CN108392641B - 一种纳米乳剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种纳米乳剂及其制备方法与应用。所述纳米乳剂包括Bodipy两亲性化合物，及装载于所述Bodipy两亲性化合物内部的全氟化碳，所述纳米乳剂携带有氧气。本发明纳米乳剂可同时实现肿瘤部位可激活的荧光、光声和19F磁共振成像以及肿瘤的光动力治疗。本发明制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产，因此在肿瘤的诊断与治疗领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医用纳米材料领域，尤其涉及一种纳米乳剂及其制备方法与应用。
背景技术
纳米诊疗平台通过将诊断剂与治疗剂整合到纳米尺寸的体系中，有望提供一种个性化的精准治疗方式，使治疗方案可以根据监测结果作出实时而迅速的优化调整。然而，纳米载体在其中仅作为药物递送的赋形剂，且装载的多种诊断剂降低了药物-载体比例。高含量的载体会增加代谢负担和毒性，多种药物整合使纳米诊疗剂的合成过程复杂化且增加成本，影响纳米药物的临床审批。为了最大化药物-载体的比例，并简化纳米诊疗剂的制备工艺，一种可行的方法是开发组分单一、功能一体化的诊疗纳米平台，利用载体本身发挥主要的治疗和诊断功能。
磁共振成像(MRI)已被广泛用于包括癌症在内的多种疾病的临床诊断。MRI副作用小，具有较高的空间分辨率和最佳的软组织对比度，无组织深度的限制。然而，对于临床上广泛使用的1H MRI而言，由于各组织均含有大量H原子，导致背景噪声高，成像对比度较低。由于体内缺少19F原子，19F MRI的信噪比显著高于1H MRI。此外，一些新兴的成像技术也具有各自独特的优势：例如，荧光成像(FLI)能提供高强度的实时图像，但光在深部组织中的穿透性差，限制了其在大型动物和临床中的应用。光声成像(PAI)作为一种快速发展的成像方式，具有较高的成像对比度，但成熟的PA成像造影剂尚待开发和优化。将FLI/PAI/MRI三项成像技术联合使用有望克服各项技术的局限，提高成像的空间分辨率、对比度和灵敏度，具有较高的临床应用潜力。然而，目前临床上使用的磁共振成像造影剂通常缺乏对目标部位的靶向性，广泛分布于全身各处，导致成像的信噪比很低。因此，如何提高多模态成像信号的信噪比是临床肿瘤成像中亟待解决的问题。
光动力治疗通过光照使光敏药物将氧气转化为有毒的单线态氧，从而达到肿瘤治疗的目的。光动力治疗的效果受到肿瘤组织含氧量的限制，而实体瘤深处通常缺乏氧气，局限了光动力治疗对实体瘤的疗效。多种全氟化碳(如全氟己烷，全氟-15-冠-5-醚等)对氧气具有较高的亲和力，通过将全氟化碳预先灌充高浓度的氧气，并将其封装于具有被动靶向功能的纳米载体中，即可实现在肿瘤部位低氧区域的氧气缓慢释放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米乳剂及其制备方法与应用，旨在提供一个多功能的诊疗纳米平台，其载体本身发挥主要的治疗和诊断功能。且能实现可激活的FLI/PAI/MRI三模态成像，以及增强光动力治疗对实体瘤的疗效。
本发明的技术方案如下：
一种纳米乳剂，其中，所述纳米乳剂包括氟硼荧(Bodipy)两亲性化合物，及装载于所述Bodipy两亲性化合物内部的全氟化碳，所述纳米乳剂携带有氧气。
所述的纳米乳剂，其中，所述Bodipy两亲性化合物和所述全氟化碳的质量配比为10:1-15:1。
所述的纳米乳剂，其中，所述Bodipy两亲性化合物和所述全氟化碳的质量配比为12:1。
所述的纳米乳剂，其中，所述纳米乳剂的平均直径为180-200nm，多分散指数为0.116。
所述的纳米乳剂，其中，所述Bodipy两亲性化合物为以Bodipy为核心的对称两亲性化合物，亲水端的聚乙二醇数均分子量为400g/mol，所述Bodipy两亲性化合物的数均分子量为4933g/mol。
所述的纳米乳剂，其中，所述Bodipy两亲性化合物具有59个氟原子。
所述的纳米乳剂，其中，所述全氟化碳选自全氟己烷、全氟三丁胺和全氟-15-冠-5-醚中的一种。
一种所述纳米乳剂的制备方法，其中，包括步骤：
将Bodipy两亲性化合物溶解在水中，加入全氟化碳后进行搅拌，在冰浴中进行超声处理得到均匀的纳米乳；
通过离心处理，往离心处理后的纳米乳中灌充氧气，得到所述纳米乳剂。
所述的纳米乳剂的制备方法，其中，所述Bodipy两亲性化合物的制备方法，包括步骤：
a)将季戊四醇与烯丙基溴于碱性高温条件下反应，所得中间产物与mPEG7Tos在高温下反应得到化合物5；
b)将季戊四醇与丙烯酸叔丁酯在碱性高温条件下反应，所得中间产物在有机溶剂中与三氟乙酸反应得到化合物8；
c)化合物8的羧基与甲醇反应得到相应的甲酯，再与乙二胺反应得到化合物10，其氨基端与Fmoc-Boc-lys-OH、三氟乙酸反应得到化合物12；
d)化合物12与化合物5在EDC催化下发生酰胺化反应，得到化合物13，然后用哌啶将Fmoc基还原成氨基，得到化合物14；
e)所得的化合物14以2：1摩尔比再与Bodipy的两个羧基发生酰胺化反应得到所述Bodipy两亲性化合物。
一种本发明所述的纳米乳剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
有益效果：本发明所述纳米乳剂可同时实现肿瘤的荧光、光声及19F核磁共振成像。全氟化碳携带氧气，能够增强肿瘤的光动力治疗效果，因此在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中化合物1的合成路线图；
图2为实施例1中化合物1的结构式和1H核磁图谱；
图3为实施例2中纳米乳剂的制备方法和对应的TEM图、粒径分布图；
图4为实施例3中评价光动力治疗对A375肿瘤细胞的杀伤效果示意图；
图5为实施例4中评价光动力治疗对A375肿瘤生长的抑制效果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种纳米乳剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种纳米乳剂，其中，所述纳米乳剂包括Bodipy两亲性化合物，及装载于所述Bodipy两亲性化合物内部的全氟化碳，所述纳米乳剂携带有氧气。
本发明以新型的聚(乙二醇)-氟硼荧两亲性化合物作为稳定剂，将全氟化碳乳化成纳米乳，并在所述纳米乳中灌充氧气，得到所述纳米乳剂。本发明所述纳米乳剂可同时实现肿瘤的荧光、光声和19F核磁共振成像以及肿瘤的光动力治疗。首先，Bodipy具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且Bodipy可作为荧光、光声和核磁共振造影剂用于肿瘤的荧光、光声和核磁共振成像；其次，纳米乳剂内部所装载的全氟化碳可以溶解高浓度的氧气，使之循环到肿瘤部位释放，为光动力治疗提供氧气原料，从而增强光动力治疗的效果。
优选地，所述Bodipy两亲性化合物和所述全氟化碳的质量配比为10:1-15:1，该配比下能形成稳定均一的纳米乳剂。更优选地，所述Bodipy两亲性化合物和所述全氟化碳的质量配比为12:1。
优选地，所述纳米乳剂的平均直径为180-200nm，多分散指数为0.116。
优选地，所述Bodipy两亲性化合物为以Bodipy为核心的对称两亲性化合物，亲水端的聚乙二醇数均分子量为400g/mol，所述Bodipy两亲性化合物的数均分子量为4933g/mol。
优选地，所述Bodipy两亲性化合物具有59个氟原子。
优选地，所述全氟化碳选自全氟己烷、全氟三丁胺和全氟-15-冠-5-醚中的一种，所述全氟化碳沸点适中，生物相容性佳。
一种本发明所述纳米乳剂的制备方法，其中，包括步骤：
将Bodipy两亲性化合物溶解在水中，加入全氟化碳后进行搅拌，在冰浴中进行超声处理得到均匀的纳米乳；
通过离心处理，往离心处理后的纳米乳中灌充氧气，得到所述纳米乳剂。
作为举例，所述纳米乳剂的制备方法包括步骤：将一种新型的Bodipy两亲性化合物溶解在水中，加入全氟化碳后搅拌10分钟，在冰浴中超声处理以形成均匀的纳米乳。然后通过低速离心，去除上清液中的化合物，得到高浓度的纳米乳。用氧气泵灌充氧气5分钟，得到所述纳米乳剂。
本发明利用一种新型的聚(乙二醇)-氟硼荧两亲性化合物作为稳定剂，将全氟化碳乳化成纳米乳，在所述纳米乳中灌充氧气，得到所述纳米乳剂。本发明该纳米乳剂可同时实现肿瘤的荧光、光声和19F核磁共振成像以及肿瘤的光动力治疗。本发明制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产，因此在肿瘤的诊断与治疗领域具有良好的应用前景。
本发明所述Bodipy两亲性化合物的制备方法，包括步骤：
a)将季戊四醇与烯丙基溴于碱性高温条件下反应，所得中间产物与mPEG7Tos(末端甲氧基聚乙二醇7聚物对甲苯磺酸酯)在高温下反应得到化合物5；优选地，所述季戊四醇溶解于NaOH溶液，中间产物在氩气保护下与mPEG7Tos(甲氧基聚乙二醇-对甲苯磺酰基)反应。
b)将季戊四醇与丙烯酸叔丁酯在碱性高温条件下反应，所得中间产物在有机溶剂中与三氟乙酸反应得到化合物8；优选地，所述季戊四醇用DMSO溶解并加入NaOH，中间产物(化合物7)的有机溶剂为苯甲醚和二氯甲烷中的至少一种。
c)化合物8的羧基与甲醇反应得到相应的甲酯，再与乙二胺反应得到化合物10，其氨基端与Fmoc-Boc-lys-OH(N-α-芴甲氧羰基-N-α-叔丁氧羰基-L-赖氨酸)、三氟乙酸反应得到化合物12；优选地，所述化合物8溶于浓硫酸中，后用饱和碳酸氢钠溶液中和，中间产物(化合物9)的有机溶剂为甲醇，所述化合物10与Fmoc-Boc-lys-OH的反应在氩气保护下进行。
d)化合物12与化合物5在EDC催化下发生酰胺化反应，得到化合物13，然后用哌啶将Fmoc基还原成氨基，得到化合物14；优选地，本步骤中的反应均在氩气保护下进行。
e)所得的化合物14以2：1摩尔比再与Bodipy的两个羧基发生酰胺化反应得到所述Bodipy两亲性化合物。优选地，本步骤中的反应在氩气保护下进行。
本发明中，所用到的水均为超纯水。
本发明中，所述的室温是指室内温度，范围在20-25摄氏度。
作为举例，本发明所述Bodipy两亲性化合物的制备方法，包括步骤：
a)将季戊四醇(68.0g，0.5mol)溶解于NaOH溶液(9.6g，200mL)中，逐滴加入烯丙基溴(24.2g，0.2mol)搅拌2小时。该反应加热至70℃持续8小时。所得中间产物化合物3的DMF溶液(7.0g，40.0mmol)在冰浴条件下逐滴加入NaH(5.8g，240.0mmol)的DMF混悬液中。搅拌30分钟后，加入mPEG7Tos的DMF溶液(79.0g，160.0mmol)并于60℃继续搅拌24小时。所得中间产物化合物4与CHCl3:CH3CN:H2O(1:1:1.5,210mL)、NaIO4(42.4g，198.0mmol)和水合三氯化钌(66.0mg，0.33mmol)混合，在室温下搅拌3小时。混合物中加水后用二氯甲烷提取。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后，真空浓缩并用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝8/1)，得到澄清的油状物化合物5。
b)将季戊四醇(68.1g，0.5mol)的DMSO溶液(68.1g，0.5mol)加热至80℃，然后加入一份氢氧化钠水溶液(4.0g NaOH，9mL H2O)，再逐滴加入丙烯酸叔丁酯(76.9g，0.6mol)。混合物在80℃下剧烈搅拌过夜。冷却过后，溶液用EA提纯。所得中间产物化合物6(13.2g,50.0mmol)和三苯基膦(59.0g,225.0mmol)的四氢呋喃溶液过
分子筛。然后在冰浴下逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(45.5g，225.0mmol)，搅拌20分钟。加入一份全氟叔丁醇(53.0g，225.0mmol)后继续在密封瓶中45℃下搅拌48小时。将中间产物化合物7(25.7g，28.0mmol)和苯甲醚(4.5g，42.0mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中，并加入三氟乙酸(63.9g，560.0mmol)，室温下搅拌4小时。该复合物在真空下浓缩，残留物用硅胶柱纯化(PE/EA＝3/1)后得到白色固体化合物8。
c)将浓硫酸(100mL)加入化合物8(21.5g，25.0mmol)的甲醇溶液(100mL)中。回流冷却8小时后，用饱和碳酸氢钠溶液中和该混合物。反应液加水(100mL)后用EA提纯。所得中间产物化合物9(21.0g，24.0mmol)溶解于甲醇(100mL)和乙二胺(30mL)中。回流冷却48小时后蒸发，残留物用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝10/1)后得到澄清的油状物化合物10。在羟基苯并三氮唑(4.6g，33.7mmol)和Fmoc-Boc-lys-OH(10.5g，22.5mmol)的DMF溶液(100mL)中加入EDC(6.46g，33.7mmol)冰浴。20分钟后，加入一份化合物10(13.5g，15.0mmol)的DMF溶液(50mL)，于45℃搅拌12小时。该反应混合物用盐水洗涤后，用EA提纯(150mL×4)。所得中间产物化合物11(12.9g，9.5mmol)和苯甲醚(1.5g，14.3mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中，并加入三氟乙酸(21.7g，190.0mmol)，室温下搅拌4小时。混合物经真空浓缩。残留物用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝8/1)后得到白色固体化合物12。
d)以下所有操作均在氩气保护下进行。在羟基苯并三氮唑(1.9g，14.4mmol)和化合物5(11.1g，9.6mmol)的DMF溶液(50mL)中加入EDC(2.8g，14.4mmol)冰浴。20分钟后，在室温下加入一份化合物12(10.0g，8.0mmol)，然后于45℃搅拌12小时。该反应混合物用盐水(200mL)洗涤后，用EA提纯(150mL×4)。在所得产物化合物13(7.2g，3.0mmol)的DMF溶液(30mL)中加入哌啶(6mL)，室温搅拌4小时。减压条件下去除DMF。残留物用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝5/1)后得到无色油状物化合物14。
e)以下所有操作均在氩气保护下进行。羟基苯并三氮唑(243.0mg，1.8mmol)和Bodipy(387.0mg，0.6mmol)溶解于DMF(20mL)中，加入0℃的EDC(345.0mg，1.8mmol)。20分钟后，室温下加入一份化合物14(3.9g，1.8mmol)，在45℃下搅拌24小时。反应混合物用盐水(200mL)洗涤，并用二氯甲烷(150mL×3)萃取。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后真空浓缩，再用硅胶柱纯化纯化(CH2Cl2/MeOH＝10/1)，得到绿色油状物化合物1。
作为举例，以全氟己烷(PFH)为代表性的全氟化碳，本发明所述PFH@Bodipy的制备方法，包括步骤：
a)将化合物1溶解在水中(0.1mg/mL)，加入全氟己烷(0.5％v/v)后搅拌10分钟，在冰浴中超声处理(100W)以形成均匀的纳米乳。然后通过低速离心，去除上清液中的化合物，得到高浓度的纳米乳。用氧气泵灌充氧气5分钟，得到纳米乳剂。
b)用于体内实验的纳米乳剂制备方法与步骤f)所述的相同，化合物1的浓度为1mg/mL，全氟己烷的浓度为3％v/v。
一种本发明所述的纳米乳剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。所述纳米乳剂同时还可作为荧光和光声造影剂。其中，所述肿瘤的治疗为光动力治疗。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
新型的Bodipy两亲性化合物的制备(合成路线见图1)
1)化合物3的制备：
将季戊四醇(68.0g，0.5mol)溶解于NaOH溶液(9.6g，200mL)中，逐滴加入烯丙基溴(24.2g，0.2mol)搅拌2小时。该反应加热至70℃持续8小时。该混合物用100mL水稀释后用EA提取(150mL×5)。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后，真空浓缩并用硅胶柱纯化(PE/EA＝1/1)，得到澄清的油状物化合物3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.82-5.92(m,1H),5.18-5.28(m,2H)，3.97(d,J＝8.0Hz,2H)，3.76(s,3H)，3.68(s,6H)，3.44(s,2H)。
2)化合物4的制备：
以下所有操作均在氩气保护下进行。将化合物3的DMF溶液(7.0g，40.0mmol)在冰浴条件下逐滴加入NaH(5.8g，240.0mmol)的DMF混悬液中。搅拌30分钟后，加入mPEG7Tos的DMF溶液(79.0g,160.0mmol)并于60℃继续搅拌24小时。减压蒸发DMF，粗品过硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝10/1)后得到澄清的油状物化合物4。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.84-5.89(m,1H)，5.24(d,J＝8.0Hz,1H)，5.12(d,J＝4.0Hz,1H)，3.93(s,2H)，3.56-3.65(m,88H)，3.44(s,4H)，3.38(s,9H)。
3)化合物5的制备：
将CHCl3:CH3CN:H2O(1:1:1.5,210mL)、化合物4(37.7g,33.0mmol)、NaIO4(42.4g,198.0mmol)和水合三氯化钌(66.0mg,0.33mmol)混合，在室温下搅拌3小时。混合物中加水后用二氯甲烷提取。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后，真空浓缩并用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝8/1)，得到澄清的油状物化合物5。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.04(s,2H)，3.54-3.65(m,86H)，3.47(s,6H)，3.38(s,9H)。
4)化合物6的制备：
将季戊四醇(68.1g，0.5mol)的DMSO溶液(68.1g，0.5mol)加热至80℃，然后加入一份氢氧化钠水溶液(4.0g NaOH，9mL H2O)，再逐滴加入丙烯酸叔丁酯(76.9g，0.6mol)。混合物在80℃下剧烈搅拌过夜。冷却过后，溶液用EA提纯。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后，真空浓缩并用硅胶柱纯化(PE/EA＝1/1)，得到澄清的油状物化合物6。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.67(t,J＝8.0Hz,2H)，3.65(s,6H)，3.52(s,2H)，3.10(s,3H)，2.50，2.49(t,J＝8.0Hz,2H)，1.46(s,9H)。
5)化合物7的制备：
将化合物6(13.2g,50.0mmol)和三苯基膦(59.0g,225.0mmol)的四氢呋喃溶液过
分子筛。然后在冰浴下逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(45.5g,225.0mmol)，搅拌20分钟。加入一份全氟叔丁醇(53.0g,225.0mmol)后继续在密封瓶中45℃下搅拌48小时。反应液加水(100mL)后用EA提纯。结合的有机层用盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，真空浓缩并用硅胶柱纯化(PE/EA＝10/1)，得到白色固体化合物7。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.04(s,6H)，3.64(t,J＝8.0Hz,2H)，3.42(s,2H)，2.45(t,J＝8.0Hz,2H)，1.44(s,9H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.64。
6)化合物8的制备：
将化合物8(25.7g,28.0mmol)和苯甲醚(4.5g,42.0mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中，并加入三氟乙酸(63.9g,560.0mmol)，室温下搅拌4小时。该复合物在真空下浓缩，残留物用硅胶柱纯化(PE/EA＝3/1)后得到白色固体化合物8。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ4.14(s,6H)，3.70(t,J＝8.0Hz,2H)，3.47(s,2H)，2.54(t,J＝8.0Hz,2H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-71.17。
7)化合物9的制备：
将浓硫酸(100mL)加入化合物8(21.5g,25.0mmol)的甲醇溶液(100mL)中。回流冷却8小时后，用饱和碳酸氢钠溶液中和该混合物。反应液加水(100mL)后用EA提纯。结合的有机层用无水硫酸钠旋蒸干燥后，真空浓缩并用硅胶柱纯化(PE/EA＝10/1)，得到白色固体化合物9。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.03(s,6H)，3.67-3.70(m,5H)，3.41(s,2H)，2.55(t,J＝8.0Hz,2H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.61。
8)化合物10的制备：
将化合物9(21.0g,24.0mmol)溶解于甲醇(100mL)和乙二胺(30mL)中。回流冷却48小时后蒸发，残留物用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝10/1)后得到澄清的油状物化合物10。1HNMR(400MHz,CD3OD)δ4.15(s,6H)，3.71(t,J＝8.0Hz,2H)，3.47(s,2H)，3.26(s,2H)，2.73(t,J＝8.0Hz,2H)，2.48(t,J＝8.0Hz,2H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-71.16。
9)化合物11的制备：
以下所有操作均在氩气保护下进行。在羟基苯并三氮唑(4.6g,33.7mmol)和Fmoc-Boc-lys-OH(10.5g,22.5mmol)的DMF溶液(100mL)中加入EDC(6.46g,33.7mmol)冰浴。20分钟后，加入一份化合物10(13.5g,15.0mmol)的DMF溶液(50mL)，于45℃搅拌12小时。该反应混合物用盐水洗涤后，用EA提纯(150mL×4)。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后，真空浓缩并用硅胶柱纯化(PE/EA＝2/1)，得到白色固体化合物11。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.82(d,J＝4.0Hz,2H)，7.69(q,J＝4.0Hz,2H)，7.41(t,J＝8.0Hz,2H)，7.33(t,J＝8.0Hz,2H)，4.38-4.44(m,2H)，4.24(t,J＝8.0Hz,2H)，4.12(s,6H)，4.0(q,4.0Hz,1H)，3.65(t,J＝8.0Hz,2H)，3.41(s,2H)，3.29(d,J＝4.0Hz,2H)，3.04(t,J＝8.0Hz,2H)，2.42(t,J＝8.0Hz,2H)，1.73-1.80(m,1H)，1.60-1.68(m,1H)，1.28-1.50(m,15H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-71.11。
10)化合物12的制备：
将化合物11(12.9g,9.5mmol)和苯甲醚(1.5g,14.3mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中，并加入三氟乙酸(21.7g,190.0mmol)，室温下搅拌4小时。混合物经真空浓缩。残留物用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝8/1)后得到白色固体化合物12。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.70(d,J＝4.0Hz,2H)，7.56(t,J＝4.0Hz,2H)，7.29(t,J＝8.0Hz,2H)，7.21(t,J＝8.0Hz,2H)，4.27-4.35(m,2H)，4.12(t,J＝8.0Hz,1H)，4.00(s,6H)，3.92(q,J＝4.0Hz,1H)，3.53(t,J＝8.0Hz,2H)，3.29(s,2H)，3.18(s,4H)，1.67-1.75(m,1H)，1.49-1.60(m,3H)，1.27-1.37(m,2H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-71.15。
11)化合物13的制备：
以下所有操作均在氩气保护下进行。在羟基苯并三氮唑(1.9g,14.4mmol)和化合物5(11.1g,9.6mmol)的DMF溶液(50mL)中加入EDC(2.8g,14.4mmol)冰浴。20分钟后，在室温下加入一份化合物12(10.0g,8.0mmol)，然后于45℃搅拌12小时。该反应混合物用盐水(200mL)洗涤后，用EA提纯(150mL×4)。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后，真空浓缩并用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝10/1)，得到无色油状物13。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝4.0Hz,2H)，7.63(d,J＝4.0Hz,2H)，7.40(t,J＝8.0Hz,2H)，7.31(t,J＝8.0Hz,2H)，4.35-4.45(m,2H)，4.21(t,J＝8.0Hz,2H)，4.04(s,6H)，3.89(s,2H)，3.53-3.65(m,90H)，3.44(d,J＝4.0Hz,6H)，3.37-3.39(m,13H)，2.90(s,2H)，2.40(d,J＝4.0Hz,2H)，1.26-1.69(m,6H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.61。
12)化合物14的制备：
在化合物13(7.2g,3.0mmol)的DMF溶液(30mL)中加入哌啶(6mL)，室温搅拌4小时。减压条件下去除DMF。残留物用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝5/1)后得到无色油状物化合物14。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(s,1H)，7.20(d,J＝8.0Hz,2H)，4.18-4.31(m,1H)，4.05(s,6H)，3.90(s,4H)，3.56-3.66(m,85H)，3.38-3.45(m,22H)，2.88(s,4H)，2.45(t,J＝8.0Hz,2H)，1.41-1.85(m,6H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.58。
13)化合物1(Bodipy两亲性化合物)的制备：
以下所有操作均在氩气保护下进行。羟基苯并三氮唑(243.0mg,1.8mmol)和Bodipy(387.0mg,0.6mmol)溶解于DMF(20mL)中，加入0℃的EDC(345.0mg,1.8mmol)。20分钟后，室温下加入一份化合物14(3.9g,1.8mmol)，在45℃下搅拌24小时。反应混合物用盐水(200mL)洗涤，并用二氯甲烷(150mL×3)萃取。结合的有机层用无水硫酸钠干燥后真空浓缩，再用硅胶柱纯化(CH2Cl2/MeOH＝10/1)，得到绿色油状物化合物1。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.07-8.12(m,8H)，7.34-7.49(m,8H)，7.07-7.09(m,4H)，4.04(s,4H)，3.89(s,4H)，3.54-3.65(m,186H)，3.42-3.44(m,20H)，3.37(s,18H)，1.90-1.95(m,2H)，1.69-1.78(m,2H)，1.53-1.56(m,4H)，1.34-1.37(m,4H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-71.34；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.0，171.1，170.6，167.8，159.4，132.3，131.8，129.3，128.6，125.4，121.5，118.6，115.0，71.9，71.3，71.0，70.5，70.4，70.3，70.2，69.9，67.6，67.2，66.1，65.5，59.0，52.7，46.1，45.3，39.7，39.5，38.0，36.3，31.8，29.2，22.6。(化合物1的结构式和核磁图谱见图2)
实施例2
纳米乳剂的制备
1)将化合物1溶解在水中(0.1mg/mL)，加入PFH(0.5％v/v)后搅拌10分钟，在冰浴中超声处理(100W)以形成均匀的纳米乳。然后通过低速离心，去除上清液中的化合物，得到高浓度的纳米乳。用氧气泵灌充氧气5分钟。
2)用于体内测试的纳米乳剂制备方法与步骤1)所述的相同，化合物1的浓度为1mg/mL，全氟己烷的浓度为3％v/v。
纳米乳剂(PFC@Bodipy)的制备方法和对应的TEM图、粒径分布如图3所示。
图3中(a)表示制备装载全氟化碳的纳米乳剂(PFC@Bodipy)的路线图，其中Bodipy表示氟硼荧，PFC表示全氟化碳；(b)和(c)分别表示纳米乳剂(PFC@Bodipy)的TEM图和粒径分布图。其中图(c)是通过马尔文粒径仪检测。
实施例3
纳米乳剂体外光动力治疗性能评价
将A375细胞培养在DMEM(10％胎牛血清)中，并以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔板中。在培养箱中孵育24小时后，用PBS洗涤细胞一次。将细胞与PFH@Bodipy和游离的Bodipy(0，0.1，0.25，0.5，2.5，5和10μM Bodipy)在37℃相同条件下温育12小时。为了评价细胞毒性，将各组的细胞用PBS冲洗2次。进行标准的CCK-8测定以评估细胞活力。每组的细胞用PBS漂洗两次。然后用功率密度为200mW/cm2的660nm激光照射细胞5分钟。照射后，将细胞再温育24小时。对照组进行避光处理，其余条件相同。随后，进行标准CCK-8测定以评估细胞活力。
图4表示不同的光动力治疗对细胞存活率的影响，其中Bodipy表示新型的氟硼荧的两亲性化合物，PFH@Bodipy代表用该两亲性化合物装载全氟己烷的纳米乳剂。如图4(a)所示，在没有光照的情况下，低于或等于5μM浓度的PFH@Bodipy和游离化合物1对A375黑色素瘤细胞显示出可忽略的细胞毒性。如图4(b)所示，随着Bodipy浓度的增大，激光照射后的细胞毒性明显增强，并且PFH@Bodipy激光照射后的细胞存活率显著低于Bodipy组。表示纳米乳剂能够显著增强Bodipy的光动力治疗效果。
实施例4
纳米乳剂体内光动力治疗性能评价所有的测试操作均按照深圳大学深圳大学实验动物伦理委员会(AEWC)通过的动物使用和保健制度。雌性无胸腺裸鼠(六周，20-25g)，在裸鼠前腿皮下注射5×106A375肿瘤细胞的PBS溶液建立老鼠肿瘤模型。当肿瘤体积达60mm3时，将携带A375黑素瘤的小鼠随机分成六组，包括：1)生理盐水组；2)盐水加激光组；3)Bodipy加激光组；4)PFH@Bodipy组；5)PFH@Bodipy加激光组；6)重复光动力治疗组。在光动力治疗的24小时前尾静脉注射PFH@Bodipy或Bodipy(Bodipy剂量：2μmol/kg)。然后，第3，5和6组的小鼠是注射200μL的纳米乳剂(30μL PFH)。对于超声的治疗，在高氧呼吸期间用超声(1MHz，500mW/cm2)照射肿瘤部位30分钟。随后进行光动力治疗，即将组3和组5的小鼠在功率密度为200mW/cm2的660nm激光下照射30分钟。第2组和第6组的小鼠在第1，6，11天接受多次治疗。在各种治疗之后的15天，每隔两天用数字卡尺测量肿瘤的长度和宽度。根据以下公式计算肿瘤体积：体积＝宽度2×(长度/2)。测试结果见图5。
图5中(a)表示不同治疗组肿瘤体积随时间(Day)的变化情况。其中Saline表示生理盐水组，laser表示激光照射处理。如图所示，PFH@Bodipy加激光组和重复光动力治疗组均能够显著抑制肿瘤的生长，其效果显著优于生理盐水组、生理盐水+激光组、Bodipy加激光组以及PFH@Bodipy组；(b)表示不同治疗组老鼠的生存周期(survival)随时间(Day)的变化情况，如图所示，PFH@Bodipy加激光组和重复光动力治疗组显著提高老鼠的生存周期，其中重复光动力治疗组的小鼠全部存活时间超过40天，显著优于生理盐水组、生理盐水+激光组、Bodipy加激光组以及PFH@Bodipy组。
本发明所述的纳米乳剂可同时实现肿瘤的荧光、光声和核磁共振成像以及肿瘤的光动力治疗。
本发明中，所述纳米乳剂具有良好的生物相容性，5μM浓度与细胞共培养24小时后细胞存活率大于95％。所述纳米乳剂可以作为荧光、光声和核磁造影剂用于肿瘤的荧光、光声和核磁共振成像。纳米乳剂内部所装载的全氟化碳可以溶解高浓度的氧气，使之循环到肿瘤部位释放，为光动力治疗提供氧气原料，从而增强光动力治疗的效果。
首先，Bodipy具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且Bodipy可作为荧光、光声和核磁共振造影剂用于肿瘤的荧光、光声和核磁共振成像。其次，利用全氟化碳提高肿瘤部位的氧气浓度，从而补充光动力治疗的原料，起到增强光动力治疗的效果。
综上所述，本发明提供的一种纳米乳剂及其制备方法与应用，通过本发明所述制备方法制备的纳米乳剂可同时实现肿瘤的荧光、光声和19F核磁共振成像以及肿瘤的光动力治疗，在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种纳米乳剂的制备方法，其特征在于，所述纳米乳剂包括Bodipy两亲性化合物，及装载于所述Bodipy两亲性化合物内部的全氟化碳，所述纳米乳剂携带有氧气；
所述纳米乳剂的制备方法包括步骤：
将Bodipy两亲性化合物溶解在水中，加入全氟化碳后进行搅拌，在冰浴中进行超声处理得到均匀的纳米乳；
通过离心处理，往离心处理后的纳米乳中灌充氧气，得到所述纳米乳剂；
所述Bodipy两亲性化合物的制备方法，包括步骤：
a)将季戊四醇与烯丙基溴于碱性高温条件下反应，所得中间产物与mPEG7Tos在高温下反应得到化合物5；
b)将季戊四醇与丙烯酸叔丁酯在碱性高温条件下反应，所得中间产物在有机溶剂中与三氟乙酸反应得到化合物8；
c)化合物8的羧基与甲醇反应得到相应的甲酯，再与乙二胺反应得到化合物10，其氨基端与Fmoc-Boc-lys-OH、三氟乙酸反应得到化合物12；
d)化合物12与化合物5在EDC催化下发生酰胺化反应，得到化合物13，然后用哌啶将Fmoc基还原成氨基，得到化合物14；
e)所得的化合物14以2：1摩尔比再与Bodipy的两个羧基发生酰胺化反应得到所述Bodipy两亲性化合物。
2.一种如权利要求1所述方法制备得到的纳米乳剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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