CN108403644A - 抗癌药物纳米微球及其制备方法 - Google Patents

抗癌药物纳米微球及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗癌药物纳米微球及其制备方法，该制备方法包括：1)在避光条件以及有机溶剂的存在下，将三乙胺和盐酸阿霉素DOX·HCL进行接触反应，最后冷冻干燥以制得疏水性阿霉素DOX；2)将DOX溶液、肽溶液进行乳化反应得到初乳球；3)将初乳球、稳定剂进行复乳化反应得到复乳化球；4)将复乳化球进行透析，然后将透析后的体系进行离心处理取上清液，最后冷冻干燥得到新型抗癌药物传递系统；肽溶液选自P10‑L3肽溶液、P10‑V3肽溶液、P10‑F3肽溶液中至少一者。该抗癌药物纳米微球具有优异的疏水作用、载药率和靶向作用，该制备方法具有有机溶剂清除得更加彻底、粒径大小更加均一、对细胞毒副作用更加降低的优势。

Description

抗癌药物纳米微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物纳米微球，具体地，涉及一种抗癌药物纳米微球及其制备方法。
背景技术
肿瘤已成为严重威胁人类生命与健康的多发病和常见病，化疗是目前临床治疗肿瘤的主要手段之一。然而，化疗药物在杀伤癌细胞的同时，也会杀伤大量的正常细胞，毒副作用大、顺应性差、对转移灶难以控制等问题。
P10肽(DGRGGGAAAA)是一种具有靶向作用的新型表面活性剂。研究表明，以阿霉素(DOX)为药物模型，在浓度为20μg/mL时，P10-DOX纳米微球的细胞抑制率相比较游离的DOX提高了2.89倍。此结果表明，P10肽作为药物运输的载体，其效果与目前运用较成熟的两亲性高分子材料接近。同时，P10肽自身的分子量小，可被人体降解吸收，避开了高分子材料的难降解、毒副作用大的缺点。因此，此类两亲性多肽是一种更安全，有效，更有前景的表面活性剂。然而，P10肽由于疏水链只有四个丙氨酸组成，形成的疏水作用力较小，导致载药率较低，即针对癌细胞入药时，很难达到有效的药物浓度。
两亲性表面活性剂包载疏水性药物的物理方法主要包括五种方法：冻干法、溶剂挥发法、空白胶束载药法、乳化法、透析法。(1)冻干法将药物和聚合物溶于可用于冻干的有机溶剂中(比如叔丁醇)，再与水进行混合，冻干后聚合物分散在水性介质中。这种方法可以进行大量生产，但是只能用于能溶于叔丁醇的聚合物和药物，这一因素也限制了冻干法的应用。(2)溶剂挥发法把药物和聚合物溶解在易挥发有机溶剂中，在搅拌的条件下，然后将有机相滴加到水相中，待有机相挥干可得到载药胶束溶液。此方法制得的纳米微球较大，不适合注入细胞中。(3)空白胶束载药法是先把聚合物制成空载胶束，再将药物溶于合适的有机溶剂加入到空载胶束溶液中，挥干有机相制得载药胶束的方法。此方法有着同样的缺点。(4)透析法与乳化法的区别在于，透析法是药物和活性剂在水相中的自组装，而乳化法是油相在水相的缓慢扩散。透析法制得的纳米微球分散性较好，且粒径均匀，但是对于疏水较小的表面活性剂而言，此方法制备纳米微球时，载药率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗癌药物纳米微球及其制备方法，该抗癌药物纳米微球具有优异的疏水作用、载药率和靶向作用，同时该制备方法具有有机溶剂清除得更加彻底、粒径大小更加均一、对细胞毒副作用更加降低的优势。
为了实现上述目的，本发明提供了一种抗癌药物纳米微球的制备方法，该制备方法包括：
1)在避光条件以及有机溶剂的存在下，将三乙胺和盐酸阿霉素DOX·HCL进行接触反应，最后冷冻干燥以制得疏水性阿霉素DOX；
2)将DOX溶液、肽溶液进行乳化反应得到初乳球；
3)将初乳球、稳定剂进行复乳化反应得到复乳化球；
4)将复乳化球进行透析，然后将透析后的体系进行离心处理取上清液，最后冷冻干燥得到新型抗癌药物传递系统；
其中，肽溶液选自P10-L3肽溶液、P10-V3肽溶液、P10-F3肽溶液中的至少一者。
本发明还提供了一种抗癌药物纳米微球，该抗癌药物纳米微球通过上述的制备方法制备而得。
在上述技术方案中，本发明三种载药率更高的新型表面活性剂(P10-L3肽、P10-V3肽、P10-F3肽)，并且利用复乳化法和透析法结合制备出纯度更高，均一性更好的三种新型靶向载药纳米微球，即可制得在生物体内高效靶向识别癌细胞的抗癌药物传递系统(三种新型表面活性剂包载药物的原理见图1)。
与现有技术相比，本发明提供的三种新型两亲性多肽做表面活性剂，并且利用复乳化法和透析法结合制备纳米微球，具有很多优势：(1)提高纳米微球的纯度：先通过复乳化法将油相中的多肽渗透入DOX溶液中，进而将有机溶剂除去，再进一步用透析法将未包载上的游离药物和残留有机溶剂除去；(2)提高纳米微球的载药率：复乳化法未包载成功的游离药物可进一步用透析法包载，减少药物的浪费，提高纳米微球中的药物浓度，并且通过延长P10肽的疏水链也可以提高载药率；(3)降低入药时对细胞毒副作用：相较于高分子材料而言，多肽可被机体快速主动吸收、参与代谢循环、能调节生物体内系统和生物体细胞间的生理功能；(4)靶向作用强：被动靶向性或通过引入一些特殊功能基使胶束具有主动靶向性，提高疗效，降低副作用。综上可知，本发明提供的三种抗癌药物传递系统具有：靶向作用强、副作用少、载药率高，载药过程操作简单，进而使其具有较广阔的应用前景。
此外，用复乳化法和透析法制备抗癌药物纳米微球的制备方法均存在操作步骤简单、操作条件温和和原料易得，产率高，纯度高的优点，进一步地使得本发明提供的技术方案能够进行大面积的推广。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明提供的抗癌药物纳米微球制备过程中表面活性剂包载药物的原理图；
图2是实施例1-3的载药率的结果统计图；
图3是实施例4-9的载药率的结果统计图；
图4是实施例10-14的载药率的结果统计图；
图5是实施例15-19的载药率的结果统计图；
图6是实施例20-24的载药率的结果统计图；
图7a是实施例1中P10-L3肽的MS质谱图；
图7b是实施例2中P10-V3肽的MS质谱图；
图7c是实施例3中P10-F3肽的MS质谱图；
图8是实施例3中纳米微球P10-F3-DOX扫描电镜图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种抗癌药物纳米微球的制备方法，该制备方法包括：
1)在避光条件以及有机溶剂的存在下，将三乙胺和盐酸阿霉素DOX·HCL进行接触反应，最后冷冻干燥以制得疏水性阿霉素DOX；
2)将DOX溶液、肽溶液进行乳化反应得到初乳球；
3)将初乳球、稳定剂进行复乳化反应得到复乳化球；
4)将复乳化球进行透析，然后将透析后的体系进行离心处理取上清液，最后冷冻干燥得到新型抗癌药物传递系统；
其中，肽溶液选自P10-L3肽溶液、P10-V3肽溶液、P10-F3肽溶液中的至少一者。
在本发明中，溶剂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，步骤1)中的有机溶剂以及肽溶液中溶剂选自乙腈、四氢呋喃、丙酮ACM、乙酸乙酯EA、二氯甲烷DCM、体积比为1:1的ACM/DCM混合液中的至少一者。
在本发明中，冷冻干燥的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，步骤1)和4)中的冷冻干燥均至少满足以下条件：温度为-80℃以下，压力为1000Pa以下，干燥时间为12-24h。
在本发明的步骤1)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤1)中，三乙胺、DOX·HCL、有机溶剂的用量比为1mL：10-15mg：4-20mL；
在本发明的步骤1)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，接触反应至少满足以下条件：磁力搅拌速率为1000-8000r/min，反应时间为2-12h，反应温度为20-30℃。
在本发明的步骤2)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤2)中，DOX溶液、肽溶液的用量比为1mL：4-15mL，且所述DOX溶液中DOX的浓度和肽溶液中肽的浓度均为0.8-1mg/mL。
在本发明的步骤2)中，乳化反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤2)中，乳化反应至少满足以下条件：磁力搅拌速率为1000-8000r/min，反应时间为12-24h，反应温度为20-30℃。
在本发明的步骤2)中，DOX溶液的投料方式可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤2)中，DOX溶液以滴加的方式添加到肽溶液中，以1mL DOX溶液为标准，滴加过程时间为15-30s。
在本发明的步骤3)中，稳定剂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤3)中，稳定剂选自吐温60、司盘60、聚乙烯醇PVA、NaCl和硬葡聚糖中的至少一者。
在本发明的步骤3)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，相对于5-16mL的初乳球，稳定剂的用量为50-100mL且稳定剂的浓度为2-5重量％。
在本发明的步骤3)中，复乳化反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤3)中，复乳化反应至少满足以下条件：磁力搅拌速率为1000-8000r/min，反应时间为4-10min，反应温度为20-30℃。
在本发明的步骤3)中，初乳球的投料方式可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤3)中，初乳球以滴加的方式添加到稳定剂中，以5-16mL的初乳球为标准，滴加过程时间为15-30s。
在本发明的步骤4)中，透析中的透析液的种类可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤4)中，透析中的透析液选择去离子水、PBS缓冲液或超纯水。
在本发明的步骤4)中，透析液的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，以50-120mL的复乳化球为标准，透析液每次用量为1-2L。
在本发明的步骤4)中，透析条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，在步骤4)中，透析满足以下条件：反应温度为20-30℃，透析时间为36-48h，透析液更换次数为3-5次。
在本发明的步骤4)中，透析中透析袋的规格可以在宽的范围内选择，但是为了提高抗癌药物纳米微球的产率，优选地，透析中透析袋的截留分子量为1000-3500Da。
本发明还提供了一种抗癌药物纳米微球，该抗癌药物纳米微球通过上述的制备方法制备而得。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，P10-L3肽、P10-V3肽、P10-F3肽的结构式分别为：
P10-L3肽、P10-V3肽、P10-F3肽的制备，以P10-L3肽为例，制备过程如下：
1)将树脂与Fmoc-Asp(otbu)-OH浸于DCM中，加DIEA进行接触反应，进行洗涤；
2)将DCM、甲醇和DIEA至体系中封头处理，加哌啶脱保护；
3)将G(甘氨酸)、HoBt、TBTU加入反应体系中接触反应；
4)将R(精氨酸)、G、A(丙氨酸)、L(亮氨酸)依次加入反应体系中接触反应，接着加哌啶脱保护，通过DMF、DCM、甲醇洗涤，；
5)加入切割液B(体积比为95mL：5mL)的TFA/H2O)切割、沉降、纯化以制得所述P10-L3肽。
P10-V3肽、P10-F3肽的制备过程如上所述，仅将步骤4)中L分别替换为V(缬氨酸)或F(苯丙氨酸)添加入反应体系中。
实施例1
a、在避光条件下，将1mL三乙胺和10mg DOX·HCL加入4mL ACM/DCM(1:1体积比)中，然后在20℃下放入磁力搅拌器中，在1000r/min下，接触反应2h，最后冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为12h)以制得DOX，在同一转速和温度下，用0.34mm规格针头的注射器将2mLDOX溶液(1mg/mL，溶剂为体积比为1:1的ACM/DCM混合液)滴加(滴加时间为15s)进8mL P10-L3肽溶液(肽的浓度为1mg/mL，溶剂为体积比为1:1的ACM/DCM混合液)中，反应12h，制得初乳化球(表面活性剂-DOX)。
b、用0.34mm规格针头的注射器将10mL的初乳球滴加(滴加时间为30s)到50mL质量分数为2％的PVA溶液中，在转速1000r/min、温度为20℃下，复乳化反应4min；将60mL复乳化球溶液放入1000Da的透析袋中，20℃下，每6h换一次1L去离子水，透析36h之后，离心取上清液，冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为12h)得新型抗癌药物纳米微球，即P10-L3-DOX微球。
实施例2
按照实施例1的方法进行制得P10-V3-DOX微球，所不同的是将P10-L3肽溶液换为P10-V3肽溶液。
实施例3
按照实施例1的方法进行制得P10-F3-DOX微球，所不同的是将P10-L3肽溶液换为P10-F3肽溶液。
实施例4
a、在避光条件下，将1mL三乙胺和10mg DOX·HCL加入4mL乙腈中，然后在20℃下放入磁力搅拌器中，在1500r/min下，接触反应3h，最后冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为12h)以制得DOX，在同一转速下，用0.34mm规格针头的注射器将2mL DOX溶液(1mg/mL，溶剂为乙腈)滴加(滴加时间为15s)进16mL P10-F3肽溶液(肽的浓度为1mg/mL，溶剂为乙腈)中，反应18h，制得初乳化球P10-F3-DOX。
b、用0.34mm规格针头的注射器将18mL的初乳球P10-F3-DOX滴加(滴加时间为30s)到80mL质量分数为2％的PVA溶液中，在1500r/min、20℃下，复乳化反应4min，将98mL复乳化球溶液放入1000Da的透析袋中，20℃下，每6h换一次2L去离子水，透析48h之后，离心取上清液，冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为48h)得新型抗癌药物纳米微球，即P10-F3-DOX微球。
实施例5
按照实施例4的方法进行，所不同的是将乙腈换为四氢呋喃。
实施例6
按照实施例4的方法进行，所不同的是将乙腈换为四氢呋喃EA。
实施例7
按照实施例4的方法进行，所不同的是将乙腈换为ACM。
实施例8
按照实施例4的方法进行，所不同的是将乙腈换为四氢呋喃DCM。
实施例9
按照实施例4的方法进行，所不同的是将乙腈换为ACM和DCM的混合液(体积比1:1)。
实施例10
a、在避光条件下，将1mL三乙胺和10mg DOX·HCL加入10mL ACM/DCM(1:1体积比)中，然后在20℃下放入磁力搅拌器中，在1000r/min下，接触反应3h，最后冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为12h)以制得DOX，在同一转速下，用0.34mm规格针头的注射器将1mL DOX溶液(1mg/mL，溶剂为ACM和DCM的混合液(体积比1:1))滴加(滴加时间为15s)进15mL P10-F3肽溶液(肽的浓度为1mg/mL，溶剂为ACM和DCM的混合液(体积比1:1))中，反应20h，制得初乳化球P10-F3-DOX。
b、用0.34mm规格针头的注射器将16mL初乳球P10-F3-DOX滴加(滴加时间为15s)到80mL质量分数为2％的PVA溶液中，在1000r/min、20℃下，复乳化反应4min，将96mL复乳化球溶液放入1000Da的透析袋中，每8h换一次1L去离子水，透析48h之后，离心取上清液，冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为24h)得新型抗癌药物纳米微球，即P10-F3-DOX微球。
实施例11
按照实施例10的方法进行，所不同的是将步骤a和b中的搅拌速率均调整为1500r/min。
实施例12
按照实施例10的方法进行，所不同的是将步骤a和b中的搅拌速率均调整为3000r/min。
实施例13
按照实施例10的方法进行，所不同的是将步骤a和b中的搅拌速率均调整为5000r/min。
实施例14
按照实施例10的方法进行，所不同的是将步骤a和b中的搅拌速率均调整为8000r/min。
实施例15
a、在避光条件下，将1mL三乙胺和15mg DOX·HCL加入15mL ACM/DCM(1:1体积比)中，然后在25℃下放入磁力搅拌器中，在8000r/min下，接触反应12h，最后冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为12h)以制得DOX，在同一转速下，用0.34mm规格针头的注射器将1mL DOX溶液(0.8mg/mL，溶剂为乙腈)滴加(滴加时间为15s)进10mL P10-F3肽溶液(肽的浓度为0.8mg/mL，溶剂为乙腈)中，反应24h，制得初乳化球P10-F3-DOX。
b、用0.34mm规格针头的注射器将11mL初乳球P10-F3-DOX滴加(滴加时间为30s)到100mL质量分数为5％的吐温60溶液中，在8000r/min、20℃下，复乳化反应8min，将111mL复乳化球溶液放入3500Da的透析袋中，每8h换一次2L超纯水，透析48h之后，离心取上清液，冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为24h)得新型抗癌药物纳米微球，即P10-F3-DOX微球。
实施例16
按照实施例15的方法进行，所不同的是将吐温60溶液换为司盘60溶液。
实施例17
按照实施例15的方法进行，所不同的是将吐温60溶液换为聚乙烯醇溶液。
实施例18
按照实施例15的方法进行，所不同的是将吐温60溶液换为NaCl溶液。
实施例19
按照实施例15的方法进行，所不同的是将吐温60溶液换为硬葡聚糖溶液。
实施例20
a、在避光条件下，将1mL三乙胺和15mg DOX·HCL加入20mL ACM/DCM(1:1体积比)中，然后在25℃下放入磁力搅拌器中，在8000r/min下，接触反应8h，最后冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为12h)以制得DOX，在同一转速和温度下，用0.34mm规格针头的注射器将1mL DOX溶液(0.8mg/mL，溶剂为ACM/DCM(1:1体积比))滴加(滴加时间为15s)进6mL P10-F3肽溶液(浓度为0.8mg/mL，溶剂为ACM/DCM(1:1体积比))中，反应18h，制得初乳化球P10-F3-DOX。
b、用0.34mm规格针头的注射器将7mL初乳球P10-F3-DOX滴加到100mL质量分数为5％的硬葡聚糖溶液中，在8000r/min、25℃下，复乳化反应10min，将107mL复乳化球溶液放入3500Da的透析袋中，每8h换一次2L PBS缓冲液(pH为7.4)，透析48h之后，离心取上清液，冷冻干燥(温度为-80℃，压力为999Pa，干燥时间为24h)得新型抗癌药物纳米微球，即P10-F3-DOX微球。
实施例21
按照实施例20的方法进行，所不同的是P10-F3肽溶液的浓度换为6mg/L。
实施例22
按照实施例20的方法进行，所不同的是P10-F3肽溶液的浓度换为8mg/L。
实施例23
按照实施例20的方法进行，所不同的是P10-F3肽溶液的浓度换为10mg/L。
实施例24
按照实施例20的方法进行，所不同的是P10-F3肽溶液的浓度换为15mg/L。
检测例1
1)对实施例中使用的P10-L3肽、P10-V3-肽、P10-F3肽进行MS(质谱)检测，具体结果见图7a、图7b、图7c。由图7a可知电喷雾质谱鉴定结果为m/z(％)：[M+H]+＝1141.50，与P10-L3肽理论值相符。由图7b可知电喷雾质谱鉴定结果为m/z(％)：[M+H]+＝1099.45，与P10-V3肽理论值相符。由图7c可知电喷雾质谱鉴定结果为m/z(％)：[M+H]+＝1243.45，与P10-F3肽理论值相符。
2)对实施例3制得的纳米微球P10-F3-DOX进行扫描电镜检测，具体结果见图8，由图可知所制得的P10-F3-DOX微球呈圆球形，形态较为均一。对实施例1-7、9-24中的微球进行相同的检测，检测结果与上述结果基本保持一致。
通过上述检测可知，本发明提供的微球结构确实如图1所示。
3)通过紫外分光光度计测定纳米微球的载药率，具体结果见图2-6，由图2可知相对于P10-L3肽和P10-V3肽，P10-F3肽对DOX的包封率更高；由图3可知相对于ACN、THF、ACM、EA、DCM，利用体积比为1:1的ACM/DCM混合液作为反应的有机溶剂，更有利于P10-F3肽对DOX的包载；由图4可知搅拌速率越大，越有利于P10-F3肽对DOX的包载，当搅拌速率达到8000r/min时，包封率达到最大；由图5可知相对于吐温60、司盘60、NaCl，利用PVA和硬葡聚糖作为反应的稳定剂，更有利于P10-F3肽对DOX的包载；由图6可知当增大P10-F3肽和DOX的投料比时，其包封率也呈上升趋势，当P10-F3肽和DOX的投料比为15:1时，包封率达到最大值。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种抗癌药物纳米微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
1)在避光条件以及有机溶剂的存在下，将三乙胺和盐酸阿霉素DOX·HCL进行接触反应，最后冷冻干燥以制得疏水性阿霉素DOX；
2)将DOX溶液、肽溶液行乳化反应得到初乳球；
3)将初乳球、稳定剂进行复乳化反应得到复乳化球；
4)将复乳化球进行透析，然后将透析后的体系进行离心处理取上清液，最后冷冻干燥得到新型抗癌药物传递系统；
其中，所述肽溶液选自P10-L3肽溶液、P10-V3肽溶液、P10-F3肽溶液中的至少一者。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中的有机溶剂以及肽溶液中溶剂选自乙腈、四氢呋喃、丙酮ACM、乙酸乙酯EA、二氯甲烷DCM、体积比为1:1的ACM/DCM混合液中的至少一者；
优选地，步骤1)和4)中的所述冷冻干燥均至少满足以下条件：温度为-80℃以下，压力为1000Pa以下，干燥时间为12-24h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤1)中，三乙胺、DOX·HCL、有机溶剂的用量比为1mL：10-15mg：4-20mL；
优选地，所述接触反应至少满足以下条件：磁力搅拌速率为1000-8000r/min，反应时间为2-12h，反应温度为20-30℃。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的制备方法，其中，在步骤2)中，所述DOX溶液、肽溶液的用量比为1mL：4-15mL，且所述DOX溶液中DOX的浓度和肽溶液中肽的浓度均为0.8-1mg/mL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，在步骤2)中，所述乳化反应至少满足以下条件：磁力搅拌速率为1000-8000r/min，反应时间为12-24h，反应温度为20-30℃；
优选地，在步骤2)中，所述DOX溶液以滴加的方式添加到肽溶液中，以1mLDOX溶液为标准，滴加过程时间为15-30s。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，在步骤3)中，所述稳定剂选自吐温60、司盘60、聚乙烯醇PVA、NaCl和硬葡聚糖中的至少一者；
优选地，相对于5-16mL的初乳球，所述稳定剂的用量为50-100mL且稳定剂的浓度为2-5重量％。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其中，在步骤3)中，所述复乳化反应至少满足以下条件：磁力搅拌速率为1000-8000r/min，反应时间为4-10min，反应温度为20-30℃；
优选地，在步骤3)中，所述初乳球以滴加的方式添加到稳定剂中，以5-16mL的初乳球为标准，滴加过程时间为15-30s。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其中，在步骤4)中，所述透析中的透析液选择去离子水、PBS缓冲液或超纯水；
优选地，以50-120mL的复乳化球为标准，所述透析液每次用量为1-2L。
9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其中，在步骤4)中，所述透析满足以下条件：反应温度为20-30℃，透析时间为36-48h，透析液更换次数为3-5次；
优选地，所述透析中透析袋的截留分子量为1000-3500Da。
10.一种抗癌药物纳米微球，其特征在于，所述抗癌药物纳米微球通过权利要求1-9中任意一项所述的制备方法制备而得。
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