CN102676423A - 还原铬离子苏云金芽孢杆菌yb-03及其培养方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03及其培养方法与应用。本发明分离出的还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653不仅能还原Cr⁶⁺，也能不同程度的对Ag⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺产生抗性，对氨苄青霉素和链霉素也不敏感，在铬污染的治理中具有重要的应用价值。

Description

还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及一种抗铬菌，具体涉及一种还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03及其培养方法与应用。 

背景技术

铬及其化合物在工业中被广泛使用，导致大量含铬废水、废渣产生，对环境造成严重污染，危及民众健康。六价铬生物毒性极大，是造成环境污染的主要重金属之一。因此，铬污染的治理引起了人们广泛的关注。传统的物理和化学治理法包括调节pH、絮凝沉淀、离子交换和活性炭吸附等，但这些方法需要消耗其他能源或使用大量的化学试剂，处理成本较昂贵，且存在着二次污染的可能。因此，铬污染的生物治理被看作是一个可以替代的治理策略，具有很大的潜力，比如Evns，吴乾菁，Dermou等人都曾用微生物模拟处理铬污染水，取得一定效果。如今国内外筛选出的具有还原六价铬的微生物很多，国外学者也已有研究报道称在大肠杆菌、假单胞菌中均发现了含有还原六价铬的基因，分别为YieF基因、NfsA基因。现有的这些微生物或六价铬抗性较小，或六价铬还原能力较低，或所需还原时间较长，普遍离工业应用还有一定距离。 

另外在哈维氏弧菌中同样发现了还原六价铬的基因，这些基因表达的蛋白酶均具能在一定条件下将六价铬进行还原，但是国内学者对六价铬还原基因鲜有报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗铬作用的还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03，并给出了具体的培养应用方法。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 

一种还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03，其保藏编号为CGMCC NO.5653。

所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03在还原六价铬离子中的应用。 

所述YB-03菌以木糖为碳源。 

所述YB-03菌还原Cr⁶⁺的最适温度为37℃。 

所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03以有机氮为氮源。 

所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03的培养方法，采用如下培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH为7.2；培养条件37℃。 

本发明具有积极有益的效果： 

本发明分离出的还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653不仅还原Cr⁶⁺，也能不同程度的对Ag ⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Zn ²⁺、Co²⁺、Mn ²⁺产生抗性，对氨苄青霉素和链霉素也不敏感，在铬污染的治理中具有重要的应用价值。

本发明所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03菌株（Bacillus thuringiensis），已于2011年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03菌株（Bacillus thuringiensis）的保藏编号为CGMCC NO.5653。 

附图说明

图1：YB-03菌在不同浓度的Cr^6 +中的生长情况对比图； 

图2：不同碳源下，YB-03菌对Cr⁶⁺的还原对比图；

图3：不同氨基酸下，YB-03菌对Cr⁶⁺的还原对比图；

图4：不同氮源下，YB-03菌还对Cr⁶⁺的还原对比图；

图5：培养基的不同初始pH下，YB-03菌对Cr⁶⁺的还原对比图谱；

图6：Cr⁶⁺初始浓度对YB-03菌还原的影响图谱；

图7：不同温度对YB-03菌还原的影响图谱；

图8：不同金属离子对YB-03菌还原的影响图谱。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。 

实施例1  六价铬还原细菌的分离、筛选 

取活性污泥（采集时间：2010年9月；采集地点：郑州市五龙口污水处理厂；采集人：魏斐）10g于90ml的无菌水中，分别稀释为10^-1～10^-6六个梯度。从每个梯度中取溶液1ml，涂布于含有适量浓度Cr⁶⁺的LB固体培养基中，放入37℃培养24h。

抗铬细菌的还原性鉴定：从培养基中挑选菌落于含有100mg/L Cr⁶⁺的LB液体培养基中，37℃，150r/min培养24h，取出适量溶液离心取上清，测定溶液中剩余Cr⁶⁺含量。 

本次筛选培养一共得到了两株不同形态的菌株，分别定名为YB-01，YB-03。两株菌株对六价铬的还原效果见表1。 

表1： 24小时后，六价铬和总铬的情况 

从表1可以看出两种菌均可以还原Cr⁶⁺，24h后，YB-01菌还原率为19%，YB-03菌还原率为28%，可以看出YB-03菌还原六价铬的效果最好，因此本发明将YB-03菌选为研究菌种。

实施例2  YB-03菌的鉴定 

（1）生理生化鉴定：按照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定，结果见表2。

表2：YB-03菌生理生化结果 

（2）16srDNA鉴定：采用碱裂解法提取细菌总DNA，用16srDNA通用引物进行PCR。

通用引物：16s-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（见SEQ ID NO.2） 

16s-R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’（见SEQ ID NO.3）

PCR体系：2×Mix：25ul；上引物：1ul；下引物：1ul；模板：1ul；ddH₂O：22ul

PCR程序为：首先94℃预变性5min，然后进入循环：94℃使DNA变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，最后在72℃延伸7分钟。然后将PCR结果进行测序（见SEQ ID NO.1），后在BLAST中比对序列。

通过测序，BLAST比对，发现YB-03菌与Bacillus sp.、Bacillus thuringiensis、Bacillus anthracis 、Bacillus cereus的同源性都为98%，由此首先确定YB-03菌为芽孢杆菌属。 

通过上述生理生化试验和16srDNA鉴定，对比《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定YB-03菌为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis YB-03）。 

实施例3  YB-03菌抗性试验 

（1）将K₂Cr₂O₇，AgNO₃，HgCl₂，Cu(SO₄)₂，Zn(SO₄)₂，CoCl₂，MnCl₂配置成各种所需浓度的母液，用无菌的0.45um过滤器进行过滤除菌，加入LB中，使培养基中含有不同浓度的金属离子，将还原菌接入培养基中，37℃,150r/min摇床振荡培养24h，观察菌体是否生长，记录还原菌抗金属离子的最高浓度。

由表3可以看出，YB-03菌除了对Cr ⁶⁺离子具有抗性，同样对其它的重金属离子也有不同程度的抗性。 

表3：YB-03菌对金属离子的抗性 

（2）将氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素、链霉素、四环素、潮霉素加入培养基中，观察还原菌对其抗性。

由表4可知，YB-03菌除了对氨苄青霉素及链霉素具有抗性外，对其它抗生素均无抗性。 

表4：YB-03菌对抗生素的抗性 

实施例4  Cr^6 +浓度对YB-03细菌生长的影响

本试验在初始pH为7.2，Cr^6 +浓度分别为0、40、70、100、130mg/L的情况下，YB-03菌的生长曲线见图1。

由图1可以看出，YB-03菌在8h前生长的速度都很快，但最后都低于对照；具体情况如下：Cr^6 +浓度为130mg/L时，菌体起初快速增长，在10～32h之间成缓慢下降趋势，最后趋于平稳；Cr^6 +浓度为40mg/L和70mg/L时，虽然菌体生长过程中各个时间段的浓度有一定区别，但在48h后差异变小；Cr⁶⁺浓度100mg/L时，32h之前生长较慢并有少量下降，但随后菌体快速增长，这于菌体对环境的适应及Cr⁶⁺浓度的减少的有关。 

实施例5  不同因素下对YB-03菌还原Cr⁶⁺的影响 

（1）不同碳源对YB-03菌还原Cr⁶⁺的影响

分别以葡萄糖，木糖，蔗糖，麦芽糖，果糖为外加碳源，在LB培养基初始pH为7.2，外加碳源为1%（w/v），在37℃、150r/min培养条件下，测定YB-03菌对六价铬的还原。

由图2结果显示，YB-03菌以木糖为碳源时，48h之内全部还原100mg/L Cr⁶⁺，这可能是菌体在利用木糖生长后，YB-03菌产生了促进还原的酶或代谢产物。以果糖为碳源时，其还原Cr⁶⁺的速率也同样快于对照LB。而以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为碳源时，最终还原速率都低于对照，这可能于YB-03菌对碳源的选择性或产生的某些物质有关。 

（2）不同氨基酸代谢中间产物对YB-03菌还原的影响 

将琥珀酸、柠檬酸、苹果酸分别加入LB培养基，浓度为1%（w/v），在LB培养基初始pH为7.2，在37℃、150r/min培养条件下，测定YB-03菌对Cr⁶⁺的还原。

如图3所示，苹果酸还原速率最快，只需36h就可完全还原Cr⁶⁺；柠檬酸的还原时间虽然短于琥珀酸，但是在40h前却慢于琥珀酸；而对照LB还原Cr⁶⁺最慢。说明以上3种不同氨基酸代谢中间产物，虽然都促进了六价铬的还原，但影响效果却不相同，这也许与电子供体有关。 

（3）不同氮源对YB-03菌还原Cr⁶⁺的影响 

分别选用氯化铵，尿素，玉米饼粉等无机和有机氮源做为外加氮源，在培养基初始pH为7.2，外加氮源为0.5%（w/v），在37℃、150r/min培养条件下，测定C-2菌对六价铬的还原。

在培养基中添加玉米饼粉时，YB-03菌还原Cr⁶⁺的速率最快，在60h内可完全还原100mg/L Cr⁶⁺；而在以NH₄CL、尿素为外加氮源时，还原速率均慢于对照LB，其中在尿素中还原的最慢（图4）。综上看出，有机氮源下的还原速率大于无机氮源，说明YB-03菌利用有机氮源的效果优于无机氮源。 

（4）不同初始pH条件下对YB-03菌对Cr⁶⁺的还原 

将LB培养基的初始pH分别调为4.0，5.0，6,0，7.0，8.0，9.0，10.0等七个梯度，在37℃、150r/min培养条件下，在此范围内测定YB-03菌对Cr⁶⁺的还原，得出最适初始pH。

由图5中看出，YB-03菌在pH5.0、pH6.0条件下，还原Cr⁶⁺的速度最慢；而在pH4.0酸性更强的情况下，菌体还原速率反而变大，并与pH7.0时的还原情况大致相同；在pH10.0下，还原速率稍快；而在pH8.0、pH9.0时48h内就可以将Cr⁶⁺还原完全，还原速率最快。 

（5）Cr⁶⁺初始浓度的影响 

在LB初始pH为9.0的条件下，Cr⁶⁺浓度分别为20、40、60、80、120、160、200mg/L时，在37℃、150r/min培养条件下，研究YB-03菌对Cr⁶⁺的还原情况。

由图6看出Cr⁶⁺浓度越低，还原所需时间越短。在Cr⁶⁺为200mg/L的情况下，72h就还原了98.71%；在Cr⁶⁺浓度为20mg/L时，YB-03菌在12h内就全部还原了六价铬；在Cr⁶⁺浓度在40～120mg/L时，Cr⁶⁺在48h内都可被还原；而在60h内，YB-03菌可100%还原160mg/L的Cr⁶⁺。 

（6）不同温度下，YB-03菌对Cr⁶⁺的还原 

在LB初始pH 9.0条件下，分别在150r/min，培养温度为28℃、37℃、45℃的温度条件下，测定YB-03菌对Cr⁶⁺的还原。

从试验结果得出，在37℃时YB-03菌的还原速率最快，60h内可将Cr⁶⁺全部还原，而在28℃时则需72h，45℃还原速率最低。由此得出YB-03菌还原Cr⁶⁺的最适温度为37℃。 

（7）不同金属离子下，YB-03菌对Cr⁶⁺的还原 

将Co²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺分别加入LB培养基中，终浓度为1mM，在初始pH为9.0，在37℃、150r/min培养条件下,测定YB-03菌对Cr⁶⁺的还原情况。

由图8可看出，在Cu²⁺、Fe²⁺，Ca²⁺存在下，还原的速率明显高于其它金属离子，48h内可完全还原160mg/L的Cr⁶⁺；Mg²⁺、Mn²⁺条件下与对照差异不大；而Co²⁺、Zn²⁺则有明显的抑制作用。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

SEQUENCE LISTING

<110>  河南省农业科学院

<120>  还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03及其培养方法与应用

<130>  /

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.2

<210>  1

<211>  1520

<212>  DNA

<213>  YB-03菌

<400>  1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcaagc     60

gaatggatta aaagcttgct cttatgaagt taccgccgga cgggtgagta acacgtgggt    120

aacctgccca taaaactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt    180

gaaccgcatg gttcgaaatt gaaaggcggc ttcggctgtc acttatggat ggacccgcgt    240

cccattacct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtac ccaacctgaa    300

agggtgatcg gccacactgg gactgaaaca cggcccaaac tcctacggga ggcaccagta    360

gggaatcttc cgcaatggac aaaagtctga cggaccaacc ccgcgtgagt gatgaaggct    420

ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa aaacaagtgc tatttgaata agctggcacc    480

ttgacggtac ctaaccaaaa agccacggct aactacgtgc caccacccgc ggtaatactt    540

aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggtgg tttcttaagt    600

ctgatgtgaa agcccacggc tcacccgtgg agggtcattg gaaactggga gacttgattg    660

caaaaaagga aagtggaatt ccatgtgtac gcggtgaaat gcgtaaagat atggaggaac    720

accagtggcg aaggcgaact tttctggtct tgtaactgac actgaggcgc gaaaaggcgt    780

ggggagcaaa cagggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt    840

gttagagggt ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat taagcactcc gcctggggag    900

tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat    960

gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc   1020

tagagatagg gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct   1080

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca   1140

tcatttagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga   1200

cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa   1260

agagctgcaa gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta   1320

ggctgcaact cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg   1380

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc   1440

gaagtcggtg gggtaacctt tttggagcca gccgcctaag gtgggacaga tgattggggt   1500

gaagtcgtaa caaggtaacc                                               1520

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

agagtttgat cctggctcag                                                 20

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

aaggaggtga tccagccgca                                                 20

Claims (7)

1.一种还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03，其保藏编号为CGMCC NO.5653。

2.权利要求1所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03在还原六价铬中的应用。

3.根据权利要求2所述的还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03在还原六价铬中的应用，其特征在于，所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03在还原六价铬时的初始pH为8.0～9.0。

4.根据权利要求2所述的还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03在还原六价铬中的应用，其特征在于，所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03以有机氮为氮源。

5.根据权利要求2所述的还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03在还原六价铬中的应用，其特征在于，所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03还原Cr⁶⁺的温度为37℃。

6.根据权利要求2所述的还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03在还原六价铬中的应用，其特征在于，所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03以木糖为碳源。

7.权利要求1所述还原铬离子苏云金芽孢杆菌YB-03的培养方法，其特征在于，接种于LB固体培养基上于37℃下培养24～48小时，所采用的LB固体培养基构成如下：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH为7.2。

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