CN103223321B

CN103223321B - 基于商用氨基酸的自组装纳米球、水凝胶及它们的制备方法

Info

Publication number: CN103223321B
Application number: CN201310164370.4A
Authority: CN
Inventors: 张翼; 戴璇; 孙志方; 石婷婷; 赵欣欣
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: CN103223321A

Abstract

本发明公开了一类基于商用氨基酸的自组装纳米球、水凝胶及它们的制备方法。该方法包括以下操作步骤：取一定量商用氨基酸，先用二甲基亚砜溶解成储备溶液，再用pH为7.4的磷酸缓冲液稀释，超声，即得到纳米球或水凝胶。本发明制备的纳米球简单廉价，形貌分布比较均一，尺寸根据浓度易于调控；所制备的水凝胶只需超声即可成胶，不易变质。本发明得到的纳米球与水凝胶是基于廉价、可大量获得的商用氨基酸，且制备方法简单快捷，制备的材料稳定性良好，为纳米球与水凝胶的工业化应用铺平道路。

Description

基于商用氨基酸的自组装纳米球、水凝胶及它们的制备方法

技术领域

本发明涉及一类基于商用氨基酸的自组装纳米球、水凝胶及其制备方法。具体说是一类利用商业化的N-芴甲氧羰基-氨基酸（Fmoc-氨基酸），通过分子间氢键和芳香性堆积，从而高效率、大批量制备自组装纳米球以及超分子水凝胶的方法和产品。

背景技术

自组装是超分子化学的一个分支，它是在没有人为干涉的情况下，利用分子间非化学键力自发地组织成有序或特定结构的过程。（Science,2002,295,2418-2421）自组装是自然与科技生活中的一种普遍现象。直到1987年诺贝尔化学奖授予研究超分子与自组装的三位科学家之后（Jean-Marie Lehn、Donald J.Cram、Charles J.Pedersen），科学家才开始广泛、深入地对自组装展开研究。近年来，有关自组装的研究成果已达到井喷的境地，其已渗入到化学、材料、纳米、生物医药等等多个领域。利用自组装技术设计和开发出的材料已成为人们获取新型功能材料的重要手段之一。

水凝胶（hydrogel）是充满水分子的半固体胶状物质。水凝胶可以分为高分子水凝胶（也叫化学凝胶）和超分子水凝胶（也叫物理水凝胶，或自组装水凝胶），前者是由化学交联形成高分子网络束缚水分子制备而成，后者是由小分子（也称凝胶因子，hydrogelator）通过自组装形成三维网络束缚水分子制备而成。近二十年，随着有机凝胶因子的兴起(Chem.Rev.1997,97,3133)，水凝胶因子(Chem.Rev.2004,104,1201)逐渐引起研究者们的兴趣。超分子水凝胶的制备过程一般是在水性环境中，水凝胶因子通过分子间的非化学键力（氢键、离子键、疏水作用、π-π堆积、范德华力等等），自组装形成三维网状结构，以此束缚水分子形成半固体果冻状凝胶物质。现今，超分子水凝胶大多通过多肽自组装而成。鉴于多肽的合成比较繁琐，成本高昂，分子设计与组装方法复杂等等，开发出廉价并可大量获得的小分子（工业级），利用简单的方法即可制备成超分子凝胶，势必有利于该领域进一步的工业化应用。

纳米球（nanosphere）由于其内在的特性，如比表面大，尺寸可控，易于表面官能化等，吸引了大量研究者的兴趣。纳米球在药物载体、纳米材料模板、化学与生物传感、表面增强拉曼光谱平台等方面已有广泛的应用。目前制备纳米球的方法有很多，包括共聚物的自组装、两亲分子自组装、高分子交联、模板辅助等等。然而，利用工业级的小分子，通过自组装的方法，简单快捷的制备纳米球的方法，还鲜有报道。所以，寻求可组装成纳米球的廉价商用小分子，将有利于该领域进一步的工业化应用。

商用氨基酸（commercially available amino acids）包括带保护氨基酸与不带保护氨基酸。其中带保护的商用氨基酸一般有叔丁氧羰基（Boc）保护氨基酸与N-芴甲氧羰基（Fmoc）保护氨基酸，这些带保护氨基酸已经工业化，主要用于多肽或蛋白质的合成。自从1984年的诺贝尔化学奖得主R.Bruce Merrifield开发出多肽固相合成（solid phase peptide synthesis）法之后，多肽的人工合成很快地达到工业化。直到现今，大多数商业化定制多肽链都是利用Fmoc保护的氨基酸通过多肽固相合成技术得到的。Fmoc氨基酸的商业化极大地促进了多肽与蛋白质的研究与应用。

鉴于Fmoc氨基酸中有一个芴基和一个酰胺基，我们考虑将Fmoc氨基酸设计成能自组装成特定超分子结构的材料（如纳米球或水凝胶等等）。其设计原理是：Fmoc中的芴基利用π-π键，氨基酸中的酰胺基利用氢键（部分氨基酸侧链有π-π键），协调Fmoc氨基酸中的非共价键，则其可以在水中自组装成纳米球或水凝胶。

利用以上原理，我们成功制备出基于商用Fmoc氨基酸的纳米球与超分子水凝胶。所制备的纳米球形貌分布比较均一，尺寸可控；所制备的水凝胶只需超声即可成胶，不易变质。我们得到的纳米球与水凝胶是基于廉价、可大量获得的商用氨基酸，且制备方法简单快捷，制备的材料稳定性良好，为纳米球与水凝胶的工业化的应用铺平道路。

目前为止，在纳米球方面，没有关于Fmoc氨基酸自组装成纳米球的报道；在超分子水凝胶方面，没有关于Fmoc氨基酸通过简单超声即成凝胶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用廉价、可大量获得的商用氨基酸通过自组装制备出纳米球及超分子水凝胶的方法和制备得到的产品。

一类基于商用氨基酸的自组装纳米球的制备方法：取商用氨基酸，先用二甲基亚砜溶解成80～120mg/mL的溶液，超声10～20秒钟，再用pH为7.4的磷酸缓冲液稀释到0.01wt%～0.1wt%，超声2-3秒，即得到纳米球；所述的商用氨基酸包括商用的Fmoc氨基酸中的一种或几种。

所述的商用氨基酸单体分子为Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-His(Fmoc)-OH。

上述的制备方法，具体优选为：称取Fmoc氨基酸，加入二甲基亚砜，配制成100mg/mL的溶液，超声10～20秒钟待Fmoc氨基酸溶解后，再用pH为7.4的磷酸缓冲溶液稀释到0.1wt%；然后再超声2～3秒即得所述纳米球。

一种基于商用氨基酸的自组装纳米球，是由上述的方法制备得到的。

一类基于商用氨基酸的自组装水凝胶的制备方法，取商用氨基酸，先用二甲基亚砜溶解成80～120mg/mL的溶液，超声10～20秒钟，再用pH为7.4的磷酸缓冲液稀释至0.3～1.5wt%，超声10-30分钟，即得到水凝胶；所述的商用氨基酸包括商用的Fmoc氨基酸中的一种或几种。

所述的商用氨基酸单体分子为Fmoc-Met-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-Asp-OMe,Fmoc-Glu-OMe。

上述的制备方法，具体优选为：称取Fmoc氨基酸，加入二甲基亚砜，配制成100mg/mL的溶液，超声10～20秒钟待Fmoc氨基酸溶解后，再用pH为7.4的磷酸缓冲溶液稀释至0.3～1.5wt%；然后再超声10～30分钟即得所述水凝胶。

上述的制备方法还可以是：取Fmoc-Asn(Trt)-OH，先用二甲基亚砜溶解成150～200mg/mL的溶液，超声3～5min，再用pH为7.4的磷酸缓冲液稀释至1.5～2.0wt%，超声30～40分钟，即得到水凝胶。

一种基于商用氨基酸的自组装水凝胶，是由上述的方法制备得到的。

我们利用商用氨基酸成功制备出两类自组装纳米材料：纳米球和水凝胶。其中，能自组装成纳米球的商用氨基酸包括:Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-His(Fmoc)-OH。其相对应的结构式分别如下：

能自组装成水凝胶的商用氨基酸包括:Fmoc-Met-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-Asp-OMe,Fmoc-Glu-OMe,Fmoc-Asn(Trt)-OH。其相对应的结构式分别如下：

有趣的是，3号化合物Fmoc-Asn(Trt)-OH在高浓度时是水凝胶，在低浓度时是纳米球。

本发明制备的纳米球和水凝胶都是在人体生理pH（7.4）环境下通过自组装形成。

本发明制备的纳米球有蓝色乳光现象，也有丁达尔效应。Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-His(Fmoc)-OH五组Fmoc氨基酸组装的纳米球其透射电镜图均为粒径约50～150nm的实心球状。通过改变氨基酸浓度，可以得到粒径不一的球（大于50nm，小于150nm均可调控）；所制备的水凝胶为果冻状半固体胶状物质，均可以倒立自支撑于血清瓶瓶底。水凝胶的透射电镜图均为纳米纤维，纤维直径约30nm。不同浓度的Fmoc氨基酸自组装纳米球和水凝胶的荧光光谱图显示，随Fmoc氨基酸浓度的增高，荧光反而降低，并且荧光峰红移。根据文献，这正是由于Fmoc氨基酸中存在π-π键以及氢键，自组装时发生聚集引发猝灭(Aggregation-caused quenching,AdvancedMaterials,2010,22,2159-2163和芳香堆积(J.Am.Chem.Soc.,2010,132,2719-2728)的结果。即水凝胶和纳米球是由Fmoc氨基酸中的π-π键以及氢键胶合而成的纳米结构。

能组装成纳米球的Fmoc氨基酸分子可简化成Fmoc-氨基酸-Trt，其中，Fmoc和Trt都为芳香性基团，可以提供双重π-π键。而中间的氨基酸分子由于存在酰胺键，故可提供氢键参与自组装。因此，我们提出了一个可能的组装模型，首先Fmoc-氨基酸-Trt分子利用芳香堆积-氢键-芳香堆积三元非共价键力进行分子识别与堆积，当堆积到一定程度时，为了达到能量最优化，分子发生卷曲，闭合，从而组装成纳米球，直径为100±50nm。

本发明的纳米球和水凝胶在PBS7.4中有最佳的组装性质，即pH低于或高于7.4，Fmoc氨基酸的自组装成纳米球及水凝胶的性质都会受到影响。当pH大于9时，纳米球和水凝胶都会变成溶液；当pH小于6时，纳米球和水凝胶的形成会受到很大的影响。也就是说，该方法制备的纳米球和水凝胶为pH敏感型纳米材料。

由于Fmoc氨基酸具有良好的生物相容性以及部分Fmoc氨基酸表现出的消炎性（Proceedings of the National Academy of Sciences,1991,88,355-359），结合本发明制备的水凝胶都是在人体生理pH环境下得到，我们相信，该Fmoc氨基酸水凝胶有望在药物缓释载体、消炎、细胞培养、组织工程、生物传感、生物医药等方面有潜在的应用。

纳米球具有良好的细胞穿透性（Nanotechnology,2010,21,155602）。本发明用于纳米球制备的商用氨基酸分子都带有一个羧基，其易于与带正电的药物分子发生作用，使药物分子吸附在纳米球上形成纳米球-药物分子复合物，然后穿透细胞内将药物分子带入细胞进行释放达到细胞水平的治疗效果。这种潜在应用的价值是巨大的。加上本发明制备的纳米球是在pH为7.4的类人体生理环境中组装形成，且氨基酸的生物相容性好，这些都进一步利于该商用氨基酸纳米球体系在药物载体上的实际应用。

有益效果

本发明首次制备出基于商用Fmoc氨基酸的纳米球与超分子水凝胶。所制备的纳米球形貌分布比较均一，尺寸可控；所制备的水凝胶只需超声即可成胶，不易变质。本发明得到的纳米球与水凝胶是基于廉价、可大量获得的商用氨基酸，且制备方法简单快捷，制备的材料稳定性良好，为纳米球与水凝胶的工业化应用铺平道路。

附图说明

图1：为水凝胶和纳米球的数码照片；

A～E分别为Fmoc-Met-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-Asp-OMe,Fmoc-Glu-OMe,Fmoc-Asn(Trt)-OH水凝胶；F～J分别为Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-His(Fmoc)-OH纳米球；

图2：左图为纳米球的透射电镜图；右图为水凝胶的透射电镜图；

图3：左图为纳米球的荧光光谱随浓度的变化曲线；右图为水凝胶的荧光光谱随浓度的变化曲线；

图4：基于Fmoc氨基酸纳米球可能的组装模型；

图5：随着浓度增加，Fmoc氨基酸纳米球粒径减小，且PdI变小，说明纳米球的尺寸可以通过浓度来控制。

具体实施方式

下面列举具体实施例对本发明进行详细描述，但不限于这些实例。

实施例1（自组装纳米球的制备）：

称取Fmoc-His(Trt)-OH或Fmoc-Cys(Trt)-OH或Fmoc-Asn(Trt)-OH或Fmoc-Gln(Trt)-OH或Fmoc-His(Fmoc)-OH1mg（0.1mg～2mg都可以，但1mg最佳）于5mL的血清瓶中，加入10μL二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为100mg/mL的储备溶液（80mg/mL～120mg/mL都可以，但100mg/mL最佳），超声10～20秒钟待Fmoc氨基酸溶解后，用移液枪移取990μL pH为7.4的磷酸缓冲溶液（PBS7.4）。超声2～3秒促进Fmoc氨基酸自组装，纳米球即制备完毕。

实施例2（自组装Fmoc-Met-OH水凝胶的制备）：

称取3mg Fmoc-Met-OH于5mL的血清瓶中（2～5mg都可以，3mg为最佳），加入30μLDMSO配制成浓度为100mg/mL的储备溶液（80mg/mL～120mg/mL都可以，但100mg/mL最佳），超声10～20秒钟待Fmoc-Met-OH溶解后，用移液枪移取970μL PBS7.4。超声10～30分钟促进Fmoc氨基酸自组装，Fmoc-Met-OH水凝胶即制备完毕。

实施例3（自组装Fmoc-Trp-OH水凝胶的制备）：

称取4mg Fmoc-Trp-OH于5mL的血清瓶中（3～6mg都可以，4mg为最佳），加入40μLDMSO配制成浓度为100mg/mL的储备溶液（80mg/mL～120mg/mL都可以，但100mg/mL最佳），超声10～20秒钟待Fmoc-Trp-OH溶解后，用移液枪移取960μL PBS7.4。超声10～30分钟促进Fmoc氨基酸自组装，Fmoc-Trp-OH水凝胶即制备完毕。

实施例4（自组装Fmoc-Asp-OMe水凝胶的制备）：

称取3mg Fmoc-Asp-OMe于5mL的血清瓶中（2～5mg都可以，3mg为最佳），加入30μLDMSO配制成浓度为100mg/mL的储备溶液（80mg/mL～120mg/mL都可以，但100mg/mL最佳），超声10秒钟待Fmoc-Asp-OMe溶解后，用移液枪移取970μL PBS7.4。超声10～30分钟促进Fmoc氨基酸自组装，Fmoc-Asp-OMe水凝胶即制备完毕。

实施例5（自组装Fmoc-Glu-OMe水凝胶的制备）：

称取4mg Fmoc-Glu-OMe于5mL的血清瓶中（3～6mg都可以，4mg为最佳），加入40μLDMSO配制成浓度为100mg/mL的储备溶液（80mg/mL～120mg/mL都可以，但100mg/mL最佳），超声10秒钟待Fmoc-Glu-OMe溶解后，用移液枪移取960μL PBS7.4。超声10～30分钟促进Fmoc氨基酸自组装，Fmoc-Glu-OMe水凝胶即制备完毕。

实施例6（自组装Fmoc-Asn(Trt)-OH水凝胶的制备）：

称取15mg Fmoc-Asn(Trt)-OH于5mL的血清瓶中（12～18mg都可以，15mg为最佳），加入75μL二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为200mg/mL的储备溶液（150mg/mL～200mg/mL都可以，但200mg/mL最佳），超声3～5分钟待Fmoc-Asn(Trt)-OH溶解后，用移液枪移取925μLPBS7.4。超声30～40分钟促进Fmoc氨基酸自组装，Fmoc-Asn(Trt)-OH水凝胶即制备完毕。

Claims

1.一类基于商用氨基酸的自组装纳米球的制备方法，其特征在于：取商用氨基酸，先用二甲基亚砜溶解成80～120mg/mL的溶液，超声10～20秒钟，再用pH为7.4的磷酸缓冲液稀释到0.01wt％～0.1wt％，超声2-3秒，即得到纳米球；所述的商用氨基酸包括商用的Fmoc氨基酸中的一种或几种；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：具体为：称取Fmoc氨基酸，加入二甲基亚砜，配制成100mg/mL的溶液，超声10～20秒钟待Fmoc氨基酸溶解后，再用pH为7.4的磷酸缓冲溶液稀释到0.1wt％；然后再超声2～3秒即得所述纳米球。

3.一种基于商用氨基酸的自组装纳米球，其特征在于，是由权利要求1或2所述的方法制备得到的。