭石的营养钵中，25天左右即可长出新根成活，成活率可达90％以上。当试管苗成活后，即可取出移栽于田间，成活率可达90％以上。
实施例3：
①试管苗诱导：取山葵品种“伊泽达摩”的顶芽，经消毒处理后，接种于下列诱导培养基：1/2MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖3％+琼脂粉0.65％；1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖3％+琼脂粉0.65％，pH6.0，培养条件为，温度20℃，光照1500Lux，照光16小时，30天左右叶片展开形成试管苗，试管苗诱导率均可达100％。
②试管苗的快速增殖培养：当山葵试管苗长至1.5-2.0cm大小时，切取幼芽接种于下列分化培养基，分化培养基为MS+6-BA0.2mg/L+KT0.4mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖4％，pH6.0，琼脂0.65％，繁殖系数为5.0；MS+6-BA0.3mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖4％，繁殖系数为4.5；MS+6-BA0.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖4％，繁殖系数为4.3；MS+6-BA0.4mg/L+KT0.1mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖5％，繁殖系数为4.6；MS+6-BA0.1mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖3％，繁殖系数为4.0；MS+6-BA0.5mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖5％，繁殖系数为4.2；MS+6-BA0.3mg/L+KT0.3mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖3％，繁殖系数为4.5；MS+6-BA0.2mg/L+KT0.3mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖4％，繁殖系数为4.8；MS+6-BA0.3mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.1mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖4％，繁殖系数为4.3；MS+6-BA0.2mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖4％，繁殖系数为4.6；MS+6-BA0.4mg/L+KT0.1mg/L+IBA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖5％，繁殖系数为4.7；MS+6-BA0.1mg/L+KT0.5mg/L+IAA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖3％，繁殖系数为4.1；MS+6-BA0.2mg/L+KT0.4mg/L+IBA0.05mg/L+GA30.05mg/L+蔗糖5％，繁殖系数为4.8。
以上培养条件均同前述。
③试管苗壮苗培养：经连续培养若干代后，试管苗长势会减弱，分化过旺，这时可将试管苗幼芽切下后转入壮苗培养基，壮苗培养基为MS+6-BA0.1mg/L+KT0.1mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖3％。促进叶片叶柄伸展，培养1-2代后，再转入上述增殖培养基，促进其分化。
④生根培养：增殖培养的试管苗，切取其幼芽，接种于生根培养基上，生根培养基配方为1/2MS+IAA0.05mg/L+蔗糖2％，培养温度为18℃，光照1500Lux，生根率为88％；1/2MS+IAA0.1mg/L+蔗糖2％，生根率为90％；1/2MS+IBA0.05mg/L+蔗糖2％，生根率为91％。
⑤驯化移栽：生根的试管苗移栽前打开瓶盖进行适应性锻炼一周，然后取出洗掉培养基，移栽于装有灭菌蛭石的营养钵中，30天左右即可长出新根成活，成活率可达85％以上。试管苗取出移栽于田间，移栽成活率可达80％以上。

Claims (4)

1.一种山葵种苗的繁殖方法，其特征在于：
1)无菌苗诱导：无菌条件下切取山葵顶芽和根状茎上的侧芽，接种于MS或B5+BA0.1-1mg/l+NAA0.05mg/l+GA30.05-0.2mg/l+糖类2-3％(质量百分比，以下同)，接种后3-5周分化出幼芽；
2)试管苗增殖：将试管苗转入MS或B5+6-BA0.1-2mg/l+KT0.1-2.0mg/1+NAA0.01-0.5mg/l或IBA0.01-0.5mg/l或IAA0.01-0.5mg/l+GA30.01-0.5mg/l的增殖培养基上，添加糖类3-5％，接种后幼芽叶片基部腋芽逐渐萌发，转接后25-35天可形成芽丛，继代增殖；
3)生根培养：增殖培养的无菌苗，经切分后接种于MS或B5+NAA0.01-0.2mg/l或IBA0.01-0.2mg/l和IAA0.01-0.2mg/l+糖类2-3％的生根培养基上，经过15-25天，苗基部生根成为完整植株；
4)上述各培养基中琼脂含量为0.6-0.8％(质量百分比，以下同)，pH5.8-6.2，各阶段的培养条件为：温度18-22℃，光照1500-2000Lux，照光14-16小时/天。
2.根据权利要求1所述山葵种苗的繁殖方法，在继代增殖过程中，增加试管苗壮苗培养过程，将试管苗转入壮苗培养基：MS或B5+6-BA0.1-1mg/l+KT0.1-1.0mg/l+NAA0.05mg/l+GA30.1-0.5mg/l+糖类3-4％，促进叶片叶柄伸展，然后再转入上述增殖培养基中促进其分化。
3.根据权利要求1所述山葵种苗的繁殖方法，其中所用糖类是指蔗糖、葡萄糖、果糖。
4.根据权利要求2所述山葵种苗的繁殖方法，其中所用糖类是指蔗糖、葡萄糖、果糖。
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