CN108384731A - 一种锰氧化菌及其筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种锰氧化菌，其分类学命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZM‑1，其保藏编号为：CCTCC NO：M2017851。本发明还提供了所述锰氧化菌的制备方法以及其在去除污染物重金属中的应用。本发明还提供了一种用于去除污染物重金属的锰氧化物，即用上述锰氧化菌进行发酵获得的发酵液，或经喷雾干燥获得的干粉菌剂。所筛选得到的锰氧化菌具有较高的锰氧化能力，同时锰氧化菌产生的锰氧化物具有对重金属铜、锌、铬、砷的去除能力；相对于物理化学法成本低、对不同污染水体适应性强且无二次污染。

Description

一种锰氧化菌及其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种锰氧化菌及其筛选方法与 应用。
背景技术
锰是地壳中含量丰富的金属元素，Mn2+是机体必需的微量元素之一，但是 长期饮用含锰过量的水会造成人体生理上的疾病。对锰矿的大量开采，不可避 免地在这个环节产生大量Mn2+的排放和污染，因而造成水中Mn2+的污染。鉴于 含锰水的普遍性、危害性，从保障饮用水卫生、安全、提高生活质量出发，研 究饮用水除锰技术是必要的。
我国的《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)和2001年卫生部正式公布的 《生活饮用水卫生规范》中规定锰的含量最高不超过0.1mg/L。鉴于水中锰的普 遍存在；水中除锰技术的理论和应用经历了不同的发展阶段:从传统的化学除锰 技术，到氯接触氧化过滤除锰、碱化除锰、光化学氧化除锰和高锰酸钾接触氧 化除锰法，再到现在的生物除锰法。锰氧化微生物可以利用酶促反应催化氧化 Mn2+，生成不溶于水的锰氧化物，从而从水中除掉；锰氧化微生物将土壤中的 可溶性有毒的Mn(II)转化成为不溶性无毒的Mn(III)和Mn(IV)，降低重金属锰如 Mn(II)在土壤中的环境污染。生物法是是目前该领域的最新发展方向，使强化锰 氧化微生物成为水质净化工艺中新兴的研究热点。
畜牧业中，为了促进牲畜生长，在配合饲料中添加高于动物的需求量的Cu、 Fe、Zn、Cr、As等金属、类金属元素在世界各国较为普遍，这势必导致畜禽排 泄物中含有大量的Cu、Zn、Cr、As等重金属。这部分牲畜粪便一旦进入沼气 工程，经厌氧发酵后就会导致沼液沼渣的重金属超标风险，而在农用过程中可 能导致土壤重金属超标。研究认为，施用沼液有重金属积累现象，尤其是Cu和 Zn含量在部分研究土壤中增高明显且在高施灌水平下存在重金属含量接近标准 限值的现象。
对比文件1：申请号为“CN200710175525.9”，专利名称为“锰氧化细菌芽 孢杆菌菌株WH4及其应用”中公开了一种锰氧化细菌在生物合成二氧化锰 (MnO2)中的应用，但该锰氧化细菌在锰氧化时，在20mmol/L的MnCl2浓度下 生成的MnO2的浓度最高达2mmol/L；锰氧化能力尚有提高的空间；且该锰氧 化细菌的发酵液并不同时具备去除污染物重金属包括锰、铜、锌、铬和砷的能 力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种锰氧化菌、利用该锰 氧化菌在去除污染物重金属中的应用以及一种用于去除污染物重金属的锰氧化 物。所筛选得到的锰氧化菌具有较高的锰氧化能力，同时锰氧化菌产生的锰氧 化物具有对污水重金属对铜、锌、铬、砷的去除能力；相对于物理化学法成本 低、对不同污染水体适应性强且无二次污染。
本发明的目的之一在于提供一种锰氧化菌，该锰氧化菌的分类学命名为解 淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZM-1，该锰氧化菌已于2018年1月 15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017851，地 址：中国，武汉，武汉大学。本发明人筛选到一株细菌ZM-1，证明该株细菌 ZM-1具有锰氧化能力，该细菌经形态鉴定、生化鉴定及测序分析为解淀粉芽孢 杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZM-1，其中菌落的革兰氏染色结果如附图1， 革兰氏鉴定结果见实施例2。
本发明的目的之二在于提供所述锰氧化菌在锰氧化菌在去除污染物重金属 中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种锰氧化菌的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1、含锰培养基的配制：配制LB培养基进行灭菌，待冷却后，加入适 量过滤除菌MnCl2溶液和生物缓冲液HEPES(pH 7.0)；
步骤2、锰氧化菌的初筛：按1％的接种量分别接种生长对数期的多种待筛 菌株的菌液于上述步骤1的含锰液体培养基，于30℃、180rpm的恒温摇床上 震荡培养48h后，采用原子吸收光谱法测定溶液中剩余锰浓度，并测定培养液 的pH值。以不接菌的液体培养基为对照，筛选锰去除率较高的菌株；
步骤3、将初筛得到的菌株接种到含锰液体培养基中，培养4～6d取样，LBB 比色法定性检测锰氧化物，筛选具有锰氧化活性的菌株，即权利要求1所述的 锰氧化菌。
本发明的目的之四在于提供一种重金属污染物的去除方法，将所述锰氧化 菌按如下方法用于去除污染物重金属：
将斜面保存的所述锰氧化菌活化，接种于活化培养基上，放入恒温培养箱 中，在30℃条件下恒温培养12h；挑取活化培养基上的菌种，接种于已灭菌含 锰液体培养基中，30℃下180rpm振荡培养10d，得发酵液用于去除污染物重 金属，或者将发酵液进行干燥处理得到干燥物用于去除污染物重金属。
本发明的目的之五在于提供一种用于去除污染物重金属的锰氧化物，该锰 氧化物为将所述锰氧化菌进行发酵获得的发酵液或所述发酵液经喷雾干燥获得 的干粉菌剂。
本发明的有益效果是：所筛选得到的锰氧化菌具有较高的锰氧化能力，同 时锰氧化菌产生的锰氧化物具有对污水重金属对铜、锌、铬、砷的去除能力； 相对于物理化学法成本低、对不同污染水体适应性强且无二次污染。
其中，本发明的菌株的保藏日期为2017年12月29日，保藏编号为CCTCC NO：M2017851。其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) ZM-1，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学， 邮编：430072。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的锰氧化菌革兰氏鉴定结果；
图2为本发明实施例3提供的锰氧化菌的锰氧化能力测定结果；
图3为本发明实施例5提供的锰氧化菌产生的锰氧化物对废水重金属铜、 锌、铬的去除效果；
图4为本发明实施例6提供的锰氧化菌产生的锰氧化物对重金属As的去除 效果。
具体实施方式
实施例1：锰氧化菌的筛选
本发明所述的锰氧化菌的筛选方法有如下步骤：
(1)含锰培养基的配制：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g， 蒸馏水1000mL，调节pH为7，分装于250mL三角瓶中，每瓶100mL，于灭 菌锅中经121℃高温蒸汽灭菌20min，待冷却后，加入适量过滤除菌的1mol/L MnCl2溶液和生物缓冲液1mol/L HEPES(pH 7.0)，使培养基Mn(II)和HEPES 的最终浓度分别为1mmol/L和20mmol/L。
(2)锰氧化菌的初筛：按1％的接种量分别接种生长对数期的多种待筛菌 株的菌液于上述步骤S1的含锰液体培养基，于30℃、180rpm的恒温摇床上震 荡培养48h后，采用原子吸收光谱法测定溶液中剩余锰浓度，并测定培养液的 pH值。以不接菌的液体培养基为对照，筛选锰去除率较高的菌株，结果如表1 所示，初筛阶段ZM-1菌对锰去除率最大，初始锰浓度为1mmol/L时培养2d 对锰的去除率可达32.1％。
表1不同待筛菌株对锰的去除效果
(3)锰氧化菌的复筛：将初筛得到的菌株接种到含锰液体培养基中，培养 一定时间后取样，LBB比色定性检测锰氧化物。
结果显示ZM-1菌在不同培养时间的产物与LBB试剂的显色情况，LBB试 剂由淡蓝色变为深蓝色，说明该菌能够生成锰氧化物。将具有锰氧化活性的菌 株，即为本发明筛选获得的锰氧化菌ZM-1接种在甘油管中，置于-80℃冰箱保 存。通过上述分离路线得到一株编号为ZM-1的菌株，证明该株细菌具有锰氧化 的能力。
实施例2：锰氧化菌的鉴定
对上述获得的一株编号为ZM-1的菌株经形态鉴定、生化鉴定及16S rRNA 测序分析为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZM-1；
1、该菌的生长生理形态为：液体培养基中形成菌膜，在固体培养基上菌落 呈淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不规则；
2、如图1所示革兰氏鉴定结果为革兰氏阳性菌，已知革兰氏阳性菌呈蓝紫 色，革兰氏阴性菌呈红色，图1中革兰氏染色后成蓝紫色，所以为革兰氏阳性 菌；
3、生化鉴定结果为，需氧，呈短杆状(0.7～3.0um)，具有运动性，圆形孢 子中生；硝酸盐还原阳性，接触酶阳性，水解淀粉，液化明胶，吲哚实验阳性， 甲基红反应阴性；
4、细菌基因组DNA提取及16S rDNA序列分析：
(1)以SDS碱裂解—酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，v/v/v)抽提—乙醇沉淀的方 法(Maloy，1990)提取细菌基因组DNA。
(2)以细菌16S rDNA通用引物(27F，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所 示和1492R，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)对菌株ZM-1进行PCR扩增， 获得序列长度为1422bp的PCR产物，PCR产物纯化后送上海桑尼有限公司测 序。具体序列见说明书序列表部分核苷酸序列SEQ ID NO：1所示。
(3)将测得的序列用DNAStar软件包进行序列拼接及人工校对后用 NCBI(National Center for Biotechnology Information)BLAST程序在GenBank中 进行核苷酸同源性比较。结果显示GenBank中该ZM-1菌株与登录号为 KM091682.1的相似性为100％，鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，属于芽孢杆菌属，由于它可以产生液化淀粉酶分解淀粉而 被命名为解淀粉芽孢杆菌。
实施3：锰氧化菌ZM-1的锰氧化能力测定
(1)配制含锰液体培养基分装于250mL三角瓶中，每瓶100mL。在无菌 操作下，加入经0.22μm微孔过滤灭菌的MnCl2溶液和HEPES(pH 7.0)，使 HEPES终浓度为20mmol/L，Mn(II)终浓度为6mmol/L，按2％的接种量接种生 长对数期的ZM-1菌菌液。
(2)将各锥形瓶置于30℃、180rpm的恒温摇床中振荡培养。每组3个平 行，每隔24h取样测定锰氧化物浓度，直到12d取样结束。
(3)如图2所示，锰氧化菌ZM-1对锰的氧化情况在3～10d时锰氧化物含 量快速上升，从3d时的0.01mmol/L上升到10d时的最大为1.92mmol/L。最 大锰氧化率达到32％，具有较强的锰氧化能力。
(4)对比文件中菌株WH4在20mM(即20mmol/L)的MnCl2浓度下生 成的MnO2的浓度最高达2000μM(即2mmol/L)，最大锰氧化率为10％。
(5)该发明的锰氧化菌ZM-1的锰氧化能力明显高于对比文件1中获得的 锰氧化细菌的氧化能力，且最大锰氧化率是对比文件的3.2倍。
表2
实施例4：锰氧化物的制备
(1)制备锰氧化菌ZM-1的种子液，取1mL处于对数生长期的种子菌液， 接种于含有100mL已灭菌的LB培养基的锥形瓶中，然后依次加入0.6mL已过 滤除菌的1.0mol/L的MnCl2溶液和2mL HEPEPS缓冲液(pH7.0)至其终浓 度分别为6mmol/L、20mmol/L。
(2)锥形瓶放置于30℃、180r/min的恒温摇床上振荡培养。
(3)培养10d后，获得所述锰氧化菌的发酵液即含有所述锰氧化物；或将 培养10d后的培养液于11000rpm下离心去上清液并用去离子水洗涤沉淀4次， 收集沉淀于离心管中，-80℃冷冻干燥，获得的干粉菌剂，保存备用。
实施例5：锰氧化物对废水重金属铜、锌、铬的去除效果
(1)称取3份0.010g实施例4中ZM-1生成的生物锰氧化物的干粉菌剂于 100mL离心管中，分别加入20mL含重金属Cu、Zn、Cr的废水，分别用1mol/L 的HNO3或NaOH调节pH为2、3、4、5、6，于25℃、180rpm振荡反应24h。
(2)反应完成后，所得悬液用高速离心机11000rpm离心，取上清液稀释 至合适倍数，原子吸收光谱法测定重金属离子浓度，以无锰氧化物为空白对照 计算生物锰氧化物对混合重金属的去除效果。同时，以表1中锰氧化菌 Sphingopyxis 4-15、LysinibacillusM14产生的生物锰氧化物(代号为4-15、M14) 和化学锰氧化物(钾锰矿)代替ZM-1产生的生物锰氧化物，做相同的废水重金 属去除实验。
(3)结果如图3所示。由图可知，废水中Cu、Zn、Cr的初始浓度分别为 25mg/L、25mg/L、2.5mg/L，ZM-1菌产生的生物锰氧化物对铜、锌、铬的最 大去除率分别可达97.7％、53.4％、79.2％，综合效果均高于锰氧化菌Sphingopyxis 4-15、Lysinibacillus M14产生的生物锰氧化物4-15、M14及钾锰矿的去除效果。
实施例6：锰氧化物对重金属As的去除效果
(1)实验组：将称取0.010g实施例4中ZM-1生成的生物锰氧化物的干粉 菌剂于100mL离心管中，加入20mL重金属As溶液，用1mol/L的HNO3或 NaOH调节pH为6.5、7、7.5、8、8.5，于25℃、180rpm振荡反应24h，悬液 用高速离心机11000rpm离心，取上清液稀释至合适倍数，原子荧光光谱法吸测 定溶液剩余As浓度，计算生物锰氧化物对As重金属的去除效果；
(2)空白对照组：以未添加锰氧化物的实验为空白对照；
(3)以锰氧化菌Sphingopyxis 4-15、Lysinibacillus M14产生的生物锰氧化 物(代号为4-15、M14)代替ZM-1产生的生物锰氧化物，做相同的废水As去 除实验；
(4)锰氧化物在对砷的去除效果如图4所示。由图可知，废水中As的初 始浓度为2.5mg/L，ZM-1生物锰氧化物对As的最大去除率可达41.2％，高于 4-15、M14生物锰氧化物的24.3％和12.3％。
综上所述，本发明所筛选得到的锰氧化菌具有较高的锰氧化能力，同时该 锰氧化菌产生的锰氧化物具有对污水重金属对铜、锌、铬、砷的去除能力；相 对于物理化学法成本低、对不同污染水体适应性强且无二次污染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种锰氧化菌及其筛选方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag 60
taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc 120
ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag 180
atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt 240
agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300
gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga 360
gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa 420
tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc 480
gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc 540
ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg 600
ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660
tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga 720
aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780
taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg 840
gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900
agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac 960
aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080
tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag 1200
aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga 1260
tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccgaagt cggtgaggta acctttagga gccagccgcc ga 1422
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat ctggctcag 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggtacct tgttacgact t 21

Claims (8)

1.一种锰氧化菌，其特征在于，该锰氧化菌的分类学命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZM-1，其保藏编号为：CCTCC NO：M2017851。
2.一种权利要求1所述的锰氧化菌在去除污染物重金属中的应用。
3.一种锰氧化菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、含锰培养基的配制：配制LB培养基进行灭菌，待冷却后，加入适量过滤除菌MnCl2溶液和生物缓冲液HEPES(pH 7.0)；
步骤2、锰氧化菌的初筛：按1％的接种量分别接种生长对数期的多种待筛菌株的菌液于上述步骤1的含锰液体培养基，于30℃、180rpm的恒温摇床上震荡培养48h后，采用原子吸收光谱法测定溶液中剩余锰浓度，并测定培养液的pH值。以不接菌的液体培养基为对照，筛选锰去除率较高的菌株；
步骤3、将初筛得到的菌株接种到含锰液体培养基中，培养4～6d取样，LBB比色法定性检测锰氧化物，筛选具有锰氧化活性的菌株，即权利要求1所述的锰氧化菌。
4.如权利要求3所述的锰氧化菌的筛选方法，其特征在于，所述LB培养基为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，调节pH为7，分装于250mL三角瓶中，每瓶100mL分别于灭菌锅经121℃高温蒸汽灭菌20min。
5.如权利要求3所述的锰氧化菌的筛选方法，其特征在于，LB灭菌冷却后加入适量过滤除菌的1mol/L MnCl2溶液和生物缓冲液1mol/L HEPES(pH 7.0)，使培养基Mn(II)和HEPES的最终浓度分别为1mmol/L和20mmol/L。
6.一种重金属污染物的去除方法，其特征在于，将斜面保存的权利要求1所述的锰氧化菌活化，接种于活化培养基上，放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养12h；挑取活化培养基上的菌种，接种于已灭菌含锰液体培养基中，30℃下180rpm振荡培养10d，得发酵液用于去除污染物重金属，或者将发酵液进行干燥处理得到干燥物用于去除污染物重金属。
7.如权利要求6所述的重金属污染物的去除方法，其特征在于，所述含锰液体培养基加有终浓度为6mmol/L的MnCl2溶液和终浓度为20mmol/L的HEPEPS缓冲液(pH 7.0)。
8.一种用于去除污染物重金属的锰氧化物，其特征在于，该锰氧化物为将如权利要求1所述锰氧化菌进行发酵获得的发酵液或所述发酵液经干燥获得的干粉菌剂。
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