CN103861115B - 一种血红蛋白纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于递送具有药理活性化合物的血红蛋白纳米粒的制备方法，将血红蛋白溶解在溶剂中，加入酸、碱或正负电荷聚电解质，再加入变性剂，将药理活性物质包入其中形成血红蛋白纳米粒。经本发明提供的方法形成的纳米粒子可以达到80%以上的包封率，超过现有技术，形成了一种高效低耗的方法，此外，本发明所提供的方法能够获得最高达60%的载药量，即纳米粒中含有60%的药理活性物质。由于有更高的载药量，在治疗时，可以获得更小的用药体积，更短的用药时间，对病人更方便。而较高的载药量降低了递送药理活性物质时蛋白的使用量，提高了产品的成本效率且不会受给药体积的限制。

Description

一种血红蛋白纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂，具体涉及一种血红蛋白纳米粒及其制备方法。

背景技术

作为血红细胞主要蛋白成分，血红蛋白大量存在于人体，具有很好的生物相容性，存在很多与药物结合的位点，可以作为药物的载体递送药理活性物质。蛋白质作为药物的载体，近年来成为药剂领域研究热点，尤其是利用纳米技术将难溶性药物通过共价或非共价结合的方式包裹于蛋白中，更是前沿技术。疏水性药物与蛋白以非共价方式形成纳米粒，其优势在于可以保持药物的活性，同时实现靶向给药，降低药物的毒副作用。

目前血红蛋白作为药物载体主要以蛋白-药物共价结合的方式实现，这种技术主要问题在于共价结合需要复杂的化学反应步骤，过程及产物难以控制，且载药量较低，难以实际应用，仅在文献中有所报道。

蛋白质纳米粒形成的方法，主要包括交联剂交联、去水溶剂法以及变性剂解折叠。如专利CN 200410066471（阿魏酸钠白蛋白纳米粒制剂及其制备方法），CN 201310076159（一种注射用载纳米粒的微球系统及其制备方法）等，这些方法工艺复杂，对蛋白的结构有可能有较大的破坏，而且交联剂难以实现“定点”交联的作用，所形成的的纳米粒成分复杂。

中国申请201310101785.7公开了“一种制备用于体内递送药物活性物质的蛋白纳米粒的方法”，其中涉及到血红蛋白纳米粒及其制备包括以下步骤：(a)用第一种溶剂溶解蛋白获得蛋白溶液；所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造多肽与蛋白、或它们的组合；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将药理活性物质加入步骤(a)中所述的蛋白溶液中，使蛋白展开与再折叠或自组装，把药理活性物质包入蛋白，形成蛋白纳米粒。

该技术方案中血红蛋白作为药物载体形成纳米粒，是在某些变性剂条件下，再加入药理活性药物，虽然该技术方案一定程度上能够实现活性物质在体内的传递。但实际应用中发现，上述方法制备得到的血红蛋白纳米粒稳定性及载药量均有待改善，难以实际推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的用于递送具有药理活性化合物的血红蛋白纳米粒的制备方法，所述方法以血红蛋白作为纳米载体，通过对制备方法的改进能够进一步提高药理活性物质的载药量，提高药理活性药物的生物利用度，保持药理活性化合物的性质稳定，提高靶向性等。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于递送具有药理活性化合物的血红蛋白纳米粒的制备方法，将血红蛋白溶解在溶剂中，加入酸、碱或正负电荷聚电解质，再加入变性剂，将药理活性物质包入其中形成血红蛋白纳米粒。

发明人在研究中意外发现，在血红蛋白表面带上电荷，对其蛋白质结构与稳定性有更好的控制作用，对后续形成的纳米粒在保持药理活性物质稳定性、药效更有优势，包括具有更高的载药能力。

其中，所述药理活性物质与血红蛋白质量比为1~600:1000，优选质量比为50~600:1000，所述血红蛋白纳米粒粒径不超过2μm，优选粒径20nm~600nm。

其中，血红蛋白在溶剂含量范围0.1%~10%。

酸、碱或正负电荷聚电解质在溶液中的浓度范围为1μM~0.1M。

变性剂与血红蛋白的摩尔比为0.5~100:1。

本发明所述的制备方法，所述的药理活性物质包括姜黄素、紫杉醇、多西紫杉醇、非诺贝特、硝苯地平、5-氟尿嘧啶、洛莫司汀、藤黄酸、放线菌素D、冬凌草甲素、卡莫司汀、鬼臼毒素、阿霉素、伊立替康、布洛芬、雷帕霉素、丝裂霉素C或它们的组合。

其中优选所述的药理活性化合物为姜黄素。姜黄素储存稳定及水溶性很差，从而限制其在临床上的应用。本发明技术方案中，当所述药物活性化合物为姜黄素时，本发明所述的制备方法能够解决姜黄素的疏水性，提高其生物活性。工艺流程简单，形成粒径大小均一、可控的纳米制剂。

本发明的方法中的血红蛋白包括但不局限于人血红蛋白，牛血红蛋白，猪血红蛋白，马血红蛋白等其他种类血红蛋白，以及它们的组合。

本发明所述的制备方法，其中溶解血红蛋白的溶剂选自水、生理盐水、糖、冻干保护剂，冻干保护剂是磷酸盐、甘氨酸、醋酸盐、海藻糖、蔗糖、乙酰色氨酸、葡萄糖或它们的组合，具体的选择为本领域技术人员所掌握，本发明优选所述的溶剂为水、生理盐水或者5%葡萄糖溶液。

其中，所述的纳米粒子的平均直径优选为20 nm～600 nm；最优为50 nm～200 nm。所述血红蛋白溶液条件优选在-10～80℃进行，最优在0℃～55℃进行。

本发明技术方案再进一步提出了一种优选制备姜黄素血红蛋白纳米粒的方法，所述方法包含以下步骤：在0℃～55℃条件下，用第一种溶剂溶解血红蛋白获得蛋白溶液，加入适量的酸碱或者正负电荷聚电解质，将姜黄素加入上述的血红蛋白溶液，从而引起蛋白展开与再折叠或自组装，把疏水药物姜黄素包在血红蛋白中；将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩；对所得溶液进行脱水作用，制得能够保存的药物剂型。

作为本发明的最佳实施方法，制备姜黄素血红蛋白纳米粒的方法包含以下步骤：称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量聚乙烯胺水溶液，温度保持25℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入二硫苏糖醇150微升，10分钟后，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

这里制得的纳米粒平均粒径为50～200nm，可包载占粒子总重量约1～60%的药理活性化合物。

本发明所述的“纳米粒”，指的是小的粒子，一般为复合体，在转运和性质方面为一个整体。本发明所制备的血红蛋白纳米粒平均粒径小于2000 nm。一个更好的区间是20 nm到200 nm。而且，本发明所制备的血红蛋白纳米粒能够结合高达60%的药理活性化合物。

本发明中所述的将药理活性化合物包入血红蛋白，指的是药理活性物质可以通过蛋白的展开和再折叠，进入蛋白特定区域。一般来说，药理活性物质为：经动物实验或临床试验，能够产生药理反应的化合物。本发明中的药理活性物质特指疏水性化合物。包括如下的化合物，但是不仅仅限于此：抗肿瘤药物，心血管药物，抗炎药物，降糖药物，中枢神经系统药物，免疫抑制药物，以及抗病毒药物。

本发明涉及的疏水性药理活性物质可以包括，但是不仅仅局限于此：姜黄素、紫杉醇、多西紫杉醇、非诺贝特、硝苯地平、5-氟尿嘧啶、洛莫司汀、藤黄酸、放线菌素D、冬凌草甲素、卡莫司汀、鬼臼毒素、阿霉素、伊立替康、布洛芬、雷帕霉素、丝裂霉素C或它们的组合。

在一个更优化的范围中，疏水性药理活性物质为姜黄素。

本发明方法中的步骤中用溶剂溶解血红蛋白获得蛋白溶液。这里的蛋白溶液指的是溶液中包括血红蛋白和能够溶解血红蛋白的溶剂。在蛋白溶液中使用的溶剂如下，但不仅仅局限于此：水，生理盐水，糖，冻干保护剂和蛋白稳定剂，在更精确的范围，溶剂包括水，氯化钠溶液，磷酸盐溶液，醋酸溶液，甘氨酸溶液，三羟甲基氨基甲烷溶液，过氧化氢水溶液，谷胱甘肽水溶液，葡萄糖溶液，海藻糖溶液，甘露醇溶液，蔗糖溶液，乙酰色氨酸溶液，辛酸钠溶液，以及它们的混合物。

在一个更加精确的范围，蛋白溶液中的溶剂包括水，磷酸盐，醋酸盐和氯化钠溶液。本发明中所使用的蛋白溶液中的溶剂的浓度只要适合溶解蛋白和蛋白再折叠，都是可行的。

实验表明，本发明中的溶剂溶解血红蛋白的反应参数对于形成纳米粒来说，是非常重要的。一般来说，要获得一个理想的结果，本发明中的溶剂溶解蛋白后须在-10℃到80℃范围之间反应。一个比较精确的范围是从0℃到55℃。本领域技术人员能够清楚溶剂溶解血红蛋白需要一段时间以使得蛋白充分的溶解。这时间取决于使用溶剂的种类，溶剂的含量，溶剂的浓度和其他的一些因素。一般来说，本领域技术人员能够充分意识到，反应过程和反应过程的每一个步骤都需要充足的时间，举一个例子，反应过程需要5分钟到8小时不等。

本发明的第二个步骤加入适量酸碱或正负电荷聚电解质条件下，将药理活性物质加入到经过溶剂溶解的血红蛋白溶液中，使蛋白展开与再折叠或者自组装。这里使用的适量酸碱或正负电荷聚电解质指的是能诱导血红蛋白改变它们的三维或者二级结构的溶液。一般来说，适量酸、碱或正负电荷聚电解质能够使蛋白表面带有一定的电荷，从而引起结构的变化。本领域技术人员能够充分意识到蛋白表面带有电荷指的是在蛋白加入适量酸碱或正负电荷聚电解质后，由于离子电离产生的带电基团或离子聚于蛋白表面而形成的静电斥力和吸引力而发生的改变。

其中所述酸为有机酸或无机酸，所述有机酸选自酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸、苯甲酸、水杨酸、咖啡酸中的一种或几种；所述的无机酸选自硝酸、硫酸、盐酸或醋酸中的一种或几种；所述的碱为有机碱或无机碱，所述无机碱选自氢氧化钠和/或氢氧化钾；所述有机碱为带有氨基的有机化合物，优选碱性氨基酸，更优选精氨酸、赖氨酸或组氨酸。

所述正负电荷聚电解质指结构单元上含有能电离的基团的线型或支化的合成/天然水溶性高分子，包括聚酸类及聚碱类电解质。

所述的聚酸类电解质指电离后成为阴离子高分子，优选为聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸或其组合；所述的聚碱类电解质指电离后成为阳离子高分子，优选为聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶或其组合。

进一步而言，本发明所述酸、碱或正负电荷聚电解质优选为酸优选为盐酸、硝酸、草石酸、抗坏血酸，碱优选为氢氧化钠、氢氧化钾、碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸或组氨酸），正电荷聚电解质优选聚丙烯酸，负电荷聚电解质优选聚乙烯亚胺。

本领域技术人员能够认识到所加的适量酸碱或正负电荷聚电解质，包括它们的浓度范围变化，在溶液中浓度范围一般为1μM~0.1M达到的效果是使蛋白表面带有“最低限度”的电荷量，在此效果下蛋白结构有展开折叠的变化。

第三个步骤，加入适量变性剂，在上一步加入酸碱及正负聚电解质后，带电荷的蛋白在变性剂条件下结构更容易展开。

此处的适量是指变性剂与血红蛋白的摩尔比为0.5~100:1，优选范围1~20:1。

本领域技术人员能够意识到本发明的范围和精髓是变动的。解折叠的物质是变化的，同时许多的药理活性物质是可使用的。本发明将会在下面的实施例中得到更加明确和清晰地描述。

本发明的有益效果在于：

首先，经本发明提供的方法形成的纳米粒子可以达到80%以上的包封率，超过现有技术，形成了一种高效低耗的方法；其次，本发明所提供的方法能够获得最高达60%的载药量，即纳米粒中含有60%的药理活性物质。由于有更高的载药量，在治疗时，可以获得更小的用药体积，更短的用药时间，对病人更方便。较高的载药量降低了递送药理活性物质时蛋白的使用量，提高了产品的成本效率；最后，现有技术提供的较低载药能力不能满足高剂量给药，因为高剂量的给药需要很大的给药体积。然而，本实验发明的具有高载药能力的纳米粒不会受给药体积的限制。

通过本发明制备的纳米粒的另一个有益效果是，纳米粒能够特异性的递送药理活性物质。且保证药理活性药物更有效发挥作用，如制备形成的姜黄素-血红蛋白纳米粒与游离姜黄素相比，具有很好的杀伤肿瘤细胞的作用。

附图说明

图1为姜黄素-血红蛋白纳米粒子扫描电镜图；

图2为姜黄素-血红蛋白纳米粒子透射电镜图；

图3为姜黄素-血红蛋白纳米粒子粒径分布图；

图4 为姜黄素-血红蛋白纳米粒中姜黄素稳定性；

图5为姜黄素-血红蛋白纳米粒在coco2细胞中的毒性。

具体实施方式

以下均是基于本发明的代表性实施例，但下述实施例不会在任何方面限制本发明的保护范围。

实施实例1

姜黄素-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量氢氧化钠水溶液，温度保持25℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入巯基乙醇150微升，10分钟后，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~300nm。

实施实例2

姜黄素-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量氢氧化钠水溶液，温度保持25℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入尿素溶液150微升，10分钟后，蛋白沉淀，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），放入透析袋中透析24h，离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例 3

姜黄素-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量盐酸水溶液，温度保持25℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入巯基乙醇150微升，10分钟后，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例 4

姜黄素-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量聚丙烯酸水溶液，温度保持25℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入二硫苏糖醇150微升，10分钟后，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例 5

姜黄素-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量聚乙烯胺水溶液，温度保持25℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入二硫苏糖醇150微升，10分钟后，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例 6

姜黄素-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量聚丙烯酸水溶液，温度保持25℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入巯基乙醇150微升，10分钟后，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例7

姜黄素-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量精氨酸水溶液，温度保持35℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入巯基乙醇150微升，10分钟后，加入2mL姜黄素乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例 8

紫杉醇-人血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量谷氨酸水溶液，温度保持35℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入巯基乙醇150微升，10分钟后，加入2mL紫杉醇乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例9

多西紫杉醇-血红蛋白纳米粒制备

称取100mg人血红蛋白，加入10mL纯水，加入适量精氨酸水溶液，温度保持35℃，形成血红蛋白水溶液10mg/mL，加入巯基乙醇150微升，10分钟后，加入2mL多西紫杉醇乙醇溶液（10mg/mL），离心除去沉淀，取上清，即所得纳米粒，粒径分布20~200nm。

实施实例10

非诺贝特-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为非诺贝特，粒径分布为20~200nm。

实施实例11

硝苯地平-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为硝苯地平，粒径分布为20~200nm。

实施实例12

5-氟尿嘧啶-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为5-氟尿嘧啶，粒径分布为20~200nm。

实施实例13

洛莫司汀-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为洛莫司汀，粒径分布为20~200nm。

实施实例14

藤黄酸-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为藤黄酸，粒径分布为20~200nm。

实施实例15

放线菌素D -血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为放线菌素D，粒径分布为20~200nm。

实施实例16

冬凌草甲素-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为冬凌草甲素，粒径分布为20~200nm。

实施实例17

卡莫司汀-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为卡莫司汀，粒径分布为20~200nm。

实施实例18

鬼臼毒素-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为鬼臼毒素，粒径分布为20~200nm。

实施实例19

阿霉素-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为阿霉素，粒径分布为20~200nm。

实施实例20

伊立替康-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为伊立替康，粒径分布为20~200nm。

实施实例21

布洛芬-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为布洛芬，粒径分布为20~200nm。

实施实例22

雷帕霉素-血红蛋白纳米粒制备

本实施例与实施例1相同，仅改变姜黄素为雷帕霉素，粒径分布为20~200nm。

试验例1

对实例5所制得纳米粒子进行扫描电镜表征，所用仪器为日本日立公司S-3400 型扫描电镜，结果见图1。如图1所示，所得的纳米粒为球形，大小约150nm，球形的纳米粒子在溶液中有很好的稳定性。

对实例5所制得纳米粒子进行透射电镜表征，所用仪器为日本产JEM-2100透射电镜（加速电压200kv）结果见图2。如图2所示，纳米粒的形态为球形，大小在100nm左右，大小均一。

对实例5所制得纳米粒子进行粒径分布测定：所用仪器为BIC 90plus ParticleSize Analyzer，平均粒径为80.4nm分布区间为42.3~153.5nm，结果如图3所示。

对实例5所制得姜黄素-血红蛋白纳米粒中姜黄素的UV光谱稳定性进行测定，所用仪器为日本岛津UV-2450分光光度计，结果见图4。从图4中可以看出，姜黄素的紫外吸收峰形在一个月后依然没有明显变化，说明形成纳米粒后姜黄素的性质没有变化，保证了其药理活性。

实例5所制得的姜黄素-血红蛋白纳米粒在Caco-2细胞中的毒性结果见图5。从图5中可以看出，纳米粒与游离姜黄素杀伤Caco-2细胞的能力相当。

对其他实施例所制备的血红蛋白纳米粒重复上述试验，所得试验结果基本一致，其中以实施例5所制备的姜黄素-血红蛋白纳米粒质量最佳。

试验例2

为了验证加入酸、碱或正负电荷聚电解质对纳米粒形成的影响，将实施例1,2,3,4,5,6中步骤2（即加入酸、碱或正负电荷电解质）除去，得到对照例1-6，对其进行综合性能检测，结果见表1、2：

表1（制备中加入酸、碱或正负电荷电解质）

实施例	稳定性（常温放置）	平均粒径（nm）	载药量（%）
				1	48h	112.5	55.8
2	48h	108.3	56.5
				3	72h	102.1	61.2
4	72h	93.3	62.0
				5	72h	92.8	63.3
6	72h	88.5	58.9

表2（制备中不加入酸、碱或正负电荷电解质）

对照例	稳定性（常温放置）	平均粒径（nm）	载药量（%）
				1	3h	250.5	35.3
2	4h	363.6	40.0
				3	3h	400.2	33.8
4	3h	532.8	28.9
				5	4h	389.1	39.8
6	4h	498.1	36.1

从表1和2中的试验数据可以看出，在加入酸、碱或正负电荷电解质后，纳米粒在稳定性、粒径、载药量有很大的改进，所获得的纳米粒粒径更小，载药量更高，常温放置稳定性时间也大大提高。其中，以实施例5制备的血红蛋白纳米粒综合质量最为理想。

Claims (2)

1.一种用于递送药理活性化合物的血红蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，将血红蛋白溶解在溶剂中，加入酸、碱或正负电荷聚电解质，再加入变性剂，将药理活性化合物包入其中形成血红蛋白纳米粒；所述血红蛋白为人血红蛋白，牛血红蛋白，猪血红蛋白或马血红蛋白；所述酸为有机酸或无机酸，所述有机酸选自酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸、苯甲酸、水杨酸、咖啡酸中的一种或几种；所述的无机酸选自硝酸、硫酸、盐酸中的一种或几种；所述的碱为有机碱或无机碱，所述无机碱选自氢氧化钠和/或氢氧化钾；所述有机碱为带有氨基的有机化合物，选自精氨酸、赖氨酸或组氨酸；所述正负电荷聚电解质指结构单元上含有能电离的基团的线型或支化的合成/天然水溶性高分子，选自聚酸类或聚碱类电解质；所述的聚酸类电解质指电离后成为阴离子高分子，选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸或其组合；所述的聚碱类电解质指电离后成为阳离子高分子，选自聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶或其组合；所述血红蛋白在溶剂含量范围0.1%~10%；酸、碱或正负电荷聚电解质在血红蛋白溶液中的浓度范围为1μM~0.1M；

所述药理活性化合物与血红蛋白质量比为50~600:1000，所述血红蛋白纳米粒粒径为20nm~600nm；

所述的药理活性化合物为姜黄素；

所述酸、碱或正负电荷聚电解质在0℃~55℃的温度下加入；

所述的变性剂为甲醇、乙醇、丙酮、巯基乙醇、尿素、二硫苏糖醇、过甲酸、戊二醛、乙二醛或其中任意组合，

变性剂与血红蛋白的摩尔比为1~20:1。

2.权利要求1所述的制备方法制备的血红蛋白纳米粒。